Сохранность ядерных клеток крови в условиях отрицательных температур различных диапазонов

№ раствора	n	Показатели сохранности
		общее количество лейкоцитов	количество эозинорезистен-тных клеток	количество гранулоцитов	количество фагоцитарно активных нейтрофилов	количество диформазан-положительных нейтрофилов	количество нейтрофилов с катионными белками
19	7	79,8±5,0+	77,0±7,7+	82,8±13,4+	55,0±7,2+	639,0±30,8+	80,2±8,4+
20	7	96,8±4,1	88,6±7,3+	94,5±6,9	75,5±8,5+	426,7±39,3+	91,7±4,6+
21	7	91,4±4,0+	77,6±8,4+	68,2±18,3+	57,0±4,0+	362,5±41,1+	99,0±1,3
22	11	93,7±3,9+	82,3±10,6+	24,0±5,6+	52,4±2,8+	785,8±96,9+	98,6±10,9
23	11	93,7±4,8+	87,0±7,6+	68,2±12,7+	57,3±5,9+	300,0±53,5+	99,1±0,8
24	11	96,2±3,8	60,2±10,4+	24,11±9,2+	29,7±3,9+	410,5±70,5+	93,6±4,9+

Примечание. Данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100%. + - p<0.05.

Положительный криозащитный эффект комбинирования ДМСО (8%) + ГМБТОЭМ (22%) + ОМЭПС (0,2%) при низкой температуре -80°С обусловлен универсальным протекторным действием ГМБТОЭМ, который положительно зарекомендовал себя при субумеренно-низкой температуре -20°С в концентрации 28% и при умеренно-низкой -40°С в концентрации 30%. Совместное применение ГЭК и ПД (растворы №22-24) при -80°С, также как и при умеренно-низкой (-40°С) температуре является не целесообразным.

При использовании криозащитного раствора №20 после 1 суток хранения не изменяется уровень Т- и В-лимфоцитов и не снижается количество растворенного в биообъекте кислорода. Уровень ПОЛ и АОА клеток (табл. 17) снижены, что, вероятно, связано с более выраженным, чем при других выше указанных температурах замедлением процессов метаболизма, связанных со стабильной кристаллизацией внеклеточной, свободной и связанной внутриклеточной фракций воды.

Таблица 17. Показатели хемилюминограммы лейкоцитов (n=6, М±у), перенесших воздействие низкой температуры (-800С) в хладоограждающем растворе №20 в течение 1 и 180 суток

Лейкоцитный концентрат	Показатели
	Imax	S	tg(-2б)	a	Z
до замораживания	86,2±10,5 *	642,8±71,3 *	19,2±2,1 *	0,25±0,004 *	7,5±0,1 *
до замораживания с хладоограждающим раствором №20	109,4±6,7	851,2±65,2	22,9±1,8	0,27±0,01	7,8±0,3
через 1 сутки хранения	64,0±8,5 *	430,8±77,9 *	14,4±1,2 *	0,22±0,01 *	6,6±0,4 *
через 180 суток хранения	82,5±11,9 *	518,0±87,7 *	22,7±3,1	0,21±0,01 *	6,2±0,4 *

Примечание * - различие с величиной показателя до замораживания с хладоограждающим раствором p<0.05.

Применение хладоограждающего раствора №20 (табл. 18) позволяет сохранить ядерные клетки крови в условиях низкой температуры (-800С) в течение 180 суток (срок наблюдения). При этом, не только количество Т-лимфоцитов, но и В- соответствует исходному, т.е. данный раствор способен обеспечить сохранность обеих популяций лимфоцитов.

Интерес вызывает характер колебаний уровня ПОЛ и АОА после отогрева через разные сроки хранения (табл. 17). Так, если через 1 сутки нахождения клеток при -80°С снижение ПОЛ и АОА возможно связано с замедлением процессов метаболизма, то через 180 суток антиоксидантная активность у клеток повышается и достигает исходного уровня (до замораживания с раствором), что позволяет сдерживать интенсивность процессов ПОЛ.

