В условиях возрастающей антибиотикорезистентности H.pylori бактериологический метод представляет особую ценность при обследовании больных, уже получивших один или два неудачных курса эрадикационной терапии, так как изучение индивидуальной чувствительности к антибиотикам позволяет сформировать оптимальную схему лечения.

Повышение чувствительности бактериологического метода возможно за счет использования ростовых добавок при культивировании, таких как сульфат железа, пируват натрия, свиной муцин, которые улучшают рост Н.pylori в культуре [11]. В последнее время стало возможным бактериологическое исследование не только биопсионного материала, но и желудочного сока, который извлекается с помощью капсулы на нити - Стринг-тест [12,13].

Штаммы, полученные при культивировании, могут быть изучены методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая позволяет оценить свойства микроба, в частности токсигенность по обнаружению генов CagA, VacA, IceA, BabA [14] и т. д., а также устойчивость микроорганизма к макролидам по точечной мутации 23S рибосомальной РНК [15], что может иметь важное прогностическое значение в оценке факторов риска канцеро- и ульцерогенеза и подборе эрадикационных схем. Возможность определения мутации 23S рибосомальной РНК непосредственно в биоптате сокращает время исследования до нескольких часов [16,17].

Гистологический метод позволяет не только обнаружить бактерии, но и определить их расположение на слизистой оболочке, наблюдать взаимоотношение с тканями "хозяина", оценить характер патологического процесса, наличие и выраженность воспаления, атрофии, метаплазии. Поэтому метод признан "золотым стандартом" в диагностике инфекции Н.pylori [18]. Для элективной окраски Н.pylori применяют различные методики. Наиболее распространенной в мире является специфическая окраска серебрением по Вартину-Старри, которая отличается высокой специфичностью и чувствительностью [19].

По мнению Л.И. Аруина с соавт. (1993) [20], наиболее чувствительными оказались окраски акридиновым оранжевым (85%) и красителем Гимзы (79%), несколько меньше чувствительность окраски по Граму (72%). Исследование, проведенное И.А. Морозовым, В.Н. Матушевской и соавт.(1996) [21], показало довольно низкую чувствительность гистологического метода в сравнении с изучением мазков-отпечатков и "Де-нол -тестом" - 79,7%. Возможно, такая низкая чувствительность обусловлена, с одной стороны, особенностями самого микроба, который обитает в слое покрывающей эпителиальные клетки слизи и не всегда плотно адгезирован к эпителию, поэтому легко вымывается при подготовке биоптатов к исследованию.

С другой стороны, и сам слизистый слой легко отмывается в процессе подготовки биоптата. Для ликвидации этого недостатка метода И.А. Морозов (1997) [22] предлагает укрывать поверхность биоптата слоем агарового геля (0,85-1,0%), что позволяет сохранить поверхностный слой слизи и бактерии, находящиеся в нем. Интерес представляет новая технология так называемой флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), предложенная Trebesius К. с соавт. (2000) [23], которая не требует культивирования Н.pylori и/или проведения ПЦР. Метод позволяет совершенствовать морфологическое выявление микроба путем обработки срезов меченными флюоресцирующими нуклеотидами.

Нуклеотиды могут быть связаны либо с 16S рибосомальной РНК (для идентификации Н.pylori), либо с 23S рибосомальной РНК (для определения резистентности к макролидам). После гибридизации бактерии обнаруживают при флюоресцентной микроскопии, при этом результаты могут быть получены в течение 3 часов. Метод имеет высокую чувствительность (91%) и специфичность (100%) и позволяет выявить инвазию смешанными штаммами, которая обнаружена у 15% больных [24]. Биохимический метод обнаружения Н.pylori в биоптате основан на высокой уреазной активности хеликобактерий.

В настоящее время существуют различные модификации уреазных тестов - преимущественно, на жидкой или гелевой основе (CLOtest, Tri-Med Specialities, Osborne Park, Western Australia и т. д.), которые просты в использовании, не требуют дополнительных исследований и позволяют с достаточно высокой точностью идентифицировать Н.pylori по изменению цвета индикатора в результате защелачивания среды аммиаком, выделившимся в процессе гидролиза мочевины микробной урезой. Большинство тестов содержат в качестве индикатора феноловый красный и изменяют свой цвет с желтого на красный в период времени от 20 мин. до 24 час., отличаются высокой чувствительностью (75-95%) и специфичностью (100%) [25].

Однако следует учитывать, что при желудочном кровотечении чувствительность уреазных тестов снижается примерно на 25% [26]. К преимуществам всех уреазных тестов следует отнести простоту выполнения и быстроту, к недостаткам - косвенную, непрямую сущность метода, то есть обнаружение не Н.pylori как такового, а лишь его уреазной активности. При невысокой степени обсемененности ткани суммарная уреазная активность может быть низкой, поэтому тест может дать ложноотрицательный результат.

Именно из-за этого, по мнению Madam S. et al. (2000) [27], у детей уреазный тест не имеет столь же высокой чувствительности, как у взрослых. Наряду с уреазопозитивными иногда встречаются уреазонегативные штаммы Н.pylori [28], которые нельзя обнаружить с помощью уреазного теста. С другой стороны, присутствие в ткани большого количества транзиторной флоры, среди которой могут встречаться менее активные уреазопродуценты (протей, псевдомонады, стрептококки и др.) может дать ложноположительный результат теста, особенно при длительной 24-часовой экспозиции в термостате [29]. В связи с этим большую специфичность имеют лишь т. н. "холодные" тесты, то есть проводимые при комнатной температуре без инкубации в термостате, что позволяет получить положительный ответ лишь на уреазу, накопленную в ткани (тканевую), специфичную для Н.pylori, а не вырабатываемую бактериями в процессе культивирования (бактериальную). Удачным примером "холодного" теста является быстрый уреазный тест на основе твердого волокнистого носителя - Хелпил-тест, который был разработан в 1998 г. [30].

