Патогенетичні механізми порушення імунологічної резистентності організму за умов формування стрес-синдрому та шляхи їх фармакологічної корекції

Бобирьов Віктор Миколайович, Українська медична стоматологічна академія МОЗ України, завідувач кафедри експериментальної та клінічної фармакології

Провідна установа: Інститут фармакології та токсикології АМН України, відділ нейрофармакології, м.Київ

Захист відбудеться “ 14 ” лютого 2002 р. о 14 год.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному

медичному університеті (65026, м. Одеса, провулок Валіховський 2).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Одеського державного

медичного університету (65026, м. Одеса, провулок Валіховський, 3).

Автореферат розісланий “_ 9 _ ” січня 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

к. мед. н. Р.В.Соболєв

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Імунні реакції є провідними в комплексі адаптивних механізмів, які забезпечують захист організму в умовах дії екстремальних факторів. Разом з тим, питання патогенезу розладів імунологічної резистентності при стресі залишаються відкритими, а отже, значну проблему являє собою і розробка сучасних методів їх фармакологічної корекції, що є одним з найактуальніших напрямків сучасної нейроімунофармакології (Г.Н.Крыжановский, 1985; Б.А.Фролов, 1987; Н.Г.Арцимович і інш., 1997; Г.М.Бутенко, 1997; К.В.Судаков, 1997).

Безперечно, що одним з провідних факторів негативного впливу стреса на стан імунологічної резистентності організму може бути системна лабілізація мембран імунокомпетентніх клітин (ІКК), внаслідок чого спостерігається їх масова деструкція, порушується рецепторний апарат, їх здатність до проліферації, кооперації та диференціювання (М.В.Милютин, 1996; В.А.Симоненкова, 1998; О.Г.Попов і спів., 1999). Однак у сучасній літературі мембранні механізми регуляції імунореактивності та перспективи імуномодуляції стрес-протекторами мембраноактивного типу дії досліджені недостатньо.

З іншого боку, дані останніх років свідчать про наявність тісного зв'язку між імунною і нейроендокринною системами організму. Основою цих взаємовідносин може бути наявність спільних рецепторів на нервових та ІКК і їх здатність продукувати східні ліганди (Е.А.Корнева, 1988-1993; A.Bateman et. al., 1989; J.E.Blalock, 1989; E.I.Cunningham, E.B.De Souza, 1993; H.O.Besedowsky, A.Del Rey, 1996; А.Д.Адо і спів., 1999). Враховуючи значення факторів нейрогуморальної регуляції в генезі порушень імунної системи, цілеспрямована корекція механізмів нейромедіаторного забезпечення ІКК і органів стає перспективним напрямком у вирішенні цієї проблеми. Одним з головних клітинних ефекторів, які забезпечують зв'язок імунної і нейроендокринної системи, є мононуклеарні фагоцити. Як основне джерело цитокінів, ці клітини здійснюють взаємодію неспецифічних і специфічних факторів резистентності організму. Здатність цитокінів виконувати функцію комунікаційного сигналу поміж різними популяціями клітин, проникати усередину клітини, змінюючи її метаболізм, здійснювати дистантний вплив на ЦНС відкриває реальну перспективу розширення уявлень про механізми забезпечення резистентності організму в умовах стресу. Отже, регуляція функціонального стану макрофагів та пов'язаних з ними клітинно-цитокінних механізмів впливу є принципово новим напрямком клінічної імунофармакології і набуває особливого значення як один з перспективних шляхів корекції стресових розладів імунітету в умовах хронічного стресу.

