Цитоморфологія‚ цитогенетика та імуноцитохімія в доопераційній діагностиці новоутворень щитовидної залози

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

14.01.14 - Ендокринологія

Цитоморфологія‚ цитогенетика та імуноцитохімія в доопераційній діагностиці новоутворень щитовидної залози

Божок Юрій Михайлович

Київ 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті ендокринології та обміну речовин імені В.П. Комісаренка АМН України

Науковий консультант чл.-кор. АМН України, доктор медичних наук, професор Епштейн Овсій Володимирович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, завідувач лабораторії функціональної діагностики.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Глузман Даніїл Фішелевич, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу імуноцитохімії;

доктор біологічних наук, професор Фабрі Золтан Йожефович, Ужгородський національний університет МОН України, професор кафедри біохімії та фармакології;

доктор біологічних наук Квітницька-Рижова Тетяна Юріївна, Інститут геронтології АМН України, завідувач лабораторії морфології та цитології.

Провідна установа Івано-Франківська державна медична академія, кафедра ендокринології, МОЗ України, м. Івано-Франківськ.

Захист відбудеться 23 листопада 2004 р. о 13-й годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.558.01 з ендокринології в Інституті ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (04114, м. Київ-114, вул. Вишгородська, 69).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка (04114, м.Київ-114, вул. Вишгородська, 69).

Автореферат розісланий 22 жовтня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук Калинська Л.М.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Рак щитовидної залози свого часу посідав незначне місце серед злоякісних новоутворень людини і становив 1-3% від усіх онкологічних захворювань. Однак‚ після Чорнобильської катастрофи спостерігається різке зростання захворюваності на рак щитовидної залози. Через 4 роки після аварії на ЧАЕС частота тиреоїдних раків у дітей України зросла в 4‚8 рази‚ а в наступні роки перевищила доаварійні показники в 8-10 разів [Тронько М.Д. та співавт., 1993; Lykhtarev L.A. et al., 1995; Богданова Т.И., 1996; Jacob P. et al., 1998]. Найбільш поширені форми цього раку - папілярна та фолікулярна - після тиреоїдектомії добре піддаються лікуванню радіоактивним йодом. Це дозволяє досягти разючих результатів відносно виживання пацієнтів у порівнянні з карциномами іншої локалізації. При умові відсутності екстратиреоїдної інвазії та метастазів у лімфовузли на початок лікування 20-річний період виживання спостерігається щонайменше у 95% хворих на папілярний рак. В той же час, наявність метастазів у лімфовузли зменшує цей відсоток до 80. Серед хворих з екстратиреоїдною інвазією 20 років виживає лише 70%. У випадку фолікулярного раку цифри для аналогічних груп хворих становлять 83%, 72% та 52% [Simpson W.J. et al., 1987]. З цього випливає, що встановлення правильного діагнозу на якомога ранішній стадії захворювання є важливішою передумовою позитивного кінцевого результату лікування. Саме тому було розроблено різні методи доопераційної діагностики раку щитовидної залози. До них відносяться ультрасонографія, сцинтиграфія, різні види томографії. Хоча згадані методи дозволяють підозрювати наявність неоплазії‚ встановити точний діагноз раку щитовидної залози вони не можуть. Наприклад‚ радіонуклідне сканування та сонографія мають невтішно низьку специфічність (3‚6% та 21% відповідно) відносно визначення раку щитовидної залози [Loy T.J. et al., 1989; Besznyak I. еt al., 2001]. Це спонукало до розробки й запровадження в практику найбільш ефективного на сьогоднішній день методу - доопераційної цитологічної діагностики (ДЦД)‚ що складається з тонкоголкової аспіраційної біопсії (ТАБ) та наступного цитологічного дослідження пункційного матеріалу. Розвиток ДЦД дозволив цьому методу за ефективністю вийти на один рівень з інтраопераційним гістологічним дослідженням. Обидва методи мають однакову чутливість (67%)‚ специфічність (99%) та точність (89%) щодо визначення злоякісних новоутворень [Hamming J.F. et al., 1998]. Тому вважається недоцільним проведення експрес-гістологічного дослідження при наявності конкретного цитологічного діагнозу [Sabel M.S. et al., 1997; Hamming J.F. et al., 1998].

На жаль‚ показники точності цитологічних діагнозів для різних новоутворень щитовидної залози коливаються в значних межах (67-94%). Це обумовлено існуванням ряду проблем‚ що заважають наблизити точність ДЦД до майже 100-відсоткового рівня точності післяопераційного патогістологічного дослідження. Сюди відносяться проблеми‚ пов'язані з отриманням адекватного пункційного матеріалу‚ ідентифікацією різних типів клітин на цитологічних препаратах та визначенням надійних маркерів малігнізації. Вирішити ці проблеми конче необхідно‚ адже від точності ДЦД багато в чому залежить правильний вибір тактики лікування‚ вчасність хірургічного втручання‚ а в результаті й виживання хворого.

Зв'язок роботи з науковими програмами‚ планами‚ темами. Робота виконана в рамках Українсько-американського проекту по дослідженню тиреоїдного раку та інших захворювань щитовидної залози в Україні після аварії на Чорнобильській АЕС та теми “Дослідження структурно-функціонального стану кісткової тканини у різного віку хворих на доброякісні та злоякісні новоутворення щитовидної залози в процесі радикального комбінованого лікування” (№ держреєстрації 0101U000620).

Мета й задачі дослідження. Метою цієї роботи є підвищення ефективності доопераційної цитологічної діагностики новоутворень щитовидної залози шляхом розробки нових методів, а також принципово нових підходів до визначення малігнізації тиреоїдного епітелію.