Таблица 18. Показатели лейкоцитов (n=12, М±у), перенесших воздействие низкой температуры (-800С) в хладоограждающем растворе №20 в течение 180 суток

Показатели	До замораживания	После отогрева	Сохранность#
Количество лейкоцитов в 1 мкл	162903189	150203987	89,36,4+
Количество эозинорезистентных лейкоцитов в %	98,11,6	89,35,0*	91,05,1+
Количество гранулоцитов в %	36,78,0	33,66,0	85,37,2+
Количество фагоцитарноактивных нейтрофилов в %	65,3±1,7	41,8±4,0*	76,714,7+
Количество диформазан-положительных нейтрофилов в %	3,4±0,5	24,7±7,0*	652,575,4+
Содержание катионных белков в нейтрофилах в у.е.	2,3±0,2	2,2±0,1*	93,89,4+
Количество Т-лимфоцитов в %	80,0±14,1	83,7±9,8	-
Количество В-лимфоцитов в %	8,5±2,1	8,5±2,1	-

Примечание. * - различие с показателем до замораживания p<0.05; # - данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100%. + - p<0.05

Через 180 суток хранения лейкоцитов при -80°С в растворе №20 в биообъекте не изменяется содержание растворенного кислорода, что наряду с благоприятными результатами жизнеспособности клеток свидетельствует об эффективности выбранной криотехнологии.

Для сравнения эффективности указанной технологии с традиционной (применение жидкого азота) в дополнительной серии исследований лейкоциты в криозащитном растворе №20 были заморожены по линейной программе в программном аппарате УОП 00.00.00 (Украина): на 1-м этапе со скоростью 1°C/мин от +22 до -7єC, на 2-м этапе - 10°C/мин от -7 до -40°C, на 3-м этапе - 20°C/мин от -40 до -80°C. Общее время замораживания составило 37 мин. После этого образцы переносили для хранения в электроморозильник на -80єС MDF-3086S «Sanyo» (Япония) где хранили в течение суток. Установлено (табл. 19), что замораживание клеток по нелинейной программе способствует большей сохранности гранулоцитов и повышению количества нейтрофилов с гранулами диформазана, по остальным показателям различий не выявлено. Следовательно оба режима замораживания являются альтернативными.

Таблица 19. Влияние режимов замораживания (-80°С) лейкоцитов в криозащитном растворе №20 на показатели жизнеспособности клеток (n=10, М±у), отогретых через сутки консервирования.

Режим замораживания	Показатели	Сохранность#
	до замораживания	после отогрева
Количество лейкоцитов в 1 мкл
Нелинейный	154703967	149403636	95,93,9
Линейный	12800±3009	12171±2692	96,1±1,7
Количество эозинорезистентных лейкоцитов в %
Нелинейный	97,80,9	88,77,0*	90,97,1
Линейный	99,7±0,5	86,6±3,7*	86,9±3,8
Количество гранулоцитов в %
Нелинейный	34,02,3	32,32,7	95,57,9 л
Линейный	42,2±9,8	39,2±9,3	87,5±6,5
Количество фагоцитарноактивных нейтрофилов в %
Нелинейный	57,4±6,2	50,0±1,7*	88,1±5,9
Линейный	27,6±2,2	24,3±3,0*	89,0±5,4
Количество диформазан-положительных нейтрофилов в %
Нелинейный	4,5±0,7	21,2±2,3*	436,1±43,6 л
Линейный	16,8±2,3	28,3±3,3*	176,5±7,3
Содержание лизосомально-катионных белков в нейтрофилах в у.е.
Нелинейный	2,6±0,2	2,4±0,5	92,6±4,7
Линейный	2,4±0,1	2,2±0,2	95,6±3,1

Примечание. # - данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100%; * - различие с показателем до замораживания p<0.05; л - различие с показателем сохранности при использовании линейного режима замораживания p<0.05

Необходимо отметить, что применение нелинейной технологии замораживания клеток требует меньших экономических затрат. А.А.Костяевым (2003) показано, что на реализацию низкотемпературного (-80°С) консервирования гемопоэтических стволовых клеток по нелинейному режиму без учета стоимости криоконсерванта требуется в 2 раза меньше средств, чем на криоконсервирование по линейным программам с использованием жидкого азота (-196°С). Себестоимость соответственно составила 33631,98 и 64083,82 $. При этом 98% себестоимости любого метода составляют затраты на технические средства, остальные 2% приходятся на оплату труда, затраты на электроэнергию, перевязочные средства и медикаменты.

