Поліаміни – маркери злоякісного росту і мішень для протипухлинної терапії

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

УДК: 616-006. 04:577.218: 616-085

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

ПОЛІАМІНИ - МАРКЕРИ ЗЛОЯКІСНОГО РОСТУ І МІШЕНЬ ДЛЯ ПРОТИПУХЛИННОЇ ТЕРАПІЇ

14.01.07 ? Онкологія

ЗАЛЄТОК СОФІЯ ПЕТРІВНА

Київ ? 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Науковий консультант:

Бердинських Ніна Констянтинівна, доктор медичних наук, професор, провідний науковий співробітник відділу біохімії пухлин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Офіційні опоненти:

Кудрявець Юрій Йосипович, доктор біологічних наук, завідувач відділу експериментальних клітинних систем Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України;

Колесник Олена Олександрівна, доктор медичних наук, провідний науковий співробітник відділу бдомінальної онкології Інституту онкології АМН України;

Матишевська Ольга Павлівна, доктор біологічних наук, професор, професор кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету ім. Тараса Шевченка.

Провідна установа ? Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького МОЗ України, кафедра онкології та медичної радіології, м. Львів.

Захист відбудеться "28" березня 2007 р. о 13 годині 30 хвилин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий "27" лютого 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук Н.В. Бородай.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Злоякісна трансформація пов'язана з порушенням таких фундаментальних біологічних процесів як ріст, диференціювання та запрограмована загибель клітин. Важливу роль у контролюванні цих процесів відіграють низькомолекулярні ендогенні регулятори, особливе місце серед яких належить поліамінам (ПА), низькомолекулярним органічним полікатіонам, які відіграють унікальну роль в живих організмах. За останні три десятиліття інтенсивного дослідження ПА багато їх функцій в процесах нормального і злоякісного росту було вивчено і розкрито. Встановлено, що ПА регулюють найважливіші метаболічні процеси в клітині, зокрема, такі, як синтез нуклеїнових кислот і білків, модифікують структуру мембран, впливають на функціонування мембранозв'язаних ферментів (Tabor, Tabor, 1984; Cohen, 1998), а, згідно сучасних даних, беруть участь у передачі регуляторних сигналів (Bachrach et al., 2001; Gerner, Meyskens, 2004).

Роль ПА в злоякісному рості інтенсивно досліджується в багатьох провідних лабораторіях світу. Однак, багато питань щодо особливостей метаболізму ПА та молекулярних механізмів їх дії при пухлинному рості ще не розкриті і потребують подальшого детального вивчення. Конкретні відповіді на ці питання мають важливе значення не тільки для розуміння фундаментальних механізмів злоякісного росту, оскільки ПА абсолютно необхідні для росту і проліферації клітин, але і тому, що агенти, які регулюють метаболізм ПА можуть бути використані в клінічній онкології в якості протипухлинних препаратів "таргетної" дії. Необхідно зазначити, що в останні роки синтезовані різноманітні аналоги ПА і інгібітори ферментів обміну ПА, частина з яких вже випробовується в онкологічних клініках США, Японії, Франції і отримані обнадійливі результати (Thomas, Thomas, 2001; Casero et al., 2005; Basuroj, Gerner, 2006). Але проблема застосування інгібіторів/регуляторів метаболізму ПА ще далека від вирішення, і потребує детального вивчення.

Відомо, що злоякісний ріст супроводжується накопиченням ПА не тільки в пухлинах, а і в тканинах і біологічних рідинах організму, в якому розвивається пухлина. Існує низка робіт, присвячених вивченню ПА як діагностичних маркерів злоякісного росту (Russell et al., 1971; Russell, 1984; Залеток С. П., 1977; Bergeron et al., 1997; Yamaguchi et al., 2005; Kawakita, Hiramatsu, 2006). Але питання щодо використання ПА як маркерів ефективності терапії і прогнозу перебігу злоякісного процесу у онкологічних хворих вивчено недостатньо. У світовій літературі є лише поодинокі роботи, в яких представлено результати дослідження вмісту ПА в біологічних рідинах онкологічних хворих в різні періоди розвитку злоякісних пухлин (при прогресії, ремісії, рецидиві хвороби) (Балицька О.В., 1992; Leveque et al., 2000; Hiramatsu et al., 2005), але і вони не дали вичерпної відповіді на питання, наскільки доцільним може бути використання показників вмісту ПА в сечі та крові в якості маркерів ефективності традиційної хіміотерапії та для прогнозу перебігу злоякісного процесу у онкологічних хворих.

Упродовж останніх років значна увага приділяється участі ПА у регуляції процесів проліферації, росту та диференціювання клітин (Bachrach, 1996; Cohen, 1998; Сяткін С. П., 1998; Morgan, 1999). Але молекулярні механізми їх участі в цих процесах, зокрема, вплив ПА на експресію певних генів ще залишаються в значній мірі нерозкритими. На цей час виявлено взаємозв'язок між інтенсивністю метаболізму ПА в клітині і експресією окремих онкогенів, наприклад, с-myc, c-jun (Tabib, Bachrach, 1999; Bachrach et al., 2001; Jдnne et al., 2005; Hu et al., 2005), однак вплив ПА на функціонування факторів транскрипції онкогенів вивчений дуже мало. Це стосується, зокрема, і впливу ПА на функціонування ядерного фактора транскрипції NF-кB, який, згідно сучасних уявлень, відіграє важливу роль не тільки в процесах запалення і імунної відповіді, а і в розвитку злоякісних пухлин, оскільки експресія багатьох клітинних генів, зокрема онкогенів, залежить від активності цього фактора (Dejardin et al., 1999; Karin et al., 2002). Механізми регуляції активності NF-кВ при неопластичному рості вивчені недостатньо; практично нерозкритим залишається зв'язок між метаболізмом ПА і активністю фактора транскрипції NF-кВ в злоякісних клітинах, є лише поодинокі роботи, присвячені вивченню цих питань (Shah et al., 1999; Shah et al., 2001).

Таким чином, дослідження особливостей метаболізму та молекулярних механізмів участі ПА в неопластичному рості є важливим напрямком сучасної фундаментальної онкології. Результати таких досліджень можуть знайти застосування в практичній онкології, зокрема для розробки протипухлинних препаратів "таргетної" дії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Роботу виконано в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України у відділі біохімії пухлин в рамках планових науково-дослідних робіт (номери держреєстрації: №01.88.0008001; №А 01004449Р; №0100U00652; №0103U000786; шифр 2.2.5.206, №0194017036; шифр 2.2.5.218; №0197U006233; шифр 2.2.5.232, №0103U000786). Частину роботи виконано за підтримки фонду CRDF (США), грант UВ 1-2446-КV-02; МОН України, грант №Ф 7/428-2001; гранту НАН України (програма "Дослідження у галузі сенсорних систем і технологій");Українського науково-технологічного центру, грант Gr-122j.