Для досягнення цієї мети поставлені наступні задачі:

1. Розробити простий спосіб швидкого визначення інформативності пунктатів під час аспіраційної біопсії новоутворень щитовидної залози для отримання адекватного пункційного матеріалу.

2. Розробити спосіб поєднання цитоморфологічних та імуноцитохімічних методів дослідження клітин на одних і тих самих цитологічних препаратах для точного визначення походження пухлинних елементів та наявності маркерів малігнізації у пунктатах новоутворень щитовидної залози.

3. Розробити спосіб визначення тиреоїдного походження новоутворень при відсутності клітинного матеріалу в пунктатах.

4. Знайти нові імуноцитохімічні та цитогенетичні маркери малігнізації фолікулярного епітелію щитовидної залози людини‚ придатні для застосування в ДЦД.

5. Запропонувати нові принципи визначення малігнізації в ДЦД новоутворень щитовидної залози.

Об'єкт дослідження - злоякісні та доброякісні новоутворення з фолікулярного епітелію щитовидної залози людини.

Предмет дослідження - маркери малігнізації фолікулярного епітелію щитовидної залози людини.

Методи дослідження:

1. Морфологічні - для вивчення особливостей будови клітин та клітинних комплексів у доброякісних та злоякісних новоутвореннях.

2.Цитохімічні - для вивчення особливостей хімічного складу та ензимохімічних особливостей досліджуваних клітин.

3.Імуноцитохімічні - для визначення наявності й локалізації у клітинах доброякісних і злоякісних новоутворень певних макромолекул‚ які є гістогенетичними маркерами та потенційними маркерами малігнізації.

4.Методи культури тканин - для отримання культур фолікулярного епітелію доброякісних і злоякісних новоутворень щитовидної залози з метою подальшого вивчення проявів малігнізації в умовах in vitro.

5.Статистичні методи - для оцінки достовірності отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Внаслідок проведених досліджень вперше:

1. Встановлено вибіркову експресію цитокератину 17 у клітинах папілярних і фолікулярних карцином щитовидної залози людини та визначено особливості біохімічного складу клітин папілярного раку‚ що містять детермінанти цього білка цитоскелету.

2. Доведено‚ що цитокератин 17 є маркером малігнізації фолікулярного епітелію для ДЦД новоутворень щитовидної залози людини.

3. Встановлено зв'язок між малігнізацією фолікулярного епітелію й появою мікроядер у його клітинах.

4. Доведено‚ що мікроядра є маркером малігнізації фолікулярного епітелію для ДЦД новоутворень щитовидної залози людини.

5. Встановлено‚ що малігнізація фолікулярного епітелію супроводжується порушенням локалізації протеїнів десмосом. Показано‚ що це явище може бути маркером малігнізації в ДЦД новоутворень щитовидної залози людини.

6. Встановлено явище аномального морфогенезу за участю макрофагів та епітеліальних клітин у дифузно-склерозуючих папілярних раках щитовидної залози людини.

7. Встановлено явище аномального морфогенезу в папілярних карциномах щитовидної залози людини‚ результатом якого є утворення особливих комплексів‚ що складаються з епітеліальних клітин‚ уражених жировою дистрофією, та кальцифікатів.

8. Показано‚ що аномальний морфогенез клітин папілярного раку є надійним маркером малігнізації тиреоїдного епітелію для ДЦД.

9. Отримані культури епітеліальних клітин in vitro з пунктатів злоякісних та доброякісних новоутворень щитовидної залози.

10. Запропоновано новий принцип визначення малігнізації в ДЦД новоутворень щитовидної залози - за ознаками цитофізіологічних особливостей ракових клітин (аномального морфогенезу та здатності до інвазивного росту in vitro).

Практичне значення одержаних результатів. В результаті виконання роботи і з метою удосконалення методичної бази доопераційної цитологічної діагностики новоутворень щитовидної залози людини розроблено:

- спосіб швидкої оцінки адекватності пункційного матеріалу на нативних препаратах;

- спосіб поєднання цитоморфологічного та імуноцитохімічного методів досліджень клітин на одних і тих самих цитологічних препаратах пункційного матеріалу (Патент №23098 А);

- спосіб визначення тиреоїдного походження новоутворень при відсутності клітинного матеріалу в пунктатах шляхом імуноцитохімічного виявлення позаклітинного тиреоглобуліну;

- спосіб доопераційної діагностики папілярних карцином щитовидної залози шляхом виявлення детермінант цитокератину 17 у клітинах пунктатів новоутворень щитовидної залози (Патент №36880 А);

- спосіб доопераційної діагностики папілярних карцином щитовидної залози шляхом виявлення мікроядер у клітинах пунктатів новоутворень щитовидної залози (Патент №59554 А);

- спосіб доопераційної діагностики папілярних карцином щитовидної залози шляхом виявлення в пунктатах новоутворень щитовидної залози комплексів епітеліальних клітин‚ уражених жировою дистрофією‚ та кальцифікатів;

- спосіб доопераційної диференційної діагностики злоякісних та доброякісних новоутворень щитовидної залози шляхом отримання культур епітелію з пунктатів цих новоутворень для подальшого тестування на інвазивність in vitro (Патент №22466 А).

Переважна більшість цих розробок уже впроваджена у практику.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно обґрунтована актуальність‚ мета й задачі дослідження‚ проведений аналіз наукової літератури‚ розроблена програма досліджень‚ обрані відповідні методи‚ проведений аналіз отриманих результатів. Дисертантом самостійно розроблено метод визначення тиреоїдного походження новоутворень при відсутності клітинного матеріалу в пунктатах‚ проведені дослідження змін в експресії десмосомальних протеїнів у результаті малігнізації тиреоїдного епітелію‚ виявлено прояви аномального морфогенезу в папілярних карциномах.

