Цитоморфологія‚ цитогенетика та імуноцитохімія в доопераційній діагностиці новоутворень щитовидної залози

При порівнянні вмісту клітин із мікроядрами в пунктатах первинних вузлів 17-и папілярних карцином щитовидної залози та їх метастазів у регіональні лімфатичні вузли, ми не знайшли достовірної різниці у середньому рівні мікроядер між цими групами (t=0,2628, p > 0,5). Це означає, що утворення мікроядер відбувається в пухлині постійно. Інакше відсоток клітин із мікроядрами зменшувався б з часом існування пухлини внаслідок “розбавлення” їх популяції іншими проліферуючими клітинами.

Суттєва й статистично достовірна різниця в появі мікроядер між папілярними карциномами та доброякісними вузлами дає можливість вважати мікроядра маркером малігнізації А-клітин щитовидної залози. Цінність мікроядер, як маркера малігнізації, стає більшою з огляду на його незалежність від найбільш важливої цитоморфологічної ознаки папілярних карцином - псевдовключень цитоплазми у ядро. Це було доведено нами при порівнянні відсотків епітеліальних клітин з мікроядрами або псевдовключеннями цитоплазми у ядро в пунктатах 41-ї папілярної карциноми (коефіцієнт кореляції - 0‚2383).

На основі проведених досліджень нами отримано патент на спосіб доопераційної цитологічної діагностики папілярних карцином щитовидної залози з використанням мікроядер в якості маркера малігнізації (№59554 А).

Шляхи пошуку принципово нових ознак малігнізації епітеліальних клітин щитовидної залози. Якими б цінними не здавались винайдені нами, або запропоновані іншими авторами імуноцитохімічні або цитогенетичні маркери малігнізації фолікулярного епітелію, вони не в змозі кардинально вирішити проблему точності ДЦД. Уважний аналіз прояву маркерів малігнізації у новоутвореннях щитовидної залози показує, що всім їм у тій чи іншій мірі притаманні певні загальні вади, що не дають можливості встановлювати з їхньою допомогою абсолютно точний діагноз:

Маркери малігнізації не є ознаками абсолютними‚ притаманними виключно злоякісним пухлинам. Вони присутні також у певній частині доброякісних новоутворень.

Маркери малігнізації‚ як правило‚ проявляються не в усіх злоякісних пухлинах певного типу.

Маркери малігнізації, як правило, проявляються лише в певному відсотку клітин злоякісного новоутворення.

Маркери‚ що мають більшу точність‚ одночасно проявляють меншу чутливість.

На наш погляд причинами такого стану є те, що:

1. Експресія маркерів малігнізації є проявом генетичної нестабільності клітин у карциномах, внаслідок якої (завдяки спонтанним мутаціям) весь час утворюються нові субклони клітин‚ що відрізняються за експресією органоспецифічних тиреоїдних білків‚ або ж виробляють білки‚ не характерні для нормального фолікулярного епітелію.

Оскільки експресія маркерів малігнізації є наслідком спонтанних мутацій, більшість із них не має прямого відношення до процесів інвазивного росту. А відтак‚ не дивно‚ що вони зустрічаються іноді і в доброякісних пухлинах.

Субклональна організація пухлини також може бути причиною експресії маркерів малігнізації лише в певній частині клітин злоякісного новоутворення. Крім того, оскільки мутаційний процес - явище випадкове, можуть зустрічатись пухлини‚ в яких на певному етапі їх розвитку ще не з'явились клони клітин‚ що несуть даний маркер малігнізації.

2. У карциномах щитовидної залози лише невелика частка тиреоцитів є дійсно злоякісними клітинами. Усі інші нікуди не мігрують, а утворюють пухлину як таку. Звідси випливає‚ що чим точніше маркер малігнізації визначає дійсно злоякісні клітини‚ тим у меншій кількості клітин пухлини він буде представлений і, відповідно, матиме меншу чутливість. Виходячи з таких міркувань, марно шукати достовірні маркери малігнізації, які були б притаманні більшості клітин злоякісної пухлини. Між тим, пошук і досі ведеться саме в цьому напрямку.