Разом з тим, сучасна профілактика стресу, заснована на пріоритетному застосуванні депримуючих засобів, не завжди враховує того, що більшість з них додатково підсилює його негативний вплив на імунологічну реактивність організму (М.Г.Айрапетянц, 1988; В.Й.Кресюн і спів, 1993; M.Fava, 1997; R.R.Griffiths et al., 1997). Традиційне ж застосування антиоксидантної терапії та класичних імуномодуляторів також не вирішує всіх проблем корекції стресових розладів імунітету (К.М.Дюмаев и спів., 1995; Н.Г.Арцимович і спів., 1997). На наш погляд, одним з нових підходів у вирішенні цієї проблеми є застосування засобів метаболітної терапії, молекулярно-біохімічні механізми дії яких імітують, захищають або підсилюють природні нейроендокринні системи захисту організму. Типовим представником цієї групи є літоніт, здатний обмежувати стресові порушення біоенергетичних процесів в структурах головного мозку та запобігати морфо-функціональним змінам мембран організму в умовах стресу (В.Й.Кресюн і спів., 1991). Однак його імуномодулюючі властивості стосовно стресових порушень імунітету залишаються ще не дослідженими.

Останнім часом особлива увага науковців зосереджена на вивченні молекулярних механізмів імунотропної дії індукторів ендогенного інтерферону, сучасним представником яких є один з похідних класу флуоренонів аміксин (Т.О.Філіпова, 1996; Ф.И.Ершов, 1998; С.А.Андронаті та інш.,1999). Окрім загальновідомих противірусних ефектів, аміксину притаманні імуномодулюючі властивості, здатність, шляхом індукції інтерферону, регулювати продукцію цитокінів в організмі, що, разом з іншими позитивними ефектами препарату відкриває перспективу його профілактичного використання з метою усунення деяких ланок патогенезу стресових розладів імунітету. З іншого боку, система інтерферону, завдяки встановленим центральними механізмам дії, поряд з ГАМК-ергічною та іншими, розглядається як одна з важливих ланок стрес-лімітуючої системи організму (N.Dafny et al., 1985; E.M.Smith, J.E.Blalock, 1993). Тому вивчення можливостей профілактичного застосування аміксину та встановлення молекулярних механізмів його імунорегуляторного впливу в умовах стресу набуває особливої актуальності. Подібні дослідження раніше не проводились.

Таким чином, складність та багатовекторність патогенетичних механізмів стресових порушень імунологічної резистентності з одного боку, неоднозначність їх оцінки на різних етапах стрес-синдрому та недослідженість провідних механізмів імунокорегуючого впливу більшості з відомих лікарських засобів, з іншого боку, диктує необхідність їх подальшого вивчення та розробки на цій основі нових підходів до імунокорекції, які б сприяли нормалізації гомеостазу всього організму.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Напрямок дисертаційної роботи тісно пов'язаний з комплексною НДР МОЗ України “Методи ранньої діагностики інфекційних та запальних хвороб на основі використання молекулярно-генетичних та біофізичних технологій” (№ держреєстрації 0196U001839), які виконуються в рамках НТП 01.01. “Охорона генофонду населення України”. Автор не є безпосереднім виконавцем вказаної теми, але працює на кафедрі, де ця НДР виконувалась.

Мета і задачі дослідження. Дослідити провідні патогенетичні механізми порушення імунологічної резистентності організму в умовах формування хронічного стрес-синдрому та розробити адекватні шляхи їх фармакологічної корекції.

У відповідності до мети було визначено такі основні задачі дослідження:

1. Дослідити особливості порушення неспецифічної резистентності організму, клітинних та гуморальних факторів імунітету за умов розвитку стрес-синдрому та післястресового періоду.

2. Виявити вплив хронічного стресу на продукцію лімфоцитактивуючого фактора (ЛАФ) перитонеальними макрофагами мишей та встановити патогенетичне значення цього факту у механізмах порушення імунологічної резистентності.

3. Вивчити залежність змін вмісту катехоламінів і циклічних нуклеотидів (ЦН) з порушенням структурно-функціонального стану мембран лімфоцитів імунокомпетентних органів та визначити їх значення в патогенезі стресових розладів імунітету.

4. Виявити наявність та встановити механізми імунотропної дії реланіуму на тлі його профілактичного використання в умовах хронічного стресу. стрес катехоламін імунотропний реланіум

5. Вивчити вплив атипового транквілізатора літоніта на різні ланки патогенезу стресових розладів імунітету та визначити провідні молекулярні механізми його імунопрофілактичної дії.