Гигроскопичный материал теста адсорбирует жидкость из биоптата, лежащего на нем, поэтому биохимическая реакция происходит на ограниченном пространстве под ним, что делает сопоставимым количество уреазы и реакционной среды и повышает тем самым чувствительность метода. Использование в качестве индикатора бромтимоло-вого синего с более низкой рН перехода позволяет зафиксировать в реакционной среде меньшее количество аммиака, а следовательно и уреазы, и также повысить чувствительность метода. Тест отличается дешевизной и быстротой (1-3 мин.) и позволяет использовать один и тот же биоптат для дальнейшего гистологического исследования, такими свойствами не обладает ни один из существующих ныне уреазных тестов. Чувствительность и специфичность Хелпил-теста у детей составляют 95%. Сочетание уреазного теста с последующим гистологическим исследованием способно приблизить точность диагностики к 100% [1].

Неинвазивные методы Серологический метод: Инфицирование Н.pylori вызывает местный и общий иммунный ответ макроорганизма с накоплением специфических антител. На ранних стадиях регистрируется повышение в крови уровня специфических антител класса IgM [31], а через 3-4 недели в крови начинает нарастать уровень IgG и IgA [32], специфичных по отношению к антигенам клеточной стенки и жгутиков бактерий. Более информативным считается определение специфического IgG, так как антитела именно этого класса иммуноглобулинов преобладают в сыворотке крови. В слизистой оболочке желудка наиболее интенсивно синтезируются антитела класса IgA, поэтому повышение в крови специфических IgA-антител имеет ограниченную чувствительность (45%), но высокую специфичность (95-100%) [33] и отражает степень повреждения слизистой оболочки [31]. Повышенный уровень специфических антител класса IgM удается обнаружить лишь у 27% Н.pylori-инфицированных детей [34]. В детском возрасте пороговые значения антител к Н.pylori ниже, чем у взрослых, а специфические антитела классов IgM и IgA вообще не являются чувствительным индикатором инфицирования хеликобактериями [35, 36]. Ввиду изложенного использование при обследовании детей критериев диагностической оценки, применимых у взрослых, приводит к гиподиагностике, в результате чего большая часть Н.pylori-инфицированных детей остается не выявленной.

Ложноотрицательные результаты ИФА могут быть обусловлены слабым иммунным ответом макроорганизма, ранней стадией инфицирования, вариабельностью антигенной структуры различных штаммов Н.pylori [37] и зависят от качества используемых тест-систем [1]. Наиболее чувствительными серологическими тестами являются ELISA, Pyloriset EIA, Helicoblot [38], но у детей их информативность составляет лишь 75%. В отличие от ИФА, иммуноблоттинг (Western blotting) продемонстрировал высокую чувствительность и специфичность в детском возрасте (95,5%) [6]. Тем не менее, не исключается полностью возможность ложноположительных результатов [39].

Ложноположительные результаты ИФА, которые не превышают 5%, могут иметь место у детей раннего возраста в связи с пассивной трансплацентарной передачей анти-Н.pylori-антител класса IgG от матери, при наличии антител к другим бактериям, которые могут перекрестно реагировать с антигенами Н.pylori (Campylobacter, Helicobacter heilmanii) после успешного лечения Н.pylori-инфекции, так как антитела в крови могут сохраняться в течение многих месяцев [40]. Методы обнаружения антител к Н.pylori в сыворотке крови ("лабораторные" тесты) более точны, чем тесты в капле цельной крови ("офисные тесты").

Последние просты и удобны в амбулаторной практике, не требуют дополнительной аппаратуры, но их чувствительность составляет всего 58-75% даже у взрослых [41,42]. Оценка тестов в определенной мере субъективна и имеет "серую" зону сомнительных результатов, что также способствует снижению их диагностической ценности. Результаты серологического исследования зависят от уровня распространенности инфекции Н.pylori в популяции. Loy C.T. и соавт. (2000) [43] показали, что в популяции с низкой распространенностью инфекции Н.pylori (10%), точными являются лишь отрицательные результаты и велик процент ложноположительных. В популяциях с высокой распространенностью H.pylori (90%), напротив, точность отрицательного результата составляет всего 63%.

Поэтому серологические тесты должны быть адаптированы к региональным условиям. Учитывая вышеизложенное, серологический метод диагностики Н.pylori предпочтителен для первичного скрининга и эпидемиологического обследования широких контингентов населения. Ценность данного метода в педиатрической практике недостаточна, поэтому согласно рекомендациям ESPGHAN [4], его использование у детей ограничено. Однако доступность и относительно низкая стоимость сделали серологическую диагностику Н.pylori наиболее широко применяемой в мире. В недавних исследованиях Gisbert J.P. и соавт.(2000) [44] показано, что снижение уровня специфических антител через 3-6 мес. после лечения может служить критерием успешной эрадикации хеликобактерий. Обнаружение антител к Н.pylori в слюне и моче может быть альтернативой серологической диагностики с использованием сыворотки крови, поскольку эти методы абсолютно неинвазивны и просты в исполнении, однако проведенные исследования показали недостаточную их чувствительность (74%) и специфичность (67%) [45,46,47].

