Лектини в медико-біологічних та фітохімічних дослідженнях: сировинна база, отримання, властивості та аспекти практичного використання

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО

АНТОНЮК ВОЛОДИМИР ОЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК: 615.32 : 547.96 /.011.012 : 578.08/.088

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора фармацевтичних наук

ЛЕКТИНИ У МЕДИКО-БІОЛОГІЧНИХ ТА ФІТОХІМІЧНИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ: СИРОВИННА БАЗА, ОТРИМАННЯ, ВЛАСТИВОСТІ ТА АСПЕКТИ ПРАКТИЧНОГО ВИКОРИСТАННЯ

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

Львів - 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології клітини НАН України та Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор ЛУЦИК Максим Дмитрович, провідний науковий співробітник інституту біології клітини НАН України.

Офіційні опоненти:

доктор фармацевтичних наук, професор ГРИЦЕНКО Олена Миколаївна Національна медична академія післядипломної освіти ім. П. Л. Шупика, професор кафедри фармацевтичної хімії і фармакогнозії;

доктор фармацевтичних наук, професор КИСЛИЧЕНКО Вікторія Сергіївна Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри хімії природних сполук;

доктор медичних наук, професор ЛОГІНСЬКИЙ Володимир Євстаxович Інститут патології крові та трансфузійної медицини АМН України, завідувач лабораторії імуноцитології та генетики пухлин крові.

Провідна установа: Державний науковий центр лікарських засобів (м. Харків).

Захист дисертації відбудеться “25” травня 2007 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.600.02 при Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 69.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (79000 м. Львів, вул. Січових стрільців, 17).

Автореферат розісланий 24.04.2007 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 35.600.02 Гасюк Г.Д.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з найважливіших завдань фармацевтичної науки і практики є пошук та створення засобів для діагностики і лікування різноманітних захворювань людини. Сьогодні особливо актуальною є діагностика та лікування онкологічних, імунних та аутоімунних захворювань, пошук методів, які можуть дозволити здійснення приживлення пересаджених органів та тканин.

Наукові відкриття останніх десятиріч засвідчили, що вирішення цих завдань неможливе без глибокого вивчення механізмів міжклітинного та внутрішньоклітинного розпізнавання “свого” і “чужого” та свідомого і цілеспрямованого впливу на ці процеси. Отримані експериментальні дані все більше переконують в тому, що вуглеводні ланцюги зберігають і передають інформацію, подібно до нуклеїнових кислот та пептидних послідовностей. Потенціал вуглеводного коду набагато переважає за своїми можливостями інші біохімічні кодові системи, в тому числі і генетичний код. Зважаючи на те, що модифікації вуглеводів (введення сульфо-, фосфо- та ацетильних груп) значно збільшують множину можливих олігомерів, які беруть участь в процесах розпізнавання, стає зрозумілою вирішальна роль вуглеводної частини глікокон'югатів у функціональній організації тканин і систем організму. Глікокод клітин живих організмів, навіть в межах одного виду, є індивідуальним і неповторним і дуже точно розпізнається специфічними рецепторними молекулами, які трансформують інформацію, записану на вуглеводах, в біологічні ефекти. Вуглеводозв'язуючі білки, що не є ферментами або імуноглобулінами, названі “лектинами” є основними розпізнавальними молекулами в цих процесах і відіграють дуже важливу роль в імунологічних реакціях [Gabius, 1997]. Тому розуміння молекулярних механізмів функціонування імунної системи організму, а також патологічних змін при її порушеннях, неможливе без глибокого вивчення ендогенних лектинів.

В той же час ендогенні лектини людини і ссавців є важкодоступними для досліджень. Незважаючи на їх бурхливе дослідження в останнє десятиріччя, лектини рослин і грибів залишаються, і ще довго будуть основними інструментами медико-біологічних досліджень, тим більше, що не виявлено суттєвих відмінностей у їхній структурі. Лектини рослин у багатьох відношеннях можуть моделювати функцію ендогенних лектинів ссавців, але є значно дешевшими і доступнішими. Крім того, значну кількість лектинів використовує гісто- і цитохімія, медична мікробіологія, аналітична біохімія та лабораторна клінічна діагностика. Для організації і проведення досліджень у вказаних галузях необхідні лектини з різноманітними властивостями, перш за все з добре дослідженою тонкою вуглеводною специфічністю. Тому пошук нових лектинів, отримання та вивчення їх властивостей досі залишається актуальним завданням.

Дослідження та застосування лектинів в Україні, започатковане в середині 70-х років, сьогодні продовжується в цілому ряді науково-дослідних та учбових закладів медичного і біологічного профілю. Сильна біологічна активність ряду лектинів, зокрема селективна токсичність, протипухлинна, антивірусна та імуностимулююча дія, а також можливість використання лектинів для цілеспрямованої доставки лікарських засобів до тканин і клітин організму або для вилучення патологічно змінених глікопротеїнів з кровообігу є експериментальним підгрунтям у створенні лікарських засобів нового покоління. У зв'язку з цим лектинами все більше цікавляться науковці фармацевтичного профілю та фармацевтичні фірми розвинутих країн світу.

Тому дослідження сировинної бази лектинів, методи одержання чистих препаратів та дослідження різноманітних аспектів їх біологічної дії та застосування є сьогодні актуальною проблемою.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у рамках планових наукових тем Інституту біології клітини НАН України:

“Дослідження впливу цитотоксичних білків і лектинів на пухлинні та імунокомпетентні клітини”, № держреєстрації 01.00U000080; “Дослідження впливу цитотоксичних білків і лектинів на пухлинні та імунокомпетентні клітини”, № держреєстрації 01.03U001404; “Дослідження процесів, що відбуваються під час апоптозу, індукованого антинеопластичними препаратами з різним механізмом дії” № держреєстрації 01.06U002599, та кафедри гістології, цитології, ембріології Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького “Лектинові маркери та цитоплазматичні сигнальні молекули у процесі клітинної диференціації”, № держреєстрації 0102U007224, шифр теми ІН 07.00.0001.02.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є аналіз вітчизняної сировинної бази для одержання лектинів, виявлення перспективних напрямків у пошуку нових лектинів різної вуглеводної специфічності, очищення нових лектинів, вивення їх фізико-хімічних властивостей, вуглеводної специфічності та аспектів їх використання у фітохімічних і медико-біологічних дослідженнях.

