Строгие постулаты Коха

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Согласно Львову, «организм - некая независимая единица интегрированных и взаимосвязанных структур и функций». У простейших, то есть у одноклеточных именно клетка является независимой единицей, иными словами, организмом. И клеточные организмы - митохондрии, хромосомы и хлоропласты - это не организмы, ибо они не являются независимыми. Получается, что если следовать определению, данным Львовым, вирусы не являются организмами, так как не обладают независимостью: для выращивания и репликации генетического материала нужна живая клетка.

В то же время, у многоклеточных видов независимо от того, животные или растения, отдельные линии клеток не могут эволюционировать независимо друг от друга; следовательно, их клетки не являются организмами. Для того чтобы изменение было эволюционно значимым, оно должно быть передано новому поколению индивидуумов. В соответствии с этим рассуждением организм представляет собой элементарную единицу некоторого непрерывного ряда со своей индивидуальной эволюционной историей.

Вирус обретает относительно независимую эволюционную историю благодаря его способности к адаптации в направлении, ведущим к приобретению им способности передаваться от хозяина к хозяину. Он может пережить клетку или организм, в которых паразитирует; фактически вирус часто «эксплуатирует» клетку. Один вирус может встречаться в разных видах, родах и типах и также один и тот же вирус может передаваться от растений насекомым и размножаться в клетках тех и других. Вирус, обладающий соответствующей приспособляемостью, может использовать разнообразные эволюционные ниши. Таким образом, вирус, конечно, обладает большей независимостью, чем любая клеточная органелла. То есть, в эволюционном плане вирус в большей степени организм, чем хромосома или даже клетка многоклеточного животного, хотя функционально он значительно менее независим, чем любая такая клетка.

И в то же время, можно рассматривать данную проблему с точки зрения другого определения: материал является живым если, будучи изолированным, он сохраняет свою специфическую конфигурацию так, что эта конфигурация может быть реинтегрирована, то есть вновь включена в цикл, в котором участвует генетическое вещество: это отождествляет жизнь с наличием независимого специфического самореплицирующегося способа организации. Специфическая последовательность оснований нуклеиновой кислоты того или иного гена может копироваться; ген - это некая часть запасов информации, которой располагает живой организм. В качестве теста на живое данное выше определение предлагает воспроизведение в различных клеточных линиях и в ряде поколей организмов. Вирус, согласно этому тесту, живой точно так же, как и любой другой фрагмент генетического материала, что его можно извлечь из клетки, вновь ввести в живую клетку и что при этом он будет копироваться в ней и станет хотя бы на некоторое время часть ее наследственного аппарата. При этом передача вирусного генома составляет основной смысл существования этих форм - результат их специализации в процессе отбора. Поэтому специализированность вирусов как переносчиков нуклеиновых кислот дает возможность считать вирусы «более живыми», чем какие либо фрагменты генетического материала, и «более организмами», чем любые клеточные органеллы, включая хромосомы и гены.

Строгие постулаты Коха

Каковы же те основные положения, сформулированные Робертом Кохом (1843-1910), которых должен придерживаться микробиолог при каждом обнаружении неизвестного возбудителя? Что может служить доказательством, что именно он является причиной данного инфекционного заболевания? Вот эти три критерия:

Неоднократное получение чистой культуры возбудителя, взятого из организма больного.

Возникновение точно такого же или сходного заболевания (как по характеру течения, так и по вызываемым им патологическим изменениям) при инфицировании здорового организма культурой предполагаемого возбудителя.

Появление в организме человека или животного после их заражения данным возбудителем всегда одних и тех же специфических защитных веществ. При контакте иммунной сыворотки крови с возбудителем из культуры последний должен терять свои патогенные свойства.

Для современной вирусологии характерно бурное развитие и широкое применение самых различных методик - как биологических (включая генетические), так и физико-химических.. Они используются при установлении новых, до сих пор еще неизвестных вирусов, и при изучении биологических свойств и строения уже обнаруженных видов.

Фундаментальные теоретические исследования дают обычно важные сведения, которые используются в медицине, в области диагностики или при глубоком анализе процессов вирусной инфекции. Введение новых действенных методов вирусологии связано, как правило, с выдающимися открытиями.

Так, например, метод выращивания вирусов в развивающемся курином эмбрионе, впервые примененный А.М. Вудрофом и Е.Дж. Гудпэсчуром в 1931 году, был с исключительным успехом использован при изучении вируса гриппа.

Прогресс физико-химических методов, в частности метода центрифугирования, привел в 1935 году к возможности кристалмуации вируса табачной мозаики (ВТМ) из сока больных растений, а в последствии и к установлению входящих в его состав белков. Этим был дан первый толчок к изучению строения и биохимии вирусов.

В 1939 году А.В. Арден и Г. Руска впервые применили для изучения вирусов электронный микроскоп. Введение этого аппарата в практику означало исторический перелом в вирусологических исследованиях, поскольку появилась возможность увидеть - хотя в те годы еще и недостаточно четко - отдельные частицы вируса, вирионы.

В 1941 году Г. Херст установил, что вирус гриппа при известных условиях вызывает агглютинацию (склеивание и выпадение в осадок) красных кровяных телец (эритроцитов). Этим была положена основа для изучения взаимоотношений между поверхностными структурами вируса и эритроцитов, а также для разработки одного из наиболее эффективных методов диагностики.

Коренной перелом и вирусологических исследованиях произошел в 1949 г., когда Дж. Эндерсу, Т. Уэллеру и Ф. Роббинсу удалось размножить вирус полиомиелита в клетках кожи и мышц человеческого зародыша. Они добились разрастания кусочков ткани на искусственной питательной среде. Клеточные (тканевые) культуры были инфицированы вирусом полиомиелита, который до этого изучали исключительно на обезьянах и лишь очень редко на особом виде крыс.

