43

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

Дефенсини та регуляція активності рецептора епідермального фактора росту в пухлинних клітинах людини

14.01.07 - Онкологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Погрібний Петро Васильович

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Науковий консультант:

член-кореспондент НАН України, доктор медичних наук, професор Чехун Василь Федорович, директор Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р. Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу механізмів протипухлинної терапії;

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Гамалія Микола Федорович, завідувач відділу клітинної фотобіології і фотомодуляції пухлинного росту Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р. Є. Кавецького НАН України, м. Київ;

доктор медичних наук Вакуленко Галина Олексіівна, доцент кафедри онкології Національного медичного університету ім.О. О. Богомольця, м. Київ;

член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор Малюта Станіслав Станіславович, завідувач відділу молекулярної генетики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Провідна установа:

Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького МОЗ України. Захист відбудеться “_14_" квітня 2004 р. о _13_ годині _30_ хвилин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, Київ, вул. Васильківська, 45). З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий “____" березня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук Н.В. Бородай

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Злоякісна трансформація еукариотичних клітин є наслідком мультифакторних порушень процесів проліферації та контролю програмованої загибелі клітин. Дослідження білків/пептидів, що можуть брати участь у таких процесах, привернули увагу до антимікробних пептидів ссавців - дефенсинів. Дані останніх років свідчать про те, що ці пептиди є не тільки антибіотиками і важливими компонентами системи природженого імунітету, але багатофункціональними біомолекулами, які концентраційно-залежним шляхом можуть впливати на сигнальну трансдукцію та проліферацію клітин чи інгібувати синтез ДНК і викликати лізис клітин (Murphy et al., 1993; Jacob еt al., 1994; Kamisz еt al., 2003;). Однак, механізми такого впливу бета-дефенсинів залишаються недослідженими, а білки-мішені - неідентифікованими.

У 2002 році Biragyn et al. встановили, що бета-дефенсин-2 людини (hBD-2) може впливати на систему адаптивного імунітету і прямо активувати дендритні клітини. Як речовини з потужними ад'ювантними властивостями, дефенсини можуть впливати на здатність адаптивної імунної системи впізнавати фрагменти білків клітин, у тому числі пухлинних. У зв'язку з цим вони можуть бути використані у клініці не тільки як антибіотики для поверхневого застосування, але і як компоненти протипухлинних вакцин.

В той же час експресія дефенсинів в пухлинах людини залишається майже не дослідженою. Дані кількох груп вчених продемонстрували наявність гіперекспресії бета-дефенсинів 1 та 2 в новоутвореннях ротової порожнини людини та відсутність такої в пухлинах простати та нирки (Abico et al., 1999, Mizukawa et al., 2000, Savaki et al., 2002, Donald et al., 2003).

Для ефективного застосування дефенсинів в клінічній онкології необхідними є фундаментальні обґрунтування механізмів впливу цих антибіотиків на системи передачі сигналів в клітинах та ретельне вивчення особливостей їх експресії в новоутвореннях людини, а також можливий зв'язок дефенсинів з регуляцією активності рецептора епідермального фактора росту (ЕФРр). Відомо, що ЕФРр відіграє критичну роль як в нормальному, так і злоякісному рості клітин (Velu, 1990; Tsanatis et al., 2000). Порушення функціонування ЕФРр спостерігаються в пухлинах різних типів (Jacob et al., 1994). Згідно даних літератури, до таких порушень відноситься поява конститутивно активованих мутантів рецептора, гіперекспресія ЕФРр та його лігандів (ЕФР/ТФР-), що асоційовані з інвазивністю пухлин і впливають на їх чутливість до протипухлинних агентів (Tahara et al., 1996; Keloff et al., 1996; Hortobagyi, 2000; Tsanatis et al., 2000). У зв'язку з цим ЕФРр розглядається як молекулярна мішень для створення нових ефективних протипухлинних ліків, а використання специфічних інгібіторів кіназної активності ЕФРр - як новий потенційно ефективний напрямок в хіміотерапії онкологічних хворих (Raymond et al., 2000; Barton et al., 2001; Seymour, 2001). Дослідження ряду лабораторій світу протягом останніх років присвячені інтенсивному пошуку та розробці специфічних природніх і синтетичних інгібіторів протеїн тирозинкінази (ПТК) рецептора ЕФР (Mendelsohn, 1997; Mendelsohn et al., 2000; Ciardiello et al., 2001). Деякі такі сполуки, що продемонстрували високу антипроліферативну активність in vitro, зараз знаходяться у І-ІІІ фазах клінічних випробувань (Hirata et al., 2002).

У звязку з цим дослідження дефенсинів in vitro як можливих ефекторів активності кінази ЕФРр в пухлинних клітинах та особливостей їх експресії в новоутвореннях людини є важливим напрямком сучасної фундаментальної онкології, що може знайти застосування в практичній медицині.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Роботу виконано у відділі біології пухлинної клітини Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Робота виконана в рамках програм ДКНТ України, Міністерства України у справах науки і технологій (шифр 2/1297-97, № 0198U005252; шифр 02.04/04439, № 0198U005179) та в планах науково-дослідних робіт Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р. Є. Кавецького НАН України, шифр проблеми 2.2.5.209, № 0198U001092).