Для реалізації поставленої мети визначено такі завдання:

- Виявити перспективні сировинні джерела для одержання нових лектинів різної вуглеводної специфічності, перш за все, рідкісної, зокрема L-фукозоспецифічних лектинів та сіалоспецифічних, а також D-манозоспецифічних, D-галактозоспецифічних, N-ацетил-D-глюкозамін- та N-ацетил-D-галактозамінспецифічних лектинів.

- Розробити методики і технологію очищення нових лектинів та інших цінних речовин в одному технологічному циклі та одержати лектини в препаративних кількостях.

- Охарактеризувати основні фізико-хімічні та деякі імунохімічні властивості одержаних лектинів.

- Отримати похідні лектинів для гісто- і цитохімічних досліджень, а саме: кон'югати лектинів з пероксидазою, флюорохромом (ФІТЦ), колоїдним золотом.

- Розробити методи синтезу біоспецифічних сорбентів шляхом іммобілізації лектинів на нерозчинних носіях.

- Вивчити токсичність лектинів на пухлинних клітинах різних ліній та нижчих тваринах (жуках і нематодах).

- Застосувати лектини при дослідженні апоптозу, вивченні резистентності пухлинних клітин до протипухлинних препаратів та в гістохімічних дослідженнях.

- Використати одержані нативні, кон'юговані та іммобілізовані лектини у дослідженні глікопротеїнів, полісахаридів та глікозидів.

Об'єкти дослідження - рослинні джерела лектинів: кореневище купини Polygonatum multiflorum (L.) All. та P. verticillatum (L.) All. , Paris quadrifolia L., кора та насіння Laburnum anagyroides Medik., кори Caragana arborescens Lam., Sarothamnus scoparius (L.) Koch., Robinia pseudoacacia L., насіння Amaranthus caudatus L., A. retroflexus L., Aesculus hippocastanum L., надземна частина Galanthus nivalis L., Leucoum vernum L., Hieracium aurantiacum L., H. pilosella L., H sylvularum Jord ex Boreau, Equisetum arvense L., Echinacea purpurea (L.) Moench.) та Rudbeckia laciniata L.;

- грибні джерела лектинів: плодові тіла Aleuria aurantia (Fr.) Tekl, Peziza badia Merat, P. verticulosa St. Am., Boletus luridus Fr., Amanita phalloides (Vaill. Fr.) Secr., Sarcoscypha coccinea (Fr.) Lambette, Clitocybe nebularis (Fr.) Kumm.;

- джерела лектинів з ікри риб: Perсa fluviatilis L. та Lucioperca lucioperca /L./;

- лектини, одержані з вказаних вище джерел;

- гісто- та цитологічні препарати нормальних та трансформованих тканин і клітин, клітини лейкемії миші ліній L929, L1210, MCF-7 (wt), MCF-7 (OOX/R).

Предмет дослідження - виявлення перспективних сировинних джерел для одержання лектинів та розробка методик їх очищення та комплексного використання; дослідження основних фізико-хімічних характеристик одержаних лектинів, їх вуглеводної специфічності та токсичності; застосування одержаних лектинів у фітохімічних, гістохімічних та фізіологічних дослідженнях.

Методи досліджень. Імунохімічні методи (реакція гемаглютинації і преципітації та реакції їх пригнічення за допомогою специфічних антигенів або гаптенів) використовувалися для виявлення лектинів та дослідження їх вуглеводної специфічності; методи препаративної хімії білків (екстракція, осадження, діаліз, центрифугування, афінна, іонообмінна та гель-хроматографія, ліофільне висушування) - для очистки лектинів з сировини; аналітичні (виявлення та кількісне визначення білків і вуглеводів, електрофорез та диск-електрофорез в ПААГ, УФ-спектроскопія, хроматографія на папері - для аналізу чистоти та дослідження фізико-хімічних властивостей одержаних лектинів та глікозидів; синтетичні - для одержання афінних сорбентів, іммобілізованих лектинів та кон'югатів лектинів з пероксидазою; гісто- та цитохімічні (виготовлення та фарбування препаратів клітин і тканин міченими лектинами) - для виявлення локалізації лектинових рецепторів на поверхні клітин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні та у світовій практиці систематизовано з фармакогностичної точки зору відомості про сировинні джерела для одержання лектинів, їх вуглеводну специфічність і біологічні властивості, що викладено в монографії “Лектини та їх сировинні джерела”. Аналіз даних літератури та власних одержаних результатів дозволив зробити прогнози щодо подальшого пошуку нових сировинних джерел лектинів, важливої в практичному плані вуглеводної специфічності. Зокрема, зроблені припущення щодо наявності L-фукозоспецифічних лектинів у грибів порядку пецицієвих підтвердились наступним знаходженням такого типу лектинів у плодових тілах пецици каштанової, пецици пухирчастої та пецици фіолетової, а припущення щодо наявності подібних лектинів у ікрі риб родини окуневих підтвердились знаходженням такого лектину у ікрі судака звичайного. Нами вперше одержані лектини з цих сировинних джерел, а також з кореневищ купини багатоквіткової та кільчастої, воронячого ока звичайного, кори карагани деревоподібної, насіння кінського каштану, насіння щириці хвостатої, трьох видів нечуй-вітрів, гриба - дубовика оливково-бурого, саркосцифи яскраво-червоної, а також вивчені їх фізико-хімічні та імунобіологічні властивості. Спосіб одержання манозоспецифічних лектинів, захищений деклараційним патентом України, дозволяє одержати лектини рослин амарилісових та лілійних із вищою чистотою та функціональною активністю. Вперше розроблено і застосовано ряд біоспецифічних сорбентів для очищення лектинів із рослинної, грибної та тваринної сировини. Вдосконалено або запропоновано нові оригінальні методи очистки лектинів з кори робінії несправжньої, із зародків пшениці, плодових тіл алеврії оранжевої, блідої поганки, насіння гороху, вики, сочевиці, кінських бобів, насіння золотого дощу звичайного тощо. Вдосконалено метод кон'югації лектинів із пероксидазою хрону та іммобілізації лектинів на агарозі. Запропоновано метод ідентифікації антибіотика-глікозиду ристоміцину сульфату за допомогою лектинів мишиного горошку, досліджено взаємодію ристоміцину сульфату з лектинами та очищено лектин із насіння гледичії колючої, який може бути родоначальником нової підгрупи глюкозоспецифічних лектинів.

Вперше показана можливість використання лектинів в аналізі диглікозидів, що може знайти застосування у фітохімічному аналізі.