Вирус в человеческих клетках, выращенных вне материнского организма, хорошо размножался и вызывал характерные патологические изменения. Метод культуры клеток (длительное сохранение и выращивание в искусственных питательных средах клеток, выделенных из организма человека и животных) был впоследствии усовершенствован и упрощен многими исследователями и стал, наконец, одним из наиболее важных и результативных для культивирования вирусов. Благодаря этому более доступному и дешевому методу появилась возможность получать вирусы в относительно чистом виде, чего нельзя было достичь в суспензиях из органов погибших животных. Введение нового метода означало несомненный прогресс не только в диагностике вирусных заболеваний, но и в получении прививочных вакцин. Он дал также неплохие результаты и в биологических и биохимических исследованиях вирусов.

В 1956 году удалось показать, что носителем инфекционности вируса является содержащаяся в нем нуклеиновая кислота. А в 1957 году А.Айзекс и Дж. Линдеман открыли интерферон, который позволил объяснить многие биологические явления, наблюдаемые в отношениях между вирусом и клеткой - хозяином или организмом - хозяином.

С. Бреннер и Д. Хорн ввели в технику электронной микроскопии метод негативного контрастного окрашивания, сделавший возможным изучение тонкого строения вирусов, в частности их структурных элементов (субъединиц).

В 1964 году уже упоминавшийся нами ранее американский вирусолог Гайдузек с сотрудниками доказал инфекционный характер ряда хронических заболеваний центральной нервной системы человека и животных. Он изучал недавно обнаруженные своеобразные вирусы, лишь в некоторых чертах схожие с ранее известными.

В то же время американский генетик Барух Бламберг обнаруживает (в процессе генетических исследований белков крови) антиген сывороточного гепатита (австралийский антиген), вещество, идентифицируемое при помощи серологических тестов. Этому антигену суждено было сыграть большую роль в вирусологических исследованиях гепатита.

В последние годы одним из крупнейших успехов вирусологии можно считать раскрытие некоторых молекулярно-биологических механизмов превращения нормальных клеток в опухолевые. Не меньшие успехи были достигнуты и в области изучения строения вирусов и их генетики.

Инфекционная единица

Наименьшее количество вируса, способное в данном опыте вызвать инфекцию, называется инфекционной единицей.

Для ее определения применяются обычно два метода. Первый основан на определении 50 %-ной летальной дозы, которая обозначается LD 50 (от лат. Letatis - смертельная, dosis - доза). Второй метод устанавливает число инфекционных единиц по числу бляшек, образовавшихся в культуре клеток.

Что, в сущности, представляет собой величина LD 50 и как она определяется? Исследуемый вирусный материал разводится в соответствии со снижающимися степенями концентрации, скажем кратными десяти: 1:10; 1:100; 1:1000 и т.д. Каждым из растворов с указанными концентрациями вируса инфицируют группу животных (десять индивидуумов) или культуру клеток в пробирках. Потом наблюдают гибель животных или изменения, происшедшие в культуре под влиянием вируса. Статистическим методом определяется степень концентрации, способная умертвить 50 % животных из числа зараженных исходным материалом. При использовании культуры клеток следует найти такую дозу вируса, которая производит губительное действие на 50 % инфицированных ею культур. В этом случае употребляется сокращение ЦПД 50 (цитопатическая доза). Иначе говоря, речь идет о такой дозе вируса, которая вызывает повреждение или гибель половины инфицированных ею культур.

Методом бляшек нельзя получить статистические данные, но можно установить фактическое число единиц вируса в материале, дающем бляшки в культуре клеток. В идеальном случае такая единица отвечает одной функционально полноценной частице.

Титрование

вирус белок генетический фаг

Индуцируемая вирусом реакция может происходить по типу «все или ничего» (то есть наличие или отсутствие инфекции), а может быть выражена количественно, например продолжительностью времени, необходимого проявления инфекции, или числом поражений в слое чувствительных клеток. Количественное определение вирусной активности называется титрованием. Титр исходной вирусной суспензии выражается числом инфекционных единиц, приходящихся на единицу объема. Инфекционные нуклеиновые кислоты, независимо от того выделены ли они из фагов или из вирусов животных или растений, как правило, обладают значительно меньшим инфекционным титром, чем исходный вирус (то есть отношение числа содержащихся в препарате молекул нуклеиновой кислоты к числу инфекционных единиц значительно больше, чем соответствующие величины для вирионов, из которых эти нуклеиновые кислоты были выделены). Однако и при титровании свободной нуклеиновой кислоты и при титровании вирионов вероятность нахождения в пробе среднего числа частиц выражается одной формулой. Отсюда следует, что вирусную инфекцию может вызвать также и одна молекула вирусной нуклеиновой кислоты. Как правило, инфекционными являются только интактные вирусные ДНК и РНК. Исключение наблюдается при множественном заражении клеток молекулами нуклеиновой кислоты, содержащими неполным геном вируса.

Резюмируя сказанное, можно прийти к выводу, что титр вирусной суспензии, выраженный числом инфекционных единиц, содержащихся в единице объема, как правило, соответствует числу вирионов (или числу молекул вирусной нуклеиновой кислоты), способных при условиях данного опыта вызвать инфекцию.

Утрата инфекционности

Как правило, чувствительность вирионов данного вируса к действию тех или иных инактивирующих веществ определяется специфическими свойствами его белков, вследствие чего методы инактивации инфекционности, разработанные для данного конкретного вируса, эффективны лишь в отношении близкородственных ему вирусов. Исключение составляет чувствительность вирусов к рентгеновским лучам, которая зависит от типа нуклеиновой кислоты вирионов и ее количества. В основе этой закономерности лежит тот факт, что действие рентгеновских лучей приводит к разрыву молекул нуклеиновой кислоты, и даже одного такого разрыва часто бывает достаточно для утраты инфекционного вируса. Результаты экспериментов показывают, что мелкие вирусы инактивируются рентгеновскими лучами значительно эффективнее, так как для них характерна большая величина отношения содержания в вирионе нуклеиновой кислоты к содержанию в нем белка, чем для крупных вирионов, более богатых белком.