3. Інвазивність і метастазування‚ відповідно до сучасних уявлень‚ реалізуються шляхом багатоетапних процесів‚ в яких послідовно задіяні сотні різних протеїнів. Виключення хоча б одного з цих етапів блокує весь процес метастазування. Між тим, на цитологічних препаратах можна визначати лише окремі білки-маркери, які синтезуються на окремих етапах цього процесу. Це не забезпечує необхідну точність визначення малігнізації.

Підсумовуючи наші міркування, доходимо до висновку‚ що відомі маркери малігнізації тиреоїдного епітелію не вказують на конкретні клітини зі злоякісними властивостями, а лише відображають ступінь генетичної нестабільності популяції‚ на тлі якої виникають субклони клітин‚ здатних до інвазії та метастазування. Тому пошук нових маркерів такого плану - непродуктивний шлях розвитку ДЦД новоутворень щитовидної залози. Скільки б не було знайдено таких маркерів‚ вони матимуть ті ж самі вади.

На наш погляд, для кардинального покращення точності ДЦД необхідно перейти від пошуку окремих цитоморфологічних та цитохімічних особливостей злоякісних клітин до визначення ознак їх агресивної поведінки - здатності до аномального морфогенезу та проникнення крізь базальні мембрани.

Аномальний морфогенез‚ як маркер малігнізації фолікулярного епітелію щитовидної залози. Хоча, на перший погляд, задачі визначення ознак агресивної поведінки клітин на матеріалі тонкоголкових біопсій здаються фантастичними, в нашій роботі показано реальні можливості досягнення цієї мети. Зокрема, це стосується аномального морфогенезу.

Найбільш цікавими в діагностичному плані можуть бути такі форми аномального морфогенезу‚ які мають пряме відношення до інвазивного росту - вростання злоякісних клітин у капсулу пухлини та інтравазації. На жаль, на цитологічних препаратах тонкоголкових аспіраційних біопсій неможливо спостерігати інвазії у капсулу. Що ж стосується інтравазацій - перспективи є. Принаймні‚ у випадку дифузно-склерозуючих папілярних раків, для яких характерно дифузне розповсюдження по паренхімі щитовидної залози, шляхом масованого проникнення острівців пухлинних клітин у лімфатичні судини органу. Структури‚ що формують клітини дифузно-склерозуючих карцином у середині лімфатичних судин‚ можна розглядати як результат інтравазації. Тому цікаво було вивчити їх детально.

Дослідження проведено на кріостатних зрізах оперативно видалених пухлин з гістологічними ознаками дифузно-склерозуючого папілярного раку (5 хворих). В результаті було визначено, що злоякісні клітини таких пухлин, проникаючи в лімфатичні судини тиреоїдної паренхіми, формують там специфічні структури. Ці солідні структури складаються з центрально розташованого псамомного тільця, оточеного суцільним шаром макрофагів, у свою чергу вкритого шаром епітеліальних клітин, що експресують цитокератин 17. Приналежність клітин зовнішнього шару до епітелію та внутрішнього шару до макрофагальних елементів була доведена методом подвійних імуноцитохімічних реакцій з використанням пар антитіл проти епітеліальних (Н1‚ Е3‚ Anti-Pan Cytokeratin‚ Anti-Desmosomal Protein) та макрофагально-гістіоцитарних антигенів (CD14, CD45, CD68).

Нам не відомі приклади сумісного формування яких-небудь структур епітелієм та макрофагально-гістіоцитарними елементами в процесі нормального органогенезу, зокрема, щитовидної залози. Тому маємо всі підстави вважати такий морфогенез аномальним. Також, маємо підстави вважати цей морфогенез проявом злоякісних властивостей клітин, оскільки йдеться про структури, розташовані в просвіті судин (інтравазація).

Якщо структури, сформовані в результаті аномального морфогенезу, реально існують у папілярних карциномах, вони можуть з'являтись і в пункційному матеріалі, отриманому з цих пухлин. Вперше ми звернули на них увагу при дослідженні пункційних біопсій папілярного раку у хворого хлопчика на прізвище Нєхорошков. Тому надалі стали називати ці утворення “комплексами Нєхорошкова”.