Також вперше досліджено сезонні зміни активності лектинів у дерев'янистих та трав'янистих рослин і розроблено рекомендації зі збору та заготівлі лектиновмісної рослинної сировини.

Спільно з співробітниками кафедри гістології ЛНМУ імені Данила Галицького досліджено гістохімічну специфічність ряду нових, вперше одержаних нами лектинів, та запропоновано деякі з них у якості гістохімічних маркерів ряду клітин і тканин.

Разом з співробітниками Інституту біології клітини НАН України досліджена токсичність деяких лектинів на клітини низки пухлинних ліній у культурі клітин та можливість використання лектинів як маркерів ранніх стадій апоптозу.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати дозволили організувати виготовлення лектинів та їх похідних (мічених пероксидазою, ФІТЦом, колоїдним золотом, іммобілізованих на агарозі) протягом 1990 - 2007 років у НВК “Лектинотест” і надати можливість їхнього використання в багатьох лабораторіях України та за її межами. Розроблені нами афінні сорбенти для очистки лектинів дають можливість здійснювати очистку нових лектинів різноманітної вуглеводної специфічності. Виявлені нами сезонні зміни активності лектинів в дерев'янистих та трав'янистих рослинах мають загальний характер і дозволяють пропонувати ряд практичних рекомендацій зі збору й пошуку рослинної сировини, яка містить лектини. Нові лектини, вперше одержані нами, знайшли застосування в дослідженні кристаллінів кришталиків експериментальних тварин у НДІ фізико-хімічної медицини МОЗ РСФСР, м. Москва (акт про впровадження від 16.02.1987 р.), при виконанні планової наукової тематики відділу генетики людини Інституту біології та генетики НАН України (м. Київ) (акт про впроваження від 2.02. 2007 р.), гістохімічних та цитохімічних дослідженнях в багатьох наукових, а також клініко-діагностичних лабораторіях України. Зокрема, в Інституті патології крові та трансфузійної медицини АМН України мічені пероксидазою лектини знайшли застосування у диференційній діагностиці різний варіантів гострих лейкемій та лімфоїдних неоплазій (акт про впровадження від 22.01.2007 р.). У лабораторії нейроімунології Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова (м. Київ) L-фукозоспецифічні та мічені пероксидазою лектини знайшли застосування для діагностики ряду нервових захворювань(акти про впровадження від 20.12.2006 р.). На кафедрі нормальної анатомії Запорізького медичного університету їх застосовують для виявлення імунологічно незрілих лімфоцитів та дендритних клітин (акт про впровадження від 30.01.2007 р.). Для потреб судово-медичної експертизи розроблений реагент на основі лектину горошку волохатого, придатний для ідентифікації антигену А як у нативних еритроцитах (визначення групи крові), так і в слідах секреторних виділень людини та в біологічному матеріалі. Афінні сорбенти з іммобілізованими лектинами були використані для сорбції глікопротеїдів з сироватки та плазми крові у НДІ гематології і переливання крові (акти про впровадження від 27.01. 1987 р.).

Лектини, мічені пероксидазою були основним інструментом досліджень при виконанні докторських дисертацій А.М. Ященко (м. Львів), О.Ю. Шаповалової (м. Сімферополь) та цілої низки кандидатських дисертацій.

При фарбуванні гістологічних препаратів, фотографії яких наведені в підручнику Луцик О. Д. і співавт. “Гістологія людини”.- Київ : Книга плюс, 2003, який рекомендований Міністерством охорони здоров'я для студентів вищих медичних навчальних закладів ІІІ - ІV рівнів акредитації, було використано лектини, мічені пероксидазою, виготовлені здобувачем.

Наукова розробка з використанням ряду лектинів використовується з 1998 року при виконанні курсових і дипломних робіт на кафедрі біофізики Білоруського університету (м. Мінськ) (акт про впровадження від 22.02.2007 р.).

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійно виконаною роботою автора, у якій дисертант зібрав та проаналізував наукову літературу і патентну інформацію, сформулював мету й задачі дослідження. Здобувач здійснював збір рослинної та тваринної сировини для одержання лектинів, розробив методики одержання афінних сорбентів для їх очищення, застосував їх для одержання лектинів та здійснив аналіз одержаних препаратів лектинів, а також здійснив їх мічення пероксидазою хрону, колоїдним золотом, ФІТЦом та іммобілізацію на нерозчинних носіях. Здобувач самостійно застосовував також деякі цитохімічні методи при дослідженні клітин, робив аналіз та узагальнення результатів досліджень.

З наукових праць, опублікованих у співавторстві, в роботі наведені лише ті ідеї та положення, які є результатом особистих досліджень здобувача.

Апробація результатів досліджень. Результати досліджень, включені у дисертацію, були повідомлені на IV з'їзді фармацевтів УРСР (Запоріжжя, 1984); Першій республіканській конференції по медичній ботаніці (Київ, 1984), Всесоюзном совещании по сорбентам для хроматографии (Москва, 1986), VIII Всесоюзной конференции "Химия и биохимия углеводов" (Тбилиси, 1987 г); 10th International Lectin Conference (Charles University, Praque, 1988), 11th International Lectin Conference (Tartu University, Tartu, 1989), 12th International Lectin Conference (Univ. of Calif. Davis and Fallen Leaf Like, Davis, 1990); 13th International Lectin Meeting (Berlin, 1991), VI Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1992); Третій українській конференції з медичної ботаніки (Київ, 1992); 15th International Lectin Meeting (Hungary, Szeged, 1993); 17th International Lectin Meeting (Germany, Wurzburg, 1997); 18th International Lectin Meeting (Portsmouth, 1999); 20th International Lectin Meeting (Denmark, Copenhagen, 2002); на Установчому з'їзді Українського Товариства клітинної біології з міжнародним представництвом (Львів, 2004); Спільному засіданні кафедр фармацевтичної, органічної, біоорганічної хімії, гістології і ембріології ЛНМУ імені Данила Галицького та Інституту біології клітини НАН України (Львів, 2007); засіданні кафедри хімії природних речовин Національного фармацевтичного університету (Харків, 2007); Науково-практичній конф/ з міжнародною участю “Лекарства - человеку. Современные проблемы создания, исследования и апробации лекарственных средств” (НФаУ, Харків, 2007).