Мета дослідження. Метою роботи було з'ясування ролі дефенсинів в аутокринній регуляції активності рецептора ЕФР в пухлинних клітинах людини.

Задачі дослідження:

Розробити експериментальні клітинні системи, що конститутивно експресують рецептор ЕФР та контрольовано продукують рекомбінантний ТФР-, оцінити їх проліферативні показники в порівнянні з вихідними лініями.

Дослідити особливості функціонування ЕФРр в отриманих експериментальних клітинних системах.

Виділити пептиди з характеристиками інгібіторів кінази ЕФРр з культурального середовища клітин і дослідити їх властивості та біологічну активність.

Отримати рекомбінантний бета-дефенсин-2 людини та моноклональні антитіла до нього.

5. Дослідити експресію генів ЕФРр та дефенсинів в лініях пухлинних клітин in vitro, встановити можливі функціональні взаємозв'язки між їх білковими продуктами.

6. Провести аналіз експресії генів ЕФРр та дефенсинів в клітинах пухлин шийки матки та вульви людини.

Об'єкт дослідження - прикріплені та суспензійні лінії клітин людини та тварин: А431 (епідермоїдна карцинома вульви людини), M-HeLa (карцинома шийки матки людини), КВ (епідермоїдна карцинома слизової оболонки порожнини рота людини), COLO320HSR (аденокарцинома товстої кишки людини), Mewo (злоякісна меланома людини), MCF-7 (фіброцистома молочної залози людини), U251 (гліобластома людини), CESS (В-клітини людини, трансформовані EBV), Molt-4 (Т-клітинний гострий лімфобластний лейкоз людини), Raji (лімфома Беркітта людини), Namalwa (лімфома Беркітта людини), Jurkat (Т-клітинна лімфома людини), СЕМ (Т-клітинний гострий лімфобластний лейкоз), клітинні сублінії А431/1522 і M-HeLa/1522, що отримано на основі ліній клітин А431 і M-HeLa в результаті їх трансфекції кДНК трансформуючого фактора росту типу ; та зразки хірургічно видалених тканин (умовно-нормальний та злоякісно трансформований епітелій вульви та шийки матки людини).

Предмет дослідження - експресія ЕФРр та дефенсинів на рівні мРНК та білку в злоякісно трансформованих епітеліальних клітинах людини.

Методи дослідження - для виділення та очищення білків та пептидів (ЕФР, ТФР-, hBD-2) в роботі було застосовано стандартні методи препаративної біохімії, переважно хроматографічні (гель-фільтрація, іонообмінна хроматографія, зворотньофазова хроматографія високого тиску), ультрацентрифугування; для дослідження отриманих препаратів використовували метод електрофорезу в градієнті поліакриламідного гелю; для дослідження проліферативних показників культивованих клітин та оцінки деяких показників трансфікованих клітинних субліній використовували радіоізотопні методи; для характеристики білків/пептидів та моноклональних антитіл застосовано імунохімічні методи дослідження (Вестерн-блот аналіз, ELISA, імуноблотинг, імунопреципітація); для вивчення експресії hBD-2 в пухлинах людини використовували імуногістохімічні методи дослідження; для дослідження біологічної дії ікЕФРр було застосовано функціональні, мікробіологічні, вірусологічні методи дослідження; для отримання клітинних субліній, що гіперекспресують ТФР- та для отримання рекомбінантного hBD-2 було застосовано генно-інженерні методи (клонування, трансфекція, експресія продукту в еукариотичних та бактеріальних клітинах); для характеристики продукту трансфекції, дослідження експресії мРНК різних генів, в тому числі hBD-2 та ЕФРр, використовували молекулярно-біологічні методи (виділення ДНК та РНК, рестриктний аналіз, Саузерн - та Нозерн-аналіз, полімеразна ланцюгова реакція, полімеразна ланцюгова реакція із зворотньою транскрипцією); для отримання анти-hBD-2-моноклональних антитіл використовували стандартну гібридомну технологію з використанням рекомбінантного hBD-2 в якості антигену.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше генно-інженерним шляхом отримано сублінії клітин А431/1522 та M-HeLa/1522, що гіперекспресують ТФР-. Досліджено особливості функціонування ЕФР-залежної системи контролю росту в цих клітинних сублініях. Показано, що гіперекспресія ТФР- в клітинах сублінії А431/1522 приводить до уповільнення проліферації цих клітин. Встановлено, що клітини А431/1522 продукують позаклітинно речовину, яка пригнічує активність кінази ЕФРр. Очищено інгібітор кінази ікЕФРр та встановлено, що ікЕФРр є пептидним антибіотиком людини - -дефенсином-2 (hBD-2). Вперше показано, що цей пептид має, окрім антимікробної активності, властивості інгібітора цитозольних та трансмембранних кіназ, цитолітичну та гемолітичну активності. Проведено аналіз експресії гена ікЕФРр (hBD-2) в пухлинних клітинах людини та досліджено її регуляцію in vitro. Вперше продемонстровано, що експресія гена hBD-2 є ТФР-/ЕФР-залежною, а білковий продукт цього гена пригнічує активність кінази ЕФРр. Проведено аналіз спектра дефенсинів, що експресуються в пухлинних клітинах вульви та шийки матки людини. Показано, що експресія гена hBD-2 є характерною для пухлин цієї локалізації та асоційована з гіперекспресією гена ЕФРр.

