Онковирусы. Механизмы трансформации клеток

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Украины

Харьковский Национальный университет им. В. Н. Каразина

Курсовая работа

По нормативному курсу «Общая вирусология»

Онковирусы. Механизмы трансформации клеток

студентки 3 курса

Биологического факультета

Заочного отделения

Слюсарь А.В.

Научный руководитель:

Орлова О.В.

2010 г.

ПЛАН

1 Трансформация клеток вирусами

2 Опухоли: что это такое?

3 Опухолеродные вирусы

4 Этиология опухолей

5 Опухоли, вызванные вирусами

6 Саркома Рауса

7 Трансформация клеток ДНК-содержащими вирусами доказательства интеграции вирусного генома

Список использованной литературы

1 ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК ВИРУСАМИ

Как уже упоминалось в предыдущих главах, заражение животной клетки вирусом может привести к одному из двух результатов. Наиболее часто наблюдается цитоцидальная реакция. В этом случае образуется новый вирус, а клетка перестает делиться или даже разрушается. Вирусы, вызывающие цитопатические реакции такого типа, благодаря тому, что они обладают способностью быстро разрушать клетки, приводят к возникновению острых заболеваний. Некоторые вирусы, однако, оказывают совершенно иное действие на клетку. Мы имеем в виду так называемые опухолеродные, или онкогенные, вирусы. Эти вирусы изменяют зараженную клетку таким образом, что она приобретает способность к непрерывному росту и делению. Частота, с которой происходит подобное изменение, зависит как от вируса, так и от клетки. Такая трансформация может закончиться, а часто и действительно заканчивается превращением трансформированной клетки в злокачественную опухолевую клетку, делящуюся бесконтрольно, что приводит к гибели животного.

Подобный процесс, наблюдающийся в культуре клеток животных, был назван трансформацией, о чем можно лишь пожалеть, ибо обычно этот термин используется для описания генотипического изменения какого-либо бактериального штамма вследствие поглощения нуклеиновой кислоты (ДНК) бактерий другого штамма. На наш взгляд, для описания этого явления более подошел бы термин конверсия, применяемый исследователями, работающими с фагами, для описания изменений свойств бактерий, вызываемых фагом. Тем не менее далее для описания конверсии клеток животных, т. е. явления, при котором нормальные клетки животных, зараженные вирусом, переходят в состояние, находясь в котором они обладают способностью к неограниченному росту и во многих случаях отличаются по своей морфологии от исходных, родительских клеток, мы будем использовать термин «трансформация».

Следует подчеркнуть, что пока еще не удалось показать, что какой-либо вирус, обладающий способностью индуцировать злокачественную трансформацию, действительно может вызывать образование опухолей у человека. Однако благодаря несомненному существованию опухолей, индуцированных вирусами, у многих, самых различных животных и крайне важному значению проблемы опухолей человека исследования в области вирусологии опухолей за последнее время очень активизировались. В этой главе мы хотим рассмотреть роль вирусов в образовании злокачественных опухолей. Особое внимание будет при этом уделено анализу явления трансформации клетки, индуцируемой вирусом, о чем мы уже упоминали выше.

2 ОПУХОЛИ: ЧТО ЭТО ТАКОЕ?

Опухолями, или неоплазмами, называются различного рода аномальные новообразования, возникающие у многоклеточных организмов-растений или животных. Клетки, из которых состоит опухоль, могут на первый взгляд совершенно не отличаться от соответствующих клеток нормальных тканей. Тем не менее опухоли отличаются от патологических гиперплазии отсутствием функциональной координации с остальными клетками (под патологическими гиперплазиями понимают избыточный рост нормальных клеток, как, например, при образовании костной мозоли на месте перелома). Автономный рост клеток, образующих опухоль, фактически превращает опухоль в паразита, живущего за счет остальной части организма. Например, опухоль жировой ткани, или липома, сохраняет жир даже в том случае, когда вследствие заболевания или голодания остальные ткани организма утрачивают почти весь содержащийся в них жир.

Следует подчеркнуть, что степень паразитического воздействия опухолей на организм у разных опухолей различна. Например, доброкачественными неоплазмами называют такие опухоли, которые растут, не разрушая активно соседние органы, не нарушают обмена веществ организма и не обладают способностью образовывать метастазы (метастазами называются вторичные опухоли, образующиеся вследствие миграции опухолевых клеток по организму и имплантации этих клеток в другие органы). Обычная доброкачественная опухоль, как, например, липома или фиброма, служит главным образом механической помехой, поскольку в процессе роста она оттесняет другие органы. Переход от доброкачественной к злокачественной опухоли, в просторечии называемой раком, совершается почти незаметно. Раковые опухоли представляют собой неоплазмы, обладающие рядом характерных свойств. К их числу относятся быстрый рост клеток, инвазия и разрушение клетками опухоли нормальных органов и тканей и образование метастазов. Существенной особенностью клеток раковых опухолей являются частые и обычно аномальные митозы.

Необходимо подчеркнуть, что не следует смешивать способность опухоли к неограниченному локальному росту со способностью клеток опухоли инвазировать другие ткани и разрастаться среди них. Раковые опухоли человека обладают как первым, так и вторым свойством. Различие между этими двумя свойствами можно продемонстрировать и в эксперименте, используя тканевые культуры. Так, было показано, что клетки культуры можно трансформировать таким образом, что в культуре они растут неограниченно, но при имплантации в организм животного вызывают образование лишь локальных опухолей. Некоторые линии трансформированных клеток при дальнейшем культивировании in vitro приобретают свойства истинных злокачественных клеток. При имплантации их в организм животного они не только образуют опухоль в месте имплантации, но и вызывают образование метастазов в различных органах и тканях организма.

Опухолевые клетки родственны нормальным клеткам и часто осуществляют ряд специфических функций, секреторных или иных, свойственных клеткам тканей, из которых они произошли, несмотря на отсутствие координации между ними и нормальными компонентами организма. Например, уже давно были обнаружены опухоли поджелудочной железы, образующие избыточное количество инсулина. Более того, в ряде случаев было показано, что опухоли специализированной ткани, например легкого, вдруг начинают секретировать гормон свойственный нормальному организму и обычно продуцируемый совершенно другой специализированной тканью, например паращитовидной железой. Следовательно, клетки опухоли могут не только сохранить или утерять способность к осуществлению специфических функций, но и приобрести способность осуществлять новые функции, не выполняемые родительской тканью.