Публікації. Основні матеріали дисертації викладені у монографії та 71 наукових публікаціях, в тому числі в 38 наукових статтях, опублікованих у фахових та академічних виданнях рекомендованих ВАК України (19 - одноосібних), та 7 авторських свідоцтв СРСР і 1 деклараційному патенті України, 25 - у матеріалах наукових конференцій і з'їздів.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 354 сторінках, складається з переліку умовних скорочень, вступу, огляду літератури (розділ 1) та експериментальної частини, що містить шість розділів, кожен з яких закінчується висновками за результатами досліджень, загальних висновків, списку використаних джерел літератури. Обсяг основного тексту дисертації становить 309 сторінок. Додатки до дисертації оформлені у вигляді окремого тому. Список літератури включає 431 джерело. Робота ілюстрована 62 таблицями та 52 рисунками (45 сторінок тексту).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність теми, сформульовані мета і завдання дослідження, визначені об'єкти, предмет і методи дослідження, наведені наукова новизна результатів дисертаційного дослідження, їх теоретичне та практичне значення, відомості щодо їх апробації.

Матеріали і методи дослідження

З метою одержання лектинів досліджено та використано рослини переважно Прикарпатського регіону та Карпат, а також вищі гриби Карпат та ікра риб. При цьому використано різні органи рослин - насіння, кору, надземну частину (траву або листя), підземні органи (цибулини, бульби, корені, кореневища). У вищих грибів предметом досліджень були плодові тіла. Частини рослин та плодові тіла грибів використовували свіжими або висушували при температурі до +60^оС.

Виявлення лектинів здійснювали за допомогою реакції гемаглютинації або, рідше, преципітації. Реакцію пригнічення гемаглютинації і преципітації вуглеводами та глікокон'югатами використовували для визначення вуглеводної специфічності лектинів. Методика постановки цих реакцій описана нами раніше у методичних рекомендаціях.

Очищення лектинів з сировини виконували методами препаративної хімії білків (екстракція, осадження, діаліз, центрифугування, афінна, іонообмінна та гель-хроматографія, ліофільне висушування) .

Аналіз чистоти одержаних лектинових препаратів здійснювали методом диск-електрофорезу в ПААГ в кислій (рН 4,3) та лужній (рН 8,6) буферних системах. Молекулярну масу визначали гель-хроматографією на сефадексах G-75 - G-200 та тойоперлі HW-55. Молекулярну масу поліпептидних ланцюгів визначали методом електрофорезу в ПААГ з 0,1 % Ds-Na в присутності або у відсутності в-меркаптоетанолу. Визначення вмісту вуглеводів у лектинах глікопротеїнової природи у більшості випадків проводили за методом Dubois et.al. (1956).

Вимірювання концентрації білка на стадіях очищення лектину проводили спектрофотометрично, за поглинанням розчину білка при 280 нм, методом Lowry et.al. (1951) та біуретовою реакцією. Для багатьох лектинів визначались межі їх стійкості у розчинах до змін рН та температури, а також необхідність іонів металів для прояву активності.

Мічення лектинів для застосування їх в гістохімічних та цитохімічних дослідженнях здійснювали шляхом приєднання пероксидази кореня хрону, ФІТЦу, колоїдного золота. Мічення лектинів пероксидазою здійснювали за методикою Nakane і Kawaoi (1974), у яку нами були внесені вдосконалення, які полягали у розподілі лектинів на окремі підгрупи, що відрізнялися умовами проведення кон'югації.

Дослідження лектинових рецепторів на препаратах, виготовлених з ізольованих клітин, зокрема у клітинах мишачої лейкемії L-1210 проводились за допомогою фарбування лектинами, міченими пероксидазою за методикою, описаною в літературі (Цегельский и др., 1989). Нами апробована методика кріоконсервування еритроцитів різних видів тварин, яка була адаптована до умов лабораторії і використана для пошуку та дослідження нових лектинів. Вона дозволяє створити колекцію еритроцитів тварин різних, у тому числі рідкісних, видів і використовувати їх в міру потреби, що розширює можливості пошуку нових лектинів, зокрема для потреб ізосерології та судової медицини.

Аналіз сировинної бази для одержання лектинів різної вуглеводної специфічності та біологічної активності

Найважливішою функціональною характеристикою лектинів є їх вуглеводна специфічність, яка визначає подальші перспективи практичного застосування лектинів. Тому в основі аналізу сировинної бази нами покладена вуглеводна специфічність лектинів. Як показали наші дослідження та дослідження інших авторів, у флорі України “класичні” манозоспецифічні лектини бобових містяться в родах Pisum L., Lens Mill., Vicia L., Lathyrus L., Galega L., Medicago L., Onobrychis Mill., Faba Mill. В той же час в родах Phaseolus L., Genista L., Sarothamnus Wimm., Glycine Willd, Tetragonolobus Scop містяться лектини іншої вуглеводної специфічності. У родах Astragalus L., Amorpha L., Lotus L., Trigonella L., Glycyrriza L. лектини до цих пір не знайдені.

На початку 90-их років ХХ сторіччя було виявлено ще одну підгрупу манозоспецифічних лектинів, що зосереджені в амарилісових та лілійних, які відрізнялись від лектинів бобових відсутністю взаємодії з D-глюкозою та її олігосахаридами. Серед лектинів цієї підгрупи нами вперше було виявлено, очищено та досліджено лектини з кореневища купини багатоквіткової та кільчастої, а також лектин білоцвіту весняного. За допомогою преципітації ристоміцину сульфату було очищено лектин з насіння гледичії колючої, який взаємодіяв з 4-нітрофеніл-в--D-глюкопіранозидом та 4-нітрофеніл-в--D-глюкозамінопіранозидом, але не з широким набором інших моно- і дисахаридів, в тому числі з D-глюкозою та D-манозою. Цей лектин, разом з лектинами чотирьох видів хвощів (Equisetum arvense L., E. sylvaticum L., E. hyemale L., E. tempatelia Ehrh.) які, як показали наші дослідження, є специфічні до 4-нітрофенільних та фенільних похідних D-глюкопіранози, можуть репрезентувати нову підгрупу манозоспецифічних лектинів.

При пошуку сіалоспецифічних лектинів серед рослин нами було виявлено такий лектин у кореневищі купини багатоквіткової (лілійні) та в інших рослинах цієї родини. Однак, подальші дослідження цих лектинів показали, що значно кращим інгібітором їх активності є хітинові олігосахариди і вони близькі за властивостями до лектину зародків пшениці. Лектини подібної специфічності були нами очищені з плодових тіл гриба дубовика оливково-бурого та з трави трьох видів нечуй-вітрів (айстрові). Це дозволило віднести їх до хітинозв'язуючих лектинів, які, як виявилось, значно ширше зустрічаються в природі і не належать лише до декількох родин вищих рослин.