Мета дослідження: Встановити особливості метаболізму та молекулярні механізми дії ПА при канцерогенезі і пухлинному рості, з'ясувати прогностичну значимість показників обміну ПА та обґрунтувати доцільність використання інгібіторів метаболізму ПА для протипухлинної терапії.

Задачі дослідження:

1. Дослідити особливості метаболізму ПА при хімічному гепатоканцерогенезі, індукованному N-нітрозодиетиламіном (N-НДЕА), і канцерогенезі кишковика, індукованному 1,2-диметилгідразином (1,2-ДМГ), у експериментальних тварин.

2. Визначити вміст ПА та активність ключового ферменту їх біосинтезу ? орнітиндекарбоксилази (ОДК) в пухлинах шлунково-кишкового тракту людини.

3. Визначити вміст ПА та активність ключового ферменту їх біосинтезу ? ОДК в пухлинах грудної залози людини.

4. Визначити вміст ПА в сечі та їх концентрацію в сироватці крові хворих на злоякісні лімфоми, рак яєчника та рак грудної залози в динаміці захворювання (в активну фазу, при ремісії та при рецидиві захворювання).

5. Довести можливість застосування показників вмісту ПА в біологічних рідинах онкологічних хворих (ПА-тесту) для оцінки ефективності терапії і прогнозу перебігу пухлинного процесу.

6. З'ясувати молекулярні механізми дії ПА при пухлинному рості: їх вплив на активність фактора транскрипції NF-кB.

7. Дослідити вплив модуляції метаболізму ПА в пухлинах на експресію білкових продуктів генів, які регулюються NF-кB.

8. Визначити показники обміну ПА в експериментальних пухлинах при формуванні резистентності до цисплатину.

9. B експериментах in vivo дослідити протипухлинну дію інгібіторів синтезу ПА та обґрунтувати перспективність їх використання для терапії онкологічних хворих.

Об'єкт дослідження: перещеплювані асцитні і солідні пухлини щурів і мишей (карцинома молочної залози Са 755, карциносаркома Уокер (Walker-256), карцинома Л'юїс, гепатома Г-27, чутливі і резистентні до дії доксорубіцину і цисплатину субштами карциноми Герена, асцитний рак Ерліха, лімфолейкоз L1210, лімфома Nk/ly), клітинна лінія раку грудної залози людини MCF-7; печінка і слизова оболонка кишковика та індуковані N-нітрозодиетиламіном (N-НДЕА) і 1,2-диметилгідразином (1,2-ДМГ) пухлини печінки і кишковика щурів; операційний матеріал (пухлини та макроскопічно незмінена тканина грудної залози; пухлини і макроскопічно незмінена слизова оболонка шлунково-кишкового тракту); кров і сеча хворих на злоякісні лімфоми, рак яєчника, рак і доброякісні пухлини грудної залози та практично здорових людей.

Предмет дослідження - вміст ПА і активність ферментів їх метаболізму в екпериментальних пухлинах і пухлинах людини, вміст ПА в сечі і крові онкологічних хворих та практично здорових людей; протипухлинна активність інгібіторів метаболізму ПА; вплив ПА на активність класичного фактора транскрипції NF-кB (р 50/р 65) та на взаємодію фактора транскрипції NF-кB з відповідними послідовностями ДНК(NRE); експресія білкових продуктів генів, залежних від NF-кB, в експериментальних пухлинах молочної залози в умовах модуляції метаболізму ПА.

Методи дослідження: в роботі використані методи експериментальної онкології (індукція пухлин хімічними канцерогенами; оцінка швидкості росту пухлин і тривалості життя експериментальних тварин; отримання резистентних до хіміопрепаратів штамів пухлин); методи виділення ядер та плазматичних мембран; методи препаративної біохімії: екстракція, діаліз, ультрацентрифугування; для визначення вмісту ПА використовували методи тонкошарової (ТШК), рідинної хроматографії високого тиску (РХВТ) та методи електрофорезу на папері; для визначення активності ферментів метаболізму ПА використано біохімічні і радіоізотопні методи; для теоретичного обґрунтування впливу ПА на процес транскрипції застосовано методи комп'ютерного моделювання і молекулярного докінгу; для оцінки впливу ПА на зв'язування фактора транскрипції NF-кB з відповідними послідовностями ДНК використано метод поверхневого плазмонного резонансу (ППР) і флюоресцентний метод безвипромінювального переносу енергії (FRET); для оцінки активності фактора транскрипції NF-кB використано метод трансфекції; для оцінки експресії білків NF-кB і білкових продуктів генів, залежних від NF-кB, застосовано методи ППР, гель-електрофорезу, Вестерн-блот аналіз.

Наукова новизна. В результаті комплексних досліджень отримані нові дані про особливості метаболізму ПА при хімічному канцерогенезі, які показують, що процесу малігнізації передують глибокі зміни метаболізму ПА, котрі проявляються в різкому зростанні активності ОДК (ключового фермента біосинтезу ПА), зниженні активності фермента катаболізму ПА диаміноксидази (ДАО) і значному збільшенні вмісту ПА (путресцину і спермідину) в тканинах-мішенях. Вперше виявлено, що при N-НДЕА-гепатоканцерогенезі та при 1,2-ДМГ канцерогенезі кишковика має місце двофазна інтенсифікація синтезу і накопичення ПА в тканині та субклітинних фракціях (плазматичних мембранах і ядрах) органів-мішеней: в ранню (1-4 тижні) і пізню (5-6 місяці) стадії, що свідчить про участь ПА в ініціації злоякісного росту і неопластичній трансформації клітин печінки та кишковика. Виявлено, що високий рівень ПА зберігається і в сформованих пухлинах.

Вперше виявлено зворотню залежність між величиною активності ОДК і ступенем диференціювання аденокарцином шлунково-кишкового тракту людини.

Проведена оцінка довготривалої (до 4-х років) динаміки вмісту ПА (ПА-тест) в сечі та сироватці крові у хворих на рак грудної залози, злоякісні лімфоми та пухлини яєчника. Виявлено, що ПА-тест відображає перебіг пухлинного процесу: при ремісії спостерігається нормалізація рівнів ПА в біологічних рідинах, а їх підвищення передує клінічним проявам рецидиву захворювання.

