Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Полежаева Татьяна Витальевна

СОХРАННОСТЬ ЯДЕРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ В УСЛОВИЯХ ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР РАЗЛИЧНЫХ ДИАПАЗОНОВ

(экспериментальное исследование)

Специальность 14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия

им С.М.Кирова» Министерства обороны

Российской Федерации (г.Санкт-Петербург)

Защита состоится __________________ 2013 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при Федеральном государственном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства России» по адресу: 193024, г.Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан «___» ______________2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук Т.В.Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для создания общей теории криоповреждения и криозащиты клеток, а также эффективных научно обоснованных методов их криоконсервирования важным является всестороннее изучение структурно-функциональных изменений биологических мембран (плазматических, ядерных, лизосомальных и др.) и метаболических процессов, протекающих с их участием. Первыми изменения окружающей среды (понижение температуры, вымерзание воды, рН, электролитный баланс, вязкость, появление чужеродных молекул и др.) воспринимают плазматические мембраны. Основной причиной их первичных повреждений являются нарушения распределения липидов, обеспечивающих ее высокую пластичность и растяжение. Повышенное содержание холестерина, полиненасыщенных жирных кислот способствует снижению температуры фазово-структурных изменений липидов, т.е перехода из жидкокристаллического состояния в гель-фазу с образованием жесткой мембранной структуры. Дегидратация, снижение рН, повышение молярности среды и др. повышают температуру фазового перехода. С переходами липидных компонентов взаимосвязаны фазово-структурные переходы фракций клеточной воды (свободной, связанной, фиксированной), каждая из которых имеет свою зону кристаллизации с определенной степенью замедления метаболизма (Сведенцов Е.П., 2000). Стабильная кристаллизация внеклеточной, свободной и связанной внутриклеточной воды характерна для низкой температуры (-70°ч-98°), а фиксированной - ультранизкой (-136°ч-272°). Этот факт широко используется при разработке технологий длительного хранения клеток и тканей организма человека при -80°С, -196°С, однако, возможность сохранения клеток в условиях других отрицательных температур остается малоизученной.

Для повышения криоустойчивости клеток в замораживаемый биообъект вводится криофилактическое вещество, действие которого основано на способности создавать прочные связи с молекулами воды (вне и внутри клетки, более прочные, чем связи воды между собой) и способности снижать концентрацию солей, что делает минимальным риск повреждения белковых структур клеток (Цуцаева А.А., 1983), а также образовывать связи со структурными компонентами мембраны клеток, предохраняя их от разрушения кристаллами (Виноград - Финкель Ф.Р., 1970; Pushkar N.S. et al. 1976; Смольянинова Е.И. и соавт., 2004). Всего в мире обнаружено и создано более 120 криофилактических средств (Сведенцов Е.П., 2010) с экзоцеллюлярным, эндоцеллюлярным и смешанным криозащитным действием. Выраженными криопротекторными свойствами обладают: глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО), диметилацетамид (ДМАЦ), пропиленгликоль (1,2-ПД), полиэтиленоксид (ПЭО-400). Слабее указанные свойства у низкомолекулярного поливинилпирролидона (ПВП). Самые слабые у многоатомных спиртов, сахаров, гидроксиэтилкрахмала, сывороточных белков и других органических соединений. Следует отметить, что в России отсутствует производство таких криопротекторов как ДМАЦ и ПЭО-400, а ДМСО не разрешен для внутривенного введения Фармкомитетом МЗ РФ. Глицерин, 1,2-ПД в связи с их токсичностью требуют отмывания после размораживания биопродукта, что дополнительно травмирует клетки. В последние годы положительно зарекомендовало себя применение комбинированных криозащитных растворов при криоконсервировании эритроцитов (Межидов С.Х. и соавт., 1996; Вильянинов В.Н., 1997; Чечеткин А.В. и др., 2005; Рамазанов В.В., 2006), гемопоэтических клеток пуповинной крови (Liu K.Y. et al., 2004), клеток поджелудочной железы (Maruyama M. et.al., 2004), стволовых клеток костного мозга (Luo K. et al., 1994). Состав сложных криоконсервантов по причине видоспецифичности биологического объекта весьма вариабелен: классические экзо- и эндоцеллюлярные протекторы (Корниенко Е.М., Бондаренко В.А., 2008; Сведенцов Е.П., 2010), а также обладающие протекторным действием антифризные протеины, гликопротеины (Андреев А.А. и соавт., 2008) и клатратные соединения азота, кислорода, аргона, криптона, ксенона (Тельпухов В.И., Щербаков П.В., 2006; Sheleg S., Hixon H., Cohen B., Lowry D., Nedzved M., 2008), антиоксиданты и стабилизаторы биологических мембран, усиливающие устойчивость клеток к эндо- и экзогенным факторам физико-химического воздействия (Carrol J., Wood M.J., Whittinham D.G. 1993; Dalvit G.C., Cetica P.D., Beconi M.T., 1988), активаторы энергетического метаболизма клетки - гетерозиды (Кабачный В.И., Горбунова Н.И., 2004), стабилизаторы температур замораживания и отогрева - наночастицы ферромагнетика (Сукач А.Н., Грищук В.П., Грищенко В.И., 2008), которые также повышают чувствительность клеточных мембран и внутриклеточных структур к магнитным и электрическим полям. Однако, несмотря на определенные успехи остается нерешенным вопрос применения низко токсичных криоконсервантов для различных клеточных суспензий, не требующих отмывания после размораживания, а также поиск универсального криопротектора для всех типов клеток при различных температурных диапазонах. Таким образом, создание экономичных и доступных технологий длительного хранения клеток в условиях отрицательных температур остается актуальным до настоящего времени.

Цель исследования - обоснование и разработка в эксперименте эффективных технологий сохранения ядерных клеток крови в условиях отрицательных температур различных диапазонов.

Задачи исследования:

1. Сравнить влияние новых комбинированных криозащитных растворов на степень устойчивости ядерных клеток крови к воздействию отрицательных температур: переохлаждения (-10°С), субумеренно-низкой (-20°С), умеренно-низкой (-40єС) и низкой (-80єС).

2. Определить возможные сроки структурно-функциональной сохранности лейкоцитов в условиях указанных отрицательных температур под защитой разработанных криозащитных растворов.

3. Изучить характер изменения уровня ПОЛ у лейкоцитов при смешивании с криоконсервантом и при разных сроках хранения в условиях отрицательных температур.

4. Определить степень антиоксидантной активности у лейкоцитов на разных этапах консервирования.

5. Изучить физико-химические и биологические особенности (токсичность, пирогенность) эффективных криозащитных растворов и определить переносимость лабораторными животными внутривенных аутогемотрансфузий криоконсервированных с данными растворами лейкоцитов.

5. Разработать новую низкотемпературную технологию консервирования ядерных клеток, включающую применение нетоксичных комбинированных криозащитных растворов и щадящих нелинейных программ замораживания биообъекта.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Комбинирование в замораживаемой биосреде в нетоксичных концентрациях непроникающих и проникающих криопротекторов, антиоксидантных и противогипоксантных компонентов повышает криоустойчивость ядерных клеток крови в условиях отрицательных температур (-10°С, -20°С, -40єС, -80єС).