Практичне значення одержаних результатів. Дослідження є завершеною фундаментальною роботою, результати якої можуть бути використані в практичній онкології. Запропонована технологія отримання hBD-2 в препаративній кількості, що дозволить провести доклінічні випробування пептиду в якості антибіотика для поверхневого застосування або протипухлинного агента для лікування хворих з новоутвореннями жіночої репродуктивної системи. Отримані моноклональні антитіла до hBD-2, які є досконалим інструментом дослідження експресії цього пептиду в новоутвореннях людини.

Особистий внесок здобувача. Дисертанту належить ідея отримання генно-інженерним шляхом субліній клітин А431 та М-HeLa, що гіперекспресують ТФР-. Він дослідив біологічно-активні пептиди та білки, що продукуються цими клітинами. Автор самостійно провів біохімічні та імунохімічні дослідження пептиду з властивостями інгібітора кінази ЕФР-рецептора, генетичні дослідження експресії генів дефенсинів in vitro та в клінічному матеріалі. Автор самостійно аналізував весь отриманий матеріал, формулював усі положення та висновки роботи, готував до друку публікації, що відображають результати дисертації.

Апробація роботи. Матеріали роботи було представлено та обговорено на:

І-й науково-практичній конференції з проблем ВІЛ/СНІД (Київ, Україна, 1995); 7-му Європейському конгресі з Біотехнології (Ніца, Франція, 1995); Першому Європейському Симпозіумі Білкового товариства (Давос, Швейцарія, 1995); 8-му Європейському конгресі з біотехнології (Будапешт, Угорщина, 1997); Міжнародних курсах EMBO/FEBS/UNESCO `Молекулярні основи бактеріальної інфекції' (Спецес, Греція, 1998); 26-му симпозіумі Федерації Європейського біохімічного товариства (Ніцца, Франція, 1999); ІІ з'їзді онкологів країн СНД “Онкологія 2000” (Київ, Україна, 2000); 18-му Міжнародному Конгресі з біохімії та молекулярної біології (Бірмінгем, Великобританія, 2000); 3-й Міжнародній конференції “ Mechanisms of cellular signal transduction and communication" (Львів, Україна, 2000); Міжнародному симпозіумі “Intracellular signalling in plant and animal systems (ISPAS) ” (Київ, Україна, 2001); 10-му з'їзді онкологів України (Ялта, Україна, 2001); 4^th Parnas Conference “Molecular mechanisms of cell activation: biological signals and their target enzymes (Вроцлав, Польща, 2002); IV науково-практичній конференції “Сучасні принципи діагностики та лікування візуальних форм генітального раку у жінок" (Львів, Україна, 2002).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладений в 35 публікаціях, в тому числі в 24 журнальних статтях у провідних фахових виданнях серед яких одна самостійна, та у 10 тезах матеріалів вітчизняних та міжнародних конгресів, конференцій, з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 284 сторінках машинописного тексту. Дисертація складається із вступу, 2 розділів огляду літератури, 9 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнень результатів досліджень, висновків і списку цитованої літератури. Дисертація містить 15 таблиць і 77 рисунки. Список використаних джерел включає 299 найменувань, з них 12 - на українській та російській мовах, 287 - на англійській мові.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. В експериментах було використано лінії клітин А431 (епідермоїдна карцинома вульви людини), M-HeLa (карцинома шийки матки людини) та клітинні сублінії А431/1522 і M-HeLa/1522, що отримані шляхом трансфекції ліній клітин А431 і M-HeLa ретровірусним вектором 1522. кДНК ТФР- розміром 1,3 т. н. п. в плазміді 1522 клоновано по сайтах рестрикції EcoR I. Всі клітини вирощували у середовищах DMEM або RPMI-1640, що містили 10% ембріональної телячої сироватки (ЕТС) (Gibco BRL, Великобританія) у насиченій вологою атмосфері з 5% СО₂. Експресію кДНК ТФР- в сублініях клітин А431/1522 і M-HeLa/1522 по досягненні конфлюентного моношару індукували шляхом зміни середовища на таке, що не містить фенолового червоного з 1,5 - 3 мкМ CdCl₂, після чого клітини інкубували протягом 48 год без сироватки. Кондиційоване середовище (К-середовище) після інкубації клітин збирали для використання в подальших експериментах.

Для визначення антимікробної активності препаратів використовували культури бактерій і грибів, отримані з Української колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Реципієнтний штам E. coli HB101, трансформований рекомбінантною плазмідою 1522 (McGeady, 1989), був люб'язно наданий професором D. Salomon (Лабораторія біології та імунології раку, Національний Інститут Раку, Бетезда, США).

