Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов

На правах рукописи

Мазепа Владимир Николаевич

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов

03.02.03-микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва 2010г.

Работа выполнена в ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Ефимов Евгений Игоревич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Несвижский Юрий Владимирович

Доктор медицинских наук, профессор Русакова Екатерина Владимировна

Доктор биологических наук, профессор Белецкий Игорь Петрович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ

Защита диссертации состоится «_____» ______________ 20___ г. в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

Автореферат разослан «____» ____________ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

На современном этапе для успешного выполнения приоритетных национальных проектов и правительственных программ в сфере здравоохранения, которые традиционно ориентированы на предупреждение распространения и ликвидацию актуальных и социально-значимых инфекционных заболеваний, важное значение приобретает совершенствование методов их лабораторной диагностики.

Актуальной задачей является разработка и внедрение в практическую медицину и систему эпиднадзора технологий, отвечающих следующим требованиям: высокая чувствительность, прецизионная специфичность, информативность, объективность, экспрессность, высокая производительность, универсальность (выявление различных возбудителей в любом типе клинического материала), биобезопасность для исполнителей, возможность автоматизации процесса. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на выявлении уникальных фрагментов геномов инфекционных агентов, соответствует данным требованиям, существенно расширяет возможности диагностики, позволяет обнаруживать некультивируемые и труднокультивируемые формы микроорганизмов (Говорун B.М.,2000; Шагинян И.А.,2000;Ребриков Д.В., 2009; Mullis K.B., 1994; Newton C.R.,1997; Farrell D.J., 2001). Универсальность метода ДНК-диагностики и автоматизация практически всех этапов анализа позволяют осуществлять одновременное выявление нескольких инфекционных агентов, способных вызывать определенный тип патологии, проводить скрининговые обследования различных контингентов населения в профилактических целях.

Несмотря на обилие публикаций, посвященных методу ПЦР и его использованию в диагностике отдельных нозологических форм, работы содержащие материалы комплексных ПЦР исследований инфекционных заболеваний, обусловленных широким спектром возбудителей, достаточно редки. Данные о частоте выявления возбудителей зачастую противоречивы, а проблемы ПЦР обследования обширных контингентов одновременно на несколько различных инфекционных агентов и определения роли и места молекулярно-биологических методов в общей системе лабораторной диагностики инфекционных заболеваний освещены недостаточно.

Широко распространенные социально значимые инфекционные заболевания, такие как острые кишечные и негонококковые урогенитальные инфекции, хеликобактериозы и вирусные гепатиты приносят значительный вред здоровью жителей России и экономический ущерб (Кишкун А.А., 2002; Козлова В.И., 2003; Шахгильдян И.В. 2003; Подколзин А.Т., 2004,). Кроме этого, хеликобактериозы и гепатиты существенно снижают продолжительность жизни, а негонококковые урогенитальные инфекции отрицательно влияют на репродуктивную функцию. Активизация и оптимизация внедрения современных технологий в диагностику этих инфекций способствует своевременному назначению этиотропной терапии, уменьшению продолжительности лечения и количества осложнений.

В связи с вышеизложенным, особую актуальность приобретают вопросы выбора наиболее значимых направлений и объектов исследования, создания и подбора тест-систем для ПЦР-диагностики, их апробации и адаптации к медицинской практике, разработки оптимальных алгоритмов применения как отдельных диагностикумов, так и сочетаний нескольких тест-систем для улучшения технологичности, повышения эффективности и уменьшения стоимости исследований.

Цель работы - Оптимизировать и адаптировать собственные и имеющиеся отечественные экспериментальные и коммерческие ПЦР тест системы к решению задач диагностики острых кишечных инфекций, хеликобактерной инфекции, негонококковых урогенитальных инфекций, вирусных гепатитов; разработать стратегию и тактику использования метода ПЦР для наиболее рационального и эффективного выявления возбудителей этих заболеваний.

Задачи исследования:

1. Провести оптимизацию методов ПЦР-диагностики для выявления актуальных патогенов - возбудителей ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов В и С, НУГИ.

2. Разработать алгоритмы диагностики ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов В и С, НУГИ с использованием оптимизированных нами методов на основе отечественных ПЦР тест-систем.

