Таблиця 5

Експресія генів hBD-1, hBD-2, HD-6 та наявність ДНК HPV в зразках пухлин (П) та умовно-нормального епітелію (Н) шийки матки людини

Примітка: /+/ - низький рівень експресії мРНК чи вмісту анти - hBD-2 антитіл; /++/ - середній рівень експресії мРНК чи вмісту анти - hBD-2 антитіл; /+++/ - високий рівень експресії мРНК чи вмісту анти - hBD-2 антитіл; /-/ - ДНК HPV не виявлено; /+/ - ДНК HPV виявлено; /*/ - маркер не досліджувався, ААТ - анти - hBD-2 антитіла в сироватці крові хворих.

Таким чином, узагальнюючи отримані дані, можна зробити висновок, що злоякісно трансформований епітелій вульви та шийки матки людини, на відміну від нормального епітелію, характеризується підвищеними рівнями експресії генів hBD-1 та ЕФРр та наявністю експресії гена hBD-2, яка жорстко асоційованою з пухлинними новоутвореннями.

Імуногістохімічне дослідження експресії hBD-2 з використанням моноклональних анти-hBD-2-антитіл доповнило дані щодо гіперекспресії мРНК hBD-2 в пухлинах шийки матки та вульви людини та дозволило встановити, що цей пептид інтенсивно експресується в цитоплазмі пухлинних клітин.

Таким чином, отримані дані продемонстрували, що злоякісні новоутворення вульви та шийки матки людини характеризуються гіперекспресією бета-дефенсину-2 як на рівні мРНК, так і на рівні білку. В той же час з даних літератури відомо, що hBD-2 є біомолекулою з високим рівнем імуногенності та має ад'ювантну активність. У зв'язку з цим було висунуто припущення, що підвищена експресія hBD-2 в пухлинах шийки матки та вульви людини може мати наслідком появу в сироватці хворих анти-hBD-2-аутоантитіл. Для перевірки цієї гіпотези рівень анти-hBD-2-антитіл в сироватці онкологічних хворих було досліджено імуноферментним методом (ELISA) з використанням рек-hBD-2 в якості антигена (Табл.4,5). Отримані дані дозволили встановити, що відносний рівень анти-hBD-2-аутоантитіл в сироватці крові хворих на рак шийки матки та вульви є підвищеним у порівнянні з таким у здорових донорів.

Узагальнюючи наведені дані, можна зробити висновок про наявність гіперекспресії бета-дефенсину-2 в пухлинних клітинах шийки матки та вульви людини. Беручи до уваги антипроліферативну активність hBD-2 як інгібітора кінази рецептора ЕФР, можна висунути припущення про потенційну пухлино-супресорну функцію hBD-2 в епітеліальних клітинах пухлин шийки матки та вульви людини. Наявність підвищеної експресії пептиду в пухлинах вульви може зумовлювати появу анти - hBD-2-аутоантитіл в сироватці крові онкологічних хворих.

Висновки

Робота присвячена дослідженню ролі дефенсинів в регуляції активності рецептора ЕФР в пухлинних клітинах людини. Отримані дані дозволили встановити, що бета-дефенсин-2 людини є аутокринним ефектором протеїн-кіназної активності ЕФРр, і, відповідно, може впливати на проліферацію малігнізованих та нормальних епітеліальних клітин людини.

Створено експериментальні клітинні сублінії А431/1522 та M-HeLa/1522, що контрольовано продукують функціонально активний рекомбінантний ТФР- в зрілій та мембранозв'язаній недопроцесованій формах.

Показано, що тривала аутокринна стимуляція клітин сублінії А431/1522 рекомбінантним ТФР- призводить до зниження рівней фосфорилювання ЕФРр та проліферації клітин та секреції пептиду з властивостями інгібітора кінази ЕФРр.

Встановлено ідентичність інгібітора кінази ЕФРр з бета-дефенсином-2 людини (hBD-2).

Встановлено, що hBD-2 поряд з широким спектром антимікробної, цитолітичної і гемолітичної активності має властивості інгібітора низки тирозин - та серин/треонін-кіназ (ЕФРр, ??Syk, Lyn та PKC).

Показано, що в клітинах А431 та M-HeLa експресія гена hBD-2 може бути індукована дією ЕФР, ТФР-, грам-позитивних бактерій B. subtilis та ліпополісахаридом з P. aeruginosa.