2. Ингредиенты хладоограждающего раствора изменяют интенсивность ПОЛ у клеток в зависимости от концентрации и молекулярного веса вещества. При совместном воздействии на клетку всех компонентов хладоограждающей среды проявляется действие механизмов выравнивания уровня ПОЛ.

3. Антиоксидантная активность клеток до замораживания с хладоограждающим раствором и после отогрева превышает интенсивность ПОЛ. Высокий антиоксидантный потенциал у клеток до замораживания обеспечивает их высокую криоустойчивость.

4. Комбинированные криозащитные растворы (патенты РФ: № 2184449, 2002; № 2240000, 2004; № 2261595, 2005; № 2290808, 2007; № 2301524, 2007; № 2439877, 2009) обладают низкой токсичностью и хорошей переносимостью лабораторными животными как в чистом виде, так и в смеси с размороженными аутологичными лейкоцитными концентратами.

5. Совместное использование предложенных хладоограждающих растворов и щадящих нелинейных программ замораживания лейкоцитов в электрических морозильниках является альтернативой традиционной жидкоазотной технологии консервирования и обеспечивает сохранность ядерных клеток крови при -10°С в течение 7 суток , при -20°С - 21 суток, при -30°С - 30 суток и при -80°С в течение 180 суток (срок наблюдения).

Научная новизна. Впервые на примере высокодифференцированных клеток организма человека показана возможность обратимого замедления метаболических процессов в условиях гипотермии (-10°С, -20°С, -40°С, -80°С) в разных по составу и механизму действия криозащитных средах.

Дано научное обоснование целесообразности применения определенной комбинации криозащитной среды в зависимости от степени снижения температуры и определены возможные сроки сохранения клеток в жизнеспособном состоянии. Установлено, что охлаждение лейкоцитов по нелинейной программе в новом комбинированном криоконсерванте, включающем в себя эндоцеллюлярный протектор глицерин (7%), экзоцеллюлярный протектор желатин (7,5%; средний молекулярный все 16 000) и антиоксидант ОМЭПС (0,3%) обеспечивает высокую криоустойчивость лейкоцитов при температуре переохлаждения (-10°С) в течение 7 суток. Криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ способствует сохранности ядерных клеток в широком диапазоне температур: при -20°С в концентрации 28% совместно с антиоксидантом ОМЭПС (0,2%) в течение 21 суток; при -40°С в концентрации 30% совместно с антигипоксантом фумаратом натрия (2,8%) и лимонной кислотой (0,06%) в течение 30 суток; при -80°С в концентрации 22% совместно с эндоцеллюлярным протектором ДМСО (8%) и антиоксидантом ОМЭПС (0,4 %) в течение 180 суток (срок наблюдения).

Впервые с использованием хемилюминесцентного метода показано, что у лейкоцитов на всех этапах консервирования по предложенной технологии антиоксидантная активность превышает интенсивность процессов ПОЛ. Следовательно, комбинирование в замораживаемой среде протекторов разно направленного действия в низко токсичных концентрациях обеспечивает высокий процент жизнеспособных клеток.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенных исследований вносят вклад в создание общей теории криоповреждения и криозащиты клеток, а также эффективных научно обоснованных методов их криоконсервирования, что является ценным для трансфузиологии, ветеринарной медицины, микробиологии, ихтиологии.

Получены новые сведения о возможности хранения ядерных клеток не только в условиях ультранизкой (-196°С) температуры, но и при других отрицательных температурах: переохлаждения (-10°С), субумеренно-низкой (-20°С), умеренно-низкой (-40єС) и низкой (-80єС).

С практической точки зрения важным является использование электрических морозильников и щадящих нелинейных программ замораживания, предупреждающих выброс кристаллизационного тепла и последующую рекристаллизацию, вызывающую гибель клеток. Разработанные технологии рекомендуются в качестве альтернативы замораживанию биообъектов в жидком азоте.

Особую практическую ценность представляют криозащитные растворы (патенты РФ: № 2184449, 2002; № 2240000, 2004; № 2261595, 2005; № 2290808, 2007; № 2301524, 2007; № 2439877, 2009), которые не уступают по своей эффективности существующим консервантам, но, при этом, являются менее токсичными и не требуют отмывания от клеток перед применением, что увеличивает число жизнеспособных лейкоцитов и снижает экономические затраты.

Предложенные технологии доступны широкому кругу учреждений и имеют значимость при необходимости создания запаса или сохранения биоматериала во время космических перелетов, длительных научных экспедициях, при ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций.

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены на Международных конференциях: «Сохранение генетических ресурсов» (С.-Петербург, 2004), «Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия» (Пущино, 2008), «Фундаментальные и прикладные аспекты физиологии» (Гродно, 2009 г.); на IV и V Международных конференциях молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы» (Харьков, 2009 г, 2010 г.); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2010); на XVIII и XIХ Съездах Всероссийского физиологического общества им И.П.Павлова (Казань, 2001; Екатеринбург, 2004); на Всероссийских научно-практических конференциях «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (С.Петербург, 2002, 2007); на Всероссийской научной школе «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: научный и образовательный аспекты» (Киров, 2006); на Всероссийском совещании «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Епифановские чтения)» (Киров, 2008 г.); на Всероссийских конференциях молодых исследователей «Физиология и медицина» (С.Петербург, 2005), «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008 г.), «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2007); на научной сессии Кировского филиала РАЕ и Кировского областного отделения РАЕН (Киров, 2004); на V и VI молодежных научных конференциях «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2006, 2007)

Публикации. По теме диссертации опубликовано ….. научных работ, в том числе 1 монография, шесть патентов Российской Федерации, 3 статьи в зарубежных и 10 статей в Российских рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 189 машинописных страницах, содержит 33 таблицы и 30 рисунков. Список литературы включает 339 источников, в том числе 122 зарубежных авторов.

Работа выполнена в лаборатории криофизиологии крови ФГБУН Института физиологии Коми НЦ УрО РАН в рамках плановых тем НИР «Функциональная активность ядерных клеток крови, перенесших холодовой анабиоза разной глубины» (ГР № 01.200 107400) и «Закономерности восстановления функциональной активности ядросодержащих клеток крови, подвергнутых воздействию отрицательных температур» (ГР № 0120.0 602860). Исследования поддержаны грантом РФФИ №08-04-0142.

Сокращения и условные обозначения. АОА - антиоксидантная активность, ГМБТОЭМ - гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина, ГЭК - гидроксиэтилкрахмал, ДМАЦ - диметилацетамид, ДМСО - диметилсульфоксид, ЛК - лейкоконцентрат, ОМЭПС - оксиметилэтилпиридина сукцинат, ПД - пропандиол.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы лейкоциты крови человека, полученные из цельной донорской крови (доноры-добровольцы 35,6 5,2 лет) методом цитафереза (центрифуга «Sorvell» (США), 5 мин, 2500 об/мин, консервант цитратфосфатдекстроза) в отделении гравитационной хирургии ФГБУН Кировского НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России. Количество ЛК в среднем составляло 22,7 ± 6,1 мл. Указанная трансфузионная среда с высоким содержанием лейкоцитов (20 000 - 32 000 в 1 мкл) имела незначительную примесь эритроцитов, тромбоцитов, стволовых клеток и плазмы.