Авторові належать ідеї всіх експериментів‚ виконаних у межах дисертації. Автор безпосередньо проводив роботи по розробці способу поєднання цитоморфологічних та імуноцитохімічних методів дослідження клітин на одних і тих самих цитологічних препаратах (за участю Тавокіної Л.В.‚ Абраменко І.В. та Бєлоус Н.І.)‚ дослідженню експресії цитокератину 17 в новоутвореннях щитовидної залози (за участю Зелінської Г.В. та Васька В.В.)‚ вивченню змін адгезивності тиреоцитів в результаті малігнізації фолікулярного епітелію (за участю Зелінської Г.В. та Хоруженко А.І.)‚ визначенню мікроядер в клітинах фолікулярного епітелію щитовидної залози людини (за участю Соколова О.О.)‚ культивуванню in vitro клітин з пункційного матеріалу доброякісних і злоякісних новоутворень щитовидної залози (за участю Хоруженко А.І.).

Патогістологічний діагноз досліджених новоутворень встановлений в лабораторії морфології ендокринної системи (завідувач - д.б.н.‚ проф. Богданова Т.І.) та в патологоанатомічному відділенні клініки (завідувач - к.м.н. Черній Я.М.).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень оприлюднені на 12-ому міжнародному конгресі цитологів (Мадрид‚ 22-25 травня 1995 р.), 9-му Європейському конгресі радіологів (Відень‚ 1995 р.), ІІ з'їзді онкологів країн СНД (Київ‚ 23-26 травня 2000 р.)‚ та на VI з'їзді ендокринологів України (Київ‚ 23-25 травня 2001 р.).

Публікації. Результати роботи опубліковані у монографії‚ 18 статтях у наукових журналах‚ 4-х патентах, тезах 4-х конференцій та наукових з'їздів та методичних рекомендаціях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 229 сторінках тексту і складається з вступу, огляду літератури, дев'яти розділів власних досліджень, заключення, висновків, практичних рекомендацій, списку використаної літератури (310 вітчизняних і закордонних). Робота ілюстрована 69 рисунками та 2 таблицями.

2. Основний зміст роботи

Матеріали і методи досліджень. В роботі використано патогістологічний та пункційний матеріал 2393 пацієнтів чоловічої та жіночої статі, що проходили обстеження та хірургічне лікування в клініці Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України. Вік пацієнтів коливався від 8 до 65 років.

Гістоморфологічні, гістохімічні та імуногістохімічні дослідження проведено на тканинах пухлин щитовидної залози‚ видалених внаслідок операцій. Серед них було папілярних карцином - 41, фолікулярних раків - 6, вузлових зобів - 11, фолікулярних аденом - 27, кіст - 4, дифузних зобів - 10, фрагментів нормальної паренхіми щитовидних залоз, видалених при тотальній тиреоїдектомії - 12.

Для цитоморфологічних, цитохімічних, імуноцитохімічних та цитогенетичних досліджень використано матеріал тонкоголкових аспіраційних біопсій, проведених у відділенні функціональної діагностики Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України. Цей матеріал складали пунктати 831 папілярних карцином, 25 фолікулярних карцином, 35 медулярних карцином, 270 аденом з А-клітин, 833 вузлових зобів, 164 кістозно-дегенеруючих вузлів, 50 залоз, уражених автоімунним тиреоїдитом, 25 вузлів із В-клітин, 8 карцином із В-клітин, 11 лімфатичних вузлів з ознаками лімфаденіту, 2 серединні кісти шиї, 2 лімфопроліферативні захворювання, 26 метастазів карцином щитовидної залози.

Дослідження експресії цитокератинів в ранньому онтогенезі людини виконано на матеріалі 49 нормальних зародків та плодів людини (медичний аборт) 6,5-13 тижнів розвитку.

Цитоморфологічні дослідження матеріалу пункційних біопсій проводили на мазках‚ фіксованих метанолом та пофарбованих за стандартним методом Май-Грюнвальда - Гімза [Лилли Р., 1969].

Морфологічні дослідження кріостатних зрізів пухлин проводили після їх фіксації метанолом (5 хв.) і забарвлення гематоксилін-еозином.

В роботі використовували також методи фазово-контрастної‚ аноптральної‚ інтерференційної та поляризаційної мікроскопії (мікроскоп PZO MP 30, Польща).

Гістохімічні та імуногістохімічні дослідження тканин новоутворень виконували на кріостатних зрізах товщиною 14 мкм. Зрізи монтували на предметні скельця, висушували‚ фіксували метанолом (5 хв.)‚ або в парах формальдегіду (2 хв.)‚ або використовували нефіксовані зрізи - в залежності від вимог методу визначення тих чи інших речовин.

Визначення активності ферментів. Визначення активності сукцинатдегідрогенази проводили на нефіксованих мазках матеріалу пункційних біопсій або кріостатних зрізах пухлин тетразолієвим методом Лойда [Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т.,1982 ].

Визначення активності неспецифічної естерази проводили на кріостатних зрізах‚ фіксованих у парах формальдегіду протягом 2 хв. методом Лойда (азосполучення з нафтолом AS-MX ацетатом) [Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т., 1982].

Активність йодпероксидази визначали на нефіксованих кріостатних зрізах бензидиновим методом [Лилли Р., 1969].

Виявлення ліпідів. Для виявлення ліпідів на мазках пункційного матеріалу використовували фарбування суданом чорним В, поляризаційну мікроскопію та екстракцію метанол-хлороформом (2:1).