Згадані комплекси мали сферичну форму, розмір від 50 до 500 мкм і складалися з центрально розташованих одного або кількох кулеподібних утворень діаметром 10-40 мкм, оточених шарами клітин із надзвичайно вакуолізованою цитоплазмою.

Центральні кулеподібні утворення представляли собою кальцифікати, оскільки давали позитивну реакцію з алізариновим червоним та розчинялися в 7% оцтовій кислоті. Імуноцитохімічні дослідження “комплексів Нєхорошкова” показали, що кальцифікати були оточені епітеліальними клітинами, які зв'язували антитіла до цитокератів 8, 17 та Pan Ck. Рідше до складу “комплексів Нєхорошкова” у невеликій кількості входили також макрофаги, що відзначалися експресією антигену ЕВМ 11.

Вакуолі в цитоплазмі клітин “комплексів Нєхорошкова” мали розмір 2-4 мкм і містили матеріал, що фарбувався суданом чорним В та мав здатність до подвійного світлозаломлення. Ці властивості зникали після обробки препаратів метанол-хлороформом (2:1) протягом 1 години, що свідчить про ліпідну природу цих цитоплазматичних утворень, а значить і про жирову дистрофію епітелію, який утворює “комплекси Нєхорошкова”.

Ретроспективне співставлення пункційних біопсій із післяопераційними гістологічними діагнозами 1697 пацієнтів, серед яких 562 мали папілярну‚ 22 - фолікулярну‚ 28 - медулярну та 8 - Б-клітинну карциноми показав, що серед злоякісних новоутворень “комплекси Нєхорошкова” відмічались лише в пунктатах папілярних карцином із частотою 11,4%. Серед обстежених 1077 доброякісних уражень щитовидної залози (вузлових зобів‚ фолікулярних‚ папілярних та трабекулярних аденом‚ кістаденом та вогнищ тиреоїдиту) лише в одному випадку кістозно-дегенеруючого вузла було знайдено структуру‚ схожу на “комплекс Нєхорошкова”. Інакше кажучи‚ “комплекси Нєхорошкова” зустрічаються в папілярних карциномах з частотою принаймні в 100 разів більшою‚ ніж у доброякісних новотворах щитовидної залози. Це дозволяє розглядати “комплекси Нєхорошкова”, як надійний цитоморфологічний маркер папілярного раку.

Таким чином, на прикладі “комплексів Нєхорошкова” доведено можливість визначення ознак аномального морфогенезу в матеріалі тонкоголкових пункційних біопсій, що відкриває принципово новий шлях для точної цитологічної діагностики злоякісних новоутворень щитовидної залози.

Культивування in vitro клітин із пункційного матеріалу доброякісних і злоякісних новоутворень щитовидної залози. В експериментальній онкології з успіхом застосовуються методи тестування на інвазивність живих клітин in vitro. Зокрема‚ культивовані тиреоцити тестують на інвазивність у камерах‚ розділених на дві половини фільтром, вкритим плівкою штучної базальної мембрани (Matrigel), через яку вони можуть мігрувати лише за умови наявності інвазивних властивостей (Hoelting T. et al., 1994).

Для реалізації такого підходу в ДЦД новоутворень щитовидної залози необхідно здобути культури тиреоцитів із пункційного матеріалу. Тому в цій роботі ми поставили собі за мету з'ясувати, чи можливо культивувати клітини з матеріалу тонкоголкових біопсій новоутворень щитовидної залози, і які саме клітини здатні жити в цих культурах. Адже, значна руйнація клітин під час аспірації може бути серйозною перешкодою для отримання їх культур. З другого боку, отриманню культур епітеліальних клітин може заважати значне забруднення пункційного матеріалу макрофагами. У спеціально проведених нами дослідженнях було показано, що в пунктатах аденоматозних вузлів, папілярних карцином та вузлів з кістовидною дегенерацією макрофаги складають відповідно 37,5%, 6,8% та 75,1% у загальній сукупності епітеліальних та макрофагальних клітин.

Для отримання культур клітин в роботі використано матеріал тонкоголкових аспіраційних біопсій 39 новоутворень щитовидної залози (11 папілярних карцином та 28 вузлових зобів). Щоб уникнути коагуляції пункційного матеріалу, до нього стерильно додавали гепарин (20 од./мл).