Серологические методы

В целях определения вида данного вируса при изучении защитных процессов в организме больного человека или зараженного животного применяются серологические методы. Серология (от лат. Serum - сыворотка, жидкая составная часть крови) - это раздел иммунологии, изучающий реакции антигена специфическими защитными веществами, антителами, которые находятся в сыворотке крови. Антитела нейтрализуют действие вируса. Они связываются с определенными антигенными веществами, находящимися на поверхности вирусных частиц. В результате связывания молекул антител с поверхностной структурой вируса последний теряет свои патогенные свойства. Для установления уровня (количества) антител в сыворотке или определения типа данного вируса проводится реакция нейтрализации вируса. Ее можно проводить как на животных, так и на культуре клеток.

Минимальную концентрацию сыворотки, содержащей антитела, достаточную для того, чтобы нейтрализовать вирус, не дать ему проявить цитопатическое действие, называют титром сыворотки, нейтрализующей вирус. Эта концентрация может быть выявлена и с помощью метода бляшек.

Для обнаружения антител используется метод торможения гемагглютинации (склеивания эритроцитов под воздействием вируса) и метод связывания комплемента. Из методов, применяемых в вирусологии для различных исследовательских целей, можно еще упомянуть методы, при помощи которых вирусологический материал подготавливается для физических и химических анализов, которые облегчают изучение тонкого строения и состава вирусов. Эти анализы требуют большого количества совершенно чистого вируса. Очистка вируса - процесс, при котором из суспензии с вирусом устраняются все посторонние, загрязняющие ее частицы. В основном это кусочки и «обломки» клеток - хозяев. Одновременно с очисткой происходит обычно сгущение суспензии, повышение концентрации вируса. Так получается исходный материал для многих исследований.

Из отдельных методов очистки упомянем лишь наиболее эффективный - метод ультрацентрифугирования, который дает препараты вируса очень высокой концентрации.

Опишем вкратце процедуру получения и очистки вирусной суспензии. Процесс этот начинается с искусственного введения вируса в мозг подопытного животного. По прошествии нескольких дней вирус размножится в ткани мозга. При этом обнаружатся характерные нарушения функций нервной системы «хозяина», и у животного выявятся признаки заболевания. Когда симптомы достигнут наибольшего развития, зверька умерщвляют, а его мозг, в тканях которого содержатся большие количества вируса, извлекают в стерильных условиях из черепа животного. Затем из мозга готовится, скажем,10 %-ная суспензия. Кроме вирионов она содержит еще и большое количество кусочков нервной ткани, остатки кровеносных сосудов, кровяные тельца и другие биологические компоненты. Кусочки ткани и другие крупные частицы устраняются первым центрифугированием со скоростью 5000-10000 оборотов в минуту. Оно продолжается около получаса. Жидкость над осадком (суперкатакт) осторожно сливают в специальные пробирки для центрифугирования, сделанные из пластмассы или нержавеющей стали, поскольку стекло не выдерживает давление, которое развивается при высокоскоростном центрифугировании. А осадок обезвреживают дезинфицирующими средствами. Слитый «супернатант» обрабатывается затем уже в ультрацентрифуге.

Для седиментации мельчайших вирусов необходимо многочасовое ультрацентрифугирование, причем полученный осадок часто бывает не больше булавочной головки. Но и после такой обработки мы имеем не совсем чистый вирусный материал, в нем еще содержатся чужеродные примеси. Для тонких анализов этот осадок надо несколько раз обработать различными реактивами и повторить ультрацентрифугирование. Только тогда можно получить концентрированную суспензию вируса высокой чистоты, которая требуется для точных и достоверных биохимических, кристаллографических анализов или для наблюдений в электронно-оптических приборах.

В распоряжении вирусологов вообще много различных технических приспособлений, как, например, центрифугирование по градиентам концентрации, когда вирионы разделяются по степеням концентрации или по форме. Другой прибор, представляющий в наше время стандартное оборудование почти каждой научно-исследовательской вирусологической лаборатории - электронный микроскоп. Это дорогостоящий, большой и сложный аппарат.

Для получения изображения вирусов существует много различных методов, и все они прошли свои этапы развития. Чтобы обнаружить вирионы в клетках, в настоящее время пользуются методом ультратонких срезов Фиксированный материал, залитый эпоксидной смолой, разрезается тончайшим стеклянным или алмазным ножом. При помощи точных ультрамикротомов одну клетку можно разрезать более чем на тысячу тонких срезов. Полученные таким образом срезы обрабатываются затем специальными химикалиями, что обеспечивает лучшую их видимость.

Для наблюдения тонкого строения отдельных вирионов применяется метод негативного контрастирования (окрашивания), внедрение которого значительно повысило качественный уровень электронного микроскопирования. Вирусные частицы при этом осторожно смешиваются с раствором фосфовольфрамовой кислоты, дающей осадок, не пропускающий электронные лучи. В результате вирионы предстают в виде своих совершенно точных отпечатков, по которым можно изучать самые тонкие детали их поверхностей. При методе позитивного окрашивания (или «металлизирования» препарата) применяются такие вещества, которые способны выборочно прилипать к поверхности вирионов (например, специфические антитела, меченные ферритином, содержащим в своей молекуле железо и потому хорошо различимые в электронном микроскопе).

Общие методы изучения вирусов

О присутствии вируса в организме как при спонтанном заболевании, так и при экспериментальном заражении хозяина судят по появлению тех или иных патологических симптомов. Всякий раз, когда возникает подозрение о присутствии вируса в изучаемом объекте, приходится подбирать определенный комплекс условий - подходящий организм и соответствующий способ заражения, - при котором вирус вызывает в зараженном организме распознаваемые изменения. Так что вирусологам приходится затрачивать большие усилия на разработку методов получения экспериментальных инфекций.