3 ОПУХОЛЕРОДНЫЕ ВИРУСЫ

онковирус трансформация клетка

По аналогии с родительскими тканями принято различать два типа опухолей, гистологически отличающихся друг от друга: опухоли эпителиальные и опухоли соединительной ткани. В качестве примера эпителиальных опухолей можно привести папилломы, эпидермальные опухоли (б том числе обычные бородавки), а также аденомы, или опухоли желез. Из опухолей соединительной ткани можно назвать хондромы - опухоли хрящей, остеомы - опухоли костей и много других. Даже в случае наиболее атипичных раковых опухолей можно уловить некоторые черты сходства между тканевой организацией опухоли и тканевой организацией какой-либо нормальной ткани. Сказанное справедливо как в отношении эпителиальных злокачественных опухолей, или карцином, состоящих из опухолевых клеток эпителиального происхождения и стромы - неопухолевой соединительной ткани, так и в отношении злокачественных опухолей соединительной ткани, называемых обычно саркомами. Способность образовывать опухоли является свойством, присущим клеткам как таковым. Опухолевые клетки, выращиваемые в культуре, сохраняют свои особенности. При пересадке подходящему хозяину такие клетки воспринимаются его организмом как «свои» и вызывают образование опухолей.

Пересадка опухолей в другой организм является одним из главных методов экспериментальной онкологии. При пересадке опухолей млекопитающим сохраняют силу все ограничения, которые следует иметь в виду при пересадке нормальных тканей. Известно, что гетерологичные трансплантаты не «воспринимаются» организмом. В конечном счете за отторжение ответственны генетические факторы, вследствие действия которых в ответ на пересадку гетерологичного трансплантата организм сразу же отвечает токсической реакцией, а через некоторое время - образованием антител к чужеродным тканям. Однако если пересадка осуществляется, например, в мозг или переднюю камеру глаза, а также в куриный эмбрион , т. е. в системы, в какой-то мере изолированные от всего организма и характеризующиеся пониженной способностью к образованию антител, а, возможно даже и меньшей эффективностью других механизмов, ответственных за резистентность, то приживаются и гетерологичные трансплантаты, причем взятые не только от животных другого вида, но и другого рода. Вообще же для того, чтобы успешно перевивать опухоли на лабораторных животных, необходимо располагать высокоинбредными, так называемыми чистыми линиями животных, получаемыми путем повторного скрещивания между сибсами.

4 ЭТИОЛОГИЯ ОПУХОЛЕЙ

Канцерогенные вещества. В чем же причина того, что какая-то клетка или группа клеток организма животного приобретает способность к неопластическому росту и превращается в опухоль? Обычно мы не знаем, почему это происходит, и говорим в таких случаях о спонтанной опухоли. Известно, однако, что ряд агентов может вызвать образование неоплазм в эксперименте и некоторые из них, несомненно, играют роль и в образовании опухолей, встречающихся в естественных условиях.

К числу наиболее хорошо изученных агентов такого рода относится группа циклических углеводородов (например, метилхолантрен, 3,4-бенз-пирен, 1,2,5,6-дибензантрацен). Нанесение этих соединений, например на кожу, в очень большом числе случаев вызывает образование опухолей. Многие химически индуцированные опухоли: подобны опухолям, образующимся спонтанно. Однако таким путем были получены и опухоли, которые ранее никогда не наблюдались. Возможно, это объясняется тем, что подобные опухоли спонтанно возникают крайне редко. Например, при введении одного из таких канцерогенных веществ крысе в ряде органов возникают изменения, которые вначале невозможно отличить от хронического воспаления, но затем более или менее быстро образуются истинные неоплазмы, а часто и раковые опухоли. В неоплазме канцерогены не содержатся, но клетки, ее образующие, тем не менее изменяются необратимо.

Из числа исследований, посвященных изучению химических канцерогенов, наибольшую известность, вероятно, получила работа, показавшая, что конденсат табачного дыма может вызвать образование у животного опухолей того же гистологического типа, что и бронхогенная карцинома человека. Эти данные согласуются с результатами массовых статистических исследований, показавших наличие связи между курением и увеличением частоты рака легкого.

Уже давно существует мнение, что, кроме химических канцерогенов, определенную роль в образовании опухолей играют некоторые физические факторы, и в первую очередь ультрафиолет и рентгеновские лучи. Ряд экспериментальных исследований, посвященных изучению влияния этих факторов на образование опухолей у животных, как и несколько превосходных статистических исследований, документально продемонстрировали увеличение частоты ряда злокачественных заболеваний у лиц, подвергавшихся интенсивному воздействию радиации. Известно, что компонентом клетки, наиболее чувствительным к действию радиации, является ее нуклеиновая кислота, а изменения свойств клетки, ответственные за ее превращение из нормальной в опухолевую, передаются по наследству от родительской клетки дочерним. Поэтому многократно предпринимались попытки выявить различия между нуклеиновыми кислотами опухолевых и соответствующих нормальных клеток. Однако пока не удалось установить каких-либо важных различий. Единственным исключением явилось обнаружение несколько большего относительного содержания метилированных оснований в нуклеиновых кислотах, выделенных из опухолевых клеток.

Попытки использовать химические или физические канцерогены для изучения в эксперименте механизма канцерогенеза пока не дали сколько-нибудь существенных результатов, ибо при помощи этих агентов не всегда удается индуцировать рак in vitro. Так, начальную стадию взаимодействия между нормальной клеткой и вызывающим образование опухолей химическим или физическим агентом, в результате которого эта клетка превращается в опухолевую, изучить на клеточном уровне так и не удалось. Поскольку это ограничение не относится к опухолеродным вирусам, изучение вирусного канцерогенеза приобрело большую популярность. Необходимо подчеркнуть, однако, что при работе с доступными пока системами вирус - клетка частоту трансформации нормальных клеток в раковые все еще точно контролировать не удается. Тем не менее эти системы намного лучше, чем любые другие системы, предлагавшиеся до сих пор для изучения in vitro канцерогенного действия химических и физических агентов.