В дослідженнях використано клінічний матеріал після хірургічного видалення первинних пухлин вульви та шийки матки, отриманий у відділенні онкогінекології Інституту онкології АМН України (зав. науково-дослідним відділенням, професор Л.І. Воробьова). Досліджено післяопераційний матеріал 40 хворих (25 хворих на рак вульви та 15 на рак шийки матки). За клінічними та гістологічними ознаками пухлини були верифіковані як плоскоклітинний рак I-ої, II-ої та III-ої стадії. Визначення стадій проводили за класифікацією TNM (1997).

Для виділення та очищення білків та пептидів (ЕФР, ТФР-, інгібітор кінази ЕФРр (ікЕФРр)) в роботі застосовано стандартні методи препаративної біохімії, переважно хроматографічні, низькошвидкісне та ультрацентрифугування. Для дослідження отриманих препаратів використовували метод електрофорезу в градієнті поліакріламідного гелю, Вестерн-блот аналіз та радіоізотопні методи.

Очищення ТФР- проводили шляхом хроматографії на міні-колонці Sep-Pak C₁₈ (Kumar, 1990) з подальшим використанням напівпрепаративної та аналітичної рідинної хроматографії високого тиску в оберненій фазі.

Для виділення ікЕФРр К-середовище клітинних культур центрифугували, ліофілізували та застосовували послідовність хроматографічних процедур, в яких критерієм відбору фракцій на проміжних стадіях очищення була наявність бактерицидної активності по відношенню до Bacillus subtilis. Активні фракції об'єднували, концентрували за допомогою міні-колонок Sep-Pak C₁₈ та проводили послідовно гель-фільтрацію високого тиску на колонці ТSK-GEL Toyopearl HW-40 (Toyo Soda, Японія), рідинну хроматографію високого тиску в оберненій фазі (ОФ РХВТ) та рехроматографію на колонці Ultrasphere ODS 5m (Beckman, США). Гомогенність та чистоту отриманого препарату перевіряли методом електрофорезу в редукуючих умовах (Леммлі, 1970).

Для отримання ¹²⁵І-ЕФР проводили йодування за методом Грінвуда (1963), використовуючи як зв'язуючий агент хлорамін Т. Радіоактивність осадів визначали на гамма-лічильнику `Гамма-1" (СРСР).

Для отримання препаратів плазматичних мембран з культивованих клітин використовували метод Payrastre (1991).

Визначення фосфокіназної активності білків клітин та препаратів плазматичних мебран проводили з використанням [³²P] - -АТФ за стандартними методиками (Иващенко, 1986). В ряді випадків після реакції фосфорилювання білки розділяли електрофорезом в поліакріламідному гелі, проводили перенос на нітроцелюлозні мембрани та використовували метод імуноблотингу (Вестерн-блот-аналіз) з застосуванням анти-фосфотирозинових антитіл.

Для Вестерн блотингу, що проводився за стандартною схемою, білки після електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності ДСН переносили на нітроцелюлозну мембрану (Schleicher&Schull, Німеччина) та проявляли з використанням 4-хлор-1-нафтолу, як субстрату для пероксидази, або набору реактивів ECL (Amersham, Англія).

Ковалентне зв'язування ¹²⁵І-ЕФР проводили відповідно до протоколу Иващенко Ю.Д. (1986) з використанням зшиваючого реагента біссульфосукцинімідилсуберату (Pierce, США).

Електрофорез білків з додецилсульфатом натрію проводили у вертикальних пластинах, в системі буферів Леммлі (1970), в 7-22% або 15-22% градієнтних поліакриламідних гелях, використовуючи апарати “Біорух" (Україна). При необхідності візуалізації низькомолекулярних білків та пептидів зразки розділяли електрофоретично з використанням Тріс/Тріцинового буфера (Liu, 1999) або оцтової кислоти з додаванням сечовини (Остерман, 1983). Гелі після електрофорезу забарвлювали діамантовим синім Coomassie G250 або азотнокислим сріблом (Deutscher, 1990). Ізоелектричну точку пептидів визначали за стандартною методикою (Deutscher, 1990; Остерман, 1983).

Забарвлені поліакриламідні гелі висушували під вакуумом на апараті “Гель-1" (СРСР) і в випадках радіоактивно мічених зразків експонували від 20 хв до 5 діб (в залежності від активності проб) при - 20^оС з рентгенівською плівкою KODAK BioMax або KODAK XAR (Eastman Kodak, США) в касеті з підсилюючим екраном Hyperscreen (Amersham, Великобританія).

Визначення концентрації білку проводили за методом, розробленим Greenberg i Craddock (1982).

За основу при міченні клітин ³⁵S-метіоніном та імунопреципітації було взято протоколи, запропоновані Weber та Gill (1984).

Для дослідження впливу ікЕФРр на активність цитозольних протеїнкіназ, для імунопреципітації протеїнкіназ і їх фосфорилювання in vitro за основу було взято протокол Law (1984).