Виявлено, що введення тваринам з експериментальними пухлинами синтетичних (б-дифторметилорнітину, б-ДФМО і полігексаметиленгуанідину, ПМГ) і природних (поліфенолів зеленого чаю) інгібіторів ОДК призводить до зниження вмісту ПА в пухлинах, що супроводжується значним гальмуванням росту пухлин і істотним збільшенням тривалості життя тварин. Показано, що ПМГ має потужні протилейкозні властивості і, в залежності від дози і схеми його введення, призводить до значного збільшення тривалості життя тварин з лімфолейкозом L 1210. Встановлено, що механізм дії ПМГ пов'язаний не тільки з його прямою інгібіторною дією на ОДК, а і з впливом на -глутамілтранспептидазу ? фермент, який бере участь в регуляції ОДК.

Доведено, що одним із механізмів дії ПА при пухлинному рості є їх регулюючий вплив на активацію фактора транскрипції NF-кB і експресію білкових продуктів NF-кB-залежних генів, залучених в пухлинний процес (c-myc, Bcl-Xl, ОДК). Вперше показано, що за присутності ПА підвищується спорідненність білка р 50 (субодиниці NF-кB) до специфічної послідовності ДНК за рахунок утворення додаткових електростатичних і водневих зв'язків, що підтвердило можливість регуляції ПА транскрипції, контрольованої NF-кB. В експериментах in vitro продемонстровано, що ПА підвищують зв'язування фактора транскрипції NF-кB з відповідними ДНК-послідовностями; в дослідах in vivo показано, що в умовах деплеції ПА активність фактора NF-кB в пухлинних клітинах молочної залози, знижується. Виявлено, що механізм протипухлинної дії поліфенолів зеленого чаю пов'язаний з його гальмівною дією на синтез ПА і активацію фактору транскрипції NF-кB.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані про багаторазове підвищення активності ОДК і вмісту ПА в пухлинах шлунково-кишкового тракту і грудної залози людини свідчать, що інтермедіанти обміну ПА можуть бути мішенню для терапії злоякісних пухлин. Ці дані, поряд з результатами експериментальних досліджень про протипухлинну дію синтетичних та природних інгібіторів метаболізму ПА, стали основою для обґрунтування можливості використання досліджуваних інгібіторів метаболізму ПА для "таргетної" терапії онкологічних хворих.

Встановлена в аденокарциномах шлунково-кишкового тракту залежність між рівнем активності ОДК і ступенем їх диференціювання може бути використана як один із маркерів ступеня злоякісності пухлин травного тракту людини. поліамін пухлинний метаболізм транскрипція

На основі тривалих (в різні фази захворювання) досліджень вмісту ПА в сечі і крові хворих на злоякісні лімфоми, рак яєчника і грудної залози розроблено і клінічно апробовано поліамінний тест (ПА-тест), чутливість якого становить 80-90 %. Встановлена кореляція між результатами ПА-тесту і активністю пухлинного процесу та ефективністю терапії, свідчить про перспективність практичного використання тесту у хворих на злоякісні пухлини яєчника, грудної залози та злоякісні лімфоми. Цей тест рекомендовано в практику онкологічних установ.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом обґрунтовано мету і сплановано завдання дисертаційної роботи, запропоновано підходи до їх виконання. Автором особисто проведено експерименти по індукції та перещепленню пухлин, проведено забір біологічного матеріалу у тварин; збір післяопераційних зразків пухлин та зразків крові і сечі у онкологічних хворих; автором особисто проведено визначення вмісту ПА та активності ферментів їх метаболізму в зразках експериментального та клінічного матеріалу. Автором модифіковано метод визначення ПА в сечі і крові, розроблено і апробовано на великому контингенті онкологічних і неонкологічних хворих ПА-тест. Автору належить ідея про залучення ПА в процес експресії онкогенів шляхом прямого впливу на зв'язування фактора транскрипції NF-кB з відповідними послідовностями ДНК. Автор брала участь у розробці способів імобілізації біологічних молекул на поверхні сенсорних чіпів спектрометра ППР для дослідження впливу ПА на міжмолекулярну взаємодію NF-кB~ДНК. Автором особисто проведено дослідження активності NF-кB за допомогою метода трансфекції. Автором самостійно проведено аналіз отриманих результатів, сформульовано усі положення та висновки дисертаційної роботи, самостійно підготовлені до друку публікації, що відображають результати дисертації.

Апробація роботи. Матеріали роботи були представлені та обговорені на: Міжн. конф. "Polyamines in Life Sciences" (Токіо, 1986); Міжн. конф. "Пухлинні маркери в онкології" (Київ, 1990); Міжн. конф. "Polyamines in Molecular and Medical Biology" (Кіото, 1990); ІІ з'їзді онкологів СНД з участю вчених Європи, Азії, Америки (Київ, 2000); Х з'їзді онкологів України (Ялта, 2001); 28-му з'їзді Федерації європейських біохімічних товариств (Стамбул, 2002); III з'їзді онкологів і радіологів СНД (Мінськ, 2004); І-му Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); конференції "Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій" (Київ, 2005); Міжн. конф. "Food, Nutrition and Cancer" (Вашингтон, 2005); ХІ з'їзді онкологів України (Судак, 2006); Міжн. конф. "Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases" (Рим, 2006).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено в 40 публікаціях, в тому числі 1 монографії, 23 статтях у провідних фахових виданнях, 1 методичних рекомендаціях, 1 деклараційному патенті на винахід та у 14 тезах доповідей у матеріалах вітчизняних та міжнародних конгресів, з'їздів та конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 269 сторінках машинописного тексту. Дисертаційна робота складається із вступу, 2 розділів огляду літератури, розділу матеріалу і методів дослідження, 5 розділів власних досліджень, обговорення результатів досліджень, висновків та списку літературних джерел (345 посилань), з них 28 на українській та російській мовах, 317 на англійській та німецькій мовах. Дисертація містить 52 таблиці та 47 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Експериментальна частина роботи виконана на 1500 експериментальних тваринах (білих нелінійних щурах та щурах лінії Wistar, віком 2?3 місяці, масою 80-150г; нелінійних мишах, мишах лінії С 57Вl та мишах-гібридах BDF1, віком 2-2,5 міс, масою 18-20г) розводки віварію Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, керуючись міжнародно прийнятими правилами проведення робіт з експериментальними тваринами.