Возможность использования этих тестов у детей в настоящее время изучается. Обнаружение антигена Н.pylori в кале с помощью поликлональных антител (Premier Platinum HpSA] стало возможным в последние 2 года. Несколько исследований, проведенных в разных частях мира, убедительно показали обнадеживающие результаты метода [48, 49]. Для проведения исследования требуется лишь небольшая порция кала, причем пробы могут храниться при температуре -20°С неограниченно долго, что позволяет собирать пробы у небольшого числа пациентов, а также проводить повторное исследование при получении сомнительного результата. Недавний обзор, суммировавший результаты мультицентровых исследований теста [50], подтвердил его высокую чувствительность (93,1%) и специфичность (92,8%) при первичной диагностике. Те же показатели у пациентов после эрадикационной терапии оказались несколько ниже и составили около 90%.

Точность диагностики антигена Н.pylori в кале была также доказана у детей [51, 52, 53], что делает этот метод особенно привлекательным для оценки эффективности эрадикационной терапии в детском возрасте. Однако у детей до 5 лет, по данным совместного российско-итальянского исследования [54], несмотря на высокую специфичность (97%), чувствительность теста оказалась низкой (67%), особенно при активном гастрите, что сужает возрастные рамки использования этого метода. Широкое внедрение метода в отечественную медицинскую практику ограничивает также его высокая стоимость. Обнаружение антигена Н.pylori с помощью ПЦР возможно не только в биоптате слизистой оболочки желудка, но и слюне, зубном налете, моче и кале. Метод позволяет обнаруживать микроб в любой форме, в том числе атипичной, кокковой, а также выявлять различные по токсигенности и антигенной структуре штаммы. Праймер для ПЦР получают из нуклеотидной последовательности генауреазы А или В Н.pylori [55]. Еще один используемый праймер - нуклеотиды, получаемые из 16S rPHK H.pylori. Эти праймеры специфичны для всех штаммов Н.pylori и не обнаруживаются у других видов бактерий видах, поэтому ПЦР является высокоспецифичной реакцией. Более того, ПЦР - наиболее чувствительный метод по сравнению с другими методами диагностики Н.pylori и позволяет обнаружить даже 1,47 рд ДНК, что соответствует 800 микр.кл. [56]. Однако частота обнаружения микробного антигена в различных биологических материалах может быть значительно ниже по сравнению с результатами исследования биоптатов.

Так в исследовании Sahin F.I. и соавт. (2001) [57] хеликобактерии были обнаружены лишь в 45% образцов зубном налета по сравнению со 100% в биоптате слизистой оболочки желудка. Специфичность метода также может существенно варьировать в зависимости от используемого праймера и условий проведения реакции, что объясняет довольно широкий разброс точности ПЦР в разных исследованиях. На сегодняшний день широкое внедрение ПЦР-диагностики в отечественную практику ограничено также из-за слабой оснащенности лабораторий и довольно высокой стоимости метода.

Дыхательные методы Неинвазивные дыхательные методы являются по сути биохимическими тестами in vivo, так как основаны на регистрации в выдыхаемом воздухе продуктов гидролиза мочевины уреазой Н.pylori - углерода, входящего в состав углекислого газа, или аммиака. В зависимости от этого их можно подразделить на две подгруппы: углеродные и аммиачные. Углеродные дыхательные тесты основаны на исследовании в выдыхаемом воздухе пациента атомов углерода С1144** или С13 после приема порции мочевины, меченной этими изотопами. Методика проведения обоих тестов сходна, но если регистрацию С14* проводят с помощью сцинтиллятора, то для определения С13, кот9рый не обладает радиоактивностью, требуется высокочувствительный газовый масс-спектрометр, который с высокой точностью может уловить микродозы С13 в выдыхаемом воздухе (0,03%). Однако перед исследованием необходимо исключить из диеты злаки и тростниковый сахар, так как они содержат С13 [58]. При сравнении этих двух дыхательных тестов видны преимущества и недостатки каждого из них. Метод с определением С14* не может использоваться у детей ввиду его радиоактивности, метод с определением С13 абсолютно безопасен, но требует использования чрезвычайно дорогого масс-спектрометра, стоимость которого доходит до $125 000. С целью удешевления данного метода для регистрации соотношения С13/С12 в настоящее время разработаны другие способы - инфракрасная спектроскопия (INFAI, IRIS) [59] и диодная лазерная спектроскопия [60]. Упрощению и удешевлению метода способствуют также снижение дозы меченной С13 мочевины до 50-75 мг и двукратный забор воздушной пробы - перед приемом мочевины и через 15-30 мин. после него. В двух исследованиях [61, 62] подтверждена необходимость приема раствора лимонной кислоты или пробного завтрака, включающего мочевину, что замедляет эвакуацию из желудка и способствует растеканию раствора по большей площади желудка, усиливая тем самым интенсивность гидролиза. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью (97-98%) и признан "золотым стандартом" среди неинвазивных методов [63, 64]. Однако его чувствительность зависит от возраста (рис. 14). В раннем возрасте из-за малого объема выдыхаемого воздуха точность метода существенно снижается [65], поэтому его использование не рекомендуется у детей до 5 лет [54]. На результаты метода может влиять физическая активность ребенка [66], а также медикаментозная терапия. Ложноотрицательные результаты теста были получены у пациентов, получавших ИПН, Н2-гистаминоблокаторы, препараты висмута и антибиотики, поэтому контроль эффективности эрадикационной терапии с помощью С13-дыхательного теста должен проводиться не ранее, чем через 4 недели после ее окончания [1]. Возможность регистрации аммиака в воздухе полости рта была доказана нами при использовании ион-дрейфового спектрометра, регистрирующего и идентифицирующего даже единичные ионы в воздушной среде [67]. Работы по совершенствованию дыхательной диагностике, основанные на учете выделенного аммиака проводятся также в Японии и Великобритании [68]. Разработанный нами Хелик-тест [69] основан на кинетической оценке концентрации аммиака в воздухе полости рта после приема пациентом порции