Встановлено, що за умов експресії hBD-2 рівень експресії мРНК ЕФРр не змінюється, проте знижується рівень протеїн-кіназної активності ЕФРр.

Доведено, що клітини злоякісних новоутворень вульви та шийки матки людини на відміну від умовно-нормальних клітин характеризуються підвищеним рівнем експресії генів hBD-1 і ЕФРр та наявністю експресії hBD-2 на рівні мРНК та білка.

8. Методами генної інженерії отримано та охарактеризовано біологічно-активний рекомбінантний бета-дефенсин-2 людини і оптимізовано умови його продукції.

9. Отримано та охарактеризовано анти-hBD-2-моноклональні антитіла, що специфічно розпізнають рекомбінантний та нативний hBD-2 в Вестерн-блот аналізі та на парафінових зрізах пухлин.

10. Запропоновано схему аутокринної регуляції ЕФРр за участю hBD-2.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Погрібний П.В. Ендогенні пептидні антибіотики як фактори імунітету тварин // Біополімери і клітина. - 1998. - Т.14, №6. - С.512-518.

2. Phylchenkov A., Slukvin I., Pogrebnoy P. V., Kudryavets Yu., Didkovskaya L., Kulik G., Chernishov V., Bykorez A. Application of flow cytometry with anti-EGF-receptor antibody and ¹²⁵I-EGF binding assay for detection of EGF-receptors in certain human tumor cell lines // Эксперим. онкология. - 1992. - Т.14, №1. - С.45-49. (Автором проведено дослідження in vitro з використанням анти-ЕФРр антитіл і ¹²⁵ І-ЕФР, підготовлено статтю до друку).

3. Кулик Г.А., Кононенко Л.И., Погребной П.В., Быкорез А.И. Влияние 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата и аденозин-3'-фосфата на димеризацию рецепторов эпидермального фактора роста и ассоциацию димеров с цитоскелетом клеток линии А431 // Эксперим. онкология. - 1992. - Т.14, № 6. - С.27-32. (Автором проведено дослідження in vitro та ковалентне мічення ЕФРр, сформульовано висновки роботи).

4. Погребной П.В., Гарманчук Л.В., Серов С.М., Кленчин В.А., Лукьянов А.В., Тарнавский Д., Маркеева Н.В., Быкорез А.И. Экспрессия гена ТФР альфа, перенесенного рекомбинантным ретровирусным вектором в клетки А431 // Молекулярная биология. - 1993. - Т.27, №4. - С.833-838. (Автором проведено трансфекцію клітин А431 ретровірусним вектором та проаналізовано отримані клони, підготовлено статтю до друку).

5. Погребной П.В., Гарманчук Л.В., Лукьянов А.В., Тарнавский Д., Быкорез А.И. Трансформирующий фактор роста типа альфа стимулирует экспрессию белка-аналога рецептора эпидермального фактора роста // Эксперим. онкология. - 1993. - Т.15, №5. - С.30-32. (Автором сформульовано задачі дослідження, проведено дослідження in vitro, підготовлено статтю до друку).

6. Погребной П.В., Гарманчук Л.В., Лукьянов А.В., Маркеева Н.В., Белоус Н.И., Быкорез А.И. Уменьшение экспрессии рецептора эпидермального фактора роста в клетках сублиний А431/1522-4 со встроенным геном трансформирующего фактора роста типа альфа // Эксперим. онкология. - 1994. - Т.16, №1. - С.37-40. (Автором сформульовано задачі дослідження, проведено дослідження in vitro, проаналізовано результати, підготовлено статтю до друку).

7. Kulik G. A., Kartel A. A., Kononenko L.I., Tarnavski D. V., Pogrebnoy P. V., Bykorez A.I. Transforming growth factor-б and epidermal growth factor stimulate oligomerization and autophosphorylation of epidermal growth factor receptor in A431 living cells // Эксперим. онкология. - 1994. - Т.16, №1. - С.33-36. (Автором проведено дослідження in vitro, сформульовано задачі дослідження, проведено аналіз даних літератури, підготовлено статтю до друку).

8. Маркеева Н.В., Гарманчук Л.В., Погребной П.В. Аутофосфорилирование рецептора эпидермального фактора роста в клетках линии А431 и сублинии А431/1522-4 при действии ЭФР/ТФР-б // Эксперим. онкология. - 1994. - Т.16, №4-6. - С.453-457. (Автором проведено дослідження in vitro з використанням ізотопу фосфору, підготовлено статтю до друку).