Використовували такі моделі хімічного канцерогененезу: канцерогенез печінки, викликаний N-НДЕА, і канцерогенез кишковика, викликаний 1,2-ДМГ. Індукцію гепатом проведено на білих нелінійних щурах-самцях 2-х місячного віку, масою 80-100г, які отримували з питною водою N-НДЕА в концентрації 0,025 %. Контрольні тварини того ж віку і статі ? неканцерогений аналог диетиламін (ДЕА) в концентрації 0,025 %. Дослідження проводили в ранній період гепатоканцерогенезу (1-4 тижні) та через 2, 3, 4, 5, 6 місяців. З тканини печінки і пухлин одержували субклітинні фракції (ядерну, плазматичних мембран і цитозольну). Виділення фракції плазматичних мембран виконували у градієнті сахарози за методом Neville (1960), для виділення фракції ядер використовували метод Рennial et al. (1964).

Канцерогенез кишковика. Дослідження проведені на білих нелінійних щурах-самцях, масою 80-100г. Для індукції пухлин кишковика тваринам один раз на тиждень протягом 6 місяців підшкірно вводили 1,2-ДМГ в дозі 20 мг/кг маси (Пожарисский, 1972). Дослідження проводили в процесі індукції пухлин (через 1, 2, 3, 4, 5 місяців після початку введення канцерогена) та в індукованих пухлинах. Об'єктом дослідження були гомогенат і цитозоль слизової оболонки тонкого та товстого кишковика.

Моделі експериментальних пухлин: перещеплювані асцитна карцинома Ерліха (АРЕ), лімфома NK/ly, лімфолейкоз L1210, а також їх резистентні до цисплатину субштами, які отримували шляхом багаторазового введення тваринам з перещепленими пухлинами цисплатину (ЦсП), (ЕБЕВЕ, Арцнайміттель, Унтерах, Австрія); вихідні та резистентні до цисплатину і доксорубіцину субштами карциноми Герена (резистентні субштами карциноми Герена були люб`язно надані канд. біол. наук І.М. Тодором (відділ механізмів протипухлинної терапії); карциносаркома Уокер, аденокарцинома Са 755, карцинома Л'юїс, гепатома Г-27.

Протипухлинну дію інгібіторів обміну ПА досліджували у тварин з перещепленими асцитними (рак Ерліха, лімфолейкоз L1210, лімфома NK/ly та їх резистентні до цисплатину субштами) і солідними пухлинами (карциносаркома Уокер, карцинома Л'юїс, гепатома Г-27). В якості синтетичних інгібіторів біосинтезу ПА використовували: б-ДФМО ("Serva", USA) та ПМГ, синтезований в Інституті органічного синтезу АН Латвії і люб'язно наданий академіком АН Латвії М. Лідаком; в якості природних інгібіторів ? суміш поліфенолів зеленого чаю, вироблену в Інституті біохімії і біотехнології ім. С. Дурмішидзе АН Грузії.

Для теоретичного обґрунтування можливості впливу ПА на процес транскрипції використано методи комп'ютерного моделювання. Пошук потенційних сайтів зв'язування NF-кВ з ПА проводили методом гнучкого молекулярного докінгу за допомогою програми "Аutodock vЗ.5" та ригідного докінгу (програма НЕХ 2.4). Просторові структури ПА будували за допомогою програми АgrusLab 1.0. Структуру NF-кВ одержали із брукхенівської бази даних білків (Рrоtein Data Ваnк). Моделювання механізму впливу ПА на функціонування NF-кВ проводили згідно програми МОІL2000. На всіх етапах, як допоміжна, використовувалась програма АgrusLab.

Для оцінки впливу ПА на зв'язування фактора транскрипції NF-кB з відповідними послідовностями ДНК застосовано метод поверхневого плазмонного резонансу (ППР) і метод флюоресцентного безвипромінювального переносу енергії (FRET). Метод ППР. Використано спектрометри ППР "Biosuplar-5" та "Plasmon SPR-05" і супутнє обладнання (сенсорні чіпи, проточні кювети), розроблені в Інституті фізики напівпровідників НАН України. Сенсорні чіпи піддавали спеціальній обробці, яка включала нанесення на чіп проміжного шару (соєвого інгібітора трипсину, СІТ). На проміжний шар іммобілізували р 50-субодиницю; для блокування залишкових альдегідних груп використовували етаноламін; послідовності ДНК вносили до кювети в буфері Дігнама (Dignam, 1983).

Метод FRЕТ. У якості донора та акцептора використовували флуоресцентні барвники родамін В (RВ) і Техаs Red (ТR), відповідно. Перший був ковалентно приєднаний до білка р 50, другий ? до 3'-кінця одного з ланцюгів штучно синтезованих дволанцюгових олігонуклеотидів NRE: (послідовність одного з комплементарних ланцюгів: 5'-АСGGСАGGGGАТТСССТСТ-3'). Олігонуклеотиди одержано в Інституті молекулярної біології Російської академії наук (комерційний препарат). Ефективність FRЕТ визначали за співвідношенням інтегральних інтенсивностей піків емісії TR (615 нм) та RВ (575 нм), які було визначено після розкладання спектрів на компоненти за допомогою програми "Siano".

Дослідження впливу ПА на активність фактору транскрипції NF-кB та експресію білкових продуктів генів, залежних від NF-кB проведено на перещеплюваних пухлинах молочної залози (карциносаркомі Уокер і карциномі Са 755) та на клітинній лінії раку грудної залози людини MCF-7. Для виснаження пулу ПА в пухлинах використовували інгібітори ОДК ? б-ДФМО та ПМГ. Інгібітори вводили тваринам внутрішньоочеревинно в дозі: 500-1000 мг/кг маси (б-ДФМО) та 10-15 мг/кг маси (ПМГ) на 1 ін'єкцію, виконували 2-5 ін'єкцій. Через добу після останньої ін'єкції тварин забивали під ефірним наркозом, пухлини видаляли, зважували та використовували для досліджень. Клітини MCF-7 культивували на середовищі Dulbecco-ISCOV ("Sigma", USA) з додаванням 10 % ембріональної телячої сироватки ("Сяйво", Львів, Україна) та антибіотикa гентаміцину (в концентрації 40 мкг/мл) при температурі 37⁰С та при насиченні повітря 5 % СО ₂ в культуральних флаконах об'ємом 150 см ² ("Sigma", USA), що містили 20 мл середовища. Для виснаження/накопичення пулу ПА в клітинах MCF-7 в культуральне середовище вносили б-ДФМО (5мМ) або б-ДФМО (5мМ) + путресцин (5Ч 10^-7M). З цими агентами клітини культивували протягом 72 годин, потім клітини механічно збирали, двічі промивали ізотонічним розчином NaCl і використовували для приготування ядерних та клітинних екстрактів, які готували за методом Sovak et al.(1997).