5 ОПУХОЛИ, ВЫЗВАННЫЕ ВИРУСАМИ

Прежде чем приступить к рассмотрению роли вирусов в образовании опухолей, имеет смысл сначала кратко описать ряд опухолей вирусного происхождения, встречающихся в природе или образующихся в экспериментах на животных. Опухолеродные вирусы вызывают широко распространенные в природе заболевания, например лейкозы птиц, лейкемию и рак молочной железы мышей, папилломы и фибромы различных млекопитающих, а также бородавки человека (доброкачественная опухоль). Ряд же других опухолеродных вирусов вызывает в естественных условиях заболевания лишь изредка. Например, вирус полиомы мышей, хотя и широко распространен в природе, в естественных условиях редко вызывает образование неоплазм. Следует, однако, отметить, что впервые он был выделен именно из такой опухоли. Однако этот вирус регулярно вызывает трансформацию культивируемых клеток, в связи с чем широко используется при экспериментальных исследованиях.

Способностью трансформировать клетки в культуре обладают и другие вирусы однако до сих пор не было обнаружено, чтобы они вызывали опухоли в естественных условиях. В качестве примера такого типа вирусов можно привести вирус 5У-40, впервые выделенный из первичной культуры клеток почек обезьян, и аденовирусы человека. Оба эти агента обладают способностью вызывать малигнизацию клеток хомяка, как в культуре, так и при введении вируса животному. Вирус 5У-40 способен также трансформировать культивируемые in vitro клетки человека. Однако ни в отношении вируса 5У-40, ни в отношении аденовирусов не было показано, что они вызывают опухоли у своих естественных хозяев, т. е. соответственно у обезьян и человека.

Поскольку объем этой книги не позволяет подробно изложить историю открытия всех до сих пор обнаруженных опухолеродных вирусов, мы вынуждены ограничиться упоминанием лишь наиболее выдающихся открытий.

Впервые осуществить успешную перевивку опухоли от одного животного другому путем введения сыворотки или бесклеточного экстракта удалось Эллерману и Бангу. Эти авторы показали, что для пассирования висцерального лимфоматоза кур от одного животного к другому не обязательно вводить реципиенту интактные клетки донора. Однако в то время не было известно, что это сложное заболевание по своему характеру близко злокачественной опухоли кроветворной системы млекопитающих. Действительным же началом развития отрасли науки, называемой теперь вирусологией опухолей, послужила работа Пейтона Рауса, в которой он показал, что «естественная» саркома кур породы плимутрок может быть пассирована от одного животного к другому путем инокуляции бесклеточного, не содержащего бактерий фильтрата опухоли.

В течение многих лёт сама возможность существования опухолеродных вирусов казалась сомнительной. Объяснялось это главным образом отсутствием понимания общей природы вирусов, а также тем, что многие экспериментаторы-патологи совершенно не считались с данными, полученными на каких-либо других объектах, помимо млекопитающих. Новым стимулом к изучению опухолеродных вирусов послужили исследования, начатые в 1932 г. Шоупом и его сотрудниками, избравшими в качестве объекта изучения вирус, вызывающий папиллому у кроликов. Этот вирус можно легко выделить из папиллом, как возникших, так и индуцированных в естественных условиях, у диких америкячских кроликов, однако следует отметить, что лишь изредка эти опухоли превращаются у них в злокачественные.

Когда же этим вирусом заразили домашних кроликов (эти животные относятся к другому роду), были обнаружены два поразительных факта. Так, оказалось, что, во-первых, индуцировавшиеся у домашних кроликов папилломы систематически превращались в злокачественные карциномы и, во-вторых, инфекционный вирус, который можно было выделить из папиллом диких кроликов без особых трудностей, из опухолей домашних кроликов удавалось выделить очень редко, хотя его присутствие можно было обнаружить, используя чувствительные антигенные тесты. Эти исследования дали толчок к изучению роли «маскированных» вирусов в образовании опухолей («маскированными» называют вирусы, не обнаруживаемые методами, основанными на выявлении инфекционное).

В 1936 г. Биттнер открыл еще один важный опухолеродный вирус. Этот исследователь показал, что рак молочной железы возникает у тех мышей, которые были вскормлены молоком, содержащим особый фактор (так называемый фактор молока). Впоследствии было показано, что этот фактор обладает свойствами, характерными для вируса, а именно проходит через бактериальные фильтры и стимулирует образование антител. На электронных микрофотографиях зараженных вирусом опухолевых клеток, культивировавшихся in vitro, можно было ясно обнаружить наличие в них вирусных частиц. Тем не менее до сих пор не удалось адаптировать этот вирус к тканевым культурам, что не позволяет осуществить его количественное изучение.

Одно интересное свойство этой системы, в особенности привлекательное для экспериментаторов, состоит в том, что рак молочной железы возникает лишь у тех зараженных этим вирусом самок мышей, молочная железа которых подвергается воздействию соответствующих гормонов, либо введенных искусственно, либо поступающих в кровоток при беременности. Эти данные вновь продемонстрировали, что опухолеродный вирусам свойственно находиться в латентном, или маскированном, состоянии. Очень важно, что эти эксперименты обратили также внимание исследователей на тот факт, что для образования вирусом опухоли необходимо какое-то вторичное событие, в данном случае гормональный стимул.

Работы Рауса, Шоупа и Биттнера стимулировали поиск опухолеродных вирусов, и в результате за последние 15 лет было открыто много новых онкогенных вирусов. Однако за последнее время внимание исследователей сосредоточилось не столько на поиске новых, сколько на изучении свойств уже открытых опухолеродных вирусов, проводящемся на клеточном уровне. Во многом этому способствовали успехи, достигнутые в совершенствовании методов работы с культурами клеток, что позволило разработать количественные методы изучения трансформации клеток опухолеродными вирусами in vitro.