Пункційний матеріал культивували при 37,5oC у 35 міліметрових пластикових чашках Петрі для культур тканин (COSTAR, США). В якості поживної рідини використовували середовище RPMI 1640 (Sigma, США) з 17% сироватки ембріонів корови (“Геном”‚ Донецьк), 25 мкг/мл гентаміцину (Sigma, США). Газова фаза містила 5% СО2.

Прижиттєве спостереження культур за допомогою інвертованого мікроскопа показало, що протягом 3 діб переважна частина епітеліальних фрагментів, які містили живі клітини, прикріплювалась до дна чашок. Тому після третьої доби ми відмивали культури від еритроцитів та зруйнованих клітин і залишали їх для культивування в поживному середовищі без гепарину на протязі ще 5-9 діб.

В наших експериментах культивування мало успіх в 31 випадку з 39. Експлантація була невдалою, коли пункційний матеріал містив мінімальну кількість тиреоцитів. При культивуванні пунктатів 11 карцином щитовидної залози в усіх випадках було отримано культури епітелію, причому 5 із них - значні за обсягом. В культурах епітеліальних клітин спостерігались картини мітозу, що свідчить про їх активну проліферацію в цих умовах. Після експлантації пунктатів 20 доброякісних вузлів з ознаками кістовидної дегенерації в 19 культурах переважали макрофаги, а в одній спостерігались фібробластоподібні клітини. Приналежність культивованих клітин до епітелію чи макрофагів була доведена за допомогою імуноцитохімічного виявлення в них епітеліальних (цитокератин 8 та Anti-Pan Cytokeratin) або макрофагальних (CD68) антигенів.

Таким чином, проведені дослідження доводять можливість отримання культур епітеліальних і стромальних клітин з матеріалу пункційних біопсій новоутворень щитовидної залози, що відкриває принципово новий шлях для визначення малігнізації в ДЦД новоутворень щитовидної залози за ознаками агресивної поведінки клітин пухлини in vitro.

Висновки

1. Наукові результати роботи розширюють методичну базу досліджень у галузі цитопатології тиреоїдного епітелію‚ дають нові уявлення про морфологічні‚ цитохімічні‚ імуноцитохімічні та цитогенетичні зміни‚ що відбуваються в результаті малігнізації клітин і відкривають нові підходи до визначення стану малігнізації тиреоцитів‚ спрямовані на підвищення ефективності доопераційної цитологічної діагностики новоутворень щитовидної залози.

2. Розроблений простий спосіб швидкого визначення інформативності пунктатів під час аспіраційної біопсії забезпечує отримання адекватного пункційного матеріалу з новоутворень щитовидної залози.

3. Розроблений спосіб відновлення активності антигенних детермінант дозволяє поєднати цитоморфологічні та імуноцитохімічні дослідження на одному цитологічному препараті, що забезпечує точне визначення походження клітинних елементів та наявності маркерів малігнізації у пунктатах новоутворень щитовидної залози.

4. Імуноцитохімічне виявлення позаклітинного тиреоглобуліну дозволяє точно визначати тиреоїдне походження новоутворень при відсутності клітинного матеріалу в пунктатах.

5. Виявлено, що внаслідок малігнізації клітин фолікулярного епітелію щитовидної залози людини в них відбувається не властива нормальним тиреоцитам експресія цитокератину 17‚ яка супроводжується пригніченням експресії ряду тиреоїдних антигенів. Це дозволяє використовувати цитокератин 17 у якості нового імуноцитохімічного маркера малігнізації у доопераційній цитологічній діагностиці (ДЦД) новоутворень щитовидної залози.

6. Встановлено, що малігнізація фолікулярного епітелію супроводжується порушенням міжклітинної адгезії та змінами в локалізації протеїнів повних десмосом. Ці явища можна використати, як нові маркери злоякісності в ДЦД новоутворень щитовидної залози людини.

7. Встановлено прямий зв'язок між малігнізацією фолікулярного епітелію та появою мікроядер у його клітинах, що дозволяє вважати мікроядра цитогенетичним маркером злоякісності в ДЦД новоутворень щитовидної залози людини.