Виявлення солей кальцію. Солі кальцію визначали за допомогою алізаринового червоного S методом Мак-Гі- Рассела [Лилли Р., 1969].

Імуноцитохімічні методи. Імуноцитохімічні реакції проводили непрямим імунопероксидазним методом із використанням у другому шарі мічених пероксидазою антитіл проти гама-глобулінів миші чи кроля (Dako Cytomation, Данія) - відповідно до перших антитіл. Для пригнічення ендогенної пероксидази препарати обробляли 1% розчином Н2О2 у PBS (рН 7‚2) протягом 30 хв. Пероксидазну активність проявляли за допомогою 3,3'діамінобензидину (ДАБ) [Угрюмов М.В., 1991].

Для визначення на одному й тому ж зрізі 2 антигенів проводили подвійну імунопероксидазну реакцію. Для цього перший антиген виявляли звичайним способом (продукт реакції брунатного кольору). Потім на тому ж препараті виявляли другий антиген‚ але у розчин ДАБ додавали CoCl2 (продукт реакції сіро-блакитного кольору). В усіх випадках ставили необхідні негативні та позитивні контрольні реакції. Для ідентифікації у тих самих структурах ферментів і антигенів‚ їх виявлення проводили на двох послідовних серійних зрізах.

В роботі були використані моноклональні антитіла проти антигенів людини: протеїнів повних десмосом (клон ZK-31, Sigma, США), тиреоглобуліну (клон RBU/01, Sigma; клон DAK-Tg 6, Dako Cytomation, Данія), Pan Cytokeratin (Sigma), цитокератинів 7 та 18 (клони С18, СО4 та ДА7, Онкологічний інститут, Брно, Чехія), цитокератинів 8 та 17 (клони Н1 та Е3, Онкологічний центр РАМН, Москва), епітеліальних глікопротеїнів м.м. 34кД та 49кД (клон Ber-Ep4, Dako Cytomation), РЕА (клон G5 ОНЦ РФ), CD68 та CD14 (клон ЕВМ11 та TUK4, Dako Cytomation), CD45 (Becton-Dickinson, США), ядерний антиген проліферуючих клітин (клон Ki - 67, Dako Cytomation). Також використовували поліклональні антитіла проти кальцитоніну Dako - Calcitonin (Dako Cytomation).

Цитогенетичні дослідження мікроядер проводили на пофарбованих за методом MGG цитологічних препаратах. Для кожного новоутворення переглядали 1000 епітеліальних клітин і підраховували відсоток клітин‚ що містять мікроядра, які визначали відповідно до загальноприйнятих критеріїв.

Статистичне опрацювання даних робили за непараметричним методом Колмогорова-Смирнова [Гублер Е.В. и др., 1973]‚ за критерієм Стьюдента [Ойвин М.А., 1964]‚ а також застосовували кореляційний аналіз [Урбах В.Ю., 1975].

Результати досліджень та їх обговорення. Швидка оцінка адекватності пункційного матеріалу. Для забезпечення ефективності процедури аспіраційної біопсії необхідно мати можливість оперативного контролю під час пункцій за наявністю достатньої кількості клітин у пунктатах.

З цією метою нами розроблено простий спосіб швидкого визначення інформативності пунктатів, що базується на оптимальному методі оптичного контрастування клітин на висушених мазках. На таких препаратах має місце значна різниця коефіцієнтів світлозаломлення висушених клітин та оточуючого їх повітря. Тому широко уживані методи оптичного контрастування (фазовий та аноптральний контраст, інтерференційна мікроскопія або метод темного поля) тут дають незадовільні результати, оскільки вони розроблені для досліджень об'єктів, що мало відрізняються від оточуючого середовища за коефіцієнтом світлозаломлення. В той же час, ми встановили, що завдяки цій різниці вдається отримати достатньо контрастне зображення непофарбованих клітин при використанні конденсора світлого поля з діаметром світлового потоку 30-50% від діаметра зіниці об'єктива. Це, у свою чергу, забезпечує можливість оперативно оцінювати адекватність пунктату.

Для оцінки ефективності цього способу було проведено порівняльний аналіз збігу оцінок адекватності на тих самих препаратах спочатку за допомогою оптичного контрастування нативних мазків, а потім - при морфологічному дослідженні після фарбування за стандартним методом MGG. Адекватними вважали препарати‚ що містили не менше 6 фрагментів фолікулярного епітелію. Дослідження проведено на 39 препаратах пунктатів, отриманих з папілярних карцином‚ 134 - з вузлових зобів‚ 73 - з кістозно-дегенеруючих вузлів‚ 35 - з ділянок автоімунного тиреоїдиту та 16 - з вузлів із клітин Ашкіназі-Гюртля.

В результаті з'ясувалось, що оптичне контрастування за допомогою діафрагмованого конденсора забезпечує можливість оцінювати адекватність пунктатів папілярних карцином - з точністю 89%, вузлових зобів - 85,8%, кістозно-дегенеруючих вузлів - 82,19%, вогнищ автоімунного тиреоїдиту - 88,5%, пухлин із В-клітин - 93,75%. Запровадження цього способу в практику нашої клініки дозволило зменшити відсоток неадекватних біопсій з 22% до 8‚9%‚ тобто більше, ніж удвічі.

Таким чином, розроблений нами простий спосіб швидкого визначення інформативності пунктатів забезпечує високу адекватність пункційного матеріалу з новоутворень щитовидної залози.