Для оцінки експресії білків NF-кB і білкових продуктів генів, залежних від NF-кB, застосовано методи ППР, гель-електрофорезу та Вестерн-блот аналіз.

При використанні методу ППР на нанесений на сенсорний чіп проміжний шар (СТІ), іммобілізували моноклональні антитіла мишей проти досліджуваного білка (Santa Cruz Biotech., СА, USA) в концентрації 2 мкг/мл у 0,01М натрій-ацетатному буфері, рН 5,5, після іммобілізації антитіл кювету промивали цим же буфером, Для блокування залишкових альдегідних груп до кювети ППР вносили 0,1М розчин етаноламіну в 0,05М натрій-фосфатному буфері, рН 7,3; надалі в кювету вводили ядерний (або клітинний) екстракт, який містив 10-100 мкг загального білка в буфері 10мМ НЕРЕS, 150мМ NaС 1, 0,1 % Tween-20. При інтерпретації даних, одержаних методом ППР, вважали, що зміна кута ППР ("відгук ППР") прямо пропорційна поверхневій концентрації білка.

Аналітичний гель-електрофорез (SDS-PAGE) виконували за модифікованою методикою Леммлі (1970). Використовували такі буферні розчини: анодний буфер: 0,2М трис-НС 1, рН 8,9; катодний буфер: 0,1М трис, 0,1М трицин, рН 8,25; буфер для концентруючого гелю: 0,71М трис-НСІ, рН 8,45, 0,1 % SDS; буфер для розділяючого гелю: 1М трис-НСІ рН 8,45, 0,1 % SDS; акриламід та метилен-біс-акриламід - у вигляді "Асrуl/Віs 37,5: 1 Sоlution 30 %" ("Аnachem", USA). Смуги білків забарвлювали Кумасі блакитним R-250 ("Sigma", USA). Використовували маркери молекулярної маси "Ultra-low Range Molecular Weight Маrkеr (1,06-26,6)" ("Sigma", USA).

Вестерн-блот аналіз проводили за методом Tsang et al (1983), білки після електрофорезу переносили на нітроцелюлозну мембрану Нуbond ECL (Аmersham Pharmacia Biotech, Швеція). Після блокування вільних місць зв'язування за допомогою знежиреного молока, мембрану поміщали на 4 години при 37⁰С у розчин моноклональних антитіл миші проти досліджуваних білків (Santa Cruz Biotech., СА, USA), а потім у розчин вторинних lgG кози проти антитіл миші, кон'югованих з пероксидазою хріну (Santa Cruz Biotech., СА, USA). Після цього мембрану інкубували в системі детекції ЕСL (Santa Cruz Biotech., СА, USA) (0,125 мл кожного реагенту ЕСL на 1см ² мембрани). Після 2-хв інкубації рентгенівську плівку ("Фотон", Україна) прикладали до мембрани. Дані Вестерн-блотингу було проаналізовано за допомогою комп'ютерної програми TotalLab.

Для оцінки активності фактора транскрипції NF-кB в пухлинах молочної залози використано метод трансфекції. В клітини MCF-7 трансфектували 1мкг NF-кB-люциферазної плазміди (LipofectAMINE, USA) згідно протоколу виробника (Invitrogen, USA).? Для контролю ефективності до кожної трансфекції була включена рCMV-в-gal плазміда (0,4мкг). Через добу після трансфекції середовище видаляли, клітини відмивали і інкубували в свіжому середовищі з або без 5мМ б-ДФМО на протязі 24 год. Активність в-галактозидази визначали згідно протоколу виробника (Invitrogen, USA).

Клінічний матеріал. Зразки пухлин грудної залози та пухлин шлунково-кишкового тракту було отримано у відділеннях пухлин молочної залози та абдомінальної онкології Інституту онкології АМН України. Всі хворі були проінформовані про дослідження і дали згоду на їх проведення.

Досліджено післяопераційний матеріал 52 хворих з пухлинами грудної залози: 36 хворих на рак грудної залози (у 26 хворих була встановлена ІІ-а стадія захворювання; у 10 - ІІІ-я стадія), 9 хворих на фіброаденоми та 7?на локалізований вузловий фіброаденоматоз. Досліджено післяопераційний матеріал 95 хворих з пухлинами шлунково-кишкового тракту: 36 хворих з пухлинами шлунка (ІІІ стадія ?30 чол., IV стадія ?6 чол); 25 хворих з пухлинами ободової кишки (ІІІ стадія ?18 чол., IV стадія ?7 чол.); 34 хворих - з пухлинами прямої кишки (ІІІ стадія ?20 чол., IV стадія ?14 чол.). За гістологічними ознаками пухлини шлунково-кишкового тракту віднесені до аденокарцином. За ступенем диференціювання аденокарциноми були розділені на високо-, помірно- і малодиференційовані.

Для визначення біохімічних показників зразки операційного матеріалу швидко заморожували у рідкому азоті. У зразках пухлинної тканини, тканини, що межує з пухлиною та макроскопічно незміненій тканині визначали активність ОДК, ДАО та вміст ПА.

Дослідження щодо інформативності ПА-тесту як маркера ефективності лікування хворих і прогнозу перебігу злоякісного процесу було проведено на зразках крові і сечі 158 хворих з пухлинами грудної залози (118 хворих на рак грудної залози і 40 ? з доброякісними пухлинами грудної залози), 140 хворих на рак яєчника і 167 хворих на лімфоми. В якості контролю досліджено екскрецію ПА з сечею та їх концентрацію у сироватці крові практично здорових людей (90 чол.). Обстежені хворі знаходились на лікуванні у відділеннях пухлин молочної залози, онкогінекології та відділенні системних захворювань Інституту онкології АМН України. Всі хворі були проінформовані про дослідження і дали згоду на їх проведення.

Екскрецію поліамінів (вміст ПА у сечі за добу) та їх концентрацію у сироватці крові визначали у хворих до, під час і після лікування (хіміотерапії чи після хірургічного видалення пухлин), при профілактичних обстеженнях, при появі рецидиву захворювання.

Визначення вмісту поліамінів в гомогенатах пухлин та нормальних тканин, субклітинних фракціях, ядерних і клітинних екстрактах пухлин і сироватці крові виконано за допомогою методів тонкошарової хроматографії (Abdel-Monem, Ohno, 1975) та високоефективної рідинної хроматографії високого тиску (Seiler, Knodgen, 1980), в сечі ? методами хроматографії на папері (Raina, 1967) та тонкошарової хроматографії (Abdel-Monem, Ohno, 1975). В якості стандартів використовували гідрохлориди ПА: спермін 4НCl; спермідин 3НCl; путресцин 2НCl ("Serva", USA).