8. Для кардинального покращення точності ДЦД необхідно перейти від пошуку окремих цитоморфологічних та цитохімічних особливостей злоякісних клітин до визначення ознак їх агресивної поведінки - здатності до аномального морфогенезу та проникнення крізь базальні мембрани.

9. Доведено можливість визначення ознак аномального морфогенезу в матеріалі тонкоголкових пункційних біопсій, що відкриває принципово новий шлях для точної цитологічної діагностики злоякісних новоутворень щитовидної залози.

10. Доведено можливість культивування живих тиреоцитів із пунктатів новоутворень щитовидної залози, що відкриває принципово новий шлях для визначення малігнізації в ДЦД новоутворень щитовидної залози - за ознаками агресивності поведінки клітин пухлини in vitro.

Практичні рекомендації

Виходячи з результатів, отриманих в представлених дослідженнях, можна дати наступні рекомендації щодо проведення доопераційної цитологічної діагностики новоутворень щитовидної залози:

1. Для забезпечення максимальної ефективності пункційних біопсій, під час їх проведення необхідно здійснювати мікроскопічний контроль адекватності пунктатів, використовуючи оптичне контрастування нативних цитологічних мазків.

2. Поєднання цитоморфологічних та імуноцитохімічних досліджень на одному цитологічному препараті забезпечує можливість співставлення морфологічних та імуноцитохімічних характеристик окремих клітинних елементів, що необхідно при визначенні тиреоїдного походження пухлин, диференціації медулярних карцином від інших новоутворень, диференціації карцином та аденом за допомогою маркерів малігнізації. Таке поєднання забезпечує розроблений і описаний нами спосіб відновлення активності антигенних детермінант на цитоморфологічних препаратах, пофарбованих за методом MGG.

3. При відсутності епітеліальних клітин у пункційному матеріалі метастазів кістозної будови, можливо встановити тиреоїдне походження новоутворень, застосувавши запропонований нами метод імуноцитохімічного визначення позаклітинного тиреоглобуліну на цитологічних препаратах.

4. Якщо на заваді диференціації папілярних карцином від доброякісних вузлів стоїть відсутність в клітинах новоутворення повного комплексу цитоморфологічних ознак злоякісності, для встановлення правильного цитологічного діагнозу необхідно застосовувати імуноцитохімічні (цитокератин 17) або цитогенетичні (мікроядра) маркери малігнізації.

5. При відсутності всіх вищезгаданих ознак малігнізації діагноз папілярної карциноми може бути встановлено при наявності в пункційному матеріалі ознак аномального морфогенезу (комплексів Нєхорошкова).

Список опублікованих праць за темою дисертації

Монографія:

1. Божок Ю.М. Цитологічна діагностика новоутворень щитовидної залози. Монографія. ТОВ “Міжнародна фінансова агенція”. - Київ, 1997. - 116 с.

Статті в наукових спеціалізованих виданнях:

1. Божок Ю.М., Банников Г.А., Тавокина Л.В., Свиткина Т.М., Трояновский С.М. Локальная экспрессия цитокератинов 8, 17 и 18 в мезенхиме и гладких мышцах на ранних этапах органогенеза человека // Онтогенез. - 1989. - Т. 20, №3. - С. 250-257. (Автором здійснювались: планування експериментів, імуноцитохімічні дослідження, узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті).

2. Божок Ю.М, Зелинская А.В, Васько В.В. Клетки, экспрессирующие детерминанты цитокератина 17, в злокачественных и доброкачественных новообразованиях щитовидной железы человека // Экспериментальная онкология. - 1994. - Т. 16, №2-3. - С. 154-158. (Автором здійснював планування експериментів, приймав участь у проведенні імуногістохімічних та імуноцитохімічних досліджень, аналізі та узагальненні отриманих результатів, написанні статті).

3. Олейник В.А.‚ Безверхая Т.П.‚ Эпштейн Е.В.‚ Божок Ю.М. Диагностика рака щитовидной железы // Проблемы эндокринологии. - 1995. - №5. - С. 37-42. (Автором проводився пошук літератури, цитологічні дослідження і узагальнення їх результатів, приймав участь у написанні статті).