6. Довести доцільність застосування імуномодулятора тималіна для попередження розвитку стресових розладів імунітету та встановити провідні механізми його імунокорегуючого впливу.

7. Вивчити вплив профілактичного уведення індуктора ендогенного інтерферону аміксина на функціональну активність системи мононуклеарних фагоцитів (СМФ), характер нейро-медіаторного забезпечення органів імуногенезу, структурно-функціональний стан мембран лімфоцитів та встановити провідні механізми імуномодулюючого впливу цього препарату.

8. З метою корекції виявлених порушень імунологічної резистентності обґрунтувати доцільність комплексного застосування літоніта, тималіна та аміксина.

Об'єкт дослідження - імунологічна резистентність організму.

Предмет дослідження - показники імунного гомеостазу та патогенетичні механізми його порушення у тварин на тлі хронічного стресу і його фармакологічної корекції.

Методи дослідження - для досягнення поставленої в роботі мети використані фармакологічні, біохімічні, радіоімунологічні, імуноферментні, морфологічні, гістохімічні та статистичні методи дослідження.

Наукова новизна роботи. Вперше комплексно досліджена роль та встановлений зв'язок динаміки порушень неспецифічної і специфічної резистентності організму з функціональною активністю СМФ, характером нейро-медіаторного забезпечення органів імуногенезу та структурно-функціональним станом мембран лімфоцитів на різних етапах формування стрес-синдрому. Вперше отримані важливі дані про участь ендотоксинів кишкової флори у механізмах ендогенної інтоксикації і сенсибілізації організму в умовах стресу. Встановлено, що хронічний стрес, який на різних етапах супроводжується різнобічними змінами величини гуморальної імунної відповіді, призводить до стимуляції продукції ЛАФ перитонеальними макрофагами, підвищує рівень ІЛ-1 в плазмі крові тварин та знижує чутливість лімфоцитів крові до комітогенного впливу ІЛ-1 в РБТЛ. Показано різке зниження продукції макрофагами ЛАФ під час стадії виснаження, яка ще більш пригнічується після додаткової стимуляції макрофагів Staphylococcus aureus за умов in vitro. Вперше зроблений порівняльний аналіз динамічних змін структурно-функціонального стану мембран лімфоцитів з характером катехоламінового забезпечення і вмістом циклічних нуклеотидів у різних органах імуногенезу в залежності від стадії стресу та встановлений їх зв'язок з характером порушення основних показників імунологічної резистентності. Показано, що початковий етап післястресового періоду характеризується подальшим, ще більш виразним пригніченням окремих показників імунологічної резистентності.

Вперше отримано широкий комплекс даних щодо профілактичної активності реланіума, літоніта, тималіна і аміксина на резистентність організму, інтегральні показники функціональної активності СМФ, нейро-медіаторної регуляції та структурно-функціонального стану мембран лімфоцитів на тлі розвитку хронічного стресу. Встановлені нові оригінальні дані про молекулярні механізми стрес- та імунопротекторної дії літоніта, пов'язані з його виразними мембранопротекторними властивостями та найбільш вдалою корекцією порушеного нейро-медіаторного балансу провідних органів імуногенезу. На основі комплексного дослідження розкриті механізми імунодепресивної дії реланіуму, які полягають у здатності цього препарату за умов профілактики хронічного стресу додатково підсилювати післястресову депресію показників фагоцитозу, Т-клітинних та деяких гуморальних факторів імунітету, збільшуючи термін їх післястресової реабілітації. Встановлено зв'язок цих змін зі здатністю реланіума поглиблювати негативні стресові зміни в мембранах лімфоцитів внаслідок додаткового накопичення в них мембранних лізофосфатидів. Вперше доведена можливість корекції стресових розладів імунітету індуктором ендогенного інтерферону аміксином та показана його висока ефективність щодо корекції порушення продукції імунорегуляторних пептидів клітинами СМФ, стабілізації фосфоліпідного матриксу лімфоцитів, зменшення в лімфоцитах надмірного катаболізму ЦН та нормалізації внаслідок цього активності мембранних ферментів обміну аденозину. Теоретично доведена ефективність імунокорегуючого впливу тималіна, здатного за умов профілактичного уведення найбільш вдало зменшувати індуковану стресом Т-клітинну лімфопенію, стабілізувати співвідношення теофілінчутливих і теофілінрезистентних клітин та підсилювати природні детоксикаційні резерви організму шляхом збільшення в крові рівня нормальних АТ. Вперше розроблено спосіб підвищення ефективності профілактики стресових порушень імунологічної резистентності комбінацією літоніта, тималіна та аміксина, яка найбільш вдало коригує ключові ланки патогенезу виявлених порушень.