Наиболее тщательному изучению подверглись следующие системы:

1) фибробласты кур, трансформированные вирусом саркомы Рауса (ВСР),

2) фибробласты млекопитающих, трансформированные ДНК-содержащими вирусами, в том числе вирусом полиомы, вирусом 5У-40 а аденовирусами.

Ниже мы сначала рассмотрим каждую из этих систем в отдельности, а затем обсудим возможные общие стадии событий, наблюдаемых при трансформации клеток вирусами.

6 САРКОМА РАУСА

Несмотря на то что в период между 1911 и 1955 гг. изучению вируса -саркомы Рауса было посвящено большое количество экспериментальных исследований, многие фундаментальные вопросы, касающиеся как -свойств вируса, например его размера, состава, стабильности, скорости размножения и т. д., так и свойств зараженных им клеток, остались неразрешенными. Содержит ли вирус каждая опухолевая клетка? Может ли клетка продуцировать вирус и одновременно делиться? Очевидно, что получение ответов на эти принципиальные вопросы имеет большое значение.

В 1958 г. Темин и Рубин разработали метод количественного - определения вируса саркомы Рауса in vitro. В основе предложенного *ими метода лежит явление, ранее обнаруженное Менакером и Групэ. Эти авторы подметили, что нанесение небольшого количества вируса саркомы Рауса на однослойную культуру куриных фибробластов приводит к образованию групп, или фокусов, измененных клеток, число которых можно подсчитать. Этот метод по своей сущности является как бы противоположностью метода подсчета числа бляшек, при помощи которого, как известно, подсчитывают число зон разрушенных клеток, каждая из которых возникает в результате распространения вируса из одной первично зараженной клетки. Метод определения трансформирующей активности вирусов путем подсчета числа «фокусов трансформации» сыграл роль инструмента, пользуясь которым удалось осуществить ряд весьма плодотворных исследований, посвященных изучению взаимодействия клетки с опухолеродными вирусами.

Число фокусов трансформации, образующихся при заражении однослойной культуры куриных фибробластов вирусом саркомы Рауса, прямо пропорционально количеству вируса, введенного в культуру, а это говорит о том, что за образование фокуса трансформации ответственна одна вирусная частица. Вирусы, образуемые клетками, принадлежащими к какому-либо одному фокусу трансформации, можно рассматривать как относящиеся к одному клону. Было показано, что такой чистый клон вируса саркомы Рауса способен трансформировать в саркоматозные мезодермальные и энтодермальные клетки, а также эктодермальные клетки радужной оболочки глаза. Детальное изучение процесса размножения вируса саркомы Рауса, в том числе и методами, позволяющими культивировать отдельные клетки в микрокаплях культуральной жидкости, показало, что большинство клеток, трансформированных этим вирусом, может одновременно и продуцировать вирус и делиться в неограниченном числе генераций. Необходимо подчеркнуть, что пока не было обнаружено другой системы вирус - клетка, где клетки были бы способны делиться и одновременно продуцировать вирус. Вирусные частицы образуются медленно. Одна клетка продуцирует один вирион примерно за 5 час. Внутри клеток содержится очень мало вирусных частиц, и большая часть вируса, связанного с клетками, нейтрализуется антисывороткой. Этот факт говорит о том, что вирус саркомы Рауса созревает у поверхности клетки, а зрелые вирионы почти немедленно после сформирования выходят из клетки. Такой тип созревания характерен для миксовирусов и арбовирусов.

Одним из наиболее загадочных вопросов, возникших в связи с результатами, полученными при изучении опухолей животных, индуцированных вирусом саркомы Рауса, явилось обнаружение образования опухолей, не содержавших вируса, - факт, находящийся в противоречии с результатами, полученными при изучении взаимодействия этого вируса с клетками in vitro. Было обнаружено, что при введении животному небольшого количества вируса вероятность образования опухоли, не содержащей вируса, выше, чем при введении большого количества вируса. Причина этого явления, как и ряда других аномалий, наблюдавшихся при изучении трансформации клеток вирусом саркомы Рауса in vitro, была в конце концов выяснена. Оказалось, что вирус саркомы Рауса является дефектным вирусом, вследствие чего для его созревания необходимо присутствие в клетке другого родственного вируса.

История открытия дефектности вируса саркомы Рауса такова. Сначала было обнаружено, что многие куры и куриные эмбрионы заражены некоторыми штаммами большой группы вирусов, вызывающих лейкозы у птиц. Некоторые из этих вирусов вызывают образование опухолей кроветворных органов, но в большинстве случаев у кур и куриных эмбрионов никаких заболеваний не наблюдается. Далее было обнаружено, что клетки, зараженные одним из этих кажущихся безвредными вирусов, приобретают устойчивость к заражению и трансформации вирусом саркомы Рауса. Используя метод количественного определения трансформирующей активности вируса саркомы Рауса (подсчет фокусов трансформации), можно обнаружить и количественно определить содержащийся в системе интерферирующий вирус (фактор, ингибирующий вирус саркомы Рауса - ФИР). Таким образом удалось отобрать культуры куриных фибробластов, не содержащих ФИР. В свою очередь, используя эти культуры, удалось выявить, какие из имеющихся препаратов вируса саркомы Рауса содержат другие вирусы этой группы, а какие - нет. Таким путем Рубин в изучавшихся им препаратах вируса саркомы Рауса обнаружил новый вирус, который он назвал Раус-ассоциированным вирусом (РАВ). Этот вирус, подобно ФИР, интерферировал с вирусом саркомы Рауса в образовании фокусов трансформации. Раус-ассоциированный вирус серологически родствен как вирусу саркомы Рауса, так и другим ФИР-вирусам.