Рис. Чувствительность и специфичность C13 дыхательного углеродного теста (по материалам Е.А.Корниенко, 2000г.) мочевины (500 мг) обычного изотопного состава.

Измерение концентрации аммиака проводится с помощью индикаторной трубки, заполненной селективным хемосорбентом, через которую прокачивается с помощью электроотсоса 2 л воздуха из полости рта, по длине окрашенного столбика в трубке, 1 мм которого соответствует концентрации 0,3 мг/м3 аммиака. Измерение проводится дважды - до и после приема мочевины. При возрастании концентрации аммиака в повторной пробе более чем на 0,6 мм/м3 результат считается положительным. При сопоставлении с данными гистологического, бактериологического, серологического методов и уреазного теста у большой группы детей тест показал высокую чувствительность (95%) и специфичность (92%). Результаты теста не зависят от физической активности пациента, они достаточно точны (90%) даже после окончания эрадикационной терапии [70]. Метод прост, дешев, не требует дополнительной аппаратуры и изотопов, результаты получается сразу же в ходе исследования, поэтому он может быть широко использован в педиатрической практике как для первичного скрининга, так и для оценки эффективности терапии. Исследование продуктов гидролиза меченной N15 мочевины может быть произведено в моче. Исследования, проведенные Krumbiegel P. и соавт. (2000) [66] по оценке N15 мочевого теста у детей показали его более высокую надежность, чем С13 дыхательного углеродного теста, поэтому этот неинвазивный биохимический метод диагностики Н.pylori in vivo также следует считать весьма перспективным. Обобщая результаты использования существующих в настоящее время способов диагностики инфекции Н.pylori, следует подчеркнуть необходимость целесообразного выбора методов в зависимости от ситуации. При проведении эпидемиологических исследований допустимо использование серологических методов, они же наряду с дыхательным Хелик-тестом, удобны для первичного скрининга. При обращении к врачу с определенными жалобами, свидетельствующими о возможности хронического заболевания желудка и двенадцатиперстной кишки, ребенка необходимо обследовать эндоскопическим методом, используя параллельно не менее 2 инвазивных тестов. Наиболее удобен при этом Хелпил-тест с последующим гистологическим исследованием тех же биоптатов. При проведении контроля эффективности эрадикационной терапии у детей предпочтительны неинвазивные тесты: исследование антигена Н.pylori в кале с помощью HpSA или ПЦР, С13 дыхательный углеродный тест или Хелик-тест. Выбор тестов зависит от возможностей медицинского учреждения. При неудачной попытке эрадикации показано бактериологическое исследование и определение чувствительности штамма Н.pylori к антибиотикам для построения индивидуальной схемы лечения. Более детальное изучение штамма микроорганизмов с помощью ПЦР и определение его токсигенности может иметь прогностическое значение в оценке вероятности формирования тяжелых форм гастродуоденальной патологии. Учитывая ограниченные возможности всех без исключения методов, применение одновременно нескольких из них у каждого больного существенно увеличивает точность диагностики.

Понимание сущности каждого из методов, их правильный выбор и сочетанное применение являются надежной гарантией постановки своевременного и правильного диагноза и важнейшим условием рационального лечения. В соответствии с Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 03.08.1999 года N 303 введен в действие Отраслевой Стандарт: «Протоколы ведения больных. Общие положения. 91500.09.0001-1999», являющийся частью Системы нормативных документов по стандартизации Здравоохранения Российской Федерации. Отраслевой стандарт предполагает следующие критерии оценки методов диагностики:

Таблица. Сравнение методов диагностики бактерии H.pylori по показателям Отраслевого Стандарта "Протоколы ведения больных. Общие положения. 91500.09.0001-1999", Москва 1999

* чувствительность - частота положительных результатов при наличии заболевания;

* специфичность - частота отрицательного результата при отсутствии заболевания;

* прогностическая ценность - вероятность заболевания при положительном результате и вероятность отсутствия - при отрицательном; отношение правдоподобия - отношение вероятности данного результата у лиц с заболеванием к вероятности данного результата у лиц без заболевания;

* безопасность метода - суммарная частота побочных эффектов и осложнений при применении данного метода диагностики;

* степень доступности - отношение числа граждан страны, которые могут получить своевременно данную услугу с учетом территориальных особенностей регионов и разобщенности медицинских учреждений, наличия соответствующего оборудования и специалистов к числу граждан, не могущих своевременно получить такую услугу;

* стоимость метода исследования с учетом капитальных затрат, текущих прямых расходов и косвенных расходов;

* соотношение стоимость/эффективность - ориентировочные расчеты по стоимостной целесообразности использования того или иного метода диагностики при данном заболевании.