Практичне значення роботи. Отримані експериментальні дані розширили існуючі уявлення про ключові патогенетичні механізми порушення резистентності організму на різних етапах хронічного стресу та надали можливість пошуку нових методів цілеспрямованої фармакологічної корекції виявлених патологічних змін. Комплексна оцінка стану інтегральних показників неспецифічної і специфічної резистентності перспективна в плані підвищення ефективності і надійності діагностики фази розвитку, ступеню глибини стресових порушень та контролю за ефективністю лікувальних заходів. Зокрема, результати досліджень дозволяють використати показники цитокінової регуляції: інтенсивність продукції ЛАФ перитонеальними макрофагами, рівень ІЛ-1 в плазмі крові і реакцію лімфоцитів на комітогенний вплив ІЛ-1, як сучасні і найбільш чутливі методи діагностики та ефективності профілактики стресу. Теоретичне значення роботи також визначається створенням нових уявлень про роль ЛАФ і ІЛ-1 у механізмах імуносупресивної дії реланіуму та імунопротективної дії аміксину на тлі хронічного стресу. Прикладний аспект роботи пов'язаний з обґрунтуванням недоцільності тривалого застосування реланіуму на тлі хронічного стресу внаслідок його негативного впливу на окремі показники імунологічної резистентності організму. Обґрунтовано використання за новими показаннями літоніту у якості мембраноактивного імунокоректора метаболітного типу дії та індуктора інтерферону аміксина як модулятора продукції цитокінів в умовах хронічного стресу. На основі результатів проведених досліджень пропонується найбільш ефективна комбінація препаратів, які впливають на різні ланки патогенезу стресових порушень імунологічної резистентності: мембраноактивний стреспротектор з неспецифічною імунокорегуючою активністю літоніт, імуномодулятор тималін та регулятор продукції цитокінів аміксин. Отримані дані, які свідчать про позитивний вплив застосованої комбінації на ключові ланки патогенезу виявлених порушень, є новим і ефективним вирішенням проблеми корекції імунологічної резистентності, зниження ендогенної інтоксикації, підвищення адаптивних можливостей організму та покращання віддалених наслідків перенесеного стресу.