Проведено более 6000 исследований по изучению структурно-функциональных особенностей ядерных клеток крови до и после воздействия отрицательной температуры (-10°С, -20°С, -40°С, -80°) под защитой комбинированных криозащитных растворов (табл. 1)

В пластикатном контейнере "Компопласт 300" в соотношении 1:1 смешивали ЛК с раствором, выдерживали при комнатной температуре в течение 20 минут и погружали в заполненную хладоносителем (96%-ный этиловый спирт) и охлажденную (с растворами №1-7 до -10оС; с растворами №8-11 до -20°С; с растворами №12-24 до -28°С) 4-х-литровую ванну камеры электрического морозильника «Криостат». После достижения указанных температур биообъект с растворами №1-7 переносили для хранения в герметично закрытую емкость с охлажденным (-10°С) 45%-ым этиловым спиртом в морозильную камеру электрического холодильника на -10°С «ЗИЛ» (Россия); в опытах с растворами №8-11 - в воздушную камеру электрического морозильника на -20°С «Derby» (Дания); в опытах с растрами №12-18 - для дальнейшего замораживания и хранения в воздушную камеру электрического морозильника на -40°С «Derby» (Дания); в опытах с растрами №18-24 - в воздушную камеру электрического морозильника на -80°С MDF-3086S «Sanyo» (Япония).

Температуру в каждой экспериментальной серии регистрировали с помощью прибора ГСП-04, датчик ТСМ-3-02 которого был установлен в одном из контейнеров с имитатором - криозащитным раствором с конечной концентрацией его ингредиентов (рис. 1). Скорость движения ленты самописца составляла 240 мм/ч. Регистрация термограмм проводилась с целью контроля выброса кристаллизационного тепла, способствующего росту кристаллов льда и гибели клеток.

клетка кровь температура отрицательный

Таблица 1. Исходная концентрация (в %) ингредиентов консервирующих растворов

№ раствора	Протектор эндоцеллюлярного действия	Протек- тор смешан- ного дей-ствия	Протектор экзоцеллюлярного действия	Дополнительные ингредиенты
	глицерин 92*	диметилсульфоксид 78*	пропандиол 76*	гексометиленбис-тетраоксиэтил-мочевина 378*	желатин 16 000*	желатин 20 000*	гидроксиэтил-крахмал 200 000*	лемнан 400 000*	оксиметилэтилпири-дина сукцинат	фумарат натрия	холина хлорид	N-метиламмония натрия сукцинат	глюкоза	лимонная кислота	трилон Б	цитрат натрия
Для температуры переохлаждения (-100С)
1	5,0	-	-	-	7,5	-	-	-	0,075	-	-	-	-	-	-	0,14
2	7,0	-	-	-	7,5	-	-	-	0,3	-	-	-	-	-	-	0,14
3	9,0	-	-	-	7,5	-	-	-	0,3	-	-	-	-	-	-	0,14
4	7,0	-	-	-	-	7,5	-	-	0,3	-	-	-	-	1,0	0,1	-
5	7,0	-	-	-	-	-	-	0,2	0,3	-	-	-	-	-	-	-
6	7,0	-	-	-	-	-	-	0,3	0,3	-	-	-	-	-	-	-
7	7,0	-	-	-	-	-	-	0,4	0,4	-	-	-	-	-	-	-
Для субумеренно-низкой температуры (-200С)
8	-	-	-	26,0	-	-	-	-	0,1	-	-	-	-	-	-	-
9	-	-	-	28,0	-	-	-	-	0,15	-	-	-	-	-	-	-
10	-	-	-	30,0	-	-	-	-	0,2	-	-	-	-	-	-	-
11	7,0	-	-	-	-	-	-	0,2	-	-	-	-	-	-	0,1	-
Для умеренно-низкой температуры (-400С)
12	-	-	-	36,0	-	-	-	-	-	3,2	-	-	-	0,09	-	-
13	-	-	-	30,0	-	-	-	-	-	2,8	-	-	-	0,06	-	-
14	-	-	-	24,0	-	-	-	-	-	2,4	-	-	-	0,03	-	-
15	6,0	-	-	-	-	-	5,6	-	0,2	-	-	-	-	-	-	-
16	4,8	-	-	-	-	-	5,7	-	0,1	-	-	-	-	-	-	-
17	3,6	-	-	-	-	-	5,8	-	0,01	-	-	-	-	-	-	-
18	-	-	21,0	-	-	-	4,7	-	0,2	-	1,0	-	3,0	-	-	-
Для низкой температуры (-800С)
19	-	6,0	-	24,0	-	-	-	-	0,3	-	-	-	-	-	-	-
20	-	8,0	-	22,0	-	-	-	-	0,2	-	-	-	-	-	-	-
21	-	10,0	-	20,0	-	-	-	-	0,1	-	-	-	-	-	-	-
22	-	-	6,0	-	-	-	3,24	-	-	-	-	0,6	-	-	-	-
23	-	-	3,0	-	-	-	3,42	-	-	-	-	0,6	-	-	-	-
24	-	-	1,5	-	-	-	3,5	-	-	-	-	0,6	-	-	-	-

Примечание * - молекулярный вес криопротектора

Рисунок 1. Термограммы замораживания лейкоцитов в криозащитных растворах (КР) №9, 18 и 20 и охлаждения в незамерзающем КР №2.

Быстрое размораживание лейкоконцентрата производили в 20-литровой водяной ванне при температуре +38єС в течение 35-50 с (в зависимости от объема биообъекта) при интенсивном покачивании контейнера (3-4 раза в секунду) до температуры биообъекта +2...+4єС. В опытах с температурой переохлаждения (-100С) объект отогревали в течение 2-3 сек.

Степень криоустойчивости различных популяций лейкоцитов определяли с помощью метода световой микроскопии (окраска мазков по Май-Грюнвальду и Романовскому), а субпопуляции лимфоцитов (Т, В) - с помощью моноклональных антител в непрямом иммунофлуоресцентном тесте. С помощью метода световой микроскопии (Nikon H550S) оценивали общее количество ядерных клеток крови (в камере Горяева).

Целостность клеточной мембраны лейкоцитов оценивали с использованием 1% раствора суправитального красителя эозина (молекулярный вес 692) методом световой микроскопии. Признаком повреждения клеточной мембраны считали диффузное окрашивание цитоплазмы в розовый цвет, клетки с неповрежденной мембраной - жизнеспособные - имели светло-зеленый цвет.

Степень активации мембраносвязанной NADPН-оксидазы нейтрофилов определяли с помощью регистрации супероксидного анион-радикала в НСТ-тесте (Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992). Тест основан на реакции спонтанного восстановления красителя нитросинего тетразолия (НСТ), который в окисленном состоянии бесцветен, а при восстановлении до диформазана (с образованием стабильного промежуточного продукта - частично восстановленного моноформазана) в клетках преципитирует в виде грубодисперсных гранул темно-синего цвета.