Результаты, полученные по указанным критериям, в разных исследованиях исследованиях отличаются и зависят от обследуемого контингента. В таблице 6 дана оценка части методов диагностики в сравнении с «золотым стандартом» по результатам исследований, проведенных в МНИИП и ДХ МЗ РФ в 1995-2000 гг. [72]. Названные выше методы легли в основу диагностического алгоритма заболеваний верхних отделов пищеварительного тракта (схема 2), принятого на IX съезде педиатров России в 2001 г.

Схема. Диагностический алгоритм инфекции H.pylori у детей

Согласно ему, все дети с жалобами на боли в животе должны обследоваться на наличие Н pylori неинвазивны-ми методами. В случае отсутствия микроорганизмов дети должны обследоваться всеми доступными инструментальными и лабораторными методами, для постановки правильного диагноза.

Детям, у которых HP выявляется повторно, необходимо провести эндоскопическое исследование со взятием биопсии и определением свойств штамма микроорганизма, для назначения адекватной терапии. Дети, у которых HP выявляется впервые, при наличии абдоминального синдрома могут получать эрадикационную терапию. Для выявления язв на поверхности слизистой оболочки необходимо провести эндоскопическое исследование. Родственникам больных детей рекомендуется провести диагностику на хеликобактериоз и назначить эрадикационную терапию. Контроль за эрадикацией проводится через 6 недель после окончания лечения.

4. Актуальные проблемы диагностики хеликобактериоза

Хеликобактериоз -- одна из наиболее серьезных проблем гастроэнтерологии в связи с тем, что распространенность инфицирования Helicobacter pylori прогрессивно возрастает, данное заболевание все чаще выявляется у людей молодого трудоспособного возраста, а также с тем, что данный микроорганизм признан канцерогеном первого порядка.

Следовательно, разработка алгоритмов ранней и точной диагностики хеликобактериоза позволит улучшить качество лечения и диспансерного наблюдения данной категории пациентов. Кроме того, все большее внимание уделяется проблеме реинфекции, в связи с тем необходимо уточнение сроков проведения контрольных тестов на H. pylori для дифференцировки реинфицирования и неуспешности эрадикационной терапии.

Несмотря на то, что Маастрихтским соглашением III в качестве рекомендуемых методов диагностики H. pylori утверждены дыхательный тест с мочевиной, меченной ¹³С, и иммуноферментный анализ H. pylori в кале [1], существование большого количества различных методов диагностики инфекции H. pylori подтверждает постулат о том, что уникального метода, так называемого «золотого стандарта», для диагностики хеликобактериоза пока не существует.

Все многообразие методов диагностики данного микроорганизма можно разделить на инвазивные (требуют проведения фиброгастродуоденоскопии) и неинвазивные (не требуют проведения фиброгастродуоденоскопии), прямые (определение собственно H. pylori) и косвенные (определение продуктов жизнедеятельности H. pylori).

Основные и наиболее часто используемые методы диагностики хеликобактериоза представлены в таблице. Инвазивные методы, как правило, используются при прохождении пациентом комплекса первичных диагностических мероприятий, т.к. в данном случае назначение фиброгастродуоденоскопии является обязательным. Потенциальные показания для использования неинвазивных методов несколько шире.

Таблица. Методы диагностики инфекции Helicobacter pylori

К ним относятся скрининговое обследование взрослых, обследование детей с жалобами на периодическую абдоминальную боль, оценка успешности эрадикации, научные показания (оценка распространенности инфекции, изучение ассоциации между наличием H. pylori и экстра-пищеварительными нарушениями) [2]. Как уже упоминалось выше, ни один метод диагностики H. pylori нельзя считать универсальным. Каждый метод исследования H. pylori имеет свои преимущества и недостатки, методы различаются по чувствительности и специфичности. Во время проведения многочисленных сравнительных исследований установлено, что результаты различных методов не всегда идентичны, следовательно, чтобы избежать получения ложнонегативных или ложнопозитивных результатов, для более точной диагностики наличия инфекции необходимо использовать как минимум два метода и результат считать положительным или отрицательным при совпадении показателей обоих методов исследования. Некоторые авторы рекомендуют даже использование трех методов для того, чтобы говорить об отсутствии инфекции [3]. К наиболее достоверным методам идентификации микроорганизма традиционно относятся бактериологический, гистологический и молекулярно-генетический методы. Бактериологический (культуральный) метод является одним из наиболее информативных и специфичных методов. Специфичность его составляет практически 100%, чувствительность более 90% [2, 4].

Основу метода составляет культивирование микроорганизма на специальных питательных средах при определенных температурных условиях. Преимуществом метода является то, что он обеспечивает возможность выделения чистой культуры H. pylori, изучения морфологических, биохимических и биологических свойств микроорганизма, определения антибиотикорезистентности возбудителя [2]. Однако у этого метода существуют и недостатки, к которым относятся: отсроченное получение результатов на 7-10 дней, трудность транспортировки материала для сохранения микроорганизма в жизнеспособном состоянии, высокие требования к условиям культивирования (определенные питательные среды, ограничение доступа кислорода), снижение эффективности выделения H. pylori в случае низкой обсемененности, при отсутствии обострения инфекции и визуальных признаков воспаления.