Розробка способу поєднання цитоморфологічних та імуноцитохімічних методів дослідження на одних і тих самих цитологічних препаратах. Завдяки застосуванню методів імуноцитохімії вдається точно визначати походження пухлин чи метастазів з А-, В- чи С-клітин, диференціювати епітеліальні клітини від клітин інших тканин та визначати маркери малігнізації тиреоїдного епітелію. На жаль, хімічні реагенти, що застосовуються при підготовці препаратів до морфологічних досліджень стандартним методом MGG, блокують більшість антигенних детермінант. Тому імуноцитохімічні та морфологічні дослідження пункційного матеріалу проводять на окремих препаратах, що призводить до додаткових пункційних біопсій та унеможливлює морфологічну ідентифікацію реагуючих з антитілами клітин. Натомість, оптимальним для ДЦД є такий варіант‚ коли цитоморфологічне й імуноцитохімічне дослідження робиться послідовно на одному й тому ж мазку пункційного матеріалу.

У своїй роботі ми проаналізували вплив фіксатора (метанолу) та барвників на перебіг імуноцитохімічних реакцій. В експериментах на кріостатних зрізах та відбитках тканин пухлин щитовидної залози було встановлено, що фіксація метанолом сама по собі не заважала виявленню епітеліальних антигенів (цитокератин 8 та 17‚ панцитокератин‚ епітеліальні глікопротеїни 34 та 49 кДа)‚ а також загальнолейкоцитарного (CD 45) та макрофагального (CD 68) антигенів. В той же час барвники суміші MGG - еозин Н, азур І та азур ІІ блокують антигенні детермінанти (азури більше‚ ніж еозин). Відомо, що ці барвники приєднуються до різних компонентів клітин за рахунок утворення іонних зв'язків. Тому логічно було спробувати відновити активність антигенних детермінант шляхом екстракції барвників. Дійсно‚ 10-хвилинна екстракція пофарбованих препаратів у 5% розчині оцтової кислоти дала змогу відновити реакційну здатність антигенів CD 45 та CD 68‚ однак для інших антигенів цього виявилося недостатньо. У таких випадках спроби відновити реакційну спроможність антигенів шляхом додаткової екстракції кислого барвника еозину у буферах із лужним рН (8,0) також були невдалими.

Такі результати можуть свідчити про блокування певних антигенних детермінант за рахунок неіонних (гідрофобних‚ Ван-дер-Ваальсових) взаємодій з молекулами барвників. Для подолання цієї перешкоди ми застосували коротку (5-10 сек.) обробку препаратів 0‚1% розчином кристалічного трипсину (СПОФА‚ Чехія) на PBS (pH 7,4). З'ясувалося‚ що послідовна обробка пофарбованих MGG препаратів 5% розчином оцтової кислоти‚ а потім 0‚1% розчином трипсину дає змогу відновити здатність до імуноцитохімічних реакцій цитокератинів 8 та 17‚ а також епітеліальних глікопротеїнів 34 та 49 кДа (антитіла Ber- Ep 4). Але при виявленні тиреоглобуліну чи кальцитоніну вдалося досягти позитивних результатів тільки змінивши порядок обробки препаратів цими реагентами на зворотній. Усі інші, згадані вище антигени, також добре виявлялись при цій послідовності обробки препаратів трипсином та оцтовою кислотою.

Контрольні досліди на мазках біопсійного матеріалу аденом молочної залози та лімфатичних вузлів‚ уражених метастазами пухлин нетиреоїдного походження, показали‚ що згадана вище обробка препаратів не призводить до появи штучної позитивної імуноцитохімічної реакції на тиреоглобулін‚ кальцитонін чи епітеліальні антигени за відсутності в клітинах зазначених речовин.

Ми з успіхом використали цей спосіб у повсякденній діагностичній роботі для виявлення тиреоглобуліну (296 новоутворень)‚ кальцитоніну (210 пухлин)‚ цитокератинів (226 пухлин)‚ загальнолейкоцитарного антигену (33 новоутворення)‚ макрофагального антигену CD68 (13 новоутворень)‚епітеліальних глікопротеїнів (46 новоутворень).

Розроблений і запатентований нами (патент №23098 А) спосіб відновлення активності антигенних детермінант дозволяє поєднати цитоморфологічні та імуноцитохімічні дослідження на одному цитологічному препараті і забезпечує можливість співставлення морфологічних та імуноцитохімічних характеристик окремих клітинних елементів.

Визначення тиреоїдного походження новоутворень за відсутності клітинного матеріалу в пунктатах. Важливим завданням для ДЦД є визначення тиреоїдного походження метастазів. На жаль, папілярні раки кістозної будови часто дають метастази у вигляді кіст. Можливість диференціації таких новоутворень від кіст нетиреоїдного походження часто обмежена відсутністю в пунктатах епітеліального компонента. У таких випадках єдиним засобом установлення тиреоїдного походження кісти‚ може бути визначення тиреоїдних гормонів у кістозній рідині.

Відомі спроби вирішити цю проблему шляхом визначення радіоімунним методом вмісту тиреоглобуліну в рідині пунктатів (Frasoldati A. et al., 1999). Але такий підхід потребує спеціального обладнання й наборів для визначення тиреоглобуліну. Крім того, пунктати містять від разу до разу різний за об'ємом домішок крові‚ контролювати який неможливо‚ що суттєво зменшує точність визначень вмісту тиреоглобуліну.