Результати роботи впроваджені в клінічні заклади м. Одеси і області, а також у практику наукових досліджень і навчальний процес ряду кафедр медичних академій і університетів України.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблена дослідницька програма, проведено більшість біохімічних, біофізичних та імунологічних досліджень. Частина радіоімунних досліджень виконана за технічної допомоги співробітників лабораторій Наукового центру акушерства, гінекології і перинатології РАМН (директор - академік РАМН В.І.Кулаков, м. Москва, Росія). Морфологічне дослідження імунокомпетентних органів виконано за допомогою співробітників гістологічної лабораторії кафедри топографічної анатомії Одеського державного медичного університету (зав. кафедри - професор О.Г. Попов), за що автор висловлює їм щиру подяку. Самостійно проведено аналіз результатів дослідження, обгрунтування основних положень дисертаційної роботи, зроблені висновки, статистична обробка матеріалу, написання та оформлення дисертаційної роботи.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до дисертації, оприлюднено на науково-практичній конференції молодих вчених Одеського медичного інституту “Творчість молодих” (Одеса,1991); 2-й Всесоюзній конференції “Фармакологічна конференція гіпоксичних станів” (Гродно,1991); Всесоюзній науковій конференції “Тривалість життя: механізми, прогнози, шляхи збільшення” (Київ,1991); Республіканській науковій конференції “Прискорене старіння, зв'язок з віковою патологією”(Київ,1992); XI-му з'їзді анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів країн СНД (Смоленськ,1992); 1-му Національному Конгресі анатомів, гістологів і ембріологів України (Івано-Франківськ,1994); VI Congress of the World Federation of Ukrainian Medical Association (Odesa,1996); Виїзній сесії Української академії наук національного прогресу (Тернопіль,1997); 2-му Національному Конгресі анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України (Луганськ,1998); VIII Congress of the World Federation of Ukrainian Medical Association (Lviv-Truskavets, 2000); Науково-практичній конференції “Ліки - людині” (Харків,2001); II Українській науково-практичній конференції “Прискорене старіння і шляхи його профілактики (Одеса,2001); Республіканській науково-практичній конференції “Досягнення та перспективи розвитку клініки внутрішніх хвороб” (Харків,2001); Міжнародній науково-практичній конференції “Медикаментозна та немедикаментозна профілактика та відновне лікування в клінічній практиці”(Київ,2001); Науково-практичній конференції “Актуальні проблеми морської медицини” (Одеса,2001); II Національному з'їзді фармакологів України (Дніпропетровськ,2001).

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 44 наукових роботах (28 статей - у фахових наукових журналах і збірниках наукових праць, решта робіт - в матеріалах і тезах конференцій та симпозіумів).

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 359 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, 5 розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел (257 робіт вітчизняних і 238 зарубіжних авторів). Текст містить одну схему, ілюстрований 42 таблицями і 64 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження проведені на 1352 високопородних щурах самцях лінії Август масою 160-180 г та 778 мишах лінії (CBA x C₅₇BL₆)F₁ вагою 18-22 г, які утримувались в стандартних умовах віварію. При проведені досліджень всі піддослідні тварини були розділені на наступні групи: 1 - інтактні тварини (контрольна група); 2,3,4 і 5-та групи - тварини, які зазнали хронічного стресу відповідно протягом 1,2,3 та 4 діб; 6,7,8 і 9 групу становили тварини, яких досліджували відповідно через 1, 3, 7 та 14 діб після закінчення експозиції стресу; наступні групи становили тварини, які протягом 4 діб аплікації стресу профілактично отримували реланіум (2 мг/кг, п/шкірно), літоніт (30 мг/кг, п/шкірно), тималін (1 мг/кг, в/черевно), аміксин (2 мг/кг, в/черевно), та одночасно комбінацію літоніта, тималіна і аміксина. У якості моделі хронічного стресу був обраний метод депривації парадоксального сну протягом 4 діб (D.Jouvet et al., 1964). Після закінчення експерименту щурів декапітували під легким ефірним наркозом. Об'єктом дослідження служили цільна кров, плазма, сироватка та окремі формені елементи крові, гомогенат і лімфоцити тимуса, селезінки і мезентеріальних лімфатичних вузлів (ЛВ), перитонеальні макрофаги. Морфологічно досліджували наднирковики та мезентеріальні ЛВ.

Для визначення фагоцитарної активності нейтрофілів у якості тест-об'єкту використовували мікроорганізми штаму Staphylococcus aureus N209-P (А.С.Козлюк і спів., 1987). Функціональний стан нейтрофілів оцінювали за НСТ-тестом (E.Guthy, D.O'Brien, 1982). Визначення вмісту лізосомально-катіонних білків (ЛКБ) проводили за лізосомально-катіонним тестом (В.Е.Пигаревский, 1979). Лізоцимну активність сироватки крові вимірювали нефелометричним методом (Г.В.Дорофейчук, 1968), сумарну пероксидазну активність (СПА) сироватки крові - методом Е.М.Мікаеляна і спів. (1984), активність комплементу - за ступенем сенсибілізованих гемолізином еритроцитів у присутності комплементу (А.С.Козлюк та інш., 1987). Кількість циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) визначали методом Е.Ф.Чернушенко, Л.С.Когосова (1978). Встановлення рівня ендогенної інтоксикації (ЕІ) проводили за допомогою лейкоцитарного індексу інтоксикації (ЛІІ) (Г.Н.Карабанов, 1990). ДНК-зв'язуючу активність білків сироватки крові вивчали радіоімунним методом (Р.А.Беловолова, 1992).