Недостатком данного метода считается его неспособность определять кокковые формы H. pylori [5], тогда как в настоящее время в достаточно высоком проценте случаев у H. pylori-позитивных пациентов в слизистой оболочке желудка преобладают именно кокковые формы возбудителя. В широкой клинической практике данный метод не применяется. В основном он используется в научных целях или при определении резистентности H. pylori к антибиотикам в случае неэффективности терапии первой линии при планировании дальнейшего лечения [6]. Гистологический метод -- наиболее объективный метод диагностики H. pylori, ведь используя именно этот метод, Warren и Marshall описали наличие спиралевидной бактерии в слизистой оболочке желудка больных активным хроническим гастритом [7].

Он позволяет обнаружить микроорганизм в гистологических препаратах слизистой оболочки желудка, определить степень обсемененности и расположение микробных тел (поверхностное, внутриэпителиальное), форму микроорганизма (вегетативную или кокковую), а также пути взаимодействия H. pylori с тканями организма человека и наличие морфологических изменений слизистой оболочки желудка, связанных с инвазией микроба (признаки воспаления, атрофия, метаплазия, дисплазия) [8]. В основе метода лежит микроскопическое морфологическое и морфометрическое исследование парафиновых срезов, окрашенных различными способами: гематоксилин-эозином, по Романовскому-Гимзе, генциан-виолетом, по Генту, толуидиновым синим, а также использование иммуногистохимического метода [2, 5]. К преимуществам этого метода диагностики относятся удобство хранения и транспортировки образцов, возможность проведения ретроспективного анализа, проведения оценки взаимосвязи между степенью обсемененности H. pylori и состоянием слизистой оболочки желудка.

Недостатками метода являются длительное приготовление парафиновых срезов, некоторая субъективность в определении степени изменения слизистой оболочки желудка, невозможность отдифференцировать виды Helicobacter и тем более их генотип, возможность получения ложнонегативных результатов в связи с неправильным забором гастробиопсийного материала (биопсия только из антрального отдела желудка, скудные биоптаты, не содержащие эпителия и слизи), а также наличия участков кишечной метаплазии, погрешностей окраски [5]. Наряду с собственно гистологическим методом, может использоваться цитологическое исследование мазков со слизистой оболочки желудка, что позволяет существенно уменьшить время получения результатов анализа [2]. Существенное повышение результатов диагностики инфекции достигается при использовании иммуногистохимического метода с моноклональными антителами против H. pylori [9]. Принцип данного метода основан на высокоспецифичном связывании антител к H. pylori, которые в дальнейшем можно визуализировать с помощью химической реакции с антигенами клеточной стенки микроба.

В результате прошедшей иммуногистохимической реакции только те бактериальные клетки, которые имеют антигены, специфичные для H. pylori, в том числе и кокковые формы H. pylori, будут иметь характерное окрашивание [5]. К сожалению, широкое использование данного метода ограничено из-за его высокой стоимости и технической сложности [10]. Последним достижением в области гистологического исследования является использование fluorescence in situ hybridization, позволяющий высоко точно и напрямую в залитых в парафин биоптатах определять не только наличие H. pylori, но и штаммов, резистентных к кларитромицину [11]. Молекулярно-генетический метод (полимеразная цепная реакция) является высокочувствительным и специфичным и по диагностической ценности имеет преимущества перед другими методами диагностики H. pylori, включая гистологический и курьтуральный методы [5, 12].

Преимуществами данного метода являются высокая специфичность (обеспечивается подбором праймеров, комплементарных уникальной нуклеотидной последовательности исследуемого микроорганизма), высокая чувствительность (позволяет диагностировать не только острые, но и латентные варианты инфекции, возможно выявление даже единичных бактерий), возможность определения как вегетативных (спиралевидных), так и кокковых форм H. pylori, возможность определения отдельных генов микроорганизма для оценки его патогенности, возможность определения микроорганизма в течение 5-6 часов (экспресс-метод). Метод состоит из трех этапов: выделение ДНК из клинического образца (биоптата), амплификация специфических фрагментов ДНК, детекция продуктов амплификации. Геном H. pylori содержит около 1600 генов. На сегодняшний день полностью определена нуклеотидная последовательность у двух штаммов микроорганизма: 26695 и J.88 [13, 14]. Существует ряд генов H. pylori, роль которых в продуцировании специфических белков - факторов патогенности микроорганизма - установлена. Именно эти гены -- гены острова патогенности H. pylori - определяют при проведении молекулярно-генетического исследования.

Таблица Отдельные гены и факторы патогенности Helicobacter pylori и возможная их роль в патогенезе хеликобактериоза [15 с дополнениями]