Зважаючи на це, нами було розроблено простий метод імуноцитохімічного визначення позаклітинного тиреоглобуліну в пункційному матеріалі, що дозволяє обійтись без спеціального обладнання та складних процедур радіоімунного або імуноферментного аналізу. Цей метод ґрунтується на тому, що пункційна рідина з новоутворень тиреоїдного походження завжди містить тиреоглобулін. Після висихання й фіксації у метанолі мазків пункційного матеріалу, ця рідина утворює щільну плівку, інкрустовану молекулами тиреоглобуліну. Завдяки цьому вона вибірково перехоплює антитіла проти тиреоглобуліну при проведенні імуноцитохімічної реакції запропонованим вище методом із виключенням етапу обробки трипсином. В результаті, ця плівка достатньо яскраво фарбується в брунатний колір, що дає змогу ефективно визначати позаклітинний тиреоглобулін у пункційному матеріалі.

Для оцінки можливості практичного застосування запропонованого методу ми провели визначення в такий спосіб позаклітинного тиреоглобуліну на мазках рідини‚ отриманої з 14 кіст та кістозно-дегенеруючих вузлових зобів. В усіх випадках на препаратах був виявлений тиреоглобулін. В той же час, цим методом не було виявлено позаклітинного тиреоглобуліну в пунктатах новоутворень нетиреоїдного походження - серединних кістах шиї (2)‚ вузлах лімфогрануломатозу та лімфоми (2)‚ карцином нетиреоїдного походження (5) та лімфатичних вузлів з ознаками лімфаденіту (11). Також не виявляється тиреоглобулін у плазмі мазків периферійної крові.

З цього випливає‚ що при застосуванні такого методу тиреоглобулін у концентраціях, у яких він присутній у крові та тканинній рідині утворень нетиреоїдного походження, не заважатиме диференціації кіст тиреоїдного та нетиреоїдного походження.

Запропонований метод пофарбування позаклітинного тиреоглобуліну був випробуваний на практиці у 9-ти випадках метастазів папілярних карцином кістозної будови і 1 випадку ектопії тиреоїдної тканини за межі щитовидної залози‚ пунктати яких містили лише кістозну рідину з макрофагами. В кожному разі на цитологічних препаратах кістозної рідини з цих утворень було виявлено позаклітинний тиреоглобулін‚ що дало змогу довести тиреоїдне походження метастазів.

Таким чином‚ наш метод імуноцитохімічного визначення позаклітинного тиреоглобуліну на цитологічних препаратах пунктатів новоутворень кістозної будови дає можливість встановлювати тиреоїдне походження новоутворень при відсутності епітеліальних клітин у пункційному матеріалі.

Цитокератин 17 як маркер малігнізації фолікулярного епітелію. Підвищення точності визначення малігнізації - головна проблема ДЦД новоутворень щитовидної залози. Певна обмеженість у цьому плані цитоморфологічних методів спонукала нас до пошуку нових ознак малігнізації клітин фолікулярного епітелію - імуноцитохімічних та цитогенетичних.

При імуногістохімічних дослідженнях кріостатних зрізів зародків та плодів людини віком від 6,5 до 13 тижнів вагітності ми спостерігали обмежену топографічно і в часі експресію білків цитоскелету - цитокератинів.

Особливою вибірковістю експресії відрізнявся цитокератин 17. Він з'являвся на 10-му тижні вагітності виключно в клітинах циркулярного шару гладких м'язів і тільки у каудальному відділі прямої кишки. Згадана експресія цитокератинів у гладких м'язах відбувалась лише в період диференціації їх клітин, а потім зникала.

Зважаючи на важливу роль цитоскелету в процесах диференціації клітин, здається виправданим пошук імуноцитохімічних маркерів малігнізації саме серед цитокератинів. За допомогою імуногістохімічних методів ми вивчали експресію цитокератинів у фолікулярному епітелії злоякісних і доброякісних новоутворень щитовидної залози - 29 карцином (18 - папілярних, 5 дифузно-склерозуючих‚ 6 - фолікулярних) та 29 доброякісних утворень (14 фолікулярних аденом, 6 дифузних і 9 вузлових зобів). Досліджено, також, фрагменти нормальної паренхіми з вільних від пухлин ділянок 6 щитовидних залоз.

Нашу увагу привернув особливий статус цитокератину 17 (ЦК 17) в пухлинах щитовидної залози. За допомогою моноклональних антитіл Е3 із вузькою специфічністю до ЦК 17 була виявлено суттєва й достовірна різниця в експресії цього компоненту цитоскелету між доброякісними та злоякісними новоутвореннями (р < 0,001, рис. 1).

Рис. 1 Розподіл папілярних карцином (ряд 1)‚ фолікулярних аденом (ряд 2) та вузлових зобів (ряд 3) за відсотком епітеліальних клітин з ЦК 17

Клітини, що містять ЦК 17, були характерні для папілярних, фолікулярних та низькодиференційованих карцином щитовидної залози. В той же час, у доброякісних новотворах цього органу вони зустрічались зрідка, або ж взагалі були відсутні. Експресія ЦК 17 не була пов'язана з гістоархітектонікою новоутворень, оскільки такі клітини знаходились у складі фолікулярних, папілярних, солідних утворень і в ділянках сквамозної метаплазії. Натомість, клітини, що містили ЦК 17, проявляли певні ознаки агресивної поведінки - локалізувались переважно на периферії пухлинних структур, проникали в строму пухлини та її капсулу, у кровоносні та лімфатичні судини, а також у значній кількості виявлялись у метастазах. Частина їх містила антиген проліферуючих клітин Ki-67. В найбільш агресивній формі папілярного раку - дифузно-склерозуючій - практично всі епітеліальні клітини, що знаходились в лімфатичних судинах, проявляли експресію ЦК 17.

Клітини, які містять детермінанти ЦК 17, відрізняються від відомих типів тиреоцитів за рядом ознак (табл. 1).