Следующей страницей истории изучения вируса саркомы Рауса было обнаружение того, что иммунологическая толерантность к вирусу ФИР играет роль в процессе, контролирующем наличие или отсутствие вируса в опухолях кур, индуцированных вирусом саркомы Рауса. Иммунологическая толерантность к данному антигену является результатом наличия этого антигена в иммунологически незрелом организме . Если данный антиген снова ввести в такой организм после окончательного созревания иммунологической системы, то организм не ответит на его введение образованием соответствующих антител. И действительно, было показано, что если в ранний период развития организма заразить его вирусом ФИР, то курица становится толерантной к вирусу саркомы

Рауса, в результате чего титр этого вируса повышается. Таким образом, титр вируса саркомы Рауса в опухолях, полученных от толерантных кур, значительно выше, чем в контрольных. Более того, в некоторых опухолях, полученных от животных, не толерантных к вирусу ФИР, вирус саркомы Рауса вовсе не удается обнаружить. Опухоли, индуцированные у нетолерантных животных, обычно рассасываются, вероятно вследствие иммунологического отторжения, тогда как у толерантных животных опухоли растут до тех пор, пока не убивают животное.

Очевидно, что конечный результат инфекции, вызванной вирусом саркомы Рауса, и в особенности образование опухолей, не содержащих вируса, зависит от каких-то факторов, родственных ФИР. В связи с этим возникает вопрос: ответственна ли за образование безвирусных опухолей лишь интенсивная иммунологическая реакция организма хозяина или в основе этого явления лежат более тонкие биологические механизмы?

Ответ на этот вопрос был получен при изучении образования вируса клетками, трансформированными при их заражении малым количеством вируса. Было обнаружено, что при разбавлении смеси, содержащей вирус саркомы Рауса (ВСР) и Раус-ассоциированный вирус (РАВ), сильно разбавленные пробы содержат чистый РАВ. Это означает, что в исходном материале концентрация РАВ превышает концентрацию ВСР. Для того чтобы очистить ВСР, Ханафуза и сотрудники вводили в культуру очень небольшие количества вируса (низкая множественность заражения), после чего небольшое количество зараженных клеток переносили в другую чашку. В результате в одной чашке появлялось максимум два-три фокуса трансформации. Для того чтобы предупредить распространение образующегося вируса от клетки к клетке, к культуре добавляли антисыворотку.

Когда клетки, трансформированные ВСР, были выделены и размножены, в результате чего исследователи получили достаточно большое количество линий таких клеток, оказалось, что более 80% линий трансформированных клеток не продуцировали ни ВСР, ни РАВ. Действие ультрафиолета или другие типы воздействия, эффективные при индукции образования фага лизогенными бактериями, не привели к образованию вируса. Однако, когда к таким не продуцирующим вирус культурам добавляли небольшое количество РАВ, наблюдалась неожиданная вспышка синтеза как РАВ, так и ВСР. Подобным образом вел себя любой из клонов трансформированных клеток, не продуцировавших вирус. Было обнаружено, что образование ВСР индуцирует не только РАВ, но и многие другие родственные штаммы вирусов, вызывающих лейкозы, в том числе и исходный вирус ФИР.

РАВ и ФИР, обладая некоторым серологическим родством, тем не менее серологически отличаются друг от друга. Вирионы же ВСР, образующиеся под влиянием одного из этих вирусов, иммунологически идентичны индуцирующему вирусу. Таким образом, резюмируя сказанное выше, можно прийти к выводу, что вирус саркомы Рауса является дефектным вирусом, неспособным индуцировать образование какого-то компонента, входящего в состав вириона. Поэтому зрелый ВСР может образоваться лишь в том случае, если этот компонент будет синтезирован либо РАВ, либо ФИР. Вновь синтезировавшийся зрелый ВСР по антигенной структуре будет походить на вирус, индуцировавший синтез недостающего компонента его вириона.

Следовательно, каждая трансформированная клетка содержит геном ВСР, однако в отсутствие вируса-помощника информация, содержащаяся в этом геноме, для образования вируса не используется. Однако в том случае, когда зрелый ВСР уже образовался, он может трансформировать клетку, не прибегая к содействию вируса-помощника. У животных, не зараженных РАВ, вирус саркомы Рауса индуцирует образование опухолей, состоящих из клеток, не продуцирующих вирус, причем в организме этих животных антитела, нейтрализующие ВСР, не образуются.

Резюмируя, мы можем прийти к выводу, что образование у животных опухолей, не продуцирующих вирус, можно объяснить двумя причинами. С одной стороны, у животных, зараженных ВСР и РАВ, иммунологическая реакция со стороны организма может привести к тому, что опухоль, индуцированная ВСР, не будет содержать вируса вследствие уменьшения количества свободного РАВ. С другой стороны, как и в опыте in vitro, опухоль, состоящая из клеток, не продуцирующих вирус, может возникнуть вследствие того, что клетка-родоначальница опухоли была трансформирована ВСР при отсутствии в ней вириона РАВ.

События, происходящие на молекулярном уровне, при трансформации клетки вирусом саркомы Рауса

Эксперименты, описанные в предыдущем разделе, выявили два важных события, происходящих при трансформации клеток вирусом саркомы Рауса, которые требуют объяснения на молекулярном уровне. Эти события таковы:

1) интеграция вирусного генома с клеткой-хозяином, претерпевшей трансформацию, которая происходит таким образом, что вирусный геном сохраняется во всех генерациях трансформированных клеток,

2) воздействие, оказываемое вирусом на клетку, результатом которого является трансформация свойств клетки.

В настоящее время ясно, что материалом, использовавшимся исследователями, пытавшимися прежде определить состав и свойства вируса саркомы Рауса, служил не чистый вирус Рауса, а его смесь с вирусом-помощником, содержание которого в этой смеси превалировало. Анализ показал, что единственной нуклеиновой кислотой, содержащейся в таких смесях ВСР и РАВ, является РНК. Было установлено, что молекулярный вес этой РНК необычайно велик - около 107 дальтон, что примерно в пять раз превышает молекулярный вес РНК вируса полиомиелита. Данные, полученные при изучении влияния на размножение вируса саркомы Рауса различных ингибиторов синтеза ДНК, а именно 5-фтордезоксиуридина, аминоптерина и цитозинарабинозида, показали, что добавление этих ингибиторов к зараженным клеткам после начала образования ВСР не прерывает его дальнейшего синтеза, и, таким образом, подтвердили, что в состав ВСР действительно входит только РНК.