Как известно, для доказательства того,что данное заболевание действительно вызывается определенным микроорганизмом, необходимо выполнить так называемые постулаты Коха: 1) показать, что данный микроорганизм регулярно обнаруживается в больном организме; 2) получить культуру этого микроорганизма на искусственной питательной среде; 3) воспроизвести данное заболевание заражением экспериментального животного выделенной культурой и, наконец,;4) повторно выделить данный микроорганизм, но теперь уже из организма искусственно зараженного хозяина. Те же постулаты mutatis mutandis справедливы и для диагностики вирусных заболеваний. В этом случае, согласно Риверсу, постулаты формируются следующим образом: 1) выделение вируса из организма больного, 2) культивирование вируса в организме или в клетках экспериментального животного, 3) доказательство фильтруемости инфекционного агента (чтобы исключить патогенные агенты большего размера, например бактерии), 4) воспроизведение подобного заболевания у другого представителя данного или родственного вида и, наконец, 5) повторное выделение того же вируса.

Культивирование и идентификация вирусов - основные вирусологические методы, используемые в практической вирусологии при диагностике вирусных заболеваний. Материал, в котором подозревается наличие вируса, например лизат бактерий, кусочек ткани или биологическая жидкость, при необходимости измельчают или гомогенезируют с тем, чтобы при контролируемых условиях перевести его в суспензированное состояние.

Большие фрагменты клеток, а также возможные загрязняющие материал микроорганизмы удаляют при помощи центрифугирования и фильтрования. Такую очищенную суспензию вводят подходящему хозяину, либо добавляют к суспензии клеток, либо наносят на монослой соответствующих клеток. В результате в слое чувствительных клеток, таких, как бактерии, растущие в чашке с агаром, или клетки животных, растущие на поверхности стекла, могут появиться локальные поражения, так называемые бляшки, которые характерны для данного вируса.. Бляшки образуются в результате заражения расположенных в данной области клеток, размножения в них вируса и их полного или частичного лизиса. Если размножение вируса не ведет к образованию визуально выявляемых дискретных бляшек, вирус может быть обнаружен и охарактеризован по изменениям, вызываемым им в культуре клеток, или по повреждению слоя клеток либо при помощи других тестов.

Если исследуемый материал не наносят на слой культивируемых клеток, а вводят в организм хозяина, то цель эксперимента - выявление общих реакций организма, свидетельствующих о развитии инфекции: появление симптомов заболевания, гибель животного или какие-либо иные специфические реакции, например образование антител.

Наконец, если ни заражение культуры клеток, ни введение материала в организм хозяина не ведут к появлению каких-либо симптомов вирусной инфекции, вирусологи прибегают к так называемым «слепым пассажам», т.е. к повторным переносам исследуемого материала, что часто приводит к повышению вирулентности вируса или к увеличению его титра.

Общий химический состав вирусов

Непременным компонентом вирусной частицы является какая-либо одна из двух нуклеиновых кислот, белок и зольные элементы. Эти три компонента являются общими для всех без исключения вирусов, тогда как остальные двалипоиды и углеводы - входят в состав далеко не всех вирусов.

Вирусы, состоящие только из белка нуклеиновой кислоты и зольных элементов, чаще всего принадлежат к группе простых, так называемых минимальных, вирусов, лишенных дифференциации, собственных ферментов или каких-либо специализированных структур. К такого рода вирусам принадлежат вирусы растений, некоторые вирусы животных и насекомых. В то же время практически все бактериофаги, которые по химическому составу, безусловно принадлежат к группе минимальных вирусов, на самом деле являются очень сложными и высокодифференцированными структурами. Вирусы, в состав которых наряду с белком и нуклеиновой кислотой входят также липоиды и углеводы, как правило, принадлежат к группе сложно устроенных вирусов. Большая часть вирусов этой группы паразитирует на животных.

Белки вирусов

Аминокислотный состав вирусных белков

Белок всех исследованных до настоящего времени вирусов построен из обычных аминокислот, принадлежащих к естественному L-ряду. D-аминокислот в составе вирусных частиц не найдено. Соотношение аминокислот в вирусных белках достаточно близко к таковому в белках животных, бактерий и растений.

Вирусные белки не содержат обычно большого количества основных аминокислот (аргинина, муцина), т.е. не принадлежат к группе белков типа гистонов и протаминов с ярко выраженными щелочными свойствами. Не учитывая нейтральных аминокислот, можно сказать, что в вирусном белке преобладают кислые дикарбоновые кислоты. Это справедливо как для вирусов с низким содержанием нуклеиновой кислоты, так и для вирусов с высоким содержанием РНК и ДНК.

Вирусная ДНК

Главной структурной особенностью большинства вирусных молекул ДНК, как и ДНК из других источников, является наличие двух спаренных антипараллельных цепей. ДНК-геном вирусов, однако, невелик и поэтому здесь возникают вопросы, касающиеся концов спирали и общей формы молекулы ДНК, а не монотонной, фактически не имеющей концов «средней» части спирали. Полученные ответы оказались весьма удивительными: молекулы вирусных ДНК могут быть линейными или кольцевыми, двухцепочечными или одноцепочечными по всей своей длине или же одно цепочечными только на концах. Кроме того, выяснилось, что большинство нуклеотидных последовательностей в вирусном геноме встречается лишь по одному разу, однако на концах могут находиться повторяющиеся, или избыточные участки.

Из всех описанных до сих пор вирусных ДНК наиболее сложно организована ДНК вируса герпеса. Геном здесь, по-видимому, состоит из двух больших соединенных сегментов, каждый из которых имеет повторяющиеся концевые последовательности. Возможны четыре способа соединения двух таких сегментов конец в конец, и все они как будто бы встречаются в каждом препарате вирионов.

Наибольший из известных вирусов - вирус осповакцины имеет геном размером 15-108 дальтон. ДНК, выделенная из свежего препарата вирионов, по-видимому, имеет поперечные сшивки, так как не разделяется по две цепи. Одна из возможных моделей такой молекулы - гигантская, не подверженная денатурации кольцевая структура, образующаяся при замыкании концов линейной двойной спирали.