Таким образом, для эффективного консервирования ядерных клеток при низкой температуре (-80°С) целесообразным является нелинейное замораживание биообъекта в криозащитном растворе №20, содержащем протектор смешанного действия ГМБТОЭМ в исходной концентрации 22%, протектор эндоцеллюлярного действия ДМСО (8%) и антиоксидант, противогипоксант ОМЭПС (0,2%). Применение указанной технологии позволяет сохранять лейкоциты при -80°С в течение 180 суток.

Физико-химические и биологические свойства эффективных криозащитных растворов

При изучении влияния длительного хранения стерильных растворов №4, №9, №13 и №20 на их криозащитные свойства установлено, что все растворы по истечении срока хранения (45 суток при +600С) оставались прозрачными, а изменение кислотности наблюдали только в серии с раствором №20 (исходное значение рН=7,29; после хранения - 6,05), т.е. данный раствор необходимо готовить непосредственно перед процедурой замораживания.

Со всеми, подвергнутыми хранению, растворами были заморожены лейкоциты и выдержаны при соответствующих температурах (раствор №4 при -100С; №9 при -200С; №13 при -400С; №20 при - 800С) в течение суток. Показано, что растворы №9, №13 и №20 сохраняют морфологическую полноценность клеток и их функциональную активность на том же уровне, что и соответствующий раствор, не подвергавшийся «старению». В опытах с раствором №4 функциональная активность лейкоцитов снижалась, что вероятно связано с возможным гидролизом (+600С) ингредиента раствора - желатина. Данный вывод нашел свое подтверждение в дополнительной серии исследований, в которой «ускоренному старению» подвергался раствор без желатина, последний добавляли непосредственно перед охлаждением клеток. Следовательно, необходимо использование либо свежеприготовленного раствора, либо раствора, хранившегося в течение 2 лет при +40С без желатиноля, последний добавляется перед охлаждением клеток.

При изучении «острой» и «хронической» токсичности, пирогенности растворов №4, №9, №13 и №20 на лабораторных животных, а также переносимости животными аутотрансфузий, консервированных с растворами клеток установлено, что все указанные растворы соответствуют требованиям, предъявляемым к трансфузионной среде для внутривенного введения, в том числе и к криозащитной среде (ГФ XII, 2007). При определении «острой» токсичности хладоограждающих растворов все белые мыши по истечении 5 суток остались живы. При выявлении «хронической токсичности» растворов белые мышеи и кролики многократное введение хладоограждающих растворов перенесли без осложнений и реакций, что подтверждается данными об их состоянии и гистологическими исследованиями внутренних органов. В эксперименте на пирогенность растворов ни у одного из использованных кроликов не было зафиксировано суммарного изменения температуры тела, превышающего норму (1,40С). При изучении переносимости собаками аутотрансфузий отогретых клеток без отмывания определенного хладоограждающего раствора у животных не наблюдали отклонений от нормы в поведении, изменений температуры, массы тела, показателей гемограммы и урограммы частоты дыхания и частоты сердечных сокращений. Таким образом, хладоограждающие растворы №4, №9, №13 и №20 нетоксичны, апирогенны, благоприятно переносятся животными.

ВЫВОДЫ

1. Предложены новые низкотемпературные технологии консервирования ядерных клеток крови при различных отрицательных температурах (-10°С, -20°С, -40°С, -80°С), включающих применение нетоксичных комбинированных недорогостоящих криозащитных растворов и щадящих нелинейных программ замораживания.

2. При температуре -10°С сохранность лейкоцитов обеспечивает комбинированный незамерзающий криозащитный раствор (патент РФ № 2261595 от 10.10.2005), включающий эндоцеллюлярный протектор глицерин (в низко токсичной исходной концентрации 7%), экзоцеллюлярный протектор желатин со средней молекулярной массой 16 000 (7,5%) и антиоксидант ОМЭПС (0,3%).

3. Через 7 суток хранения клеток при -10°С в указанном растворе: сохраняется (от исходного уровня) 94,28,7% лейкоцитов; у 91,1±8,9% мембрана непроницаема для эозина; содержание гранулоцитов составляет 83,6±5,8%, количество фагоцитарноактивных нейтрофилов 94,8±4,8%; уровень лизосомально катионных белков не изменяется, количество нейтрофилов с гранулами диформазана увеличивается в 1,2 раза; антиоксидантная активность остается на высоком уровне и превышает степень активации ПОЛ.