Визначення активності ОДК в зразках експериментальних пухлин (субклітинних фракціях, ядерних і клітинних екстрактах) та післяопераційних зразках пухлин і макроскопічно незмінених тканин людини проводили радіометричним методом (Russell, Snyder, 1968) та методом Сяткіна С. П., Березова Т.Т. (1980); активність ДАО визначали за методом Aarsen, Kemp (1964). Активність ферментів виражали у одиницях активності на 1 мг білка.

Вміст білка в досліджуваних зразках визначали за допомогою методів Braddford (1976) та Greenberg і Craddock (1982).

Для статистичної обробки результатів дослідження використано методи варіаційної статистики (Лакін, 1990) та непараметричні методи оцінки (Гублер, Генкин, 1973).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження показників обміну ПА при хімічному канцерогенезі у щурів. Дослідження виконані на 2 моделях канцерогенезу: N-НДЕА-гепатоканцерогенезі та канцерогенезі кишковика, індукованого 1,2-ДМГ. При гепатоканцерогенезі вміст поліамінів визначали в гомогенатах печінки, цитозолі та субклітинних фракціях, ядрах та плазматичних мембранах, активність ОДК - в цитозолі та ядрах.

Найбільш виражені зміни вмісту ПА і активності ОДК в печінці спостерігались в ранній період канцерогенезу (протягом І-го місяця) і в індукованих N-НДЕА пухлинах печінки. Так, у цитозольній фракції клітин печінки вже через І тиждень виявлено зростання активності ОДК, максимальних значень активність ОДК досягала через 2 тижні, надалі цей показник знижувався, але залишався вищим, ніж в контролі (табл.1).

Таблиця 1. Активність ОДК (нмоль путресцину/мг білка за год) і вміст ПА (нмоль/мг білка) у цитозолі печінки щурів в ранній період N-НДЕА-гепатоканцерогенезу, (М m)

Примітка: *P < 0,05 порівняно з показниками у контрольних тварин; n = 5-8.

Протягом перших 2-х тижнів в цитозольній фракції значно зростав також вміст спермідину і путресцину. На 3-4-му тижні їх вміст знижувався, хоча і перевищував (за виключенням сперміну) відповідні величини в контролі.

Особливо високих значень активність ОДК досягала у ядерній фракції ? вже через І тиждень цей показник в 11?12 разів перевищував середні величини в нормі. Одночасно у ядерній фракції відбувалось зростання вмісту ПА (10-кратно збільшувався вміст путресцину, 5-кратно ? спермідину, і дещо менше, у 1,5 рази, сперміну (табл.2). На 4-му тижні ці показники знижувалися, але перевищували величини у контрольних тварин.

Таблиця 2. Активність ОДК (нмоль путресцину/10⁹ядер за год) і вміст ПА (нмоль/10⁹ядер) у ядерній фракції клітин печінки щурів в ранній період N-НДЕА-гепатоканцерогенезу та сформованих гепатом, (М m)

Примітка: *P < 0,05 порівняно з показниками у контрольних тварин; n = 5-8.

В ранній період гепатоканцерогенезу виявлено значне збільшення вмісту ПА і у фракції плазматичних мембран клітин печінки ? на 2-й тиждень гепатоканцерогенезу рівень путресцину у 8, а спермідину у 10 разів перевищував значення у контролі. Через І місяць ці показники знижувались, але рівень спермідину залишався в 2 рази вищим ніж у контролі. Як відомо, у ранній період канцерогенезу особливого значення набувають зміни, що реєструються в плазматичних мембранах клітин. Оскільки ПА виконують роль структурних компонентів мембран, впливають на в'язкість та проникність мембран, беруть участь у регуляції активності мембранозв'язаних ферментів, таке значне зростання їх вмісту в плазматичних мембранах в гостротоксичну фазу канцерогенезу в ПМ може мати істотне значення для ініціації трансформації клітин під впливом канцерогену.

Протягом подальшого періоду гепатоканцерогенезу (2-3 місяці) активність ОДК і вміст ПА в клітинах печінки знижувались і наближались до значень у контрольних тварин (табл.3).

Таблиця 3. Активність ОДК (нмоль путресцину/мг білка за год) і вміст поліамінів (нмоль/мг білка) в цитозольній фракції клітин печінки щурів в процесі N-НДЕА-гепатоканце-рогенезу та в цитозольній фракції клітин сформованих гепатом (М m)

Примітка: *P < 0,05? порівняно з показниками у контрольних тварин; n =5-8.

Проте через 4 місяці, і, особливо в період формування гепатом (через 5 місяців), в клітинах печінки спостерігалась друга фаза підвищення активності ОДК і збільшення вмісту ПА. Таке ж підвищення спостерігали і в індукованих гепатомах: так, активність ОДК і загальний вміст ПА в цитозольній фракції клітин гепатоми в 2 рази перевищував ці показники в цитозольній фракції клітин печінки контрольних тварин. При цьому кількість путресцину більш ніж в 3 рази перевищувала контрольні величини, спермідину ? вдвічі, кількість сперміну також була збільшена (див. табл.3).

Значні зміни ОДК і вмісту ПА виявлені і в ядерній фракції та фракції плазматичних мембран клітин гепатоми: активність ОДК в ядерній фракції в 14 разів перевищувала контрольні значення (4,321,14 нмоль путресцину/мг білка за год проти 0,300,18 нмоль путресцину/мг білка за год); вміст ПА також значно збільшений. Рівень путресцину в 5 разів (14,01,85 нмоль/мг білка проти 2,800,40 нмоль/мг білка), а спермідину в 2 рази вищий (11,4 1,43 нмоль/мг білка проти 5,60 0,25 нмоль/мг білка) ніж в ядерній фракції клітин печінки інтактних щурів. У фракції плазматичних мембран гепатом виявлено 2-разове збільшення вмісту путресцину і спермідину порівняно з показниками у контрольних тварин.

На іншій моделі хімічного канцерогенезу, канцерогенезі кишковика, індукованого 1,2-ДМГ, в слизовій оболонці кишковика щурів через місяць після початку введення канцерогену також виявлено значне зростання активності ОДК в порівнянні з величиною цього показника у контрольних тварин: 12-разове ? в тонкому кишковику і 10-разове в товстому (рис. 1).

Рис. 1. Активність ОДК в слизовій оболонці кишковика щурів в процесі канцерогенезу, індукованого 1,2-ДМГ.