Помимо очень интересных различий в форме молекулы и в структуре концевых участков вирусных ДНК существуют также большие различия в величине генома. Среди наименьших «полных» вирусов (т.е. вирусов, способных размножаться в клетке-хозяине) можно назвать фаг X174, парвовирусы, паповирусы, вирусы полиомы и SV40. С другой стороны, у крупных бактериофагов и вирусов человека и животных (паприляр, герпеса и осповакцины) геном значительно больше - от 1 до 1,5.108 дальтон, так что он мог бы кодировать более 100 белков. Действительно, у бактериофага Т4 сейчас идентифицировано больше ста генов.

В 1953 г. Уайетт и Коэн сделали неожиданное открытие, весьма существенное для последующих экспериментов: оказалось, что в ДНК Т-четных бактериофагов содержится не цитозин, а 5-гидроксиметилцитозин. Это отличие дало возможность изучать фаговые ДНК независимо от ДНК хозяина. Были открыты кодируемые фагом ферменты, которые изменяют метаболизм инфицированной клетки, и она начинает синтезировать компоненты, необходимые вирусу. Еще одно биохимическое отличие ДНК бактериофага состоит в том, что к ее гидроксиметилцитозину присоединены остатки глюкозы: последние, видимо, препятствуют прерыванию фаговой ДНК некоторыми ферментами хозяина.

В противоположность этому у вирусов животных ДНК почти не подвергается модификациям. Например, хотя ДНК клеток-хозяев и содержит много метилированных оснований, у вирусов имеется в лучшем случае лишь несколько метильных групп на геном. Большинство вирусных дезоксинуклеотидов не модифицированы, и поэтому нахождение несомненных модификаций представляло бы большой интерес.

Вирусная РНК

Исследования вирусной РНК составили один из самых значительных вкладов вирусологии в молекулярную биологию. Тот факт, что у вирусов растений реплицируемая генетическая система состоит только из РНК, ясно показал, что и РНК способна сохранять генетическую информацию. Была установлена инфекционность РНК вируса табачной мозаики, и выяснилось, что для инфекции необходима вся ее молекула; это означало, что интактность структуры высокомолекулярной РНК существенно для ее активности. Не менее важным результатом ранних исследований на том же вирусе явилась разработка методом выделения высокомолекулярной РНК и изучения ее свойств. Эти методы послужили в дальнейшем основой для изучения различных типов РНК, встречающихся у других вирусов.

Размеры вирионов РНК - вирусов сильно варьируют - от 7.106 дальтон у пикорнавирусов до >2.108 дальтон у ретровирусов; однако размеры РНК и, следовательно, объем содержащейся в ней информации различаются в значительно меньшей степени.

РНК пикорнавирусов - вероятно, наименьшая из известных - содержит около 7500 нуклеотидов, а РНК парамиксовирусов - едва ли не самая крупная - почти 15000 нуклеотидов. По-видимому, всем независимо реплицирующимся РНК-вирусам нужен какой-то минимум информации для репликационной системы и капсидного белка, но у них отсутствует очень сложная добавочная информация, которой могут обладать крупные ДНК-вирусы.

Матричная РНК (м РНК) - промежуточный носитель генетической информации

Механизм, благодаря которому генетическая информация ДНК «транскрибируется» в матричную РНК, а затем транслируется в белок, выяснился через несколько лет после того, как молекулярные биологи осознали, что нуклеотидные последовательности в ДНК генов прямо ответственны за аминокислотные последовательности белка. Тот факт, что некоторые вирусы растений и животных содержат в качестве генетического материала РНК и что вирусная РНК сама по себе инфекционна, уже говорит о вероятной промежуточной роли РНК в переносе генетической информации. Когда Жакоб и Моно предсказали существование короткоживущего, нестойкого посредника между генами и аппаратом белкового синтеза, поиски молекулы РНК с такими свойствами были уже начаты. Первые указания на наличие фаговой РНК, которая вновь синтезировалась после фаговой инфекции и была ассоциирована с предсуществовавшими бактериальными рибосомами. Окончательное доказательство роли м РНК в синтезе полипептидов было получено в опытах с бесклеточной белок-синтезирующей системой. Экстракты нормальных клеток Е coli могли быть запрограммированы для синтеза специфических белков фага F 2 добавлением РНК из этого фага.

В дальнейшем м РНК была идентифицирована и изучена как в бактериальных, так и в животных клетках. Позже было показано, что многие молекулы м РНК, и вирусные и невирусные, способны программировать синтез специфических белков в самых разных клеточных экстрактах. Это подтверждало, что специфичность синтеза белка в различных системах зависит от м РНК, а не от системы, синтезирующей белок. Во всех клетках первым этапом экспрессии генов оказалась «транскрипция» ДНК с образованием соответствующей м РНК.

Углеводы

Четверым компонентом, обнаруживаемым иногда в очищенных вирусных препаратах, являются углеводы (в количестве, превышающем содержание сахара в нуклеиновой кислоте). Глюкоза и гентибиоза, обнаруживаемая в составе Т-четных и некоторых других фагов, - компоненты нуклеиновой кислоты и рассматриваются в разделе, посвященном составу ДНК и РНК. Помимо этих «экстра»-углеводов, в составе бактериофагов могут быть и другие полисахариды. Единственная группа вирусов, в которой наличие углеводов точно доказано, - вирусы животных, хотя различные авторы приводят весьма противоречивые данные как о количественном, так и о качественном составе их углеводного компонента. В составе элементарных телец вируса гриппа и классической чумы птиц находятся до 17 % углеводов.

Ферменты вирусов

Аспекты проблемы

Термин «ферменты вирусов» может употребляться в узком и широком смысле слова. В первом случае имеется в виду ферментативная активность, связанная с покоящимися вирусными частицами, с вирусом внеклеточным. Широкое толкование этого термина обозначает всю совокупность ферментных систем, принимающих участие в синтезе вируса в зараженной клетке, т.е. ферменты размножающегося внутриклеточного вируса.

Было доказано, что присутствие в вирусных препаратах одного фермента представляет собой достаточно редкий феномен, установленный в настоящее время с полной достоверностью для лизоцимной и фосфатозной активностей бактериофагов и нейтраминидазной активности миксовирусов. Во всех остальных случаях либо не было получено убедительных доказательств собственно вирусного происхождения определяемого фермента, либо, наоборот, твердо доказано происхождение активности фермента от клеточных загрязнений.