Активность ферментов и белков гранул (первичных и вторичных) нейтрофилов, обеспечивающих киллерный эффект определяли в лизосомально-катионном тесте по методике А.А. Славинского и Г.В. Никитиной (1999). Данный метод исследования также свидетельствует о глубине низкотемпературных повреждений нейтрофилов, т.к. мембраны лизосом весьма чувствительны к замораживанию и, теряя свои барьерные свойства, обеспечивают выход гидролаз в цитоплазму и развитие вторичных «латентных» повреждений клетки.

Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по модифицированному методу С.Г. Потаповой и соавт. (1977) с использованием инертных частиц латекса диаметром 0.08 мкм («Sigma-Aldrich» Германия). Определяли только процент фагоцитирующих клеток. Количество захваченных частиц (фагоцитарный индекс) до замораживания соответствовал II степени (11-30 частиц), а после отогрева - I степени (до 10).

Потребление кислорода оценивали по его содержанию в среде амперометрическим методом на анализаторе Эксперт-001-4 (ООО «Эконикс-эксперт» г.Москва) в режиме работы «термооксиметр».

Интенсивность ПОЛ и АОА клеток определяли методом индуцированной (перекисью водорода с сульфатом железа) хемилюминесценции на биохемилюминометре БХЛ-07 (ЦНИЛ НГМА; «ИМБИО» Н.Новгород, Россия). По показателям хемилюминограммы Imax (мВ) и S (мВЧсек) - судили о степени активности ПОЛ, антиоксидантный потенциал оценивали по показателю tg(-2б) и коэффициентам a (S/Imax Ч t) и Z (S/Imax).

Изучение стабильности криозащитных свойств хладоограждающих растворов проводили в соответствии с «Временной инструкцией по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре (1983)». Образцы выдерживали в течение 45 суток при +600С в стеклянных флаконах по 50 мл, что соответствует двум годам хранения при +40С, проверяли прозрачность, рН и оценивали его криозащитные свойства при замораживании клеток.

Биологические свойства (токсичность, пирогенность, переносимость) криоконсервантов оценивали по указанным методикам на 192 животных (табл. 2)

Таблица 2. Биологические методы исследования криозащитных растворов

Показатель	Методика	Вид животного	Число животных
«Острая токсичность»	ГФ XII с. 124	Мыши белые лабораторные	20
«Хроническая токсичность»	ГФ XII с. 124	Мыши белые лабораторные	100
Пирогенность	ГФ XII с. 125	Кролики неальбиносы	62
Биологическая переносимость	Сведенцов Е.П. (1999)	Беспородные собаки	12

При статистической обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение ± среднее квадратичное отклонение (M±д). Для выявления статистической значимости различий между группами применяли непараметрический критерий Уилкоксона (Гланц С., 1998) с использованием компьютерной программы для медико-биологической статистики «BIOSTAT.EXE»

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние ингредиентов хладоограждающих растворов на уровень ПОЛ и антиоксидантный потенциал клеток до замораживания

Токсичные продукты цепных реакций пероксидации липидов способствуют развитию повреждений клеточных мембран. Процессы ПОЛ весьма чувствительны к присутствию в биологической системе таких веществ экзогенного происхождения, как криопротекторы (Гордиенко А.Д., 1980). При изучении влияния используемых в составе хладоограждающих растворов веществ на уровень ПОЛ и АОА лейкоцитов установлено (табл. 3):

* При смешивании лейкоцитов с любым криопротектором отмечается совместное изменение показателей ПОЛ и АОА, причем АОА, как правило, в большей степени.

* С увеличением молекулярного веса используемого криопротектора до определенного значения отмечается повышение активности процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты, а затем их совместное снижение (рис. 2).

* Степень повышения интенсивности ПОЛ - АОА зависит от концентрации используемого вещества. Это выявлено на примере протектора смешанного действия ГМБТОЭМ: чем больше его концентрация, тем большее совместное повышение ПОЛ - АОА он вызывает.

* Антигипоксант фумарат натрия не изменяет уровень ПОЛ лейкоцитов и их АОА.

* Антиоксидант и противогипоксант ОМЭПС в концентрации 0,15% снижает интенсивность ПОЛ, а 0,2% и 0,3% повышает ее. Однако, при всех используемых концентрациях наблюдается снижение АОА клеток примерно в 0,8 раза.

* При совместном воздействии на клетку до замораживания определенного хладоограждающего раствора ПОЛ и АОА: снижаются (раствор №4), остаются без изменений (раствор №13), равномерно повышаются (раствор №2, №20) или увеличивается только АОА (раствор №9).

Таблица 3. Влияние некоторых ингредиентов хладоограждающих растворов на уровень перекисного окисления липидов (по показателю хемилюминограммы S) и антиоксидантную активность (по tg(-2б)) лейкоцитов

Вещество	Молекулярная масса	Концентрация, %	№ раст-вора	Влияние на уровень ПОЛ	Влияние на уровень АОА
ПД	76	21 6	18 22	Снижает в 0,8 раза	Снижает в 0,7 раза
ДМСО	78	8	20	Снижает в 1,2 раза	Снижает в 1,3 раза
Глицерин	92	7	2 4	Повышает в 1,2	Повышает в 1,9
Фумарат натрия	160	2,8	13	Не изменяет	Не изменяет
ОМЭПС	255	0,15	9	Снижает в 0,8 раза	Снижает в 0,8 раза
		0,2	20	Повышает в 1,2	Снижает в 0,8
		0,3	2 4	Повышает в 1,2	Снижает в 0,7
ГМБТОЭМ	378	22	20	Повышает в 1,3	Повышает в 1,4
		28	9	Повышает в 1,3	Повышает в 1,5
		30	13	Повышает в 1,4	Повышает в 1,7
Желатин	16 000	7,5	2	Повышает в 4,0	Повышает в 5,1
	20 000	7,5	4	Повышает в 2,0	Повышает в 1,5
ГЭК	200 000	5,7	16	Повышает в 1,6	Повышает в 1,3
Лемнан	400 000	0,3	6 11	Не изменяет	Не изменяет

Таким образом, если используемые в составе сложных криоконсервирующих растворов ингредиенты и снижают устойчивость мембран лейкоцитов к перекисному окислению липидов, то при их совместном воздействии данный эффект нивелируется, т.е. проявляется действие механизмов выравнивания ПОЛ и АОА..



Рисунок 2. Динамика уровня ПОЛ (по показателю S) и АОА (по tg(-2б)) лейкоцитов в зависимости от молекулярного веса используемого вещества.

Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие температуры переохлаждения (-10єС)

Изучено влияние 7 комбинированных криозащитных растворов на показатели структурно-функциональной целостности ядерных клеток крови в условиях отрицательной температуры -10°С. Указанные растворы отличаются концентрацией эндоцеллюлярного протектора - глицерина, видом и концентрацией экзоцеллюлярных протекторов - желатина и лемнана (апиогалактуронановый пектиновый полисахарид из ряски малой), концентрацией водорастворимого антиоксиданта - ОМЭПС, также обладающего противогипоксическим, мембраностабилизирующим действием.