Особливу увагу в роботі приділено пошуку нових L-фукозоспецифічних лектинів. Це порівняно нечисленна група серед інших вуглеводозв'язуючих білків. Для прикладу, раніше нами було обстежено 401 орган, що належить 282 видам вищих рослин. Лектини були виявлені у 150 органах (37,4 %) 111 видів рослин. Серед них фукозоспецифічні лектини були знайдені у 6 органах 5 видів (4 %). Найчисленнішими були D-галактозоспецифічні лектини (37 %) і лектини, що не мали специфічності до моносахаридів (34 %). Аналіз існуючих даних літератури та власні дослідження засвідчили, що є окремі родини рослин, грибів і тваринних організмів, де L-фукозоспецифічні лектини зустрічаються частіше. Серед вищих рослин їх можна шукати в родині бобових в родах Laburnum, Sarothamnus, Tetragonolobus, Ulex. У грибів фукозоспецифічні лектини знайдені серед представників класу сумчастих (аскоміцетів) - Ascomycetes, зокрема, у представників порядку пецицієвих (Pezizales). Поряд з раніше очищеними лектинами з плодових тіл алеврії оранжевої (Aleuria aurantia), та Melastiza chateri, нами вперше виявлені та очищені лектини з пецици коричнево-каштанової (Peziza badia), пецици пухирчастої (Peziza verticillata) та пецици фіолетової (P. violacea Fr.) L-фукозоспецифічні лектини знайдені у представників родини окуневих (Percidae), зокрема, в ікрі окуня та судака. З ікри окуня нами вперше крім L-фукозоспецифічного, очищено ізолектин, який є високоспецифічним до целобіози.

Зважаючи на широке розповсюдження в природі і велику кількість лектинів з різними біологічними властивостями, група D-галактозоспецифічних лектинів вимагала детальнішої класифікації. Проф. Альбертом Ву (1991, 2003) була запропонована класифікація цих лектинів на основі взаємодії їх з дисахаридами. Вона була застосована нами при характеристиці сировинних джерел лектинів у монографії “Лектини та їх сировинні джерела”. Нами вперше було очищено та досліджено ряд лектинів цієї групи, зокрема, з кори саротамнуса віникового та карагани деревоподібної, робінії несправжньої, насіння амаранта хвостатого, з плодових тіл гриба саркосцифи яскраво-червоної.

Нами запропоновано новий метод очистки гемолітичного лектину (фалолізину) з плодових тіл блідої поганки, який можна віднести до поки нечисленної групи цитолітичних біфункціональних лектинів. Показано, що фалолізин-індукований гемоліз повністю пригнічується поліетиленгліколем-1350 і не пригнічується в присутності ПЕГ-400 і ПЕГ-600. Це дало можливість обчислити діаметр “дірок”, які робить фалолізин у мембранах еритроцитів (1,6 - 2,3 нм) та визначити його вуглеводну специфічність, так як присутність ПЕГ-1350 не впливала на титр гемаглютинації і на взаємодію з вуглеводами.

Зміни активності лектинів у рослин. Досліджено якісні та кількісні зміни у активності лектинів протягом річного життєвого циклу рослин. Було виявлено такі загальні закономірності у змінах активності лектинів у річному циклі розвитку рослин:

- в насінні активність лектинів зростає в міру їх дозрівання;

- у корі деревних і кущових видів рослин активність лектинів непостійна і зростає під час весняного сокоруху, досягаючи максимуму в момент розпускання бруньок листків, або в деяких рослин в моменти максимального росту суцвіть. У літній період активність лектинів в корі є найнижчою, а далі зростає до моменту дозрівання насіння, залишаючись на високому, відносно постійному рівні в зимовий період;

- з ростом листків активність лектинів у них знижується, а з початком їх повноцінного функціонування вона зростає, залишаючись на відносно постійному рівні протягом літа і знижується восени;

- різні вегетативні органи рослин можуть містити лектини неоднакової вуглеводної специфічності. Окрім того, один і той же орган рослини може містити декілька лектинів;

- у деяких рослин у різні періоди вегетації екстракти одного і того ж органу можуть проявляти різну вуглеводну специфічність.

Різниця у титрах гемаглютинації екстрактів органів рослин, зібраних в різні фази вегетації дуже значна і часом сягає трьох порядків. Наприклад, для екстракту кори Robinia pseudoacacia в момент розкриття бруньок сягає 1:2048, а в фазі повного цвітіння - 1:2. Очевидно тому в рослинах з незначною активністю лектинів їх можна виявити лише в період їх максимальної активності. Що це дійсно так, ми переконались на прикладі низки трав'янистих рослин. Зокрема, у видів нечуй-вітру, полину гіркого і звичайного, ромашки без'язичкової та деяких інших рослин родини складноцвітих (айстрових) лектини виявляються лише весною під час їх інтенсивного росту.

Очищення лектинів та їх характеристика

Для очищення лектинів різної вуглеводної специфічності нами було одержано ряд афінних сорбентів на основі природних полісахаридів та глікопротеїнів. Для очищення глюкозоспецифічних лектинів з насіння гороху, сочевиці, вики посівної, кінських бобів, видів чини нами одержано сорбент на основі поперечно-зшитого крохмалю, який за гідродинамічними та сорбційними властивостями може бути замінником імпортних сефадексів G-100 - G-200. Гель можна використовувати багаторазово, він добре зберігається у присутності 10 % дiоксану або консервантів -- азиду натрію чи мертіолату. Для очищення манозоспецифічних лектинів амарилісових та деяких лілійних нами було одержано та випробувано декілька різних сорбентів, зокрема “овогель”, тиреоглобулін, іммобілізований на агарозі, дріжджовий манан, іммобілізований на агарозі або співполімер крохмального гелю та дріжджового манану. Найкращим з випробуваних сорбентів виявився останній. Цей сорбент може бути використаний для очищення манозоспецифічних лектинів з цибулин або надземної частини амарилісових та лілійних, зокрема підсніжника (Galanthus nivalis L.), білоцвіту весняного (Leucojum vernum L), видів нарцису (Narcissus sp.), крокуса весняного (Crocus vernus ), кореневища купини багатоквіткової (Polygonatum multiflorum /L./All.) тощо.