Компоненты вирионов, не относящиеся к нуклеиновым кислотам и белкам

Наиболее важный из таких компонентов мы уже упоминали это двойной слой липидов, образующий основную массу наружной оболочки у тех вирусов у которых она имеется. Полагают, что липиды оболочек просто заимствуются из плазматической мембраны клетки-хозяина и поэтому, строго говоря, не могут считаться «вирус-специфическими». Действительно, парамиксовирусы, размножающиеся в различных клетках, могут содержать и соответственно разные липиды. Поэтому специфика вирусной оболочки зависит от вирусных гликопротеидов, находящихся на ее поверхности. Высокоочищенные препараты вирионов содержат ряд низкомолекулярных компонентов, функция которых в некоторых случаях понятна. У бактериофагов и вирусов животных и растений обнаружены полиамины. Возможно, что их единственная физиологическая функция состоит в нейтрализации отрицательного заряда нуклеиновой кислоты. Например, вирус герпеса содержит достаточно спермина, чтобы нейтрализовать половинку вирусной ДНК, а в вирусной оболочке, кроме того, присутствует спермидин.

В состав некоторых вирусов растений ( морщинистости турнепса, крапчатости фасоли, табачной мозаики) входит бис (3-аминопропил) амин. Полагают, что этот полиамин, подобно полиаминам фагов нейтрализует заряды вирусной РНК; поскольку он не был обнаружен в здоровых листьях, возможно, что он синтезируется только в зараженных клетках.

Типы организации вирионов

Основным структурным компонентом вириона является капсид, в котором заключена нуклеиновая кислота. Капсиды построены из белковых субъединиц, собранных строго определенным образом в соответствии с относительно простыми геометрическими принципами. Именно поэтому капсиды совершенно различных вирусов, например фагов, вирусов животных или вирусов растений, могут быть построены точно по одному плану и быть практически неразличимыми морфологически.

Крик и Уотсон, исходя из того, что содержащаяся в нуклеиновой кислоте вируса генетическая информация недостаточна для того чтобы вирус мог кодировать множество различных белков, пришли к выводу, что капсиды вирусов должны быть построены из множества идентичных субъединиц. Существуют два типа организации, при которой идентичные асимметричные субъединицы, такие, как молекулы белка, могут соединиться друг с другом с образованием правильного капсида: спиральная сборка и формирование замкнутых белковых оболочек. Соответственно существуют лишь два типа капсидов: спиральные и изометрические (или квазисферические); капсиды всех вирусов относятся к одной из этих двух категорий. Каждый из этих типов структур образуется белками капсидов в результате процесса, называемого самосборной. Этот процесс идет лишь в том случае,если он энергетически выгоден. Это означает, что из всех возможных форм капсида реализуется именно та, которая отвечает минимуму свободной энергии специфических белков данного вируса. Реальная форма и размеры капсида, таким образом, определяются специфической формой молекул белка, являющихся субъединицами, из которых строится капсид, и характером связей, которые эти субъединицы образуют друг с другом. Стабильность структуры, возникающей в конечном счете, зависит от числа и силы слабых связей, образующихся между белками, входящими в состав данного капсида. Чем больше свободная энергия, выделяющаяся в процессе сборки капсида, тем прочнее собранный капсид.

Спиральные капсиды. Вирионы многих вирусов растений и ряда фагов имеют «голый» спиральный капсид, без внешней оболочки. Наиболее хорошо изученным вирусом данной группы является ВТМ.

Капсиды ВТМ - это относительно жесткие по структуре палочки. Столь же жестки по структуре капсиды по крайней мере еще одного фага. Капсиды других вирусов растений, например вируса желтухи сахарной свеклы и Х-вируса картофеля, тоже представляет собой спиралеобразные палочки, но палочки эти гибкие. Гибки также спиральные капсиды ряда обладающих внешней оболочкой вирусов животных. Гибкость этих палочковидных капсидов свидетельствует о том, что субъединицы, из которых они построены, образуют друг с другом менее прочные и более подвижные связи, чем те, которые образуются между субъединицами палочек типа вирионов ВТМ.

Изометрические (квазисферические) капсиды. Капсиды многих вирусов по форме почти идентичны сфере, однако электронная микроскопия показывает, что на самом деле эти капсиды представляют собой не сферы, а правильные многогранники. Такие капсиды называют изометрическими, так как их линейные размеры вдоль ортогональных осей идентичны.

Сложные капсиды. Серологические и морфологическое исследование капсидов показало, что они представляют собой сложные структуры. При детальном электронно-микроскопическом анализе строения капсидов на их поверхности части удается обнаружить выступы, иначе называемые шипами, которые обычно расположены на каждой из 12 вершин икосаэдра. Эти шипы играют важную роль в инициации инфекции. В литературе описан «волосатый» фаг, у которого от поверхности головки вириона отходят многочисленные фибриллы.

У самых крупных фагов имеются отростки, «хвосты». Эти отростки являются органами, при помощи которых фаги прикрепляются к поверхности бактерии-хозяина. Существует мало биологических объектов, которые были бы более удивительны, чем Т-четные фаги.