Оказалось, однако, что, несмотря на то что уже начавшийся синтез вируса Рауса действительно продолжается при ингибировании синтеза ДНК, синтез ДНК является необходимым условием самого обоснования этого вируса в клетке. Так, например, было показано, что облучение клеток с равной эффективностью блокирует как рост клеток, так и их трансформацию ВСР, а ингибирование синтеза ДНК эффективно подавляет как инициирование трансформации клеток ВСР, так и инициирование образования самого ВСР. Дальнейшие эксперименты показали, что период, в течение которого синтез ДНК необходим для последующего развития процессов, индуцируемых ВСР, заканчивается примерно через 5 час после заражения клеток вирусом. Интересно, что, несмотря на то что образование вируса не начинается раньше чем через 15 часов после заражения клетки, процессы, идущие по окончании 5 час после заражения вирусом, не прерываются при подавлении синтеза ДНК. Для объяснения этих результатов Темин предложил следующую схему синтеза ВСР. Согласно этой схеме, геном вируса саркомы Рауса, т. е. его РНК, служит матрицей для образования комплементарной ей двухспиральной ДНК-реплики (провирусной ДНК), в свою очередь интегрирующейся с ДНК клетки. Вновь образующаяся вирусная РНК транскрибируется с интегрированной клеточной вирусоподобной ДНК. Эта схема объясняет еще одно неожиданное наблюдение, а именно ингибирование уже начавшегося синтеза ВСР актиномицином антибиотиком, как известно, подавляющим синтез РНК на ДНК-матрице.

Хотя эта схема и противоречит ортодоксальным представлениям, она тем не менее стимулирует дальнейшее изучение этой проблемы. Следует, однако, подчеркнуть, что результаты, полученные при изучении влияния ингибиторов на взаимодействие ВСР с клеткой, можно объяснить и другим образом. Например, известно, что хотя актиномицин практически не подавляет размножения ряда РНК-содержащих вирусов, на синтез вируса ньюкаслской болезни он оказывает такое действие. В вирионе этого вируса содержится примерно столько же РНК, сколько и в вирионах ВСР - РАВ. Однако этот вирус размножается в цитоплазме и поэтому ни в коей мере не зависит от клеточной ДНК. Следовательно, за ингибирование действия ВСР актиномицином может быть ответственно не блокирование синтеза РНК на ДНК-матрице, а какой-то иной эффект, оказываемый этим антибиотиком.

7 ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК ДНК-СОДЕРЖАЩИМИ ВИРУСАМИ И ДОКАЗАТЕЛЬСТВА ИНТЕГРАЦИИ ВИРУСНОГО ГЕНОМА

При изучении действия вирусов на культуры клеток был обнаружен еще один вид индуцируемой вирусами трансформации клеток - конверсия фибробластов эмбрионов млекопитающих в опухолевые клетки, вызываемая вирусом полиомы, вирусом 5У-40 и аденовирусами. Из представителей этой группы трансформирующая активность была обнаружена сначала у вируса полиомы - вируса, впервые выделенного из опухоли слюнной железы мыши. Этот вирус обладает удивительным свойством: он вызывает образование опухолей самых различных органов, причем не только у мышей, но и у хомяков и у иных животных. Примечательно, что подобным широким спектром действия обладают также и клоны, выделенные из отдельных бляшек. Способность вируса полиомы индуцировать трансформацию клеток культуры ткани впервые была обнаружена Фогт и Дульбекко. Затем Шейн и Эндерс показали, что вирус 5У-40 способен трансформировать клетки эмбриона человека, а Трентин обнаружил способность аденовирусов вызывать образование опухолей у хомяков.

При воздействии этих вирусов на первичные эмбриональные клетки трансформируется менее 1% клеток, подвергшихся заражению. В этом отношении эти вирусы резко отличаются от вируса саркомы Рауса, способного трансформировать до 20-40% эмбриональных клеток культуры. Вначале трансформацию клеток вирусом полиомы удавалось наблюдать лишь в массе культивировавшихся клеток, причем не ранее чем через 10 дней после заражения, когда разросшаяся зона трансформированных клеток становилась легко видимой. Недавно было показано, что уже установившиеся культуры нормальных клеток трансформируются вирусами полиомы и 5У-40 в опухолевые с частотой, варьирующей от 1 : 2 до 1 : 10.

Частота трансформации может быть определена непосредственно путем количественного анализа клонов клеток, растущих в культуральной среде, содержащей агар. Нормальные фибробласты не в состоянии расти в такой среде, тогда как большинство трансформированных клеток обладает таким свойством.

После того как было установлено, что трансформация клеток вирусом полиомы является четким, хорошо воспроизводимым явлением, были предприняты попытки определить, сохраняется ли вирус в трансформированных клетках. Очевидно, можно представить себе две возможности:

1) клетка может сохранять состояние трансформации лишь в том случае, если гены вируса интегрированы с геномом клетки;

2) роль вируса сводится к инициации у клетки каких-то изменений, передающихся затем клеткам всех последующих генераций, однако дальнейшее присутствие вируса в клетке для поддержания состояния трансформации не обязательно. Анализ многих клонов трансформированных клеток, при получении которых в культуральную среду добавляли антивирусную сыворотку, показал, что большинство, если не все клональные линии трансформированных клеток, не содержат цельного инфекционного вируса. Более того, все попытки обнаружить в этих линиях трансформированных, не содержащих инфекционного вируса клеток, инфекционную вирусную ДНК, антигены, сходные с белками капсида, а также все попытки реактивировать вирусные гены путем заражения трансформированных клеток родственными мутантными вирусами (метод демаскировки гена) оказались совершенно безуспешными.

Однако в то же время с помощью иных иммунологических методов были получены данные, позволяющие предполагать, что в трансформированных вирусом полиомы клетках содержится и функционирует по крайней мере часть генома вируса. Эти исследования показали, что в таких клетках содержится чужеродный антиген, отличающийся от анти-тенов капсида вируса и ответственный за отторжение этих клеток организмом иммунологически компетентного животного. Еще более важным оказалось то, что все опухоли, индуцированные вирусом полиомы, по-видимому, содержат одинаковый вируеоепецифичный антиген. Наиболее вероятная интерпретация этих результатов состоит в том, что в таких клетках содержится геном вируса, который и ответствен за образование трансплантационного антигена.