Установлено (табл. 4), что при замораживании клеток по нелинейным программам в хладоограждающих растворах №2, №4, №6 и хранении биообъекта в течение 1 суток при -100С показатели сохранности клеток в большей степени соответствуют исходному уровню.

На следующем этапе исследования были установлены допустимые сроки хранения клеток при -10°С в указанных растворах. Показано (табл. 5), что большинство показателей жизнеспособности сохраняются на исходном уровне в криоконсерванте №2 - 7 суток, №4 - 5 суток, №6 - 1 сутки. При этом количество фагоцитарноактивных нейтрофилов, которое является главным критерием оценки сохранности функции гранулоцита, после отогрева остается на уровне выше 70% (от исходного) в опытах с раствором №2 - 12 суток, раствора №4 - 9 суток, а раствора №6 - 2 суток.

Таблица 4. Показатели сохранности лейкоцитов (М±у), перенесших воздействие температуры переохлаждения (-10°С) в течение 1 суток в соответствующем криозащитном растворе

№ раствора	n	Показатели сохранности
		общее количество лейкоцитов	количество эозино резистентных клеток	количество гранулоцитов	количество фагоцитарно активных нейтрофилов	количество диформазан-положительных нейтрофилов	количество нейтрофилов с катионными белками
1	7	99,31,6	87,99,6+	91,06,7	79,45,7+	106,1±1,7+	98,2±3,1
2	7	95,26,4	95,04,1	88,46,4+	101,00,9	104,0±3,8+	99,1±0,7
3	7	79,27,4+	89,54,9+	52,04,2+	69,74,1+	95,0±11,2	98,6±9,4
4	7	98,42,1	98,21,2	89,4±3,9	88,83,0+	102,2±4,8	99,2±0,5
5	8	90,7±6,6+	81,6±15,9+	78,9±10,5+	86,1±5,6+	330,0±11,5+	80,7±8,2+
6	13	98,2±3,1	97,6±1,7	99,1±1,2	99,7±0,7	113,4±9,3+	99,2±8,1
7	5	86,5±6,2+	83,5±12,1+	95,5±5,8	98,7±2,9	300,0±20,0+	94,7±8,0+

Примечание. Данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100%. + - p<0.05.

Показано также (табл. 6), что раствор №2 повышает интенсивность ПОЛ у лейкоцитов до замораживания примерно в 1,2 раза, а АОА - в 1,9 раза и сохраняет данные значения в течение 12 суток экспозиции клеток в нем при -10°С. В опытах с раствором №4 исходно уровни ПОЛ и АОА снижаются в 1,4 и 1,7 раза, однако, через 9 суток хранения (срок наблюдения) при -10°С уровень ПОЛ повышается в 1,2 раза, а АОА в 1,5 раза (табл. 7). В каждом случае у отогретых клеток отмечается более высокий уровень АОА, чем интенсивность процессов перекисного окисления, что позволяет клеткам оставаться жизнеспособными.

Таблица 5. Показатели сохранности лейкоцитов (М±у), перенесших воздействие отрицательной температуры -10°С разные сроки в криозащитных растворах №2, №4, №6.

Сроки хране-ния, сутки	n	Показатели сохранности
		общее количество лейкоцитов	количество эозино резистентных клеток	количество гранулоцитов	количество фагоцитарно активных нейтрофилов	количество диформазан-положительных нейтрофилов	содержание катионных белков в нейтрофилах
в криозащитном растворе №2
5	7	96,12,1	89,1±9,8+	93,0±6,9+	94,7±4,3	102,7±7,6	94,1±4,9
7	9	94,28,7	91,1±8,9+	83,6±5,8+	94,8±4,8	116,0±9,9+	99,1±0,1
9	10	93,25,7	86,9±11,2+	88,0±9,3+	76,6±5,0+	120,8±8,9+	87,2±1,3+
11	7	94,65,5	91,4±4,7+	81,7±5,5+	75,5±9,8+	133,8±7,9+	68,6±1,3+
12	6	92,65,7	81,3±4,6+	82,2±3,6+	75,7±4,3+	145,8±7,0+	57,0±1,8+
14	7	95,24,8	56,6±7,8+	81,4±4,5+	52,9±6,1+	204,1±18,2+	46,2±4,1+
в криозащитном растворе №4
5	7	93,95,2	95,8±4,6	69,4±9,3+	91,0±11,1	103,6±7,7	92,1±1,9+
7	8	92,77,3+	86,8±4,7+	67,2±6,7+	78,5±2,7+	104,9±10,9	83,0±2,9+
9	9	84,810,9+	83,5±6,0+	77,2±8,8+	72,6±3,8+	111,5±9,8	71,2±2,3+
11	7	80,78,9+	82,7±6,8+	68,0±4,6+	61,4±2,8+	120,3±14,1+	62,6±3,3+
12	9	81,64,8+	76,6±7,7+	64,4±3,3+	57,2±4,4+	131,7±10,1+	56,9±1,8+
14	8	80,42,9+	74,7±12,7+	62,8±6,9+	45,5±3,0+	140,8±8,3+	47,2±3,1+
в криозащитном растворе №6
2	10	86,1±0,9+	73,0±12,8+	67,8±15,8+	70,1±9,5+	99,2±8,1	113,4±9,3
3	10	79,5±16,1+	57,2±11,5+	61,5±12,9+	69,7±4,9+	101,5±3,0	119,1±13,8+

Примечание. Данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100%. + - p<0.05.

Таблица 6. Показатели хемилюминограммы лейкоцитов (n=6, М±у), перенесших воздействие температуры переохлаждения (-10°С) под защитой криоконсервирующего раствора №2 в течение 7 и 12 суток

Лейкоцитный концентрат	Показатели
	Imax	S	tg(-2б)	a	Z
до замораживания	73,0±12,7 *	543,0±106,2 *	17,0±2,3 *	0,25±0,004 *	7,4±0,1 *
до замораживания с раствором №2	261,5±7,5	1601,0±3,5	58,0±3,1	0,21±0,01	6,2±0,5
через 7 суток хранения	289,2±21,4 *	1841,0±48,4 *	55,6±6,4	0,22±0,01	6,5±0,4
через 12 суток хранения	270,5±17,2	1649,2±8,6	57,0±5,1	0,22±0,01	6,6±0,5

Примечание. * - различие с величиной показателя до замораживания с хладоограждающим раствором p<0.05.

Таблица 7. Показатели хемилюминограммы лейкоцитов (n=8, М±у), перенесших воздействие температуры переохлаждения (-10°С) под защитой криоконсервирующего раствора №4 в течение 9 суток

Лейкоцитный концентрат	Показатели
	Imax	S	tg(-2б)	a	Z
до замораживания	118,2±10,8 *	773,2±14,02 *	28,9±3,9 *	0,22±0,02 *	6,6±0,5 *
до замораживания с раствором №4	95,4±2,2	639,8±7,12	16,2±0,1	0,29±0,004	8,8±0,1
через 9 суток хранения	111,8±12,5 *	759,8±71,8 *	24,1±3,7 *	0,23±0,02 *	6,8±0,5 *

Примечание. * - различие с величиной показателя до замораживания с хладоограждающим раствором p<0.05.