4. В условиях температуры -20°С полноценность ядерных клеток крови обеспечивает криозащитный раствор (патент РФ №2240000 от 20.11.2004), содержащий протектор смешанного действия ГБТОЭМ (28%) и антиоксидант ОМЭПС (0,2%).

5. Через 21 сутки экспозиции биообъекта в данном растворе при -20°С: сохраняется 90,97,6% лейкоцитов, эозинорезистентность выявлена у 89,36,8% клеток, содержание гранулоцитов составляет 93,79,8%, количество фагоцитарноактивных нейтрофилов 71,7±10,8%, уровень лизосомально катионных белков 99,1±0,1%; не изменяется число Т-лимфоцитов; в 3 раза повышается количество нейтрофилов с гранулами диформазана; содержание растворенного в биосреде кислорода снижается, однако уровень ПОЛ и антиоксидантный потенциал клеток не отличаются от исходного.

6. При температуре -40°С сохранность клеток обеспечивает хладоограждающий раствор (патент РФ №2184449 от 10.07.2002), содержащий криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ (30%), антигипоксант фумарат натрия (2,8%) и лимонную кислоту (0,06%).

7. Через 30 суток хранения лейкоцитов в данном растворе при -40°С: сохраняется 84,510,8% клеток; у 70,114,9 % мембрана устойчива для эозина; криоустойчивость наблюдается у 62,44,9% гранулоцитов; количество фагоцитарноактивных нейтрофилов составляет 92,26,4%; уровень лизосомально катионных белков не изменяется; в 3 раза увеличивается количество нейтрофилов с гранулами диформазана; не изменяется число Т-лимфоцитов; содержание растворенного в биосреде кислорода соответствует исходному; антиоксидантная активность увеличивается и стабилизирует уровень ПОЛ.

8. В условиях температуры -80°С сохранность лейкоцитов обеспечивает криозащитный раствор (патент РФ №2290808 от 10.01.2007), содержащий криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ (22%), криопротектор эндоцеллюлярного действия ДМСО (8%) и антиоксидант ОМЭПС (0,2 %).

9. Через 180 суток хранения клеток в данном растворе при -80°С: сохраняется 89,36,4% лейкоцитов; у 91,0±5,1% мембрана непроницаема для эозина; содержание гранулоцитов составляет 85,3±7,2%, количество фагоцитарноактивных нейтрофилов 76,7±14,7%; исходный уровень лизосомально катионных белков характерен для 93,89,4% нейтрофилов; в 4 раза увеличивается количество нейтрофилов с гранулами диформазана; не изменяется число Т- и В-лимфоцитов; содержание растворенного в биосреде кислорода и антиоксидантная активность соответствуют исходному уровню, интенсивность ПОЛ снижена.

10. Предложенные комбинированные криозащитные растворы по физико-химическим и биологическим (острая и хроническая токсичность, пирогенность) свойствам обладают низкой токсичностью и хорошей переносимостью лабораторными животными как в чистом виде, так и в смеси с размороженными аутологичными лейкоцитными концентратами.

11. Криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ проявляет эффективные протекторные свойства при широком диапазоне температур (-20°С до -80°С), а с учетом его низкой токсичности (ЛД50=15,5±0,6 г/кг массы мыши) может претендовать на роль универсального протектора.

12. Замораживание ядерных клеток по нелинейным программам в электрических морозильниках (-10°С, -20°С, -40°С, -80°С) с использованием комбинированных недорогостоящих консервантов, включающих проникающие и непроникающие протекторы в низко токсичных концентрациях, позволяет исключить контроль скорости замораживания и процедуру отмывания консервантов от клеток, что способствует снижению экономических затрат на реализацию указанной технологии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Предложены новые экономически выгодные методы криоконсервирования лейкоцитов крови человека в электрических морозильниках под защитой комбинированных криозащитных растворов, обеспечивающих высокую сохранность морфологических и функциональных свойств клеток. Рекомендуются в качестве альтернативы замораживанию биообъектов в жидком азоте.

2. Для сохранности лейкоцитов при температуре -10°С в течение 7 суток клетки смешивают в соотношении 1:1 в контейнере с незамерзающим свежеприготовленным криозащитным раствором, включающем в себя глицерин (в исходной концентрации 7%), желатин со средней молекулярной массой 16 000 (7,5%) и водорастворимый антиоксидант ОМЭПС (0,3%). Ориентировочная стоимость 1 литра раствора составляет 1381 руб. Смесь выдерживают 20 минут при комнатной температуре и помещают для охлаждения и последующего хранения в заполненную антифризом - этиловым спиртом (50°) охлажденную до -10°С емкость электрического морозильника. Размораживание клеток производят покачиванием контейнера в емкости с водой, нагретой до +38°С до температуры биообъекта +2...+4єС. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 2-3 сек.