Кількість та афінність молекул ЕФРр на поверхні клітин оцінювали за допомогою ПАП-методу (пероксидаза-антипероксидаза) з використанням моноклональних антитіл (МКАТ), вторинних кролячих антитіл проти Ig мишей та ПАП комплексу (Пинчук В.Г. и др. 1990). Аналіз та обробку препаратів проводили з використанням світлового мікроскопу і програми Statistika 3.0, яка дозволила проводити розрахунки для груп середніх (М) та похибок середніх арифметичних (м).

Для визначення гемолітичної активності ікЕФРр досліджували лізис еритроцитів в шарі агарози. Суспензію еритроцитів заливали у 70 мм пластикові чашки Петрі (Росія), після чого в шарі агарози пробивали лунки діаметром 3 мм, куди вносили тестований матеріал в серійному розведенні. Після інкубації при 30^оС протягом 5 год вимірювали діаметр зон гемолізу і обчислювали залежність площі зони від логарифму концентрації ефектора.

Для оцінки впливу пептиду на проліферативну активність культивованих клітин застосовано варіант методу, основаного на включенні міченого тимідину в ДНК клітин, що використовується для визначення бласт-трансформації лімфоцитів згідно методу Тессенова (1979). Активність проб визначали на рідинному сцинцілляційному лічильнику Intertechnique SL-30 (Франція).

Дослідження впливу hBD-2 на крупноблочну фрагментацію геномної ДНК в пухлинних клітинах проводили, як описано в роботі Heller (1989).

Для отримання клонів клітин, що гіперекспресують ТФР-, було використано лінії клітин людини А431 та М-HeLa. Введення провірусної ДНК в клітини РА317 здійснювали методом електротрансфекції (Neumann, 1982; Агаркова, 1987) з подальшою селекцією клітин, що продукують рекомбінантні вірусні частинки. Клітини інфікували та проводили клонування і селекцію з G418 (Gibco, Великобританія).

Плазмідну ДНК виділяли шляхом екстракції сумішшю фенол-хлороформ (1:

1), як описано Birnboim (1983). Препарат плазмідної ДНК зберігали в етанолі при - 20^оС.

ДНК-зонди мітили за допомогою набору для нік-трансляції та [³²P] - dCTP (Amerscham,CША), враховуючи рекомендації фірми-виробника. Виділення фрагментів ДНК, що включили [³²P] dNTP, проводили на хроматографічній колонці з сефадексом G-50. Радіоактивність зонду вимірювали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника LS 30 (Intertechnigue, Франція).

Виділення сумарної РНК з культивованих клітин та післяопераційного матеріалу проводили за методом P. Chomczynski (1987). Концентрацію та ступінь чистоти зразку РНК визначали на спектрофотометрі Beckman DU-8B та в 1% агарозному гелі, що містив 20% формальдегіду.

Геномну ДНК виділяли за модифікованим методом Johns (1989).

Елюцію ДНК з поліакриламідних гелів проводили шляхом дифузії, з агарозних гелів - плавленням із застосуванням набору Gene Clean №3105 (BIO 101, Inc., Канада) згідно з протоколом фірми-виробника. Очистку ДНК проводили стандартним фенол-хлороформним методом (Маниатис, 1984).

Нозерн - та Саузерн-блот-гібридизацію нуклеїнових кислот проводили згідно протоколу Маниатиса (1984) з використанням [³²Р] - мічених зондів.

Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили з використанням ПЛР буферу та термостабільної Taq-полімерази виробництва Fermentas (Литва) за принципом “Hot Start”. Аналіз ампліфікованої ДНК здійснювали використовуючи метод електрофорезу.

Послідовність олігонуклеотидних затравок добиралась за допомогою комп'ютерної програми Oligo з використанням даних про нуклеотидну послідовність генів, що досліджувались, та їх мРНК, отриманих з генетичного банку даних на Internet-сайті Американського Центру Біотехнологічної Інформації (www.ncbi. nlm. nih.gov). Оптимальні умови ампліфікації для кожної пари олігонуклеотидних затравок підбирались в експерименті на геномній ДНК людини, виходячи з теоретично передбачених за допомогою програми Oligo.

Реакцію зворотньої транскрипції (ЗТ-ПЛР) проводили в об'ємі 20 мкл з використанням набору для синтезу кДНК RevertAidTM, First Strand cDNA Synthesis Kit (№К1621, Fermentas, Литва). Синтезовану кДНК зберігали при 20⁰С.

Для перевірки генетичної належності фрагментів ДНК, отриманих в результаті полімеразної ланцюгової реакції, проводили реакцію рестрикції з використанням ендонуклеаз рестрикції AluI, BstNI, DdeI, EcoRI, HaeIII, HincII, MspI (Маниатис, 1984).

Для аналізу виділеної та синтезованої в умовах ПЛР ДНК використовували методи електрофорезу в горизонтальному агарозному та вертикальному поліакриламідному гелях. Після проведення електрофорезу ДНК детектували в ультрафіолетовому світлі на трансілюмінаторі.

Антимікробну активність препаратів визначали за пригніченням росту бактерій в тонкому шарі агарози за модифікованим методом Hultmark (1983). Для визначення мінімальної інгібіторної концентрації ікЕФРр використовували серійні розведення досліджуваних пептидних зразків. Летальну концентрацію пептиду визначали екстраполяцією лінійної залежності на нульове значення площі зони лізису. Аналогічно тестували активність пептидів проти грибів, що висівали на сусло-агар.