Следует заметить, что по данным молекулярно-генетического метода можно косвенно судить о прогнозе заболеваний, ассоциированных с H. pylori. Так, например, если у пациента с язвенной болезнью выявляется микроб, содержащий 1-2 гена острова PAI H. pylori, то с высокой степенью вероятности, прогноз будет благоприятным, с другой стороны, если у молодого практически здорового человека при профилактической фиброгастродуоденоскопии выявляются воспалительно-деструктивные изменения и присутствует H. pylori, содержащий 5-6 генов острова PAI, то прогноз неблагоприятен, если своевременно не провести эрадикационную терапию. Однако не следует забывать, что, согласно Маастрихтскому консенсусу III, различие в штаммах H. pylori, содержащих разное количество и вид генов, не освобождает пациента от прохождения курса антихеликобактерной терапии. Если говорить о неонвазивных методах диагностики H. pylori, следует уделить особое внимание дыхательным тестам, определению микроорганизма в кале и серологическому методу диагностики. В основе работы дыхательных тестов лежит биохимический метод определения инфицированности H. pylori слизистой оболочки желудка по уреазной активности микроорганизма, а именно способности уреазы разлагать мочевину до NH⁴⁺ и HCO^3- с последующим образованием из HCO^3- СО₂, который, попадая в кровоток, затем выделяется через легкие и может быть определен в выдыхаемом воздухе. Радиоизотопный уреазный дыхательный тест с мочевиной, меченной радиоактивным углеродом С¹³ или С¹⁴, считается наиболее точным для диагностики H. pylori из неинвазивных методов и известен с 1987 года [16]. Чувствительность и специфичность радиоизотопного уреазного дыхательного теста достигает 90% по данным большинства исследований, однако для данного теста в ряде случаев отмечены ложноположительные результаты по сравнению с гистологическим методом [2]. Вместе с тем способ проведения этого теста до сих пор четко не стандартизирован, а используемые реактивы достаточно дороги [2]. Возможность использования для проведения дыхательного теста детекции паров аммиака (второй метаболит гидролиза мочевины) в воздухе ротовой полости после приема обследуемым мочевины нормального изотопного состава существенно повысила частоту использования дыхательных тестов, т.к. способствовала удешевлению метода, а также повышению его безопасности, поскольку не используются радиоактивные изотопы. Согласно данному принципу в России в 1997 году ООО «АМА» (Санкт-Петербург) разработан «Хелик-тест», показатели которого не зависят от возраста и характера гастродуоденальой патологии, а свидетельствуют лишь о наличии или отсутствии H. pylori [17]. Следует заметить, что дыхательные тесты не рекомендуется проводить больным, получающим антисекреторную терапию во избежание получения ложноотрицательных результатов с учетом возможного взаимодействия соляной кислоты и аммиака [18]. Особенно актуальным считается использование дыхательных тестов у детей в связи с ограничением применения инвазивных методов диагностики H. pylori в детском возрасте. Для определения H. pylori в кале используется иммуноферментный анализ выявления антигена H. pylori и полимеразная цепная реакция с детекцией генов острова патогенности H. pylori (ureC, cagA). Иммуноферментный анализ выявления антигена H. pylori в кале является высокочувствительным и специфичным методом и признан стандартом в диагностике H. pylori у детей и взрослых как до, так и после проведения эрадикационной терапии. Единственным ограничением широкого применения данного метода является его высокая стоимость по сравнению с другими способами диагностики H. pylori. Полимеразная цепная реакция с детекцией генов острова патогенности H. pylori -- относительно новый экспериментальный метод, чувствительность и специфичность которого четко не определены. Серологический метод диагностики основан на определении антител IgG к H. pylori и IgG к цитотоксину CagA H. pylori в крови. Данный метод показан для скрининга в популяции, для первичной диагностики инфекции H. pylori, однако мало информативен у детей в связи со слабым иммунным ответом, с помощью этого метода невозможно различить прошедшую или текущую инфекцию, следовательно, он не рекомендован для оценки эффективности эрадикации H. pylori [19, 20]. Согласно многочисленным литературным данным, оценку эффективности эрадикации следует проводить не ранее, чем через 1,5-2 месяца после окончания терапии и отдавать предпочтение неинвазивным методам исследования, если нет необходимости в проведении контрольной фиброгастродуоденоскопии, что особенно актуально в детском возрасте [2, 13, 15, 17, 18]. Как видно из вышеизложенных данных, все методы диагностики H. pylori имеют свои преимущества и недостатки, следовательно, для получения четкого представлены о наличии H. pylori в организме человека необходимо соблюдать следующие правила диагностики:

1. Использование 2-х и более методов диагностики H. pylori

2. Использование сочетания методов из разных групп: инвазивный+неинвазивный, прямой+непрямой для первичной диагностики H. pylori

3. Использование метода ПЦР как наиболее точного для диагностики H. pylori, а также для определения молекулярно-генетических особенностей микроорганизма для оценки его вирулентности, формирования представления о дальнейшем течении и прогнозе заболевания

4. Использование для контроля эрадикации H. pylori преимущественно неинвазивных методов не ранее, чем через 1,5-2 месяца после окончания терапии.

При сравнительном анализе эффективности различных методов диагностики H. pylori у взрослых больных H. pylori-ассоциированными заболеваниями, проведенном на кафедре пропедевтики внутренних болезней СПбГМА имени И.И. Мечникова, было установлено, что по данным быстрого уреазного и дыхательного теста H. pylori выявлялся у 100% пациентов, гистологическим методом определялся у 70%, методом ПЦР -- у 70% больных. Получение положительных результатов уреазного теста и Хелик-теста при отрицательных -- гистологического метода или ПЦР может объясняться не ложноположительными результатами, а тем, что при проведении уреазного и Хелик-теста определяются продукты жизнедеятельности H. pylori, а не сам микроорганизм, который может не попасть в биоптат, исследуемый с помощью гистологического метода или ПЦР. Кроме того, при оценке информативности методов диагностики H. pylori было выявлено, что результаты бактериологического метода в 25% случаев были отрицательными при положительных результатах других методов исследования, что связано со сложностью культивирования H. pylori, следовательно, только на данные бактериологического метода не рекомендуется ориентироваться во избежание ложноотрицательных результатов.