В подальшому (через 2 місяці) активність ферменту падала, а потім поступово знову зростала, і досягала максимальних значень в сформованих пухлинах. При аналізі складу ПА в слизовій оболонці тонкого кишковика в процесі канцерогенезу встановлено, що концентрація путресцину і спермідину, а також сумарний вміст ПА протягом всього досліджуваного періоду достовірно вищий за норму. Вміст сперміну, за винятком 3-го місяця, навпаки, знижений, що вказує на розвиток процесу дисдиференціювання тканини. В слизовій оболонці товстого кишковика концентрація путресцину вища за норму тільки на 1-му і 5-му місяцях канцерогенезу. У пухлинній тканині загальна кількість ПА підвищена в порівнянні з нормою в середньому в 1,8 рази, що пов'язано із збільшенням всіх фракцій ПА і, особливо, путресцину. Виявлено також, що активність фермента катаболізму ПА ? диаміноксидази (ДАО) в пухлинах кишковика в середньому в 9 разів нижча, ніж в слизовій оболонці контрольних тварин. Це свідчить, що підвищення вмісту ПА в пухлинній тканині пов'язано не тільки з активацією їх синтезу, але і з ослабленням катаболізму.

Таким чином, дослідження вмісту ПА і активності ферментів їх обміну при канцерогенезі кишковика показали, що динаміка змін досліджуваних показників аналогічна змінам, які спостерігаються при гепатоканцерогенезі. Як при НДЕА-індукованому канцерогенезі печінки, так і при 1,2-ДМГ-індукованому канцерогенезі кишковика спостерігалась двофазна активація біосинтезу ПА (в ранню стадію ? протягом 1-го місяця та пізню стадію, в період формування пухлин), що проявлялось в підвищенні активності ОДК, зниженні активності ДАО і збільшенні внутріклітинного вмісту ПА. Накопичення ПА в тканинах-мішенях на ранній стадії канцерогенезу, з одного боку, може бути пов'язане із захисно-компенсаторними процесами, і активація синтезу ПА може бути направлена на відновлення порушеної структури і функцій клітин, що розвинулися внаслідок токсичного пошкодження їх канцерогеном, З іншого боку, активація біосинтезу і накопичення біологічно-активних ПА на ранній стадії канцерогенезу в таких клітинних структурах як плазматичні мембрани і ядра клітин, може призводити до активації різних сигнальних шляхів, залучених до регуляції експресії онкогенів, що беруть участь в ініціації неопластичного процесу. Накопичення ПА в пізній фазі пов'язане з підвищеною проліферативною активністю і неконтрольованим ростом трансформованих клітин.

Наступним завданням роботи було дослідити показники обміну ПА в пухлинах та макроскопічно незміненій слизовій оболонці різних відділів шлунково-кишкового тракту людини і співставити результати біохімічних досліджень з клінічними та морфологічними даними.

Дослідження показали, що активність ОДК в пухлинах шлунку в середньому в 4,8 рази вища, ніж в макроскопічно незміненій слизовій оболонці, і в 3,2 рази вища, ніж в слизовій оболонці на межі з пухлиною (табл.4). Загальний вміст ПА в пухлинах шлунку підвищений порівняно з макроскопічно незміненою слизовою оболонкою в середньому в 1,6 рази. В пухлинній тканині змінювалось також і кількісне співвідношення окремих ПА, що призводило до підвищення величини молярного співвідношення спермідин/спермін з 1,920,10 до 2,59 0,20 (Р<0,01), яке свідчить про інтенсифікацію проліферативних процесів.

Таблиця 4. Активність ОДК (пмоль ¹⁴СО ₂/мг білка за год) в слизовій оболонці і пухлинах шлунка людини, (М m)

Примітка: *P<0,05 - між (1) та (2); *P < 0,001-між (2) та (3); *P < 0,001-між (1)та (3).

При прогресуванні захворювання активність ОДК і вміст ПА збільшувались як в пухлині, так і в прилеглій до неї слизовій оболонці і навіть в макроскопічно незміненій тканині шлунку.

Виявлено чітку (r=0,9; Р<0,001) обернену залежність між величиною активності ОДК і ступенем диференціювання пухлин (рис. 2).

Рис. 2. Активність ОДК в макроскопічно незміненій слизовій оболонці, слизовій оболонці на межі з пухлиною та в аденокарциномах шлунку людини різного ступеня диференціювання.

При дослідженні показників обміну ПА у пухлинах товстого кишковика людини нами виявлена аналогічна направленність їх змін: значне збільшення активності ОДК (в середньому в 5 разів) і підвищення вмісту ПА (в 1,6-2 рази) в порівнянні з цими показниками в неураженій слизовій оболонці. Найбільш суттєво змінювався вміст путресцину, дещо менше ? спермідину. Вміст сперміну практично не змінювався, що призводило до підвищення величини молярного співвідношення путресцин/спермідин і спермідин/спермін, Рівень активності ОДК в макроскопічно незміненій слизовій оболонці товстого кишковика у хворих з пухлинами цих локалізацій зростав з прогресуванням захворювання. Як і в аденокарциномах шлунку, в аденокарциномах товстого кишковика виявлено обернену залежність між величиною активності ОДК в аденокарциномах і ступенем їх диференціювання. Аналіз результатів щодо активності ОДК та вмісту ПА, одержаних при хімічному канцерогенезі кишковика щурів і в пухлинах шлунково-кишкового тракту людини показав, що підвищення активності ОДК і збільшення вмісту ПА є характерною рисою процесу малігнізації в органах шлунково-кишкового тракту.

Показники обміну ПА в пухлинах грудної залози людини. Виявлено, що рівень активності ОДК в тканині злоякісних пухлин грудної залози в 5,5 рази вищий порівняно з таким у макроскопічно незміненій тканині грудної залози і в 2 рази вищий порівняно з тканиною, що межує з пухлиною. В доброякісних пухлинах грудної залози активність ОДК значно нижча (в 3,7 рази), ніж у злоякісних пухлинах, але вища, ніж в макроскопічно незміненій тканині. Вміст ПА в злоякісних пухлинах в декілька разів перевищував такий у макроскопічно незміненій тканині і значно вищий, ніж в прилеглій до пухлини тканині (табл.5).

Таблиця 5. Активність ОДК (пмоль путресцину/мг білка за год) і вміст ПА (нмоль/мг білка) у макроскопічно незміненій тканині грудної залози (а), тканині, прилеглій до пухлини (б), пухлинах (в) грудної залози людини, (Мm)

Примітка: Р 0,05 ? порівняно з відповідними показниками в макроскопічно незміненій тканині грудної залози.