Следует отметить, что все три указанные раствора в качестве основного активного ингредиента содержат эндоцеллюлярный протектор глицерин в конечной концентрации 3,5%. Используемая концентрация является низко токсичной (не требует отмывания перед применением) и, по результатам полученных исследований, является достаточной для проявления свойств данного протектора: способность сжиматься при замораживании и образовывать мелкокристаллический лед с переходом в стеклование, поддерживать переохлажденное состояние клетки (за счет образования стабильных водородных связей с водой), легко проходить через клеточные мембраны (при +22°Сч+37С), обеспечивать действие противосолевого буфера и уравнивать осмотическое давление по обе стороны мембраны.

Кроме того, указанные растворы в качестве «реставрирующего» компонента содержат в 0,15% конечной концентрации ОМЭПС, обладающий (Барабой В.А., 1991, 1992; Клебанов Г.И. и соавт., 2001) противогипоксическим действием, обусловленным наличием в составе остатка янтарной кислоты и антиоксидантным - ингибирование ПОЛ в ее начальной фазе. Данное вещество также способно (Дюмаев К.М. и соавт., 1995) модулировать активность мембрансвязанных ферментов, рецепторных комплексов, что усиливает их способность связывания с лигандами и способствует сохранению упорядоченной структурно-функциональной организации биомембран. Указанные свойства ОМЭПС нашли свое применение при коррекции иммунных нарушений (Тепаев Д.В., 2006) и интенсивной терапии гнойных нейроинфекций (Хвойнов Д.В., 2006). Отмечено также положительное влияние ОМЭПС на систему крови в условиях стресса человека (Мороз Б.Б., 2006).

Однако, совместное действие глицерина и ОМЭПС в указанных концентрациях обеспечивает сохранность (n=10, Му) при -10°С (Сведенцов Е.П. и соавт, 2008) в течение 1 суток 90,3±1,7% (от исходного уровня) лейкоцитов, у 96,2±1,5% отогретых клеток сохраняется устойчивость к эозину, однако, сохранность гранулоцитов составляет лишь 57,2±2,6%. При этом определить способность отогретых нейтрофилов к фагоцитозу было невозможным, в связи с разрушением их ядерной мембраны.

Дополнительное введение в состав раствора с глицерином и ОМЭПС экзоцеллюлярных протекторов значительно повышает криоустойчивость клеток в ряду: лемнан (средний молекулярный вес 400 000; использован в растворе №6) - желатин (20 000; в растворе №4) - желатин (16 000; в растворе №2). Согласно теории М.И. Шраго (1981) вещество, обладающее функциональными группами (-OH, -COOH, -CH3, =S=O-CH3, -(CH2-CH2O)-OH, др.) может оказывать криозащитное действие. Лемнан (как и глицерин) содержит -OH радикалы, желатин -COOH, но увеличение молекулярного веса вещества уменьшает его криопротекторный эффект. В отношении лемнана также установлено, что увеличение его концентрации в замораживаемой среде не повышает сохранность клеток.

Таким образом, для эффективного консервирования ядерных клеток при температуре переохлаждения (-10°С) целесообразным является нелинейное охлаждение биообъекта в незамерзающем криозащитном растворе №2, содержащем эндоцеллюлярный протектор глицерин (в нетоксичной исходной концентрации 7%), экзоцеллюлярный протектор желатин (со средней молекулярной массой 16 000; 7,5%) и антиоксидант, противогипоксант ОМЭПС (0,3%). Указанный состав раствора в лучшей степени, чем остальные исследуемые способствует повышению криоустойчивости клеток при температуре -10°С.

Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие субумеренно-низкой температуры (-20єС)

Изучены криозащитные свойства 4 криозащитных растворов, отличающихся природой протекторов: эндоцеллюлярный - глицерин, экзоцеллюлярный - лемнан, смешанного действия - ГБТОЭМ, а также концентрацией антиоксиданта и противогипоксанта ОМЭПС.

Установлено (табл. 8), что хладоограждающий раствор №9, содержащий в исходной концентрации ГМБТОЭМ - 28% и ОМЭПС - 0,15% в отношении ядерных клеток крови проявляет лучший криозащитный эффект, чем раствор с меньшей (№8) или с большей (№10) концентрацией ингредиентов, а также раствор (№11), содержащий глицерин (7,0%) и лемнан (0,2%).

Таблица 8. Показатели сохранности лейкоцитов (М±у), перенесших воздействие субумеренно-низкой температуры (-20°С) в течение 1 суток в соответствующем криозащитном растворе

№ раствора	n	Показатели сохранности
		общее количество лейкоцитов	количество эозинорезистен-тных клеток	количество гранулоцитов	количество фагоцитарно активных нейтрофилов	количество диформазан-положительных нейтрофилов	количество нейтрофилов с катионными белками
8	5	92,41,5	73,5±4,7+	62,38,1+	63,8±6,4+	-	-
9	7	91,06,2	86,9±1,4+	80,812,3+	75,7±7,9+	257,5±19,8+	80,3±1,4+
10	6	94,34,6	78,1±8,1+	65,74,0+	57,6±6,5+	-	-
11	12	88,9±10,5+	78,0±6,7+	52,2±11,9+	76,0±12,9+	380,6±19,3+	94,5±7,8+

Примечание. Данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100%. + - p<0.05.

Вероятно, положительный криозащитный эффект раствора №9 обусловлен тем, что используемый в его составе протектор ГМБТОЭМ имеет радикалы: оксиэтильные (CH2-CH2-O-), гидроксильные (-OH), метильные (-CH3), которые по теории М.И.Шраго (1981) определяют его криофилактические свойства и не содержит циклических групп, обуславливающих его канцерогенное действие (ЛД50=15,5±0,6 г/кг массы мыши). Молекулярная масса ГМБТОЭМ - 378 обуславливает его смешанное криопротекторное действие (экзо- и эндоцеллюлярное). Исходная 28% концентрация протектора в растворе достаточна для обеспечения криозащитного эффекта в отношении лейкоцитов при -20°С.

Следует отметить, что эффективное криопротекторное действие у ГМБТОЭМ (исходная концентрация 20%) впервые было показано в 1987 г Е.П.Сведенцовым при криоконсервировании (-196°С) клеток костного мозга. Автором показано, что данное вещество образует связи со структурными компонентами мембраны, что повышает ее устойчивость к повреждающему действию кристаллов, а также, частично проникая в клетку, связывает воду и способствует образованию преимущественно мелких кристаллов льда при замораживании. ГМБТОЭМ является также хорошим растворителем, что способствует удерживанию концентрации солей в межкристаллических пространствах на физиологически допустимом уровне и, следовательно, защищает клетки от неблагоприятного воздействия гиперконцентрации солей и денатурации клеточных белков.

Для усиления криозащитного эффекта ГМБТОЭМ при температуре -20°С, когда фракции связанной и фиксированной воды не кристаллизуются и метаболизм имеет малое замедление в состав раствора был введен антиоксидант и противогипоксант ОМЭПС в исходной концентрации 0,15%, которая оказалась более эффективной, чем 0,05% или 0,1%.