Лімфоцити з периферичної крові тварин видаляли за методом Boyum (1968). Встановлення вмісту Е-РУК і ЕАС-РУК в периферичній крові здійснювали методом розеткоутворення (Р.В.Петров і спів., 1976). Антитіла (АТ) до ДНК визначали методом імуноферментного аналізу. У якості антигену (АГ) використовували курчачу нативну і денатуровану ДНК (“Лахема”, Чехія) у концентрації 10 мкг/мл, а інтенсивність реакції оцінювали на багатоканальному фотометрі Мультіскан при =492 нм. Визначення вмісту АТ до гліколіпіду А E.Coli здійснювали реакцією пасивної гемаглютинації (Р.А.Беловолова, 1992). Встановлення сенсибілізації до антигену кишкової палички здійснювали за допомогою плантарної проби. Алерген кишкової палички вводили в/шкірно в плантарну поверхню лапки щурів через три доби після закінчення стресу. Оцінка реакції проводилась через 48 годин після ін'єкції алергену візуально та вимірюванням об'єму лапки. Проліферативна активність лімфоцитів периферичної крові оцінювалась за результатами проведення в/шкірної проби з Кон А, (розведення 50 /мл, 0,1 мл у вухо щурів). Реакцію оцінювали через 48 годин порівняльним зваженням вуха з утвореним інфільтратом і контрлатерального вуха. За збільшенням ваги оцінювали мітогенний вплив Кон А.

Оцінку гуморальній імунній відповіді проводили через 5 діб після імунізації мишей еритроцитами барана в дозі 0,2 млрд. клітин в/черевно на 0,2 мл фізіологічного розчину шляхом підрахунку кількості антитілутворюючих клітин (АУК) селезінки та титрів загальних АТ в крові. Титри АТ в сироватці крові визначали методом прямої гемаглютинації в мікротитраторі Токачі, а кількість АУК в селезінці - методом локального гемолізу в гелі агарози (K.N.Jerne, A.A.Nordin, 1963).

Резидентні макрофаги змивали з перитонеальної порожнини декапітованих мишей 5 мл середовища 199 з 100 ОД/мл пеніціліну. Для індукції утворення лімфоцитактивуючого фактора (ЛАФ) використовували Staphylococcus aureus у розрахунку 20-30 вбитих нагріванням мікробних тіл на 1 фагоцит. ЛАФ активність інкубатів мононуклеарних фагоцитів оцінювали за їх здатністю викликати комітогенний вплив на проліферацію тимоцитів, стимульованих субоптимальними дозами лектинів (L.J.Rosenwasser, C.A.Dinarello, 1981). Включення Н³-тимідину в ДНК поділених клітин оцінювали за допомогою сцинтиляційного -лічильника (LKB). За одиницю активності ЛАФ приймали таку його концентрацію (в мл), яка підсилювала проліферацію тимоцитів на 50% відносно її максимальної стимуляції, яка викликається субоптимальною дозою лектину. Для проведення реакції бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ) периферичної крові щурів клітини культивували з Кон А (0,75 мкг/мл) і нативним препаратом ІЛ-1 кроля в дозі 0,06 мкг/мл. Радіоактивність зразків вимірювали за допомогою сцинтиляційного -лічильника (LKB). Пряме визначення концентрації ІЛ-1 в плазмі крові у мишей здійснювали стандартним радіоімунним методом з використанням Interleukin-1 [¹²⁵I] RIA kit (Amersham, UK).