4. Божок Ю.М.‚ Хоруженко А.І.‚ Зелінська Г.В. Шляхи вдосконалення доопераційної діагностики карцином щитовидної залози на основі вивчення змін адгезивності клітин при малігнізації // Журнал АМН України. - 1995. - Т. 1, №2. - С. 344-351. (Автором здійснювались: пошук літератури за темою, планування експериментів, цитоморфологічні та імуноцитохімічні дослідження, узагальнення отриманих результатів, написання статті).

5. Божок Ю.М.‚ Тавокіна Л.В.‚ Епштейн О.В. Нове в діягностиці рака щитовидної залози. Оптимальне поєднання морфологічних та імуноцитохімічних методів дослідження пункційного матеріялу // Лікарський вісник (США). - 1996. - №1 (138). - С. 40-43. (Автором здійснювались: планування експериментів, пошук літератури за темою, цитоморфологічні та імуноцитохімічні дослідження, узагальнення отриманих результатів, написання статті).

6. Bozhok Y.M., Khoruzhenko A.I., Nikonenko A.G. Primari cell cultures of fine needle aspirates from human thyroid tumors // Эксперим. онкология. - 1997. - Т. 19‚ №2. - С. 157-161. (Автор здійснював планування експериментів, приймав участь у пошуку літератури за темою, експериментах по культивуванню клітин, узагальненні отриманих результатів, написанні статті).

7. Божок Ю.М. Участь макрофагів в морфогенезі деяких епітеліальних структур дифузно-склерозуючих папілярних карцином щитовидної залози людини // Эксперим. онкология. - 1997. - Т.19‚ №3.- С. 217-220.

8. Эпштейн Е.В., Олейник В.А.‚ Божок Ю.М. Диагностика рака щитовидной железы // Лабораторная диагностика. - 1997. - №2. - С. 32-33. (Автором здійснювались: пошук літератури за темою, цитологічні дослідження та узагальнення їх результатів, участь у написанні статті).

9. Божок Ю.М. Цитологическая диагностика рака щитовидной железы: сегодняшний день и перспективы // Лабораторная диагностика. - 1999. - №2 (8). - С. 47-50.

10.Болгов М.Ю.‚Комиссаренко И.В.‚ Богданова Т.И.‚ Божок Ю.М.‚ Эпштейн Е.В.‚Рыбаков С.Й.‚ Коваленко А.Е.‚ Лысенко А.Г.‚Чернышов С.В.‚ Омельчук А.В.‚ Козырицкий В.Г.‚ Зурнаджи Л.Ю. Характеристика результатов тонкоигольной аспирационной биопсии и экспресс-гистологического исследования при хирургическом лечении узловой патологии щитовидной железы // Ендокринологія. - 1999. - Т.4‚ №2. - С. 146-158. (Автором здійснювались: цитологічні дослідження, аналіз та узагальнення їх результатів, участь у написанні статті).

11. Эпштейн Е.В.‚ Олейник В.А.‚ Комиссаренко И.В.‚ Божок Ю.М.‚ Совенко Т.К. Диагностика и лечение рака щитовидной железы // Журнал АМН України. - 1999. - Т.5‚ №3. - С. 516-524. (Автором здійснювались: пошук літератури за темою, цитологічні дослідження, аналіз та узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті).

12. Божок Ю.М. Експресія десмосомальних білків в епітеліальних клітинах доброякісних та злоякісних пухлин щитовидної залози людини // Журнал АМН України. - 1999. - Т. 5‚ №2. - С. 319-327.

13. Зелинская А.В.‚ Божок Ю.М. Использование иммуноцитохимического выявления детерминант цитокератина №17 в дооперационной цитологической диагностике злокачественных новообразований щитовидной железы // Онкология. - 2000. - Т. 2‚ №1-2. - С. 56-60. (Автором здійснювались: цитоморфологічні дослідження, участь в аналізі отриманих результатів, участь у написанні статті).

14. Эпштейн Е.В.‚ Божок Ю.М.‚ Матящук С.И.‚ Найда Ю.Н.‚ Явнюк А.В. Ультразвуковая диагностика новообразований щитовидной железы // Променева діагностика‚ променева терапія. - 2001. - №2. - С. 19-21. (Автором здійснювались: цитологічні дослідження, аналіз та узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті).