Показано (табл. 9), что криозащитный раствор №9 способен обеспечить сохранность ядерных клеток при -20°С в течение 21 суток.

Таблица 9. Показатели лейкоцитов (М±у; n=7), перенесших воздействие температуры -200С в хладоограждающем растворе №9 в течение 70 суток

Сроки хранения, сутки	Показатели	Сохранность #
	до замораживания	после отогрева
Количество лейкоцитов в 1 мкл
14	138101302	12600226	90,19,0+
21	157703551	135303435	90,97,6+
28	136009573	127308982	93,40,5+
42	73291989	65302478	87,411,0+
56	85261752	81392008	94,65,6+
70	83672249	75542166	90,15,9+
Количество эозинорезистентных лейкоцитов в %
14	99,70,5	93,84,2*	94,23,8+
21	99,21,2	88,67,5*	89,36,8+
28	99,10,9	89,14,1*	90,04,4+
42	99,40,8	81,98,4*	82,18,5+
56	99,90,4	82,69,3*	82,79,3+
70	100,00,0	87,56,2*	87,56,2+
Количество гранулоцитов в%
14	34,2±6,9	30,4±7,3	80,8±12,3+
21	30,68,8	28,37,6	93,79,8+
28	36,16,8	31,24,1	87,36,7+
42	34,94,9	26,14,7*	75,19,9+
56	46,68,6	32,65,5*	71,917,6+
70	43,36,7	35,93,2*	84,010,6+
Количество фагоцитарноактивных нейтрофилов в %
14	46,3±1,2	35,2±3,7*	75,28,1+
21	56,9±6,5	38,3±7,7*	71,710,8+
28	60,4±5,9	36,4±2,9*	60,67,3+
42	58,9±4,9	36,0±6,3*	58,310,8+
56	57,7±5,4	36,1±4,8*	60,410,7+
70	61,7±4,9	35,1±4,7*	57,18,3+
Количество диформазан-положительных нейтрофилов в %
14	4,81,3	12,2±0,8*	254,1±0,9+
21	4,2±1,1	12,8±1,2*	304,8±1,2+
28	4,00,6	13,2±1,4*	330,0±3,9+

Примечание. * - различие с показателем до замораживания p<0.05; # - данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100%. + - p<0.05

Данный срок обозначен на основании результатов сохранности гранулоцитов и способности нейтрофилов к фагоцитозу, а также дополнительных исследований. В частности установлено, что содержание микробицидных белков в нейтрофилах после 21 суток холодового воздействия (-200С) достоверно не изменяется - исходный уровень среднего цитохимического коэффициента составляет 2,3±0,6 у.е (n=10, М±у), после отогрева - 1,9±0,4 у.е. Установлено также (рис. 3), что содержание растворенного в биосреде кислорода через 21 сутки нахождения лейкоцитов при -200С снижается (p<0.05), однако уровень ПОЛ и антиоксидантный потенциал данных клеток (табл. 10) достоверно не отличаются от исходного, т.е. до замораживания с хладоограждающим раствором. Следовательно стабильный уровень прооксидантно-антиоксидантного равновесия при данном холодовом воздействии подтверждает стадию долговременной адаптации клеток.

Рисунок 3. Содержание растворенного кислорода в смеси лейкоцитных концентратов (ЛК; n=10) с криопротекторным раствором (КР) №9 до и после экспозиции при -200С в течение 21 суток.

+ - p<0.05.

Таблица 10. Показатели хемилюминограммы лейкоцитов (n=6, М±у), перенесших воздействие субумеренно-низкой температуры (-20°С) под защитой криоконсервирующего раствора №9 в течение 21 суток

Лейкоцитный концентрат	Показатели
	Imax	S	tg(-2б)	a	Z
до замораживания	117,7±20,3	899,3±181,5	23,4±2,2 *	0,25±0,01 *	7,6±0,2 *
до замораживания с раствором №9	139,0±30,6	939,7±150,3	32,9±7,0	0,22±0,01	6,6±0,4
через 21 сутки хранения	158,0±27,4	1022,0±182,6	30,9±3,9	0,22±0,005	6,5±0,2

Примечание. * - различие с величиной показателя до замораживания с хладоограждающим раствором p<0.05.

Интерес представляет то, что раствор №9 (табл. 11) обеспечивает сохранность в условиях -20°С в течение 21 суток популяции Т-лимфоцитов, но не способен повысить криоустойчивость В-лимфоцитов. Тогда как известно (Белоус А.М., Грищенко В.И., 1994), что Т-лимфоциты являются более чувствительными к замораживанию (-80°С; -196°С), отогреву и осмотическому шоку. Следовательно, предложенная технология обеспечивает сохранность у лейкоцитов в течение 21 суток при -20°С способности как к неспецифическому (фагоциты), так и специфическому (Т-лимфоциты) иммунному ответу.

Таблица 11. Содержание Т- и В-лимфоцитов (М±у; n=5), в ЛК, подвергнутых холодовому воздействию (-20оС) разные сроки в хладоограждающем растворе №9

Популяция лимфоцитов	Количество лимфоцитов в %
	до замораживания (контроль)	после размораживания
		через 1 сутки	через 21 сутки
Т-лимфоциты, %	75,0±8,4	86,2±7,6	85,2±3,3
В-лимфоциты, %	8,7±2,7	6,7±2,5	1,7±0,9*

Примечание. * - p<0.05.

Таким образом, нелинейное замораживание биообъекта в криозащитном растворе №9, содержащем протектор смешанного действия ГМБТОЭМ (в исходной концентрации 28%) и антиоксидант, противогипоксант ОМЭПС (0,15%) позволяют обеспечить структурно-функциональную сохранность лейкоцитов при -20°С в течение 21 суток.

Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (-40єС)

Температура -40°С характеризуется неустойчивой кристаллизацией связанной внутриклеточной фракции воды и самое незначительное колебание температуры может стать губительным для замороженной клетки. Поэтому количество ингредиентов для поиска эффективной комбинации хладоограждающего раствора было большим, чем при других изучаемых температурах. В конечном итоге были выбраны 7 криозащитных растворов, отличающихся природой протекторов: эндоцеллюлярные - глицерин и ПД, экзоцеллюлярный - ГЭК, смешанного действия - ГБТОЭМ. В качестве «реставрирующих» компонентов в составе растворов использованы: ОМЭПС - антиоксидант и противогипоксанта, фумарат натрия - антигипоксант биоэнергетической направленности, холина хлорид - представитель комплекса витаминов группы «В», входит в состав фосфолипида лецитина, обладает мембранопротекторным и др. действием, глюкоза - обладает слабым эндоцеллюлярным криопротекторным действием, регулятор осмотических и метаболических процессов в клетках, способствует эффективной их репарации. Также использована лимонная кислота - для нейтрализации основной реакции раствора и как необходимое звено в системе биохимических реакций клеточного дыхания, реализующее энергетический метаболизм клетки (Точилкин А.И., 1980).