9. Глушков А.Н., Аносова Т.П., Аносов М.П., Гарманчук Л.В., Погребной П.В. Выявление антител против рецептора эпидермального фактора роста в сыворотке крови онкологических больных // Эксперим. онкология. - 1996. - Т.18, №1. - С.81-83. (Автором проведено аналіз сироваток крові хворих, підготовлено статтю до друку).

10. Соловьян В.Т., Андреев И.О., Колотова Е.Ю., Погребной П.В., Тарнавский Д.В. Упорядоченная деградация ядерной ДНК как специфическая геномная реакция, сопровождающая апоптоз, ответ на стресс и дифференцировку // Биополимеры и клетка. - 1996. - Т.12,№ 3. - С.67-76. (Автором проведено дослідження in vitro та молекулярно-біологічні дослідження ДНК клітин, підготовлено статтю до друку).

11. Погребной П.В., Гарманчук Л.В., Маркеева Н.В., Протас А.Ф., Быкорез А.И. Особенности влияния мелиттина и его триптолитического фрагмента на активность протеинкиназы С // Биополимеры и клетка. - 1996. - Т.12, № 3. - С.41-46. (Автором проведено дослідження активності протеїнкінази С та аналіз отриманих триптолітичних фрагментів, підготовлено статтю до друку).

12. Sololov'yan V. T., Andreev I. O., Kolotova T. Yu., Pogribniy P. V., Tarnavsky D. T., Kunach V. A. The cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments occurs not only during apoptosis but also accompanies changes in functional activity of the nonapoptotic cells // Exp. Cell Res. - 1997. - V.235. - С.130-137. (Автором проведено дослідження in vitro та молекулярно-біологічні дослідження ДНК клітин, підготовлено статтю до друку).

13. Погребной П.В., Гарманчук Л.В., Маркеева Н.В., Хобта А.И., Серов С.М., Быкорез А.И. Гиперэкспрессия трансформирующего фактора роста альфа клетками M-HeLa/1522 // Эксперим. онкология. - 1997. - Т. 19, №1. - С.50-55. (Автором проведено трансфекцію клітин M-HeLa ретровірусним вектором та проаналізовано отримані клони, підготовлено статтю до друку).

14. Погребной П.В., Хобта А.И., Гарманчук Л.В., Маркеева Н.В. Ингибирование киназной активности рецептора ЭФР гидрофобным пептидом, секретируемым клетками А431/1522 // Эксперим. онкология. - 1997. - Т. 19, № 4. - С.296-299. (Автором проведено дослідження in vitro кіназної активності ЕФРр, підготовлено статтю до друку).

15. Гарманчук Л.В., Хобта А.И., Маркеева Н.В., Погребной П.В., Быкорез А.И. Изменение соотношений молекулярных форм трансформирующего фактора роста альфа и мРНК рецептора ЭФР при гепатоканцерогенезе, индуцированном N-нитрозодиэтиламином у крыс // Эксперим. онкология. - 1998. - Т. 20, №1. - С.29-32. (Автором проведено біохімічне дослідження молекулярних форм ЕФРр, проаналізовано результати, підготовлено статтю до друку).

16. Pogrebnoy P. V., Hobta A.I., Soldatkina M. A., Garmanchouk L. V., Markeeva N. V., Eremenko T. A protein kinase inhibitor from A431 subline overexpressing TGFa possesses antimicrobial activity // New Microbiologica. - 1998. - V.21, №3. - Р.269-273. (Автором проведено дослідження in vitro та мікробіологічні дослідження, підготовлено статтю до друку).

17. Hobta A.I., Pogrebnoy P. V. Mammalian peptide antibiotics as regulatory and anticancer agents // Exp. Oncol. - 1998. - V. 20, № 3-4. - P.170-179. (Автором проведено збір та аналіз даних літератури, підготовлено огляд до друку).

18. Погребной П.В., Кухаренко А.П., Тихонкова И.А., Пальчевский С.С., Савинская Л.А., Погребная А.П., Валевка Т.И., Маркеева Н.В., Солдаткина М.А., Мацука Г.Х., Гут И.Т., Филоненко В.В. Получение и характеристика моноклональних антител против р70S6-киназы б // Эксперим. онкология. - 1999. - Т.21, №3-4. - с.232-238. (Автором проведено вдосконалення методики отримання гібридомних клітин, отримано анти-р70S6К-моноклональні антитіла, підготовлено статтю до друку).