Таблиця 1 Порівняння цитохімічних та імуноцитохімічних ознак клітин з ЦК 17 з відомими типами тиреоцитів

На це вказують результати проведених нами подвійних імуногістохімічних реакцій з послідовним виявленням ЦК 17 та інших тиреоїдних антигенів на одних і тих самих препаратах, а також співставлення на паралельних зрізах імуноцитохімічних реакцій на ЦК 17 та активності деяких ферментів. З іншого боку, є підстави вважати‚ що клітини з ЦК 17 генетично пов'язані саме з А-клітинами. Про це свідчить наявність “перехідних форм” клітин, які містять одночасно невелику кількість ЦК 17 та тиреоглобуліну.

В окремій серії експериментів було проведено імуноцитохімічне визначення тиреоцитів з ЦК 17 на матеріалі аспіраційних біопсій 40 папілярних карцином‚ 15 аденом та 5-и аденоматозних вузлів. При підрахунку відсотка клітин з експресією ЦК 17 у загальній популяції клітин фолікулярного епітелію було знайдено статистично достовірну різницю (p<0,001) між вмістом клітин з ЦК 17 у пунктатах злоякісних та доброякісних пухлин (в останніх цей вміст не перевищував 0,25%, а в злоякісних сягав 55%). Встановлено також, що експресія ЦК 17 не корелює з наявністю в клітинах псевдовключень цитоплазми у ядро.

Таким чином, внаслідок малігнізації клітин фолікулярного епітелію щитовидної залози людини в них відбувається не властива нормальним тиреоцитам експресія цитокератину 17‚ яка супроводжується пригніченням експресії ряду тиреоїдних антигенів. Це дозволяє використовувати цитокератин 17 у якості нового імуноцитохімічного маркера малігнізації в ДЦД новоутворень щитовидної залози.

За матеріалами цих досліджень, зроблених нами разом із співавтором Зелінською Г.В., запатентовано “Спосіб доопераційної діагностики злоякісних новоутворень щитовидної залози”, що базується на виявленні клітин з ЦК 17 у матеріалі пункційних біопсій (патент №36880 А).

Вивчення змін адгезивності тиреоцитів та експресії десмосомальних протеїнів у результаті малігнізації фолікулярного епітелію. При отриманні пункційного матеріалу, клітини фолікулярного епітелію піддаються дії значних руйнівних сил, що відривають їх від базальної мембрани фолікулів та викликають фрагментацію епітеліальних пластів. Якщо в нормальному фолікулярному епітелії міцність міжклітинних зв'язків перевищує механічну стійкість самих клітин, це зумовить руйнацію останніх при фрагментації епітеліального пласта. У злоякісних пухлинах послаблення зв'язків між епітеліальними клітинами є необхідною передумовою метастазування. Водночас, таке послаблення вірогідно полегшить фрагментацію епітеліальних пластів і зменшить руйнацію клітин при відокремленні однієї від одної під час аспірації пункційного матеріалу.

Для перевірки викладених припущень ми провели порівняльні дослідження пунктатів 31 доброякісного утворення (14 мікрофолікулярних‚ 10 - нормофолікулярних‚ 1 - макрофолікулярної‚ 3 - тубулярних аденом та 3 вузлових зобів) та 29 злоякісних пухлин щитовидної залози (25 папілярних, 3 фолікулярних та 1 низькодиференційованого раків), діагноз яких був підтверджений гістологічно. На препаратах, пофарбованих за методом MGG, визначали відсоток неушкоджених клітин фолікулярного епітелію, що знаходились на краю епітеліального пласта, або відокремлених від нього. Як бачимо на рис. 2, доброякісні та злоякісні пухлини достовірно відрізняються за відсотком неушкоджених епітеліальних клітин у пункційному матеріалі (р < 0‚01).

Рис. 2 Розподіл злоякісних пухлин (ряд 1) та доброякісних вузлів (ряд 2) за відсотком неушкоджених клітин фолікулярного епітелію на мазках пункційного матеріалу

Різницю між карциномами та доброякісними вузлами за відсотком незруйнованих клітин можна використати, як додатковий тест на малігнізацію фолікулярного епітелію. З певним запасом можна прийняти 30% незруйнованих клітин за межу‚ вище якої знаходяться пухлини‚ цитологічно підозрілі на малігнізацію. Таким чином, результати цієї роботи вказують на перспективність досліджень змін характеру міжклітинних зв'язків для визначення нових ознак малігнізації.

Загальновідомим фактом є те, що клітини фолікулярного епітелію з'єднані між собою десмосомами. Серед інших, десмосомальні з'єднання є найбільш стабільними. Без істотного порушення десмосомальних зв'язків вихід і міграція злоякісних клітин за межі епітеліального пласта неможливі. Для вивчення конкретних змін у системі десмосом у злоякісних новоутвореннях нами було зроблено серію імуногістохімічних досліджень із використанням моноклональних антитіл ZK 31 проти десмосомальних протеїнів (ДП) повних десмосом на кріостатних зрізах 23 доброякісних утворень (15 - фолікулярних аденом та аденоматозних вузлових зобів, 4 - дифузних зобів та 4 - кіст), 17 папілярних раків (у тому числі 3 - дифузно-склерозуючих) та неуражених патологічними процесами ділянок 6 щитовидних залоз.