Дослідження впливу вірусної інфекції на експресію генів дефенсинів in vitro проводили стандартним методом інфікування клітин А431 еталонним штамом аденовірусу 5 типу (Носач, 1982). Аналіз вірус-специфічних включень аналізували, використовуючи люмінісцентний мікроскоп МЛ-2 (ЛОМО, Росія).

Для клонування гена hBD-2 було обрано вектор pGEX-2T. Олігонуклеотидні затравки були наступного складу: 5` - ___ - пряма, 5` - _____ - зворотня. Ампліфікацію фрагмента кДНК гена hBD-2 для клонування проводили на кДНК, отриманої в результаті ЗТ-ПЛР. Культивування бактерій, очистку плазмідної ДНК, реакції рестрикції та лігування, проводили за стандартними методиками (Маниатис, 1984). Для отримання продуцента рекомбінантного hBD-2, в складі химерного білку (злитого з глутатіон-S-трансферазою (GST), використовували штам E. coli XL-Gold. Відбір рекомбінантних колоній на наявність вставки фрагмента кДНК гена hBD-2 проводили шляхом скринінгу плазмідної ДНК методом ПЛР та рестриктним аналізом. Рекомбінантні плазміди просиквеновані з метою виявлення можливих помилок в послідовності кДНК гена hBD-2 та згідно сиквенсу відібрано клон, що використовувався в подальшій роботі.

Очистку рекомбінантного hBD-2 з лізату клітин E. coli XL-Gold, попередньо індукованих IПTГ, проводили шляхом афінної хроматографії на колонці з глутатіон-НT-сефарозою. Після протеолізу химерного білку тромбіном (Sigma, США), hBD-2 очищали методом іонообмінної хроматографії на колонці MonoSP.

Гібридому, що секретує моноклональні антитіла до hBD-2, отримано в результаті соматичної гібридизації спленоцитів мишей лінії BALB/c з клітинами мишиної мієломи SP2/0. Було використано варіант довгострокової імунізації із залученням рекомбінантного hBD-2. Через три доби після останньої імунізації проводили гібридизацію клітин селезінки з клітинами мієломи з використанням 50% поліетиленгліколю (PEG-1500) в 1мМ NaOH за методом Davidson R. тa Gerald P. (1978). Після селекції клітинних гібридів у ГАТ та ГТ середовищах скринінг продукції специфічних антитіл здійснювали методами ELISA та Вестерн-блотингу. Після клонування, реклонування і культивування in vitro було відібрано клон гібридоми, що активно продукує антитіла до hBD-2.

Імуногістохімічні дослідження проводили на парафінових зрізах за схемою непрямого методу виявлення антигенів із застосуванням авідин - біотинової системи та пероксидази в якості ферментної мітки згідно стандартних протоколів. Для блокування ендогенної пероксидази застосували 0,3 % розчин перекису водню протягом 30 хвилин, розведення антитіл - 1/2000. Дослідження проводили за допомогою мікроскопу Axioplan (Zeiss, Німеччина) із застосуванням імерсійного об`єктиву (х100). Система вводу зображень складалася з відеокамери Sony DXC-151AP із композитним відеовиходом, плати відеовходу EZ Capture, комп`ютера Pentium III та програми аналізу зображень ImagePro (Media Cybernetic, США). Обробку даних проводили за допомогою програми Statistika 3.0.

Статистичну обробку результатів досліджень проводили в пакетах програм Origin 5.0 i GraphPad Prism 2.0. Цифровий матеріал, що наведено в дисертаційній роботі, підлягав варіаційно-статистичній обробці (Урбах, 1975). Результати вважали достовірними при коефіцієнті вірогідності Р 0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Визначення фрагментів кДНК дефенсинів лише після 40 циклів ампліфікації свідчило про невисокий рівень експресії цих генів в клітинах вищезгаданих ліній. Експресія гена HD-6 в клітинах СЕМ та Molt-4, а також експресія генів HNP-1 та HNP-3 в клітинах гліобластоми U251 була виявлена вперше в клітинах такого типу (Табл.3).

На основі отриманих даних можна зробити припущення про дерегуляцію/блокування нормальної експресії генів дефенсинів в злоякісно трансформованих клітинах.

Таблиця 3

Експресія генів дефенсинів в культурах пухлинних клітин людини

Примітка: /+/ - наявність експресії гена /-/ - експресії гена не зафіксовано

Згідно даних літератури рівень експресії генів б-дефенсинів та hBD-1 має конститутивний характер, а експресія гена hBD-2 є стимул-залежною і може бути індукована у відповідь на мікробну інфекцію внаслідок контакту з бактеріальними агентами чи ЛПС. У зв'язку з цим було проведено дослідження, що мало за мету встановлення впливу бактеріальних агентів на рівень експресії генів дефенсинів in vitro в лініях пухлинних клітин А431 та M-HeLa. Цими дослідженнями встановлено, що 6 годинна інкубація клітин А431 або M-HeLa з живими або стерилізованими кип'ятінням клітинами B. subtilis (2,5 x 10⁹ клітин) призводить до індукції експресії мРНК hBD-2, але не впливає на рівні експресії генів hBD-1 та HD-6 в цих клітинах.