Концентрація путресцину і сперміну в доброякісних пухлинах дещо вища, ніж в макроскопічно незміненій тканині, але як сумарна концентрація ПА, так і вміст їх окремих фракцій значно менші від такого в злоякісних пухлинах. Аналіз рівнів активності ОДК в пухлинах в залежності від стадії захворювання (II і III стадія) виявив лише тенденцію до підвищення активності ОДК при поширенні пухлинного процесу (табл.6).

Таблиця 6. Активність ОДК (пмоль путресцину/мг білка за год) і вміст ПА (нмоль/мг білка) у макроскопічно незміненій тканині (а), тканині, прилеглій до пухлини (б), злоякісних пухлинах(в) грудної залози людини залежно від клінічної стадії, (Мm)

Примітка: *Р<0,01 - порівняно з макроскопічно незміненою тканиною.

Таким чином, проведені дослідження виявили значне підвищення активності ОДК і вмісту поліамінів в злоякісних пухлинах шлунково-кишкового тракту і грудної залози людини. Ці дані можуть служити науковим підґрунтям для розробки нових хіміотерапевтичних підходів до лікування злоякісних пухлин цих локалізацій з залученням інгібіторів біосинтезу ПА та їх аналогів.

Наступною задачею було дослідити вміст ПА в біологічних рідинах (сечі та сироватці крові) хворих на злоякісні пухлини і проаналізувати можливість застосування ПА-тесту для оцінки ефективності терапії і прогнозу перебігу пухлинного процесу.

ПА в біологічних рідинах у хворих на злоякісні лімфоми (ЗЛ). Виявлено, що у 82 % хворих на неходжкинські лімфоми рівень екскреції ПА з сечею та концентрація їх у сироватці крові в кілька разів перевищував ці показники у практично здорових людей і становив, відповідно: 32,07±2,94 мг/добу і 8,97±0,74 мкг/мл. Збільшення вмісту ПА в сечі, в основному, відбувалось за рахунок спермідину і путресцину, в крові ? за рахунок спермідину. У практично здорових людей добова екскреція ПА в сумі складала 7?8 мг, а концентрація ПА в сироватці крові ? від 0,1 до 3,0 мкг/мл. У хворих на лімфогрануломатоз (ЛГМ) встановлено значне, порівняно з нормою, підвищення екскреції ПА з сечею (табл. 7) та їх концентрації у сироватці крові. Кореляції між рівнями ПА в добовій сечі і сироватці крові та клінічною стадією злоякісного процесу не виявлено. Найвищі рівні ПА в сечі спостерігали при II Б, IV А і IV Б стадії.

Таблиця 7. Екскреція поліамінів з сечею (мг за добу) у хворих лімфогрануломатозом в залежності від стадії захворювання при активному процесі, (M ±m)

Примітка: *? ПА ? сумарна кількість поліамінів в сечі за добу.

При ефективному лікуванні кількість ПА в сечі і сироватці крові у хворих на злоякісні лімфоми в перші дні лікування зростала (що, згідно сучасних поглядів, свідчить про загибель пухлинних клітин і виділення з них ПА), а потім істотно знижувалась. Якщо лікування було неефективним, зберігався початковий (виявлений до лікування) рівень ПА. Встановлено, що у більшості хворих на злоякісні лімфоми в стані ремісії вміст ПА в сечі і сироватці крові був суттєво знижений, а при рецидиві захворювання ? підвищений. Отримані дані підтверджують доцільність використання показників вмісту ПА в біологічних рідинах для оцінки ефективності лікування і прогнозу захворювання у хворих на злоякісні лімфоми.

ПА в біологічних рідинах у хворих на пухлини яєчника. Встановлено, що сумарна кількість ПА в сечі за добу (?ПА) у хворих на рак яєчника в 3,2 рази вища, в порівнянні з показниками у практично здорових жінок (?ПА=20,521,62 і 6,480,53 мг/добу, відповідно). Найвищу кількість ПА в сечі виявлено у хворих на первинно множинний рак яєчника (?ПА=26,723,54 мг/добу). У тих випадках, коли перебіг захворювання ускладнювався накопиченням асцитної рідини, показники екскреції ПА з сечею у таких хворих були невисокі (?ПА=11,34 0,83 мг/добу). Об'єм сечі за добу у цих хворих складав 200-350 мл, а об'єм асцитної рідини ? 2-6 л. Аналіз зразків асцитної рідини показав, що концентрація ПА в ній висока. Так, концентрація спермідину в окремих випадках досягала 8,7 мкг/мл, що свідчить про гіперпродукцію ПА і накопичення їх в асцитній рідині. Окрім цього, відмінності у концентрації спермідину в сироватці крові у хворих на рак яєчника з асцитом і без нього були незначні. Це свідчить про те, що в тих випадках, коли перебіг захворювання супроводжується накопиченням асцитної рідини, концентрація спермідину в сироватці крові несе більш об'єктивну інформацію ніж вміст ПА у сечі.

Встановлено, що у хворих на рак яєчника, як і у хворих на злоякісні лімфоми екскреція ПА з сечею та концентрація їх у крові корелюють з ефективністю лікування. При ефективній хіміотерапії, в перші 48?72 години після її початку спостерігали значне збільшення екскреції ПА з сечею та концентрації їх у крові (що свідчить про загибель пухлинних клітин і виділення з них ПА), надалі ці показники знижувались. При відсутності ефекту лікування екскреція ПА з сечею та їх концентрація в сироватці крові в ці терміни не знижувались, а, навпаки, підвищувались. Збереження початкового рівня ПА або його зниження в цей період указує на те, що пухлина нечутлива до хіміопрепарата. Виявлено, що більш інформативним для оцінки ефективності лікування є величина співвідношення спд₂/пут_2, спд₁/пут_1, де спд₁ і пут₁ ? рівні спермідину і путресцину в сечі до лікування; спд₂ і пут₂ ? через 48 годин після початку лікування. При успішній терапії величина цього співвідношення (індексу) вища за 1,25; а при неефективній - нижча (рис. 3). При обстеженні хворих на рак яєчника в процесі лікування виявлено пряму залежність між величиною цього індексу і клінічною оцінкою стану хворих: у 78 % випадків встановлена повна відповідність між передбачуваним (на підставі величини даного індексу) результатом лікування і клінічною оцінкою ефективності проведеного курсу лікування. Результати дослідження вмісту ПА в сечі хворих на протязі 1?4 років показали, що зміни в екскреції ПА корелюють з перебігом пухлинного процесу: при ремісії вміст ПА в сечі хворих на рак яєчника значно нижчий, ніж при прогресуванні, рецидиві або генералізації процесу.