В результаті було показано, що, як не дивно, експресія ДП часто підвищується в клітинах папілярного раку в порівнянні з нормальним епітелієм. У той же час, має місце значне порушення розподілу ДП в епітелії карцином. В нормальному фолікулярному епітелії ДП виявлялись у вигляді дрібних гранул, локалізованих виключно на бічній поверхні клітин, головним чином, в апікальній зоні епітеліального пласта. В епітелії папілярних карцином ДП знаходились не тільки на бічній поверхні, а в значній кількості були дифузно розподілені по всьому об'єму цитоплазми клітин. Більше того, у 57% папілярних карцином спостерігались особливі дифузно пофарбовані кулеподібні утворення з ДП у базальній частині цитоплазми клітин. В дифузно-склерозуючому варіанті папілярного раку зміни в експресії та локалізації десмосомальних білків набували максимальної виразності, аж до повної відсутності гранул ДП біля поверхні клітин при дифузному зв'язуванні антитіл ZK-31 по всій цитоплазмі. Ймовірно, що такі серйозні порушення в локалізації десмосомальних білків в епітелії папілярних карцином щитовидної залози можуть суттєво послаблювати міжклітинні зв'язки, полегшуючи утворення метастазів.

В доброякісних новоутвореннях порушення експресії ДП зустрічалось лише зрідка в епітелії деяких фолікулів, або кіст. В той же час, виявлена суттєва різниця в частоті‚ з якою зустрічаються дифузно пофарбовані кулеподібні утворення з ДП серед злоякісних та доброякісних новоутворень (р < 0,01). Останнє дає підставу розглядати такі утворення, як потенціальний маркер малігнізації фолікулярного епітелію.

На цитологічних препаратах пунктатів новоутворень щитовидної залози ДП також виявлялись антитілами ZK-31 після обробки трипсином та оцтовою кислотою. При цьому в епітелії аденом або карцином спостерігалась типова картина розподілу ДП на апікальній поверхні пластів. Водночас, серед клітин папілярних карцином можна було зустріти такі‚ що мали дифузне пофарбування цитоплазми антитілами ZK-31 і навіть структури‚ аналогічні дифузно пофарбованим кулеподібним утворенням з ДП‚ які ми спостерігали на кріостатних зрізах.

Наведені факти свідчать‚ що внаслідок малігнізації фолікулярного епітелію відбуваються порушення міжклітинної адгезії та зміни в локалізації протеїнів повних демосом. Це дозволяє використати згадані явища, як маркери злоякісності в ДЦД новоутворень щитовидної залози людини.

Мікроядра‚ як маркер малігнізації фолікулярного епітелію щитовидної залози людини. Генетична нестабільність популяції клітин фолікулярного епітелію в злоякісних пухлинах щитовидної залози обумовлює появу клонів‚ здатних до інвазивного росту та утворення метастазів. Серед цитогенетичних проявів цієї нестабільності нас зацікавило утворення мікроядер‚ оскільки ці структури легко виявляються на звичайних цитологічних препаратах і неодноразово спостерігались нами в пункційному матеріалі папілярних карцином.

Для визначення частот‚ з якими з'являються мікроядра в епітелії новоутворень з А-‚ В- та С-клітин‚ були досліджені цитологічні препарати пунктатів 41 папілярної карциноми та 45 доброякісних вузлів (вузлових зобів та аденоматозних вузлів)‚ 8 аденом із клітин Ашкіназі-Гюртля та 7 медулярних карцином із гістологічно підтвердженим післяопераційним діагнозом.

Проведені нами дослідження показали суттєву різницю в кількості тиреоцитів з мікроядрами між папілярними карциномами та доброякісними вузлами з А-клітин (р < 0‚01, рис. 3).

Як свідчать дані доступної літератури‚ одним із головних факторів‚ що викликає появу мікроядер у лімфоцитах периферійної крові та ексфоліативному епітелії‚ є радіоактивне опромінення‚ в тому числі радіоактивним йодом. Тому було природно припустити‚ що поява мікроядер у фолікулярному епітелії щитовидних залоз наших пацієнтів може бути спричинена опроміненням радіоактивним йодом‚ що потрапив у тиреоїдну паренхіму після аварії на ЧАЕС. Для перевірки цього припущення ми провели дві серії досліджень, в яких порівнювали частоти появи мікроядер у фолікулярному епітелії з пунктатів карцином щитовидної залози у пацієнтів‚ які під час аварії перебували‚ або не перебували в зонах, забруднених радіоактивним йодом.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3 Розподіл злоякісних (А) та доброякісних (Б) новоутворень щитовидної залози за відсотком клітин з мікроядрами у фолікулярному епітелії

Перша серія складала 37 патогістологічно верифікованих папілярних карцином‚ серед яких 26 належали пацієнтам‚ що після аварії на ЧАЕС перебували у зоні‚ забрудненій радіоактивним йодом, а 11 - тим, що знаходились поза нею (рис. 4). Друга серія складала 46 папілярних карцином, 32 з яких належали пацієнтам із зони забруднення радіоактивним йодом‚ а 14 - тим, що знаходились поза цією зоною. В результаті, в обох серіях не було знайдено вірогідної різниці у відсотку тиреоцитів з мікроядрами між групами папілярних карцином із забруднених та чистих зон (для першої серії t= 0,62032, p > 0,5; для другої t = 1‚222, p 0,1).

З цього випливає, що опромінення радіоактивним йодом не є головною причиною появи мікроядер в епітеліальних клітинах папілярних карцином щитовидної залози.

Рис. 4 Розподіл папілярних карцином за відсотком клітин фолікулярного епітелію з мікро ядрами у пацієнтів‚що перебували (ряд 1) і не перебували (ряд 2) на територіях‚ забруднених радіоактивним йодом. 1-а серія досліджень

Зважаючи на це‚ а також на різницю в частотах появи мікроядер між доброякісними вузлами та папілярними карциномами‚ можемо припустити‚ що мікроядра з'являються в клітинах фолікулярного епітелію внаслідок процесів‚ пов'язаних із канцерогенезом.