19. Лісовський І.Л., Хобта А.І., Солдаткіна М.А., Литвин Д.І., Маркеєва Н.В., Сидорик Л.Л., Погрібний П.В. Експресія гена дефенсину-6 (HD-6) у лініях пухлинних клітин людини // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т.16, №6. - С.525-529. (Автором проведено дослідження in vitro та молекулярно-біологічні дослідження, проаналізовано отримані дані).

20. Lisovskiy I. L., Soldatkina M. A., Lytvyn D.I., Markeeva N. V., Turchak O. V., Nespryad'ko S. V., Vinnitskaya A. B., Pogrebnoy P. V. Expression of defensins genes in А431 and М-Hela cell lines and in tumors of human vulval and cervical carcinoma // Эксперим. онкология. - 2001. - Т.23, №2. - С.119-122. (Автором проведено дослідження in vitro та молекулярно-біологічні дослідження, проаналізовано отримані дані, підготовлено статтю до друку).

21. Lisovskiy I. L., Soldatkina M. A., Lytvyn D.I., Markeeva N. V., Turchak O. V., Nespryad'ko S. V., Vinnitskaya A. B., Nosach L. N., Povnitsa O. U., Pogrebnoy P. V. Pattern of expression of beta-definsin-2 (hBD-2) and EGFR mRNA in malignant cells of human cervix and vulvae // Эксперим. онкология. - 2001. - Т.23, №4. - С.248-252. (Автором проведено забір клінічних зразків та молекулярно-біологічні дослідження, проаналізовано отримані дані, підготовлено статтю до друку).

22. Hobta A.I., Lisovskiy I. L., Mikhalap S., Kolybo D., Romanyuk S., Soldatkina М., Markeeva N., Garmanchouk L., Sidorenko S., Pogrebnoy P. Epidermoid Carcinoma derived Antimicrobial Peptide (ECAP) inhibits phosphorylation by protein Kinases in vitro // Cell Biochem Func. - 2001. - № 19. - Р.291-298. (Автором проведено дослідження in vitro та імунопреципітацію кіназ, проаналізовано отримані дані, підготовлено статтю до друку).

23. Pogribnoy P. V., Lisovskiy I. L., Markeeva N. V., Shnitsar V. M., Zinchenko I.I., Soldatkina M. A. Produсtion of recombinant of hBD-2 - human antimicrobial peptide expressed in cervical and vulval cancer // Эксперим. онкология. - 2003. - Т.25, №1. - С.36-39. (Автором проведено клонування та характеристика рекомбінантного пептиду, підготовлено статтю до друку).

24. Shnitsar V. M., Soldatkina M. A., Zinchenko I.I., Markeeva N. V., Rodnin N. V., Nespyadko S. V., Turchak O. V., Vinnitskaya A. B., Pogrebnoy P. V. Autoantibodies against human beta-defensin-2 in the blood serum of patients with vulval and cervical cancer // Эксперим. онкология. - 2003. - Т.25, №3. - С.155-157. (Автором проведено дослідження сироваток крові хворих методом ELISA, проаналізовано отримані дані).

25. Лісовський І.Л., Солдаткіна М.О., Литвин Д.І., Шніцар В.М., Маркеєва Н.В., Сєров С.М., Погрібний П.В. Гіперекспресія трансформуючого фактору росту та механізми контролю росту клітин лінії А431/1522 // “Шляхи та перспективи розвитку експериментальної онкології в Україні”, під. ред. Чехуна В.Ф. // “ДІА”, Київ, 2001. - С.70-77.

26. Tarnavski D. V., Garmanchuk L. V., Markeeva N. V., Pogrebnyi P. V. Expression of TGF-б gene transferred into M-Hela, A431 human cells // Тези The Protein Society, First European Symposium, Switzerland, Davos. - 1995. - Р.104.

27. Hobta A.I., Garmanchouk L. V., Markeeva N. V., Pogrebnyi P. V. The novel antimicrobial peptide production in culture of human carcinoma A431 cells transfected with TGFa gene // Тези 8^th European Congress on Biotechnology, Hungary, Budapest. - 1997. - Р.96-97.