Обращает на себя внимание тот факт, что при проведении ПЦР ген ureC, который традиционно считается маркером наличия инфекции H. pylori, у пациентов Санкт-Петербурга определялся только в 78% случаев, что доказывает высокую изменчивость микроорганизма. Следовательно, необходимо проводить определение не только гена ureC, но и хотя бы еще одного часто встречающегося гена H. pylori, например, гена cagA или ureI, что уже внедрено в практику в некоторых европейских странах.

Также нами была проведена сравнительная оценка результатов различных методов выявления инфекции H. pylori с последующей разработкой алгоритма оптимизации диагностики хеликобактериоза.

Для этого было обследовано 135 пациентов от 17 до 72 лет с патологией верхних отделов пищеварительного тракта (37% больных язвенной болезнью, 63% - с хроническим гастродуоденитом).

Пациентам проводилась фиброгастродуоденоскопия с взятием биоптатов из тела и антрального отдела желудка для верификации H. pylori следующими методами: быстрый уреазный тест, «Хелик-тест», гистологическое исследование, полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией ureC и cagA генов острова патогенности микроорганизма, бактериологическое исследование (посев биоптатов слизистой оболочки желудка для выявления роста H. pylori). При сравнении полученных результатов было установлено, что максимальное количество положительных результатов определялось при использовании быстрого уреазного теста, минимальное количество -- при посеве биоптатов (рисунок 1).

Рис. 1. Сравнительная характеристика результатов различных методов диагностики H. pylori По оси абсцисс -- методы исследования По оси ординат -- количество положительных результатов, %

Кроме того, нами был проведен корреляционный анализ в отношении совпадения показателей различных методов диагностики, на основании которого установлена корреляционная связь между результатами быстрого уреазного теста и ПЦР (ген ureC) (рисунок 2), быстрого уреазного теста и гистологического исследования (H. pylori в теле желудка) (рисунок 3), «Хелик-теста» и гистологического исследования (H. pylori в теле желудка) (рисунок 4). На основании этого можно утверждать. Что использование комбинаций этих методов будет наиболее информативно для диагностики инфекции.

Рис. 2. Корреляционная связь между результатами быстрого уреазного теста и ПЦР (ген ureC) По оси абсцисс -- результаты быстрого уреазного теста, баллы 0-3, По оси ординат -- результаты ПЦР (ген ureC) (0--отрицательный, 1--положительный)

Рис. 3. Корреляционная связь между результатами быстрого уреазного теста и гистологического исследования (H. pylori в теле желудка) По оси абсцисс -- результаты быстрого уреазного теста, баллы 0-3 По оси ординат -- результаты гистологического исследования (H. pylori в теле желудка), (0-отрицательный, 1--положительный)

Рис. 4. Корреляционная связь между результатами «Хелик-теста» и гистологического исследования (H. pylori в теле желудка)

По оси абсцисс -- результаты «Хелик-теста», (0--отрицательный, 1--положительный) По оси ординат -- результаты гистологического исследования (H. pylori в теле желудка), (0--отрицательный, 1--положительный) На основании полученных данных нами были сделаны следующие выводы разработаны рекомендации:

1. Получение положительных результатов уреазного теста и «Хелик-теста» при отрицательных -- гистологического метода или ПЦР может объясняться не ложноположительными результатами, а тем, что при проведении уреазного и «Хелик-теста» определяются продукты жизнедеятельности H. pylori, а не сам микроорганизм, который может не попасть в биоптат, исследуемый с помощью гистологического метода или ПЦР.

2. «Хелик-тест» рекомендуется как точный неинвазивный метод при проведении оценки эффективности эрадикационной терапии, особенно в детском возрасте.

3. Для повышения точности диагностики хеликобактериоза рекомендуется использовать как минимум два, а лучше три, метода исследования, предпочтительно сочетание быстрого уреазного теста или «Хелик-теста» с гистологическим методом исследования (биоптат из тела желудка) или ПЦР (детекция гена ureC).

5. Влияние антисекреторных и антацидных средств на чувствительность уреазного теста при диагностике хеликобактерной инфекции

Центральным объектом большого числа научных исследований в области гастроэнтерологии, начиная с середины прошлого столетия, стала париетальная клетка. Вслед за открытием на ней гистаминовых рецепторов и созданием первых Н2-блокаторов пришло осознание того, что наиболее оптимальной мишенью для селективного подавления кислой желудочной секреции является водородно-калиевая АТФаза. Путем химических модификаций пиридин-2-ацетамида, который первоначально предполагалось использовать как антивирусное средство, был получен пиридин-2-метилтиобензимидазол, а затем тимопразол. Эти субстанции обладали выраженной антисекреторной активностью, не зависящей от гистаминовых рецепторов, но связанной с подавлением активности водородно-калиевой АТФазы париетальных клеток [1]. В 1979 г. на основе этих соединений был синтезирован, а в 1988 г. был разрешен к клиническому применению омепразол. Бурный прогресс в создании антисекреторных средств был обусловлен также открытием в 1983 г. этиологической роли Helicobacter pylori в развитии хронического гастрита и язвенной болезни двенадцатиперстной кишки [2]. Оказалось, что повышение внутрижелудочного рН является обязательным условием для оптимального действия антибактериальных препаратов, включаемых в курс антихеликобактерной терапии. Антисекреторные препараты надежно подавляют секрецию соляной кислоты париетальными клетками и длительно удерживают в желудке нейтральные значения рН, при которых антибиотики медленнее деградируют и дольше оказывают свое бактерицидное и бактериостатическое воздействие.