Данные, полученные впоследствии при изучении клеток, трансформированных другими ДНК-содержащими вирусами, убедительно показали, что вышеизложенная интерпретация правильна. Так, было обнаружено, что в сыворотке крови животных, являющихся носителями свободных от вируса опухолей, индуцированных аденовирусами типа 12 и 18, содержатся комплемент связывающие антитела против антигенов, содержащихся в экстрактах культивируемых клеток, продуцирующих эти вирусы. Более того, эти антитела обладали соответствующей типовой специфичностью, т. е. у животных, в организме которых имелась опухоль, индуцированная аденовирусом типа 12, в сыворотке крови имелись и антитела против антигенов аденовируса типа 12, а не типа 18, и наоборот. Дальнейшие эксперименты показали, что в сыворотке крови хомяков, в организме которых имеются опухоли, индуцированные аденовирусом, содержатся антитела к той части капсида аденовируса, которая определяет типовую специфичность вируса. Эти данные свидетельствуют о несомненном наличии по крайней мере части генома вируса в не содержащих инфекционного вируса опухолях.

Дополнительные доказательства справедливости изложенной выше точки зрения были получены при изучении клеток, трансформированных вирусом 5У-40. Оказалось, что в этих клетках содержится опухолевый антиген, названный Т-антигеном, который отличается от антигенов капсида вируса. Т-антиген был обнаружен также в клетках, зараженных вирусом 5У-40, которые продуцируют инфекционный вирус и реагируют на заражение цитопэтической реакцией. В таких клетках Т-антиген появлялся за много часов до появления антигенов капсида вириона. Более того, в случае когда к зараженным клеткам с целью предотвращения синтеза вирусной ДНК добавляли фтордезоксиуридин или цитозинарабинозид, синтеза антигена капсида вируса не наблюдали никогда, тогда как опухолевый антиген синтезировался как обычно. Поэтому представляется вполне вероятным, что по крайней мере те гены вируса, которые детерминируют образование антигена этого типа, действительно включаются (интегрируются) в геном клетки.

Весьма противоречивы мнения о том, сколь велика часть генома вируса, включающаяся в геном клетки. Изучение относительной чувствительности к облучению цитопатической активности вируса полиомы (т. е. способности образовывать бляшки) и его трансформирующей активности показало, что при увеличении дозы ультрафиолета вирус сначала теряет способность образовывать бляшки и лишь при дальнейшем-воздействии оказывается неспособным трансформировать клетки. Эти данные согласуются с представлением, согласно которому для осуществления трансформации необходимо сохранение целостности, а возможно, и интеграции с геномом клетки лишь части генома вируса.

С другой стороны, были опубликованы данные, согласно которым линии клетки, трансформированные вирусом 5У-40, спорадически образуют зрелый инфекционный вирус. Однако такой способностью обладают далеко не все клетки, трансформированные вирусом. Действительно, как было показано впоследствии, большинство линий клеток, трансформированных вирусом 5У-40 и выделенных в виде отдельных клонов из культур, росших на культуральных средах, которые содержали антивирусную сыворотку, по-видимому, никогда не образуют полного вируса. Было, однако, обнаружено, что если эти клетки смешать с клетками почек африканских зеленых мартышек, то в такой культуре индуцируется образование вируса 5У-40. Кроме того, было показано, что некоторые вирусные частицы, по своему генотипу являющиеся вирусом 5У-40, могут размножаться лишь в том случае, когда в культуре одновременно содержится аденовирус. Однако образующиеся при их размножении вирионы обладают капсидом аденовируса. Поэтому возможно, что за наблюдаемое иногда образование вируса 5У-40 трансформированными клетками ответствен вирус-помощник.

Недавно было показано, что быстро метящаяся РНК (по-видимому,, информационная РНК), выделенная из клеток, трансформированных вирусом полиомы, специфически гибридизуется с ДНК вируса полиомы. Эти данные также свидетельствуют в пользу того, что в трансформированных клетках действительно содержится вирусная ДНК, причем, вероятнее всего, включенная в геном клетки. В клетках, трансформированных аденовирусом, эта вирусоспецифичная РНК концентрируется главным образом в полисомах. Этого и следует ожидать в случае, если часть содержащегося в трансформированной клетке вирусного генома активно функционирует. Таким образом, весьма вероятно, что в большинстве клеточных линий, трансформированных мелкими ДНК-содержащими вирусами, действительно содержатся гены вируса, которые, по-видимому, функционируют и продуцируют вирусо специфичные молекулы РНК и вирусо специфичные антигены.

Природа интеграции вирусной ДНК. Молекулярная сущность процесса интеграции молекулы вирусной ДНК с геномом клетки пока остается неясной, хотя результаты, полученные при изучении генетики умеренных бактериофагов, свидетельствуют о физическом включении ДНК фага в цепь ДНК хромосомы бактериальной клетки

Для решения этой проблемы могут оказаться полезными некоторые данные, полученные при изучении ДНК-содержащих опухолеродных вирусов. В настоящее время твердо установлено, что значительная часть молекул ДНК вируса полиомы, выделенных из чистого вируса, имеет форму замкнутого кольца. Исходя из того, что своеобразные седи-ментационные свойства ДНК вируса папилломы также наводят на мысль что ее молекула имеет кольцевую форму, и принимая во внимание, что молекула ДНК умеренного фага к может замыкаться в кольцо (что, по-видимому, и происходит при ее интеграции с геномом бактериальной клетки, Дульбекко выдвинул гипотезу о существовании связи между способностью ДНК образовывать кольцевую молекулу и ее интеграцией с геномом клетки.

Было показано, что заражение вирусом полиомы монослойных культур эмбриональных клеток мыши, разросшихся до такой максимальной плотности, при которой синтез ДНК в клетках прекращается, приводит к стимуляции образования ферментов, катализирующих синтез ДНК, и, как следствие этого, к увеличению синтеза ДНК в клетках. По крайней мере часть этой вновь синтезированной ДНК представляет собой клеточную, а не вирусную ДНК. Таким образом, вполне возможно, что интеграция вирусного генома становится возможной вследствие аномального или несбалансированного синтеза ДНК клетки-хозяина.