28. Hobta A., Lisovskiy I., Soldatkina M., Markeeva N., Pogribnoy P. Inhibition of the protein kinases by ECAP // Тези 26^th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, France, Nice. - 1999. - Р.256.

29. Lisovsky I., Hobta A., Soldatkina M., Pogrebnoy P. V. Detection of expression of beta defensin gene in human tumor cells // Тези П съезда онкологов стран СНГ, Украина, Киев. - 2000. - С.145.

30. Lisovsky I., Hobta A., Soldatkina M., Garmanchuk L., Lytvyn D., Pogribnyi P. Induction of cationic antimicrobial peptides in cultured cells exposed to ligands of EGF receptor // Тези 3^th Parnas Conference “Mechanisms of cellular signal transduction and communication”, Ukraine, Lviv. - 2000. - Р.82.

31. Lisovskiy I., Hobta A., Soldatkina M., Garmanchouk L., Markeeva N., Lytvyn D., Pogribnyi P. Detection of mRNA for beta-defensin 2 in human cell lines of epithelial origin // Тези 18^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, UK, Birmingham. - 2000. - Р.162.

32. Lisovskiy I. L., Soldatkina M. A., Lytvyn D.I., Markeeva N. V., Nosach L. N., Povnitsa O. U., Pogrebnoy P. V. Expression pattern of defensin genes in cervical and vulval cancer cells // Тези Intern. Sympos. Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems, Ukraine, Kyiv. - 2001. - Р.76.

33. Лісовський І.Л., Солдаткіна М.О., Погрібний П.В. Експресія генів дефенсинів в пухлинах генітальної системи людини // Тези Х з'їзд онкологів України, Україна, Крим. - 2001. - С.45.

34. Pogrebnoy P. V., Markeeva N. V., Lisovskii I. L., Soldatkina M. A. Defensin and EGFR mRNA expression in transformed human cells // Тези 4^th Parnas Conference “Molecular mechanisms of cell activation: biological signals and their target enzymes”, Poland, Wroclaw. - 2002. - Р.70.

35. Soldatkina M. A., Markeeva N. V., Lisovskii I. L., Podrebnoy P. V. Defensin and EGFR expression in human cervical, vulval and gastric tumors // Тези 4^th Parnas Conference “Molecular mechanisms of cell activation: biological target enzymes”. Poland, Wroclaw. - 2002. - Р.55.

Анотація

Погрібний П.В. Дефенсини та регуляція активності рецептору епідермального фактора росту в пухлинних клітинах людини. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія. Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р. Є. Кавецького НАН України, Київ, 2004.

Дисертація присвячена встановленню ролі дефенсинів в аутокринній регуляції активності рецептора епідермального фактора росту (ЕФРр) в пухлинних клітинах людини.

Дослідження проведено на трансформованих клітинах людини ліній A431 та M-HeLa і субліній A431/1522 та M-HeLa 1522, що контрольовано гіперекспресують TФР-, та зразках хірургічно видалених пухлин вульви та шийки матки 25 та 15 пацієнтів відповідно.

В експериментах in vitro встановлено, що при дії EФР/TФР- на трансформовані епітеліальні клітини індукується експресія бета-дефенсину-2 людини (hBD-2) на рівні мРНК та білка. Виявлено, що hBD-2 має широкий спектр біологічної активності, а саме антимікробну, протигрибкову, цитотоксичну, здатний концентраційно-залежним шляхом впливати на проліферацію культивованих клітин та інгібувати тирозин - та серин/треонин протеїн-кіназну активність EФРр, Syk, Lyn та PKC. Отримані результати дали можливість запропонувати гіпотетичну схему, згідно якої hBD-2 може приймати участь в регуляції активності ЕФРр.

Отримано рекомбінантний hBD-2 та анти-hBD-2 моноклональні антитіла, які було використано при проведенні досліджень експресії hBD-2 в пухлинах шийки матки та вульви людини. При дослідженні хірургічно видалених зразків пухлин людини виявлено, що експресія hBD-2 на рівнях мРНК та білка жорстко асоційована з пухлинними клітинами, а також з гіперекспресією ЕФРр та наявністю інфекції папіломатозними вірусами.

Ключові слова: бета-дефенсини, рецептор епідермального фактору росту, експресія, рак вульви, рак шийки матки.

Аннотация