3. Для консервирования лейкоцитов при -20°С в течение 21 суток клетки смешивают (1:1) с криозащитным раствором, содержащем ГМБТОЭМ (28%) и антиоксидант ОМЭПС (0,2%), и выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Ориентировочная стоимость 1 литра раствора составляет 917 руб. Биообъект на 10 мин для замораживания помещают в охлажденную до -20°С емкость с этиловым спиртом (96°) электрического морозильника, после чего переносят в воздушную камеру для последующего хранения. Размораживание клеток производят покачиванием контейнера в водяной ванне, нагретой до +38°С до температуры биообъекта +2...+4єС. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 40 сек.

4. Для эффективного консервирования лейкоцитов при -40°С в течение 30 суток клетки смешивают (1:1) с криозащитным раствором, содержащем ГМБТОЭМ (30%), антигипоксант фумарат натрия (2,8%) и лимонную кислоту (0,06%), и выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Ориентировочная стоимость 1 литра раствора составляет 346 руб. Для замораживания смесь помещают на 15 мин в охлажденную до -28°С емкость с этиловым спиртом (96°) электрического морозильника, после чего переносят для дальнейшего замораживания и хранения в воздушную камеру электрического морозильника на -40°С. Размораживание клеток производят покачиванием контейнера в водяной ванне, нагретой до +38°С до температуры биообъекта +2...+4єС. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 45 сек.

5. При низкотемпературном (-80°С) консервировании лейкоцитов в течение 180 суток клетки смешивают в соотношении 1:1 в контейнере со свежеприготовленным криозащитным раствором, включающем в себя ДМСО (8%), ГМБТОЭМ (22%) и ОМЭПС (0,2%). Ориентировочная стоимость 1 литра раствора составляет 1366 руб. Смесь выдерживают 20 минут при комнатной температуре и помещают для замораживания смесь помещают на 15 мин в охлажденную до -28°С емкость с этиловым спиртом (96°) электрического морозильника, после чего переносят для дальнейшего замораживания и хранения в воздушную камеру электрического морозильника на -40°С. Размораживание клеток производят покачиванием контейнера в водяной ванне, нагретой до +38°С до температуры биообъекта +2...+4єС. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 45 сек.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Сведенцов Е.П., Туманова (Полежаева) Т.В., Якшина С.А., Утемов С.В., Костяев А.А., Карпов Д.А. Способ введения лейкоцитов крови человека в холодовой анабиоз при -500С // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т.136. №11. С.594-597.

2. Сведенцов Е.П., Щеглова О.О., Туманова (Полежаева) Т.В., Деветьярова О.Н., Костяев А.А., Утемов С.В. Фагоцитарная активность нейтрофилов и лимфоцитов после различных сроков хранения в состоянии холодового анабиоза (-400С) // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004. Т.138. №10. С.400-402.

Svedentsov E.P., Shcheglova O.O., Tumanova (Polezhaeva) T.V., Devet,yarova, Kostyaev A.A, Utemov S.V. Phagocytic activity of neutrophils and lymphocytes at various periods of storage in the state of cold anabiosis (-40°C) // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2004. №10. P.354-356.

3. Сведенцов Е.П., Деветьярова О.Н., Туманова (Полежаева) Т.В., Щеглова О.О., Костяев А.А., Утемов С.В. Введение лейкоцитов в холодовой анабиоз (-200С) по экспоненциальной программе // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2005. №3. С.558-566.

4. Сведенцов Е.П., Туманова (Полежаева) Т.В., Щеглова О.О., Деветьярова О.Н. Изучение устойчивости лимфоцитов к холодовому анабиозу разной глубины // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Т.142. №8. С.142-144.

Svedentsov E.P., Tumanova (Polezhaeva) T.V., Shcheglova O.O., Devet,yarova O.N. Lymphocyte resistance to cold anabiosis of different degree // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2006. Vol.142, №2. P.179-181.