Вирионы этих фагов собраны более чем из 50 видов различных белков и обладают высокоорганизованной, изумительно сложной и правильной структурой. Воротничок и базальная пластинка этих фагов обладают гексагональной симметрией. Белковая оболочка их головки представляет собой деформированный икосадельтаэдр с дополнительным рядом субъединиц, вследствие чего в одном направлении она длиннее, чем в других. Гексагональный отросток такого фага каким-то образом присоединен к макушке головки по плану пентагональной симметрии. При сборке фага Т4 иногда образуются вирионы с двумя отростками вместо одного. Многие вирусы животных, некоторые вирусы растений и, по крайней мере,один класс бактериофагов имеют внешнюю оболочку, окружающую их капсиды. Неотъемлемой структурой этих оболочек, как и всех других биологических мембран, является двойной слой фосфолипидов, в который погружены молекулы специфических белков. В тех случаях, когда двойной слой фосфолипидов расположен на поверхности вириона и, следовательно, легко доступен для эфира или других растворителей липидов, вирионы легко разрушаются и интактивируются такими растворителями. Фосфолипиды внешних оболочек вирусов бывают идентичны липидам клетки-хозяина или сходны с ними, что, например, характерно для большинства оболочек вирусов животных, в других случаях наблюдаются достаточно выраженные различия между фосфолипидами. Оболочки вирусов животных формируются в составе плазматической или ядерной мембраны клетки. Электронные микрофотографии зараженных вирусами клеток показывают, что белки вируса появляются на небольших участках плазматической мембраны клетки, к которой в последствии мигрируют капсиды вируса, что, в конечном счете, ведет к формированию вириона и его отпочкованию. Следует, однако, подчеркнуть, что далеко не у всех вирусов животных вирионы имеют квазисферическую форму. Например, вирионы рабдовирусов по форме напоминают пулю; их оболочка, так же как и у других вирусов животных, образуется в результате отпочкования от плазматической мембраны клетки. Оболочки других вирусов, например вируса оспы, построены значительно сложнее и полностью формируются в цитоплазме клетки. Такие вирионы нечувствительны к действию эфира, не дают перекрестных иммунологических реакций с белками клетки-хозяина и, по-видимому, состоят только из компонентов, специфичных для вируса.

Проблемы и методология

Вирусная частица, или вирион, - это инертная статическая форма вируса. Когда вирионы находятся вне клетки, они не размножаются и в них не происходит никаких метаболических процессов. Все динамические события - биосинтез вирусных компонентов, повреждение организма-хозяина - начинаются лишь тогда, когда вирус проникает в клетку. Даже у многоклеточного хозяина решающие события при вирусной инфекции происходят на клеточном уровне. Распространение вируса совершается в результате повторных циклов взаимодействия вируса с клетками и рассеяния вирионов во внеклеточной среде. Все то, что мы уже знали о различных компонентах вирионов, заставляет предполагать, что внутри клетки-хозяина организация этих компонентов должна быть не такой, как в свободной вирусной частице. И действительно, в зараженных вирусом клетках происходит глубокая перестройка вирусного материала, а часто также и компонентов клетки-хозяина. Возникает новая система - комплекс вирус-клетка, функциональная организация, которой определяется взаимодействием вирусных и клеточных функций. Активные механизмы этого комплекса существенно отличаются от механизмов незараженной клетки.

Фазы развития: эллипс, репликация и созревание

С помощью различных методов было обнаружено много разнообразных ситуаций, которые, однако, имеют между собой нечто общее, а именно то, что у каждого вируса взаимодействие с хозяином представляет собой специфическую последовательность событий. Каждый вирус - это организм со своими собственными процессами онтогенеза и морфогенеза, а также со своим филогенетическим прошлым. Однако циклы развития разных вирусов, если их рассматривать в широком плане, имеют ряд общих черт.

После прикрепления вируса в клетке происходит ряд событий, ведущих к освобождению вирусного генетического материала внутри клетки. При этом инфицирующие вирионы перестают существовать как организованные структуры. Так как инфекционность свободной вирусной нуклеиновой кислоты, как правило, намного меньше инфекционности цельного вириона, освобождение вирусного генома и переход его внутрь клетки-хозяина сопровождаются уменьшением или исчезновением инфекционности. Это явление получило название эклипса. Проникновение нуклеиновой кислоты вируса в клетку в процессе ее заражения может происходить различными способами. Например, у фагов, ингецирующих свою ДНК, ориентированным образом через оболочку бактериальной клетки, нуклеиновая кислота освобождается непосредственно у поверхности клетки. Некоторые фаги прикрепляются к жгутикам или ворсинкам бактерий, после чего вводят через эти органеллы свой генетический материал или же используют их для того, чтобы приблизиться к поверхности клетки. Вирусы, обладающие наружной оболочкой, могут сливаться с клеточной мембраной, и в цитоплазму клетки проникает весь внутренний капсид вируса, после чего происходит освобождение вирусного генома. Как только вирусный геном освободится от белка, он может служить источником информации как для репликации, так и для транскрипции, действуя как матрица для биосинтеза соответствующих продуктов. Размножение вирусных геномов идет путем репликации генетического материала, т.е. ДНК или РНК. Репликация ДНК происходит в основном с помощью тех же биохимических механизмов, что и репликация генетического материала клетки. Репликация вирусного ДНК-генома в клетке хозяина возможна, если геном является репликоном, который распознается репликационным аппаратом клеточного или вирусного происхождения. В процессе репликации могут совместно участвовать и клеточные и вирусные ферменты. В некоторых случаях репликация начинается лишь после ряда предварительных этапов и создания особых условий. При вирусной инфекции набор клеточных ферментов может пополняться - иногда за счет ферментов, привносимых в клетку вирионом (вирусы осповакцины, везикулярного стоматита и гриппа, ретровирусы), а иногда - за счет ферментов, вновь синтезируемых как продукты вирусных генов. Последние, в частности, доказано для некоторых фагов, для репродукции которых нужны особые компоненты ДНК. Эти фаги содержат информацию, необходимую для синтеза соответствующих ферментов. Вирусы могут также вызывать синтез ферментов, катализирующих реакции, которые уже ранее осуществлялись с помощью клеточных ферментов.

Большинство РНК-содержащих вирусов размножаются путем образования копий РНК без участия промежуточных ДНК-матриц, и поэтому их репликация может происходить в клетках с ингибированным синтезом ДНК. Эти вирусы кодируют собственную РНК-репликазу.

Клетки хозяина такого фермента не имеют. У некоторых групп РНК-содержащих вирусов РНК реплицируется на промежуточной комплиментарной ДНК, синтезируемой на вирусной РНК с помощью обратной транскриптазы. Этот фермент привносится в клетку хозяина вирионом вместе с вирусной РНК. Введение уже синтезированного вирусного фермента в клетку - явление не столь редкое.