Таким чином, отримані дані підтвердили, що експресія генів hBD-1 та HD-6 є конститутивною та не залежить від наявності зовнішніх стимулів, в той час як наслідком бактеріальної інфекціі є індукція експресії гена hBD-2, а вірусна інфекція не впливає на експресію цього гена.

Задачею даної роботи було також дослідити, як впливає вірусна інфекція на експресію генів дефенсинів in vitro. Дані літератури відносно противірусної дії дефенсинів малочисельні. В той же час найпоширеніші форми раку у жінок (а саме плоскоклітинний рак шийки матки та вульви), згідно сучасних поглядів, асоційовані з інфекцією певними серотипами папіломних вірусів. Клітинні лінії А431 та M-HeLa, як відомо, мають походження із злоякісних новоутворень вульви та шийки матки людини відповідно. Методом ПЛР з використанням вироджених праймерів до ДНК вірусів HPV була підтверджена наявність вірусної ДНК в геномі клітин лінії M-HeLa. Як і передбачалось, ЗТ-ПЛР дала негативну відповідь. Тобто, за нормальних умов культивування та за умов культивування клітин з культурою B. subtilis вірус папіломи в цих клітинах перебуває в стані провірусу та не транскрибується.

Отримані дані показали, що продукція рекомбінантного ТФР- клітинами клону А431/1522 індукує секрецію антимікробного пептиду з властивостями інгібітора кінази ЕФРp. Біохімічними методами було встановлено, що досліджуваний пептид є бета-дефенсином-2 людини. Для підтвердження цих даних було проведено дослідження спектру експресії мРНК дефенсинів клітин А431/1522 при культивуванні з 3 мкМ Cd²⁺ протягом 1, 3, 6, 9 та 12 год. Після проведення ЗТ-ПЛР було встановлено, що починаючи з 6 години такої інкубації клітини А431/1522 експресують мРНК hBD-2 (Рис.6, а). При цьому змін в рівні експресії генів hBD-1 в залежності від дії рек-ТФР- не спостерігалось. За умов стимуляції клітин ліній А431 та M-HeLa екзогенним ЕФР (10 мкг/мл) індукцію експресії мРНК hBD-2 було відмічено, починаючи з 2 годин інкубації, але змін в рівні експресії генів hBD-1 та HD-6 не спостерігали.

Таким чином, результати досліджень вперше продемонстрували, що транскрипція гена hBD-2 в епітеліальних клітинах може бути індукована не тільки внаслідок дії мікроорганізмів, але і факторів росту - ЕФР та ТФР-. Наші дані виявили існування спільних ланок в регуляції ЕФР-залежної системи контролю росту та системи неспецифічного імунітету.

У зв'язку з цим паралельно з дослідженням експресії генів дефенсинів в даній серії експериментів було визначено рівень фосфорилювання ЕФР-рецептора та експресію генів, що його кодують, методом напівкількісної ЗТ-ПЛР. В експерименті не було виявлено достовірного відхилення рівня експресії гена ЕФРp в зразках клітин лінії А431, що були інкубовані 6 годин в присутності ЕФР чи бактеріальних клітин, в порівнянні з таким в контрольних клітинах. Таким чином, було встановлено, що за умов індукції експресії гена hBD-2 рівень транскрипції гена ЕФРp залишається на постійному рівні.

Наступною задачею було дослідити можливість взаємозв'язку між білковими продуктами цих генів. Наші попередні дані вказували на те, що антимікробний пептид здатний пригнічувати кіназну активність рецептора. Тому було проведено експерименти по визначенню рівня аутофосфорилювання ЕФРp в клітинах лінії А431, в яких після інкубації з ЕФР, мікробною культурою чи ЛПС була індукована експресія hBD-2. Отримані дані показали, що:

1) грам-позитивні бактерії, ЛПС P. aeruginosa та ЕФР при тому, що мають різні специфічні рецептори (TLR-2, TLR-4 та ЕФРp, відповідно), викликають швидку активацію аутофосфорилювання рецептора

2) при 24 годинній інкубації клітин з мікробними тілами, ЛПС чи ЕФР знижується рівень аутофосфорилювання рецептора ЕФР,

3) тривале культивування клітин А431 в присутності цих же чинників призводить до накопичення одного й того ж білкового продукту, фосфорильованого по тирозину, що має молекулярну масу 38-42 кДа. Ці дані, як ми вважаємо, свідчать про те, що зниження кіназної активності рецептора ЕФР корелює з продукцією hBD-2 і, що спільною ланкою функціонування ЕФРp та відповіді клітини на мікробну інфекцію є білок з м. м.38-42 кДа.