Визначення вмісту кортикостерону в сироватці крові здійснювали радіоімунним методом (Н.П.Гончаров і інш., 1977). Вміст адреналіну (А), норадреналіну (НА) і дофаміну (ДА) в тимусі, селезінці і мезентеріальних ЛВ вивчали флюорометричним методом (В.В.Меньшиков, 1987).

Вміст цАМФ і цГМФ визначали за допомогою наборів фірми Amercham (UK). Для визначення цАМФ використовували - [¹²⁵І] RIA KIT Code: R¹⁰¹²; для цГМФ - [¹²⁵І] RIA KIT Code: R¹⁰⁴². Радіоактивність зразків вимірювали на -лічильнику (LKB). Розмірність концентрації - пмоль/10⁶ лімфоцитів.

Вміст малонового діальдегіду (МДА) в гомогенаті імунокомпетентних органів визначали методом І.Д.Стальної, Т.Г.Гарішвілі (1977); дієнових кон'югатів ненасичених вищих жирних кислот (ДК) - методом В.А.Костюк і спів. (1984), активність супероксиддисмутази (СОД) - методом О.П.Макаревич, П.П.Голікова (1983), каталазну активність - методом М.А.Королюк і спів. (1988). Стан неферментної системи антирадикального захисту (САЗ) оцінювали за вмістом в імунокомпетентних органах токоферолу (Р.Ш.Киселевич, С.И.Скварко, 1972). В ліпідних екстрактах лімфоцитів, отриманих за методом J.Folch (1957), визначали вміст загального холестерину (ХС), фосфоліпідів (ФЛ) та вираховували їх молярне співвідношення. Фракціонування ФЛ проводили методом тонкошарової хроматографії на пластинах “Silufol UV-254” (Чехія), ідентифікували за відомими значеннями R_f. Вміст індивідуальних фракцій - лізофосфатиділхоліну (ЛФХ), сфінгомієліну (СФМ), фосфатиділхоліну (ФХ), кардіоліпіну (КЛ) і фосфатиділетаноламіну (ФЕА) оцінювали за кількістю ліпідного фосфору (В.Л.Зубер, 1982). Окрім того, в лімфоцитах органів імуногенезу вивчали активність аденозиндезамінази - (АДА) (Н.М.Дмитренко і спів., 1980) і 5'-нуклеотідази - (5'-НК) (В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов, 1988).

У піддослідних щурів морфологічно досліджували наднирковики і мезентеріальні ЛВ. Морфологічні зрізи лівого наднирковика проводили точно за центром. Вивчали вміст і характер розподілу ФЛ по Лізону і аскорбінової кислоти (АК) методом Бакхуса. Об'єктом морфометрії були ядра клітин пучкової та сітчастої зони кори і хромафінних клітин мозкової речовини наднирковиків. Каріометрію проводили на фотовідбитках, виготовлених із зрізів, пофарбованих гематоксиліном і еозином при збільшенні у 1000 разів. На кожному фотовідбитку вивчали середню площу перерізу 25 ядер, обраних спонтанно. Ширину коркового шару і мозкової речовини вимірювали за допомогою стереологічної решітки у 10 різних ділянках залози.

Мезентеріальні ЛВ видаляли біля кореня брижі тонкої кишки. На рівні воріт органу робились серійні зрізи товщиною 5-6 мкм, які фарбувались гематоксилін-еозином та азур-2-еозином. Всього виготовлено 808 зрізів, отриманих з 184 ЛВ. Препарати досліджувались методом світлової мікроскопії на МБІ-6 при збільшенні мікроскопа (х 400). Всі вимірювання для кожного спостереження проводили за 3 серединними зрізами та в 5 полях зору. Підрахунок окремих клітинних елементів ЛВ здійснювали за допомогою морфометричної решітки.

Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали за допомогою критерію Ст'юдента та коефіцієнта кореляції на ЕОМ Pentium-2 MMX-233 та пакету програм Microsoft Word, Microsoft Excel, Microsoft Graph 5.0.

Результати дослідження та їх обговорення