5. Сведенцов Е.П., Степанова Е.С., Туманова (Полежаева) Т.В., Зайцева О.О., Соломина О.Н. Применение препаратов на основе желатина при создании ограждающего раствора для консервирования лейкоцитов при температуре переохлаждения // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. Т.144. №10. С.445-447.

Svedentsov E.P., Stepanova E.S., Tumanova (Polezhaeva) T.V., Zaitseva O.O., Solomina O.N. Creation of a gelatin-based solution fot preservation of leukocytes // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2007. Vol.144, №4. P.563-565.

6. Сведенцов Е.П., Туманова (Полежаева) Т.В., Худяков А.Н., Зайцева О.О., Соломина О.Н., Утемов С.В., Шерстнев Ф.С. Сохранение биологических мембран ядерных клеток крови при температуре -800С // Биологические мембраны. 2008. Т.25. №1. С.23-29.

Svedentsov E.P., Tumanova (Polezhaeva) T.V., Khudyakov A.N., Zaytseva O.O., Solomina O.N., Utemov S.V., Sherstnev F.S. Cryopreservation of Functionally Active Blood Nuclear Cell Membranes at -80єC // Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2008, V.2., № 1. Р. 19-25.

7. Сведенцов Е.П., Туманова (Полежаева) Т.В., Оводова Р.Г., Головченко В.В., Зайцева О.О., Соломина О.Н., Степанова Е.С., Оводов Ю.С. Криозащитное действие лемнана, пектина ряски малой // Доклады академии наук. 2008. Т.421. №4. С. 559-561.

Svedentsov E.P., Tumanova (Polezhaeva) T.V., Ovodova R.G., Golovchenko V.V., Zaytseva O.O., Solomina O.N., Stepanova E.S., Ovodov Yu.S. Cryoprotective action of lemnan, a pectin from the duckweed Lemna minor // Doklady Biological Sciences. 2008. Vol.421, №4. P.233-234.

8. Сведенцов Е.П., Зайцева О.О., Туманова (Полежаева) Т.В., Соломина О.Н., А.Н. Худяков. Применение холинхлорида для консервирования (-40°С) лейкоцитов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. Т.148. № 9. С. 353-355.

Svedentsov E.P., Zaytseva O.O., Tumanova (Polezhaeva) T.V., Solomina O.N., Khudyakov A.N. Use of choline chloride for leukocytes cryopreservation (-40°C) // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2009. Vol.148, № 3. Р. 461-463.

9. Соломина О.Н., Сведенцов Е.П., Зайцева О.О., Полежаева Т.В., Оводова Р.Г., Головченко В.В., Лаптев Д.С., Худяков А.Н., Степанова Е.С., Оводов Ю.С. Криопротекторные свойства ряда пектинов // Доклады академии наук. 2010. Т. 430. № 4. С. 559-561.

Solomina O.N., Svedentsov E.P., Zaitseva O.O., Polezhaeva T.V., Ovodova R.G., Golovchenko V.V., Laptev D.S., Khudyakov A.N., Stepanova E.S., Ovodov Y.S. Cryoprotective properties of some pectins // Doklady Biological Sciences. 2010. Vol.430, №1. P.20-22.

10. Сведенцов Е.П., Лаптев Д.С., Полежаева Т.В., Зайцева О.О., Худяков А.Н., Соломина О.Н. Сохранение лейкоцитов в условиях умеренно-низких температур // Физиология человека. 2012. Т.38, №5. С.1-5.

Svedentsov E.P., Laptev D.S., Polezhaeva T.V., Zaitseva O.O., Khudyakov A.N. and Solomina O.N. Preservation of leukocytes at moderately low temperatures // Human Physiology. 2012. Vol.38, №5. Р.560-563.

Статьи в зарубежных научных изданиях

1. Svedentsov E.P., Stepanova E.S., Tumanova (Polezhaeva) T.V., Shcheglova O.O., Devetyarova O.N., Utyomov S.V. Еffect of cryohypobiosis on concervation of human blood leukocytes // J. Cryoletters. 2005. Vol.26, N6. Р.387-394.

2. Svedentsov E.P., Tumanova (Polezhaeva) T.V., Shcheglova O.O., Devetyarova O.N., Stepanova E.S. Freezing leukocytes to -400C and -200C under an exponential programme with original cryopreservatives // International Journal of Refrigeration. 2006. V.29. Р.369-373.