Отримані результати дозволили висунути власну гіпотезу про наявність аутокринної петлі в регуляції активності рецептора ЕФР в епітеліальних клітинах за участю hBD-2. Згідно з цим припущенням, клітини реагують на екзогенні стимули (фактори росту, бактерії, ЛПС) активацією протеїн-кінази ЕФРр, наслідком якої є утворення відповідного сигнального каскаду та прискорення проліферації клітини. В той же час мітогенний стимул призводить до індукції експресії гена hBD-2, транскрипції відповідної мРНК, утворення пептиду та його секреції епітеліальними клітинами. Екзогенний hBD-2 зв'язується з рецептором ЕФР та інгібує його протеїн-кіназну активність, тим самим блокуючи надмірну проліферативну відповідь клітин.

Для дослідження властивостей ізольованого бета-дефенсину-2 людини, а також з метою подальшого отримання моноклональних антитіл проти нього, нами було клоновано відповідну кДНК, оптимізовано умови бактеріальної експресії та виділено рекомбінантний білок. Для отримання рекомбінантної молекули hBD-2 (рек-hBD-2) пептид експресували у вигляді химерного білка, кон'югованого з глутатіон-S - трансферазою (GST), та оптимізували умови його продукції.

Очистку злитого білку проводили згідно протоколу GST-fusion system (центрифугування, афінна хроматографія на GST-сефарозі, протеоліз тромбіном). Вихід рек-hBD-2 складав 200 мкг з 100 мл вихідної бактеріальної культури.

Було встановлено, що очищений рек-hBD-2 є функціонально активним та виявляє антимікробну активність в тесті Hultmark і пригнічуває протеїн-кіназну активність ЕФРр в лізатах клітин А431. Ці дані остаточно підтвердили висунуті раніше припущення про наявність у бета-дефенсину-2 людини якостей інгібітора кінази ЕФРр.

Розробка оригінальної схеми очищення рек-hBD-2 дозволила використати його як антиген при імунізації тварин для отримання моноклональних анти-hBD-2-антитіл (МКАТ) за стандартною гібридомною технологією. В результаті було отримано та реклоновано 7 клонів гібридомних клітин, що є позитивними в ELISA до hBD-2. Далі анти-hBD-2 МКАТ були напрацьовані та очищені. Їх специфічність досліджено методами Вестерн-блот аналізу та імуногістохімії. Встановлено, що анти-hBD-2 МКАТ специфічно впізнають антиген (рек-hBD-2) та нативний hBD-2 на зрізах пухлин вульви та шийки матки людини і можуть бути використані для аналізу експресії hBD-2 в пухлинах різної локалізації.

Дослідження, проведені in vitro, продемонстрували, що в злоякісних клітинах, що мають походження з пухлин шийки матки та вульви людини, експресуються гени дефенсинів, причому експресія hBD-2 індукується у відповідь на дію факторів росту та може впливати на активність кінази рецептора ЕФР. З чисельних даних літератури відомо, що пухлини вульви та шийки матки людини характеризуються гіперекспресією мРНК ЕФРр та ЕФР. Цей показник свідчить про поганий прогноз захворювання і може бути наслідком експресії генів папіломатозних вірусів в пухлинних клітинах. Тому наступною задачею даної роботи було проведення експериментів по визначенню рівня експресії генів дефенсинів в злоякісних новоутвореннях шийки матки та вульви людини у порівнянні з нормальною тканиною того ж гістогенезу та їх можливу асоціацію з папіломовірусною інфекцією та гіперекспресією мРНК ЕФРр.

В даній серії експериментів досліджено експресію генів дефенсинів hBD-1, hBD-2 та HD-6 на клінічному матеріалі, отриманому із зразків 25 пухлин вульви та 15 пухлин шийки матки (Табл.4,5). Контролем була макроскопічно незмінена тканина тих же паціентів, що видалялася під час операції, згідно правил проведення операцій такого типу. У всіх зразках пухлин і лише у деяких зразках нормальних тканин отримана позитивна відповідь при проведенні ПЛР на інфікованість папіломавірусом (Табл.4,5).

В усіх досліджуваних зразках пухлин вульви та шийки матки виявлено високий рівень експресії гена hBD-2, при цьому в жодному з досліджених зразків макроскопічно незміненої тканини експресію гена hBD-2 не було зареєстровано. Поряд з цим, у 70% випадків в зразках пухлинної тканини рівень експресії гена hBD-1 був вищим у порівнянні з таким у зразках нетрансформованих тканин.

Достовірних закономірностей відносно рівня експресії гена НD-6 в пухлинній тканині в порівнянні з макроскопічно незміненою не отримано. Крім того, аналіз макроскопічно незмінених і трансформованих тканин вульви та шийки матки людини дозволив встановити, що в клітинах усіх досліджених зразків пухлин та в 30 % зразків умовно нормального епітелію вульви та шийки матки людини присутня ДНК папіломавірусу (Табл.4,5). Отримані нами дані виявили гіперекспресію мРНК ЕФРр в пухлинах вульви та шийки матки у порівнянні з відповідними зразками умовно нормальних тканин.

Таблиця 4

Експресія генів hBD-1, hBD-2, HD-6 та наявність ДНК HPV в зразках пухлин (П) та умовно-нормального епітелію (Н) вульви людини