Число компонентов биосинтетического аппарата, которое мог бы кодировать вирус, лимитируется величиной вирусного генома. Самые малые вирусы содержат около 106 дальтон ДНК или РНК. Так как соотношение молекулярных весов кодирующей нуклеиновой кислоты и кодируемого белка составляет примерно 9:1 для РНК или одноцепочной ДНК и 18:1 для двухцепочной ДНК, эти вирусы в состоянии обеспечить синтез лишь нескольких белков, и обычно это лишь структурные белки вириона. Очевидно, что все вирусы в значительной степени зависят от ферментного аппарата клеток - хозяев. Некоторые вирусы нуждаются даже в помощи других вирусов. Например, РНК вируса - сателлита некроза табака состоит всего из 1200 нуклеотидов, а белковая субъединица капсида, которую эта РНК кодирует, состоит из 400 аминокислотных остатков. Очевидно, что ни для какой другой информации в геноме этого вируса не хватило бы места. Поэтому он способен размножаться только в тех клетках, которые одновременно заражены вирусом некроза табака. Последний и служит источником необходимой репликазы. Есть и другие примеры вирусов, сохраняющихся в естественных условиях только благодаря вирусам - помощником, инфицирующим те же клетки.

Во время своей репликации вирусная нуклеиновая кислота не связана со специфическими белками, имеющимися в зрелых вирионах. При определенных условиях репликация нуклеионовых кислот происходит тогда, когда синтез белков химическим путем ингибирован. В ходе инфекции, ведущей к образованию и высвобождению новых вирусных частиц, синтез вирионных белков обычно начинается после того, как репликация нуклеиновой кислоты уже развернулась. В результате синтеза этих белков накапливается фонд предшественников, служащий источником материала, используемого при сборке капсидов. Созревание - сложный и необратимый процесс: ни нуклеиновая кислота, ни структурные белки, включенные в полный капсид или его часть, снова уже не освобождаются в той же клетке. Таким образом, при сборке капсида вирусный геном исключается из реплицирующейся популяции нуклеиновой кислоты, а капсидные белки - из фонда белковых предшественников. Если вирусы имеют наружную оболочку, то она присоединяется к капсиду позднее, либо в цитоплазме клетки, либо при взаимодействии с клеточной мембраной. Такой процесс сборки, включающий этапы наполнения предшественников позволяет объяснить явление фенотипического смешения, когда в клетке, зараженной двумя различными, но совместимыми вирусами, образуются вирионы с капсидами, построенными из субъединиц, кодируемых разными геномами.

Вновь образованные вирионы освобождаются во внешнюю среду (нередко вместе с незрелыми формами) либо в результате лизиса клетки - хозяина, вызываемого вирусными ферментами, как при инфекции бактерий фагами, либо путем выталкивания участков цитоплазмы, либо, наконец, путем выхода отдельных вирионов или небольших их групп. Некоторые вирусы животных с трудом освобождаются из клеток в культурах in vitro; в живом организме выходу таких вирусов из клеток и их распространению способствует захват поврежденных вирусом клеток фагоцитами и их переваривание. Вирусы растений обычно не освобождаются путем лизиса клеток, а переходят из клетки в клетку через межклеточные соединения.

Взаимодействие фага с бактериями

вирус белок генетический фаг

Основные проблемы и явления

Бактериофаги являются паразитами представителей почти всех групп прокариотических организмов от крошечных Dellovibrios, которые сами паразитируют на других бактериях, до некоторых крупных сине-зеленых водорослей. Общие свойства фагов обычно служат отражением свойств клетки бактерии-хозяина. Наличие жесткой клеточной стенки у большинства прокариот требует особых механизмов для проникновения или выхода вирусов. Прокариоты не дифференцируются в стволовые или специализированные клетки, а являются популяцией более или менее сходных клеток, которые продолжают размножаться, пока имеется соответствующая питательная среда. Поэтому взаимодействие фагов с бактериями происходит в бактериальной культуре циклически, пока не наступит некое равновесное состояние, которое определяется числом клеток-хозяев и вирусных элементов и скоростью их воспроизведения. Другая ситуация возникает тогда, когда бактерии способны к дифференцировке, например при споруляции или смене состояний.

Прикрепление и проникновение

Прикрепление вирионов фага к бактериальной клетке является реакцией первого порядка и происходит обычно на клеточной поверхности. Последняя различна по своей структуре у разных типов бактерий. Некоторые фаги прикрепляются к особым выростам, так называемым F и L-ворсинкам, которые принимают участие в процессе конъюгации. Вирионы фагов группы х обратимо прикрепляются к жгутикам бактерий и затем соскальзывают вдоль них к поверхности клетки, причем этому процессу, по-видимому, способствует движение самих жгутиков (поскольку неподвижные бактериальные мутанты не бывают хозяевами этих фагов). На поверхности бактериальной клетки имеются специфические рецепторы для фагов, однако данные об их природе весьма ограничены. Тот факт, что фаг неспособен адсорбироваться на бактериальном мутанте, не обязательно означает, что мутант утратил химические группы, выполняющие роль рецепторов фага, - последние могут быть просто скрыты другими компонентами клеточной оболочки. Рецепторы не всегда необходимы для самой клетки; например, при росте бактерий в определенных температурных условиях они могут утрачиваться.

Из оболочки бактерий, чувствительных к фагу, удается экстрагировать специфическое вещество, способное инактивировать фаг. Возможно,это вещество является самим рецептором или компонентом рецепторной структуры на поверхности бактерий. Сами по себе рецепторы, по-видимому, способствуют лишь первому обратимому этапу адсорбции. Не исключено, что они также участвуют в других процессах, частности в транспорте ионов железа. После прикрепления фага бактерия в течение некоторого времени (латентный период) не претерпевает заметных морфологических изменений даже и в том случае, если заражение, в конце концов,приведет к лизису клетки, поскольку лизис наступает всегда внезапно.