Для очищення N-ацетил-D-глюкозамінспецифічних, D-галактозоспецифічних та ряду N-ацетил-D-галактозамінспецифічних лектинів нами використовувались одержаний М.Д. Луциком (1984), та нами гелі на основі глікопротеїнів курячого яйця, які взаємодоповнювали один одного. Зокрема, останній сорбент було використано для очищення лектину з насіння Amaranthus caudatus, A. retroflexus, A. albus, кори робінії звичайної, карагани деревовидної, бульб картоплі.

Фукогалактоманан трутовика Phellinus igniarius (Fr.) Quell., іммобілізований на агарозі, використано для очищення фукозоспецифічного лектину з гриба алеврії оранжевої. Для очищення лектинів з ікри окуня та судака ми застосовували сорбент, виготовлений шляхом співполімеризації групоспецифічної речовини Н (О) крові людини з 6 %-ною агарозою.

У деяких живих організмів нами було виявлено декілька різних лектинів, які відрізняються вуглеводною специфічністю і представляють практичний інтерес. Так, у кореневищі купини багатоквіткової містяться манозо- та хітобіозоспецифічні лектини, які було очищено з використанням послідовно афінної хроматографії на двох різних сорбентах. З ікри окуня два ізолектини було одержано за допомогою афінної елюції спочатку целобіозою, а потім L-фукозою. З кори карагани деревоподібної два ізолектини одержано іонообмінною хроматографією на ДЕАЕ-целюлозі.

Застосування афінної хроматографії відкриває можливості до комплексного і більш раціонального використання сировини, що часто було неможливим при застосуванні інших методів очистки. Нами була розроблена схема одержання фітину і аглютиніну зародків пшениці в одному технологічному циклі.

Фізико-хімічні властивості очищених лектинів. Нами вперше виявлено, очищено та досліджено основні фізико-хімічні властивості та вуглеводну специфічність 17 лектинів, ряд характеристик яких представлені в табл. 1. Ще 10 лектинів були очищені афінною хроматографією і досліджена їх вуглеводна специфічність, але молекулярна маса і структура молекули не досліджувалась.

Серед лектинів, наведених в табл. 1 найбільше специфічних до L-фукози та до олігомерів N-ацетил-D-глюкозаміну. Це пояснюється спрямованістю пошуку: шукали і досліджували насамперед лектини рідкісної вуглеводної специфічності, до яких належать L-фукозоспецифічні та сіалоспецифічні. Однак, знайдені нами рослинні лектини, що взаємодіяли з сіаловою кислотою, ще краще взаємодіяли з олігомерами N-ацетил-D-глюкозаміну (рис.1), нагадуючи тим самим аглютинін зародків пшениці. Такі лектини були знайдені в плодових тілах гриба-дубовика, у низці рослин родини лілійних та айстрових. Незалежно від знаходження, такі лектини мали подібну будову молекули, молекулярну масу і характеризувались підвищеною стійкістю до кислого середовища. Широка розповсюдженість лектинів подібного типу може свідчити про їх важливу фізіологічну роль у життєдіяльності рослин і грибів.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Відносна інгібіторна сила взаємодії лектину купини багатоквіткової (PMRL^-) з вуглеводами. За одиницю прийнята сила взаємодії NAcDGlc (1); 2 -NANA (1,3); 3 - б-phe-NАcDGlc (6,6); 4 -N,N'-диацетилхітобіоза (20); 5 --нітрофеніл-NАcDGlc (47); 6 -N,N'-диацетилхітобіозил-Asp (47,6); 7 -N,N',N",N"'-тетраацетилхітотетраоза (200).

Таблиця 1 Молекулярна маса, структура молекули та найсильніший інгібітор активності вперше очищених лектинів

Так само, порівнюючи L-фукозоспецифічні лектини ікри окуня, судака, плодових тіл грибів порядку пецицієвих та кори золотого дощу звичайного, які відносяться до віддалених у еволюційному плані організмів, можна зробити заключення про близькість значень їх молекулярної маси та молекулярної структури. Звертає на себе увагу наявність в ікрі окуня а також у насінні та корі золотого дощу звичайного двох пар аналогічних за імунохімічними властивостями ізоформ лектинів, що мають ідентичну молекулярну масу та подібну структуру молекули.

Дослідження біологічної активності лектинів

Токсичність лектинів для нормальних і пухлинних клітин. Дослідження проведені разом з співробітниками Інституту біології клітини НАН України на культурі пухлинних клітин з використанням одержаних нами лектинів показали їх неоднакову токсичність до клітин різних ліній. Наприклад, цитоморфологічними методами досліджено механізм загибелі культур пухлинних клітин при дії лектинів купини багатоквіткової і RCA-120 (аглютинін насіння рицини). Було виявлено, що клітинам А-549 аденокарциноми легень людини властива підвищена чутливість до цитотоксичного впливу лектину купини PMRL⁺, що характеризується зростанням кількості апоптотичних та загиблих клітин. В той же час, цей лектин практично не діє на клітини ліній НЕр-2 та НЕр-2Е7. Клітини ліній НЕр-2 та НЕр-2Е7 були більше чутливі до впливу RCA-120, ніж до дії лектинів купини PMRL⁺та PMRL^-.Водночас, лінія НЕр-2 чутливіша від НЕр-2Е7 до цитотоксичного впливу лектину купини PMRL^-.

Вивчено також токсичну дію ряду лектинів на клітини лейкемії миші лінії L 1210 з нормальною чутливістю, та клітини сублінії L1210/R., які характеризуються підвищеною резистентністю до дії протипухлинного препарату цисплатини. Результати цих досліджень представлені в табл. 2.

Таблиця 2 Концентрація лектинів, що викликає загибель 50% клітин (IC₅₀) через 48 годин культивування на поживному середовищі

Цікавим є те, що на відміну від більшості лектинів, лектин з кори Rоbіпіа рsеиdоасасіа володіє вищою токсичністю до клітин сублінії L1210/R (резистентних), ніж до клітин L 1210 (чутливих). Останнє спостереження може бути експериментальним підґрунтям при розробці нових підходів у подоланні набутої резистентності злоякісних клітин до протипухлинного препaрату цисплатину.

Дія лектинів на жуків та нематод. На початок 90-х років ХХ сторіччя стало зрозумілим, що лектини відіграють важливу роль у процесах розпізнавання у різноманітних біологічних системах. У рослинах результатом такого розпізнавання може бути захист від шкідливих бактерій, комах і хижих тварин або симбіоз між азот-фіксуючими бактеріями і кореневими волосками бобових рослин. Дійсно, виконано ряд робіт, в яких описано інсектицидну дію WGA, лектину кропиви, підсніжника, Griffonia simplicifolia-лектину-ІІ тощо [Huesing e. a., 1991; Setamou e. a., 2003; Zhu e. a. 1996].