Интересные результаты были получены и исследователями, работавшими в несколько ином направлении. Так, Грин и Ласи показали, что ДНК аденовирусов типа 12 и 18 (аденовирусы этих типов индуцируют образование опухолей) более близка по нуклеотидному составу ДНК клетки-хозяина, чем ДНК аденовирусов некоторых других типов. Оказалось также, что степень гомологии между ДНК различных опухолеродных аденовирусов выше, чем между ДНК опухолеродных аденовирусов и ДНК аденовирусов, не индуцирующих образование опухолей. В связи с этим нельзя не вспомнить, что ДНК умеренных фагов также обладает нуклеотидным составом, сходным с нуклеотидным составом их бактерий-хозяев, и в ней действительно имеются последовательности оснований, гомологичные ДНК этих бактериальных хозяев.

Микроскопические картины роста трансформированных клеток, растущих в культуре, резко отличаются от нормальных. При изучении подвижности живых нормальных куриных фибробластов методом киносъемки было обнаружено, что в случае возникновения контакта между двумя нормальными клетками или даже между нитевидными выступами на поверхности клеток движение клеток прекращается {контактное ингибирование движения). Нормальные клетки вскоре после возникновения контакта между ними перестают делиться, благодаря чему при росте на поверхности стекла они образуют только монослойные культуры (контактное ингибирование роста).

При росте трансформированных клеток наблюдаются различного рода нарушения этих правил. Например, клетки, трансформированные вирусом саркомы Рауса (как продуцирующие ВСР и РАВ, так и не продуцирующие вирус), не обладают способностью к контактному ингибирова-нию и поэтому наползают друг на друга, образуя многослойные фокусы трансформации. Трансформация клеток этим вирусом приводит также к изменению формы клетки, причем это изменение вируса специфично. Известны мутантные штаммы вируса Рауса, индуцирующие образование стабильных линий клеток различной формы.

Подобные же фибробласты, трансформированные вирусом полиомы, характеризуются чрезвычайно разнообразной формой, и способность к контактному ингибированию у них отсутствует. По-видимому, наиболее эффективно контактное ингибирование проявляется в том случае, когда обе контактирующие клетки выполняют специфические функции. Так, например, трансформированная вирусом полиомы клетка, контактирующая с нормальной клеткой, теряет способность к делению, однако если такая клетка контактирует с другой трансформированной клеткой, то она сохраняет эту способность. Подобным же образом облученная трансформированная клетка, потерявшая способность к делению, ингибирует способность к делению другой, контактирующей с ней трансформированной клетки. Таким образом, можно полагать, что контактное ингибирование наблюдается, по-видимому, в том случае, если нормальная или трансформированная клетка получает сигнал со стороны нормальной клетки или клетки, потерявшей способность к росту.

Результаты, полученные в опытах, описанных выше, имеют несколько весьма важных аспектов. Известно, что клетки опухолей животных, индуцированные вирусом полиомы, по микроскопической картине весьма напоминают наиболее злокачественные типы клеток. Тем не менее эти опухоли имеют резко очерченные границы и обычно не метастази-руют. Возможно, причина такого поведения этих опухолей кроется в контактном ингибировании нормальными клетками размножения лишь тех трансформированных клеток, которые расположены на поверхности опухоли, тогда как размножение клеток, расположенных внутри опухоли, продолжается. Наиболее выраженными признаками злокачественности, в том числе и способностью к метастазированию, обладают клетки, не способные ни посылать, ни воспринимать сигналы, ведущие к контактному .ингибированию. Такие клетки образуются и в опухолях, индуцированных ^вирусом полиомы, и причиной их образования являются дальнейшие генетические изменения опухолевых клеток. Этот процесс был назван прогрессией. Наиболее вероятно, что в основе прогрессии лежит аномальность хромосомного набора трансформированных клеток. Как показали исследования , у трансформированных клеток, растущих в культуре, хромосомный набор не сохраняется постоянным, а колеблется, как у длительно перевиваемых клеточных линий. Такие единичные жизнеспособные клетки могут проникнуть в кровоток и инициировать образование масс опухолевых клеток в участках организма, расположенных Едали от первичной опухоли.

Результаты, полученные при изучении контактного ингибирования, навели на мысль, что поверхность клетки, быть может, и является той областью, где в конечном счете реализуются индуцируемые вирусом изменения, ведущие к трансформации клетки. Вообще говоря, о способности вирусов индуцировать изменения поверхности зараженных ими клеток свидетельствуют многочисленные уже ранее известные факты. Впервые такая мысль возникла под влиянием данных, полученных при изучении вируса гриппа. Так, Хойл при помощи микроскопии в темном поле обнаружил, что на поверхности клеток аллантисного мешка куриного эмбриона, зараженных вирусом гриппа, идет активный процесс. Дальнейшие исследования, проведенные с помощью электронного микроскопа, показали, что этот процесс представляет собой конечную стадию созревания вируса гриппа - заключение вирусного нуклеопротеида в оболочку, представляющую собой участок мембраны зараженной клетки. В липопротеид-кой оболочке вирионов миксовирусов, а, вероятно, также и арбовирусов содержатся компоненты, специфичные для мембраны клетки. Остается, однако, неясным, имеет ли место при этом процессе проникновение в мембрану новых вирусо специфичных белков и, как следствие, изменение мембраны, или механизм этого явления какой-то иной.

Хорошо известен и ряд других воздействий, оказываемых вирусами на поверхность инфицируемых ими клеток. Например, при заражении клеток вирусами герпеса, кори или вирусом Сендай происходит слияние мембран зараженных клеток, в результате чего образуются гигантские многоядерные клетки. Клетки, зараженные аденовирусами или вирусом полиомиелита, отрываются от поверхности стекла, а некоторые виды клеток при заражении вирусом осповакцины слипаются, образуя бесформенные массы .