15. Божок Ю.М.‚ Соколов О.О. Мікроядра‚ як маркер малігнізації фолікулярного епітелію щитовидної залози людини // Журнал АМН України. - 2003. - Т. 9, №1. - С. 141-149. (Автором здійснювались: пошук літератури за темою, планування експериментів, цитоморфологічні дослідження, участь у цитогенетичних дослідженнях, узагальнення отриманих результатів, написання статті).

16. Божок Ю.М.‚ Зелінська Г.В.‚ Кулініченко Г.М.‚ Устименко Г.Я. Маркери малігнізації в сучасній доопераційній цитологічній діагностиці карцином щитоподібної залози (огляд літератури і власні дані) // Ендокринологія. - 2003. - Т.8, №1. - С. 99-111. (Автором здійснювались: пошук літератури за темою, участь у цитоморфологічних та імуноцитохімічних дослідженнях, узагальнення отриманих результатів, написання статті).

1. Пат. №22466 А UA‚ МПК 6 А23К 1/16. Спосіб доопераційної диференційної діагностики злоякісних та доброякісних новоутворень щитовидної залози / Божок Ю.М.‚ Хоруженко А.І. - №95073537; Заявл. 27.07.95; Опубл. 03.03.98.

2. Пат. №23098 А UA МПК6 G01N33/50. Спосіб приготування морфологічних препаратів для імуноцитохімічного дослідження / Божок Ю.М.‚ Тавокина Л.В.‚ Абраменко І.В.‚ Бєлоус Н.І. - №95041574; Заявл. 07.04.95; Опубл. 30.06.98‚ Бюл. №3.

3. Пат. №36880 А UA МПК 7 G01N33/574. Спосіб доопераційної діагностики злоякісних новоутворень щитовидної залози / Зелінська Г.В.‚ Божок Ю.М. - №2000020938; Заявл. 18.02.2000; Опубл. 16.04.2001‚ Бюл. №3.

4. Пат №59554 А UA‚ МПК 7 G01N33/574. Спосіб доопераційної діагностики папілярних карцином щитовидної залози / Божок Ю.М.‚ Соколов О.О.‚ - Заявл. 20.07.02; Опубл. 15.09.2003, Бюл. №9.

За матеріалами дисертації опубліковано також 4 тези доповідей в збірниках наукових праць міжнародних та республіканських з'їздів та видано 1 методичні рекомендації.

Анотація

Божок Ю.М. Цитоморфологія‚ цитогенетика та імуноцитохімія в доопераційній діагностиці новоутворень щитовидної залози. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 14.01.14 - ендокринологія. - Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, Київ, 2004.

В результаті гістохімічних, цитохімічних, імуногістохімічних та імуноцитохімічних досліджень, проведених на післяопераційному та біопсійному матеріалі 2393 пацієнтів із доброякісними та злоякісними новоутвореннями щитовидної залози, суттєво розширено методичну базу доопераційної цитологічної діагностики тиреоїдних пухлин. Розроблено способи швидкого визначення інформативності пунктатів, поєднання цитоморфологічних та імуноцитохімічних досліджень, імуноцитохімічного виявлення позаклітинного тиреоглобуліну. Отримано нові уявлення про зміни в експресії цитокератинів, десмосомальних протеїнів, порушення міжклітинної адгезії та утворення мікроядер в результаті онкогенезу, що дало можливість запропонувати ряд нових маркерів малігнізації фолікулярного епітелію. Доведено можливість визначення ознак аномального морфогенезу в матеріалі тонкоголкових пункційних біопсій та можливість культивування живих тиреоцитів із пунктатів новоутворень щитовидної залози, що відкриває принципово нові шляхи для точної цитологічної діагностики злоякісних новоутворень щитовидної залози.

Ключові слова: новоутворення щитовидної залози, цитологічна діагностика, цитоморфологія, цитогенетика, імуноцитохімія, маркери малігнізації, культура клітин.