Нами досліджено дію ряду токсичних і нетоксичних лектинів на ріст і розвиток деяких нижчих тваринних організмів, зокрема, колорадських жуків Leptinotarsa decemlineata та нематод Саепоrhabditis е1еgапs. Одержані результати свідчать про можливу захисну функцію лектинів в рослинних організмах та ікрі риб.

Зокрема, в результаті проведених експериментів було встановлено, що однократне згодовування рицином є достатнє для повної загибелі личинок колорадських жуків. Лектин омели є менш токсичним і при однократному годуванні личинки гинули на 1-2 доби пізніше, ніж при годуванні рицином, а повна загибель личинок спостерігалась лише тоді, коли вони споживали лектин кожен день. Інші випробувані лектини (гороху, ФГА-Е, підсніжника і білоцвіту) також негативно впливали на розвиток жуків, однак їх токсичний вплив був дещо меншим.

Усі випробувані лектини (еритроаглютинін квасолі звичайної, ФГА-Е), лектин насіння гороху (РSL), фукозоспецифічний лектин ікри окуня (РFА-L), аглютинін зародків пшениці (WGА), токсин насіння рицини (рицин, RС-60) виявились токсичними для нематод Caenorhabditis elegans. Серед них рицин, PSL та PFA-L в дозі 200 мкл 1 % -ного лектину на чашку Петрі приводили до повної загибелі нематод. ФГА-Е та WGA володіли дещо меншою токсичністю. Однак, найцікавішим результатом цих досліджень є те, що відносно нетоксичні лектини для ссавців виявились високотоксичними для жуків і нематод.

Переважна асоціація лектинів з тими частинами рослин, які є найбільш чутливими до нападу чужорідних організмів, є аргументом на користь захисної ролі лектинів. Органи, що накопичують запасні речовини, перш за все насіння, особливо уразливі, тому що вони найбільш привабливі для потенційних паразитів і хижаків. Приймаючи до уваги еволюційну адаптацію рослин, можна припустити, що вони розвинули пасивні системи захисту запасних органів і насіння. З цього погляду переважне нагромадження лектинів у типових запасаючих органах є показовим.

Нематоди, які відносяться до первиннопорожнинних червів, часто є паразитами рослин і тварин. Тому очевидно, деякі з рослин, а також можливо, ікра риб, у процесі еволюції розвинули захисні механізми проти них. Проведені експерименти свідчать, що лектини можуть претендувати на роль молекул, які обумовлюють захист рослин, а також ікри риб від паразитарних червів.

Дослідження можливостей практичного застосування лектинів у фармації, медицині та біології

Лектини в дослідженні глікокон'югатів. За допомогою лектинів можна вивчати глікокон'югати як на поверхні клітин, так і використовуючи їх в чистому вигляді. Інформацію про наявність тих чи інших вуглеводів на клітинній поверхні дає селективна аглютинація та цито- та гістохімічні методи візуалізації лектинових рецепторів. Афінна хроматографія на лектинах відомої вуглеводної специфічності, окрім розділення глікокон'югатів, дає цінну інформацію про структуру їх вуглеводної частини. Преципітація лектинів глікокон'югатами може нести інформацію не лише про наявність того чи іншого вуглеводу, але і про молекулярну масу, ступінь розгалуженості й полідисперсності зразка, що аналізується.

Досліджено вуглеводну частину ліпопротеїнів сироватки крові людини, які відіграють значну роль у патогенезі атеросклерозу. Відомо, що основний білок ліпопротеїнів низької густини (ЛПНГ) - апо-В містить у своєму складі до 5 % вуглеводів, які розташовані на поверхні і беруть участь у взаємодії зі специфічними рецепторами клітин крові і судин. Однак склад і розташування вуглеводів на поверхні як ЛПНГ, так і ліпопротеїнів дуже низької густини (ЛПДНГ) невідомі. У роботі вивчали реакцію преципітації ліпопротеїнів з лектинами, результати якої оцінювали за зміною світлорозсіювання при 650 нм. Були використані лектини різної вуглеводної специфічності. Виявлено, що ЛПНГ сильно преципітує лектин кори бузини червоної і дуже слабко - лектин жарновця віникового, а з ЛПДНГ - взаємодіє тільки лектин жарновця віникового. Це дозволяє припустити, що термінальним вуглеводом у ЛПНГ є в- D-галактоза, а в ЛПДНГ - б-2-ацетамідо-2-дезоксигалактоза.

Нами було розроблено метод іммобілізації лектинів на агарозних гелях з утворенням довгого спейсера і використано утворений гель для очищення тиреоглобуліну бика, а згодом для досліджень взаємодії лектину білосніжки весняної з полісахаридами та глікопротеїнами, а також для розділення апоптотичних і неапоптотичних клітин L 1210 на колонці PSL-агарози. У розробленому методі для іммобілізації лектинів в якості нерозчинного носія використовували 4 % або 6 % агарозу, яку обробляли в лужному середовищі епіхлоргідрином, далі гексаметилендіаміном і накінець, глутаральдегідом. Білок ковалентно приєднували в нейтральному або слабокислому середовищі (рН 4,0 -7,0). Розроблена методика дозволяє іммобілізувати від 3 до 8 мг лектину на 1 мл 4 % агарозного гелю. Окрім описаного методу, разом з к.х.н. Гайдою А.В. (Інститут гематології і переливання крові, м. Львів) нами був апробований метод іммобілізації лектинів на дрібнопористому активованому склі. Як носій для іммобілізації використовували силохром С-80, модифікований г-гліцидооксипропілтриетоксисиланом. Іммобілізацію білка проводили після активації носія в лужних умовах. Після іммобілізації 1 г сорбенту містив 15 мг зв'язаного лектину (еритроаглютиніну насіння квасолі), а лектину щириці хвостатої та конканаваліну А - 12 і 40 мг/г сорбенту відповідно.

Іммобілізувавши лектин білоцвіту весняного (Leucoum vernum L.), нами було досліджено зв'язування його з рядом полісахаридів та глікопротеїнів. Для вивчення взаємодії глікокон'югату з іммобілізованим лектином 4 мг полісахариду або глікопротеїну розчиняли в 3,5 мл 0,05 М фосфатного буферного розчину, рН 7,2, що містив 0,5 М натрію хлориду i наносили на колонку з іммобілізованим лектином об'ємом 20 см³ (висота колонки - 10 см, діаметр - 1,3 см).