Установлено (табл. 12), что большей криоустойчивостью к факторам холодового воздействия обладают лейкоциты, замороженные в хладоограждающем растворе №13, содержащем ГМБТОЭМ, в исходной концентрации 30%, фумарат натрия 2,8% и лимонную кислоту 0,06%. По эффективности ему незначительно уступает раствор №16, ингредиентами которого явились: глицерин (4,8%), ГЭК (5,7%) и ОМЭПС (0,1%). Менее эффективным для консервирования лейкоцитов при умеренно-низкой температуре -40°С оказался хладоограждающий раствор №18, содержащий ПД (21%), ГЭК (4,7%), ОМЭПС (0,2%) и хлорид (1%), что указывает на целесообразность применения ГЭК совместно с глицерином, но не ПД.

Таблица 12. Показатели сохранности лейкоцитов (М±у), перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (-40°С) в течение 1 суток в соответствующем криозащитном растворе

№ раствора	n	Показатели сохранности
		общее количество лейкоцитов	количество эозинорезистен-тных клеток	количество гранулоцитов	количество фагоцитарно активных нейтрофилов	количество диформазан-положительных нейтрофилов	количество нейтрофилов с катионными белками
12	13	97,13,0	52,85,1+	61,36,1+	49,86,8+	420,2±15,6+	52,6±12,3+
13	12	94,23,7	84,36,6+	88,99,0+	95,9±4,5	254,0±10,1+	81,7±12,4+
14	14	91,69,3	54,98,4+	57,16,5+	50,44,7+	440,3±12,8+	61,3±8,1+
15	6	99,31,6	60,42,9+	85,011,5+	33,59,0+	-	-
16	6	98,34,1	82,04,1+	96,28,5	72,07,6+	335,0±15,5+	60,2±8,2+
17	6	88,314,0+	51,07,4+	88,27,1+	47,86,6+	-	-
18	5	85,47,1+	79,010,1+	74,66,6+	66,44,6+	-	-

Примечание. Данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100%. + - p<0.05.

Исследования длительности хранения клеток при -40°С в криозащитном растворе №13 показали (табл. 13), что возможным максимально допустимым сроком являются 30 суток.

Согласно данным хемилюминограммы (табл. 14), даже через 30 суток экспозиции биообъекта при -40°С не отмечается повышения ПОЛ и сохраняется высокий уровень АОА. При этом содержание растворенного в среде кислорода не снижается.

Таблица 13. Показатели лейкоцитов (М±у; n=7), перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (-400С) в хладоограждающем растворе №13 в течение 50 суток

Сроки хранения, сутки	n	Показатели	Сохранность#
		до замораживания	после отогрева
Количество лейкоцитов в 1 мкл
20	7	70401698	65841300	94,46,2
30	12	92831111	87501124	84,510,8+
40	7	197002000	15910634 *	87,48,5+
50	7	80501472	6420887 *	84,72,6+
Количество эозинорезистентных лейкоцитов в %
20	7	97,62,4	70,45,2*	75,18,0+
30	12	96,62,6	67,313,8*	70,114,9+
40	7	99,11,5	78,79,4*	79,78,3+
50	7	99,70,5	61,212,8*	61,212,8+
Количество гранулоцитов в %
20	7	32,21,6	29,63,1	89,27,1+
30	12	38,88,5	24,55,1 *	62,44,9+
40	7	32,05,8	18,75,8 *	57,99,8+
50	7	42,89,9	19,92,1 *	42,43,2+
Количество фагоцитарноактивных нейтрофилов в %
20	9	36,92,6	34,35,2	92,90,6+
30	12	46,75,2	43,06,8	92,26,4+
40	7	38,01,4	20,11,9*	53,11,4+
50	7	33,91,1	15,42,1*	44,32,1+
Количество диформазан-положительных нейтрофилов в %
20	7	24,43,3	71,01,6*	291,82,8+
30	12	22,31,9	96,87,2*	433,58,1+
Содержание лизосомально-катионных белков в нейтрофилах в у.е.
20	7	1,10,3	1,12,1	100,86,8
30	12	1,10,1	1,10,2	102,09,1

Примечание. * - различие с показателем до замораживания p<0.05; # - данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100%. + - p<0.05

Таблица 14. Показатели хемилюминограммы лейкоцитов (n=5, М±у), перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (-40°С) под защитой криоконсервирующего раствора №13 в течение 30 суток

Лейкоцитный концентрат	Показатели
	Imax	S	tg(-2б)	a	Z
до замораживания	77,2±11,9	590,8±50,6	17,7±3,3	0,25±0,02	7,7±0,8
до замораживания с раствором №13	94,0±21,6	674,0±99,0	20,4±5,7	0,24±0,02	7,2±0,7
через 30 суток хранения	120,5±26,9	699,2±105,2	32,1±8,2 *	0,19±0,01 *	5,8±0,5 *

Примечание * - различие с величиной показателя до замораживания с хладоограждающим раствором p<0.05

Следует отметить, что также как и раствор №9 (ГМБТОЭМ 28% + ОМЭПС 0,15%) при -20°С, раствор №13 (ГМБТОЭМ 30%, фумарат натрия 2,8% и лимонная кислота 0,06%) в условиях -40°С обеспечивает сохранность только популяции Т-лимфоцитов (табл. 15), что расширяет возможные способы консервирования данных клеток.

Таблица 15. Содержание Т- и В-лимфоцитов (М±у; n=5), в ЛК, подвергнутых холодовому воздействию (-40оС) разные сроки в хладоограждающем растворе №13

Популяция лимфоцитов	Количество лимфоцитов в %
	до замораживания (контроль)	после размораживания
		через 1 сутки	через 30 суток
Т-лимфоциты, %	82,8±1,9	88,3±2,1	87,2±3,1
В-лимфоциты, %	9,2±3,9	2,7±0,6*	1,9±0,8*

Примечание. * - p<0.05.

Таким образом, для повышения криоустойчивости лейкоцитов в условиях субумеренно-низкой температуры (-40°С), при которой наблюдаются неустойчивая кристаллизация фракции связанной воды, также как и субумеренно-низкой (-20°С), при которой связанная вода не замерзает наиболее целесообразным является применение криопротектора смешанного действия ГМБТОЭМ в качестве основного ингредиента криозащитного раствора. Данный протектор в исходной концентрации 30% совместно с антигипоксантом биоэнергетической направленности фумаратом натрия (2,8%) способен обеспечить сохранность лейкоцитов при -40°С до 30 суток.

Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие низкой температуры (-80єС)

Изучены криозащитные свойства 6 растворов, отличающихся природой используемых протекторов. Установлено (табл. 16), что в лучшей степени сохранности ядерных клеток крови при -80°С в течение суток способствует сочетание ДМСО + ГМБТОЭМ + ОМЭПС (растворы №19-21), чем ПД + ГЭК + N-метиламмония натрия сукцинат (№ 22-24). Наиболее высокие показатели жизнеспособности наблюдаются у клеток замороженных по нелинейной программе в хладоограждающем растворе №20, содержащем в исходной концентрации ДМСО - 8%, ГМБТОЭМ - 22% и ОМЭПС - 0,2%.

Таблица 16. Показатели сохранности лейкоцитов (М±у), перенесших воздействие низкой температуры (-80°С) в течение 1 суток в соответствующем криозащитном растворе