Аннотация

Божок Ю.М. Цитоморфология, цитогенетика и иммуноцитохимия в дооперационной диагностике новообразований щитовидной железы. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук по специальности 14.01.14 - эндокринология. - Институт эндокринологии и обмена веществ им. В.П. Комиссаренко АМН Украины, Киев, 2004.

В работе представлены исследования, проведенные на послеоперационном и биопсийном материале 2393 пациентов клиники Института эндокринологии и обмена веществ им. В.П. Комиссаренко.

Научные результаты работы расширили методическую базу дооперационной цитологической диагностики новообразований щитовидной железы. Разработан простой способ быстрого определения информативности пунктатов в ходе процедур аспирационной биопсии, обеспечивающий получение адекватного пункционного материала из опухолей. Предложен метод восстановления активности антигенных детерминант на цитологических препаратах, ранее окрашенных по методу Май-Грюнвальда - Гимза, что позволяет последовательно проводить морфологические и иммуноцитохимические исследования одних и тех же клеток. Разработан способ иммуноцитохимического выявления внеклеточного тиреоглобулина, позволяющий определять тиреоидное происхождение новообразований при отсутствии клеточного материала в пунктатах.

Проведенные исследования дают новые представления о морфологических, цитохимических и цитогенетических изменениях, возникающих в фолликулярном эпителии при малигнизации.

Установлено, что в результате этих процессов происходит не свойственная нормальным тиреоцитам экспрессия цитокератина 17, сопровождающаяся угнетением экспрессии ряда тиреоидных антигенов. Это позволяет использовать цитокератин 17 в качестве нового иммуноцитохимического маркера малигнизации в дооперационной цитологической диагностике новообразований щитовидной железы.

Выявлено, что малигнизация фолликулярного эпителия сопровождается нарушением межклеточной адгезии и изменениями в локализации протеинов полных десмосом, что может быть использовано для дифференциальной цитологической диагностики папиллярных карцином.

Установлена прямая связь между малигнизацией фолликулярного эпителия и появлением микроядер в его клетках, что является основанием для использования микроядер в качестве цитогенетического маркера папиллярных карцином щитовидной железы.

В работе обосновывается необходимость кардинального изменения подходов к определению малигнизации в дооперационной цитологической диагностике путем выявления прямых признаков агрессивного поведения злокачественных клеток - способности к аномальному морфогенезу и проникновению сквозь базальные мембраны. Доказана возможность определения признаков аномального морфогенеза в папиллярных карциномах щитовидной железы на материале тонкоигольных аспирационных биопсий. Получены культуры живых тиреоцитов из пунктатов опухолей щитовидной железы, что открывает путь к их тестированию на инвазивность in vitro в системах с искусственными базальными мембранами.

Ключевые слова: новообразования щитовидной железы, цитологическая диагностика, цитоморфология, цитогенетика, иммуноцитохимия, маркеры малигнизации, культура клеток.

Summary

Bozhok Y.M. Cytomorphology, cytogenetics and immunocytochemistry in preoperative diagnostics of the thyroid neoplasms - Manuscript.

Thesis for the Degree of Doctor of Biological Sciences, speciality 14.01.14 - Endocrinology. - Institute of Endocrinology and Metabolism of the Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004.

As a result of histochemical, cytochemical, immunohistochemical, immunocytochemical studies of histopathologic and cytologic material from 2393 patients with benign and malignant thyroid gland tumors the methodological basis for cytologic diagnosis of thyroid lesions was extended. The methods for rapid determination of adequacy of the thyroid aspirates, combination of cytomorphological and immunocytochemical studies, immunocytochemical determination of extracellular thyroglobulin were developed. The new ideas about alterations of cytokeratins and desmosomal proteins expression, disorders in intercellular adhesion and formation of micronuclei during oncogenesis were obtained which enabled to propose a number of new markers of the malignization of the follicular epithelium. The possibility of the determination of characteristics of abnormal morphogenesis in the material of the fine needle aspiration biopsy as well as possibility of cultivation of alive thyrocytes from fine-needle aspirates were demonstrated that modernize the new ways for accurate cytologic detection of malignant thyroid nodules.

Key words: thyroid neoplasm, cytologic diagnosis, cytomorphology, cytogenetics, immunocytochemistry, marker of the malignancy, cells culture.

Размещено на Allbest.ru