Колонку промивали буферним розчином, а далі зв'язаний глікопротеїн або полісахарид знімали з колонки за допомогою 1 %-го розчину ацетатної кислоти. Аналіз фракцій на наявність глікопротеїнів проводили на спектрофотометрі за світлопоглинання при 280 нм; полісахариди визначали за допомогою реакції з сульфатною кислотою та фенолом, вимірюючи оптичну густину продукту реакції на спектрофотометрі при 465 нм.

Одержані результати показали, що за характером профілю елюції на іммобілізованому лектині білоцвіту весняного всі глікокон'югати можна розділити на три групи: 1) ті, що не зв'язуються з колонкою; 2) ті, що зв'язуються частково; 3) ті, що повністю затримуються на колонці. З іммобілізованим лектином на колонці не зв'язувались орозомукоїд, трансферин, пероксидаза хрону, фітогемаглютинін-L, глікоген дріжджів, лужна фосфатаза кишківника теляти. Повністю затримувались на колонці тиреоглобулін людини і бика, дріжджевий манан, лектин картоплі, білої акації, лімської квасолі, кори золотого дощу звичайного. Телячий фетуїн, Ig G людини, лектин насіння сої, виноградного слимака, бузини чорної, еритроаглютинін насінин квасолі, овальбумін, полісахариди насіння Trigonella foenum graecum та афілофорових грибів затримувались на колонці частково (від 5 % до 95 %).

При дослідженні зв'язування з іммобілізованим еритроаглютиніном насіння квасолі білків сироватки крові людини було виявлено, що він зв'язує не менше шести білків сироватки крові людини, серед яких переважає б₂-макроглобулін та імуноглобуліни класу М. Іммобілізований лектин не зв'язує преальбумін, церулоплазмін, трансферин.

Лектин щириці хвостатої і конканавалін А, незважаючи на різну моносахаридну специфічність, володіють приблизно однаковою зв'язуючою здатністю, причому сорбують з різних фракцій донорської крові практично ті самі білки. Лектин щириці може бути корисним при очистці деяких білків плазми крові, зокрема, IgG та плазміногену. У фракціях білків, одержаних при хроматографії екстракту фракції П + Ш по Кону, виявляється (після активації стрептокіназою) фібринолітична активність, що відповідає очистці плазміногену в 22,5-30 разів.

Використання лектинів в аналізі глікозидів. Селективна взаємодія лектинів з вуглеводами допускає можливість їх застосування у аналізі глікозидів. Доволі детально досліджена взаємодія конканаваліну А з глікозидами, полісахаридами та глікопротеїнами. Він добре взаємодіє з аліфатичними та ароматичними глікозидами б-D-глюкози та б-D-манози. Встановлено, що глікозиди з ароматичними агліконами є сильніші інгібітори ніж ті, що вміщують аліфатичні аглікони. Дослідження взаємодії конканаваліну А з серією синтетичних С-глюкозидів та С-манозидів показало, що лектин зв'язує С-глікозиди з афінністю, близькою за силою до аналогічних О-глікозидів.

У літературі дуже мало даних про взаємодію лектинів з антраглікозидами, флавоноїдами, сапонінами та іншими глікозидами, які є основою численних природних фармацевтичних препаратів. Відсутність подібних досліджень пояснюється рядом причин, головною з яких є відсутність чіткої переваги застосування лектинів при аналізі або очищенні глікозидів над існуючими фізико-хімічними та хроматографічними методами.

На наш погляд, в окремих випадках використання лектинів в аналізі глікозидів може бути доцільним. Це можуть бути у випадку встановлення типу зв'язку між агліконом і вуглеводом, попередня оцінка наявності тих чи інших вуглеводів у складі глікозидів, окремі випадки розділення глікозидів.

При дослідженні взаємодії лектинів з антибіотиками-глікозидами було виявлено, що ристоміцину сульфат утворює преципітати з деякими з них. Антибіотик ристоміцину сульфат є глікозидом, у якому три цукрові ланцюги приєднані до ароматичного аглікону. За своєю структурою він нагадує рослинні глікозиди, у яких до ароматичного аглікону приєднані два або більше цукрових ланцюги. Такі глікозиди зустрічаються серед сапонінів, серцевих глікозидів, антраглікозидів, флавоноїдів. Тому ристоміцину сульфат може бути доброю моделлю для дослідження взаємодії між лектинами та диглікозидами.

Виявлено, що цей антибіотик-глікозид найкраще преципітує глюкозо- (манозоспецифічні) лектини бобових та амарилісових. Коли ж ми використали високу концентрацію ристоміцину (3 %), то помітили утворення преципітату з багатьма лектинами. Однак, мінімальна концентрація ристоміцину, яка давала видимий осад для різних лектинів, сильно відрізнялась, а лектин омели видимого осаду не давав і при 3 %-ній концентрації ристоміцину. Про специфічність взаємодії лектинів з вуглеводною частиною молекули ристоміцину свідчить той факт, що при додаванні до комплексу ристоміцин-лектин сочевиці або ристоміцин-конканавалін А 0,1 М розчину б-метил-D-глюкопіранозиду спостерігалось розчинення осаду. Ще кращим інгібітором преципітації між конканаваліном А та ристоміцином був б-феніл-NАcDGlc. В той же час ристоміцину сульфат утворює преципітати з деякими білками нелектинової природи, що пояснюється неспецифічною взаємодією їх з ристоміциновим агліконом. Проведені нами дослідження по пригніченню преципітації між білками та ристоміцином амінокислотами виявили, що, очевидно, у різних білків при взаємодії з ристоміцином приймають участь різні амінокислоти і тому не можна підібрати якоїсь однієї амінокислоти для пригнічення неспецифічної взаємодії між ристоміциновим агліконом та білком, хоча, як було виявлено нами, такі амінокислоти, як метіонін, гістидин, орнітин найчастіше приймають участь у такій взаємодії. Це зменшує цінність ристоміцину як можливого реагента при пошуку нових лектинів в рослинних об'єктах. Все ж виявилось можливим підібрати концентрацію ристоміцину сульфату, при якій неспецифічна преципітація між ристоміциновим агліконом та білками не спостерігається. Якщо при такій концентрації є осад, і його утворення пригнічується специфічним вуглеводом, це свідчить про наявність лектину у ньому.