3. Svedentsov E.P., Tumanova (Polezhaeva) T.V., Zaytseva O.O., Solomina O.N., Utemov S.V. Preservation of leukocytes in conditions of cryoanabiosis // Cell Preservation Technology. 2007. V.5, №3. Р.144-149.

Монография

Сведенцов Е.П., Туманова (Полежаева) Т.В. Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из криоанабиоза. - Екатеринбург: УрО РАН, 2007 - 81 с.

Патенты

1. Пат.2184449 Российская федерация. RU 21844449 С1. Криозащитный раствор для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре / Сведенцов Е.П., Туманова (Полежаева)Т.В., Хомякова С.А., Утемов С.В., Костяев А.А., Семенов А.Н., заявители и патентообладатели: Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН, Кировский НИИ гематологии и переливания крови. - №2001110726; заявл. 18.04.2001; опубл.10.07.2002; Бюл. №19.

2. Пат.2240000 Российская федерация. RU 2240000 С2. Хладоограждающий раствор для замораживания лейкоцитов при субумеренно-низкой температуре / Сведенцов Е.П., Туманова (Полежаева) Т.В., Деветьярова О.Н., Утемов С.В., Костяев А.А., Щеглова О.О., заявители и патентообладатели: Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН, Кировский НИИ гематологии и переливания крови. - №2002132652; заявл. 04.12.2002; опубл. 20.11.2004; Бюл. №32.

3. Пат.2261595 Российская федерация. RU 2 261 595 С1. Протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С / Сведенцов Е.П., Туманова (Полежаева) Т.В., Камышева Е.С., Костяев А.А., Утемов С.В., Деветьярова О.Н., Щеглова О.О., заявители и патентообладатели: Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН, Кировский НИИ гематологии и переливания крови. - №2004101597/15; заявл.1901.2004; опубл. 10.10.2005; Бюл. №28.

4. Пат.2290808 Российская федерация. RU 2 290 808 С2. Криопротекторный раствор для замораживания лейкоцитов при низкой температуре / Сведенцов Е.П., Туманова (Полежаева) Т.В., Деветьярова О.Н., Щеглова О.О., Утемов С.В., Костяев А.А., заявители и патентообладатели: Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН, Кировский НИИ гематологии и переливания крови. - №2004135631/15; заявл. 06.12.2004; опубл. 10.01.2007; Бюл. №1.

5. Пат 2301524 Российская федерация. RU 2301524 С1. Криоконсервант для лейкоцитов / Сведенцов Е.П., Туманова (Полежаева) Т.В., Оводова Р.Г., Оводов Ю. С., Головченко В.В., Соломина О.Н., Щеглова О.О., Утемов С.В., Костяев А.А., заявители и патентообладатели: Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН, Кировский НИИ гематологии и переливания крови. - №2006101031/15; заявл. 10.01.2006; опубл. 27.06.2007; Бюл. №18.

6. Пат 2439877 Российская федерация. RU 2 439 877 С2. Криопротекторный раствор для консервирования лейкоцитов при умеренно-низкой температуре (-400С) / Сведенцов Е.П., Полежаева Т.В., Лаптев Д.С.. Соломина О.Н., Зайцева О.О., Худяков А.Н., Утемов С.В., Шерстнев Ф.С., заявители и патентообладатели: Учреждение РАН Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН, ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Федерального медико-биол. агентства». - №2009147672/21; заявл. 21.12.2009; опубл. 20.01.2012; Бюл. №2.

Автор выражает глубокую признательность научному консультанту доктору медицинских наук профессору Евгению Павловичу Сведенцову за ценные рекомендации и отеческую поддержку при выполнении данной работы. Автор искренне благодарит за помощь в проведении исследований сотрудников лаборатории криофизиологии крови ФГБУН Института физиологии Коми НЦ УрО РАН к.б.н. О.О.Зайцеву, к.б.н. О.Н.Соломину, к.б.н. А.Н.Худякова, к.б.н. Е.С.Степанову, к.б.н. Д.С.Лаптева, Г.А.Никулину и сотрудников лаборатории консервирования крови и тканей ФГБУН Кировского НИИ гематологии и переливания крови д.м.н. А.Н.Костяева, к.м.н. С.В.Утемова, Н.Л.Ежову.

Автор выражает благодарность Российскому фонду фундаментальных исследований за оказанную финансовую поддержку (грант №08-04-01423) при выполнении раздела данной работы.

Размещено на Allbest.ru