3. Апробировать и адаптировать к практической диагностике систему молекулярно-биологических методов выявления актуальных бактериальных возбудителей ОКИ - бактерий родов Shigella, Salmonella, Yersinia, Campylobacter и генов, ответственных за патогенность энтеробактерий.

4. Оценить возможности метода ПЦР при изучении распространения бактерий H. pylori у больных разных возрастных групп с различными типами гастродуоденальной патологии, а также при внутривидовом типировании и выявлении генов факторов патогенности H pylori.

5. Разработать экономичный вариант метода ПЦР для оценки вирусной нагрузки у больных вирусными гепатитами В и С, изучить особенности репликации вирусов гепатитов В, С, D, G при моно- и смешанном инфицировании, определить эффективность и значимость вертикального пути передачи вирусов гепатитов В и С в Нижегородском регионе.

6. С помощью комплексного ПЦР исследования получить новые знания о распространении и особенностях циркуляции наиболее значимых возбудителей НУГИ (U. urealyticum, M. hominis, C trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II) у взрослых и детей, и о возможной связи отдельных представителей НУГИ с формированием различных форм патологии.

7. На основе полученных новых знаний определить роль и место молекулярно-биологических методов в лабораторной диагностике НУГИ, ОКИ, хеликобактерной инфекции, парентеральных вирусных гепатитов, провести апробацию разработанных алгоритмов их диагностики в практической медицине.

Научная новизна работы.

Впервые в Нижегородском регионе проведено освоение и внедрение в практическое здравоохранение и систему эпиднадзора метода ПЦР. На основе многолетних системных исследований группы возбудителей актуальных инфекционных заболеваний (ОКИ, хеликобактерная инфекция, НУГИ, вирусные гепатиты) получена новая объективная информация о распространенности и особенностях циркуляции инфекционных агентов среди населения.

Разработаны оптимальные алгоритмы применения амплификационных методов для решения задач диагностики ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов, НУГИ. Определены роль и место данных технологий в общей системе диагностических исследований для наиболее рациональной и эффективной реализации последних.

Впервые разработаны экспериментальные лабораторные тест-системы для выявления бактерий рода Shigella, и генов токсинов энтеробактерий (термолабильного - LT; термостабильного - ST; шигатоксина первого типа - VT1).

Впервые установлено, что использование ПЦР при первичном обследовании больных с подозрением на ОКИ позволяет более чем в 2 раза увеличить эффективность выявления бактерий родов Shigella и Salmonella по сравнению с классическим микробиологическим исследованием.

Впервые в РФ проведен многолетний мониторинг (18 лет) клинических изолятов энтеробактерий. Установлены особенности циркуляции в Нижнем Новгороде штаммов энтеробактерий, содержащих гены факторов патогенности. Наиболее распространены варианты, имеющие оперон инвазивности (Shigella ssp., E.coli). Показано, что циркуляция токсигенных штаммов энтеробактерий нехарактерна для Нижегородского региона. Выявлены единичные случаи обнаружения гена шигаподобного токсина первого типа у представителей Shigella ssp., E. col.i Впервые выявлен факт наличия у E. coli O127 генетических структур, сходных по нуклеотидной последовательности с геном адгезии холерного вибриона.

Установлена широкая распространенность H. pylori среди больных разных возрастов с различными типами гастродуоденальной патологии в Нижнем Новгороде (частота выявления 58,9% у детей и 82,9% у взрослых). Определена распространенность токсигенных вариантов H. pylori в бактериальной популяции. Варианты сagA + составили 76,4%, а варианты vakА + - 66,0% в популяции соответственно.

Определена активность репликации вирусов у больных хроническими гепатитами В и С разных возрастов при моноинфицировании, частота выявления вирусных нуклеиновых кислот составляла 48 - 50%. Установлено, что эффективность репликации вирусов гепатитов B, C, D, G снижается при смешанном инфицировании (вирусные нуклеиновые кислоты выявлялись суммарно в 25,5 -37,0% случаев в зависимости от состава ассоциации).

Определена вероятность вертикальной передачи вирусов гепатитов В и С в Нижнем Новгороде - 12,8% и 10,0% соответственно.

Впервые изучена циркуляция наиболее распространенных в Европе генотипов вируса гепатита С (1а, 1b, 2, 3а) на территории г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области. Показано доминирование генотипов 1b и 3а, частота их выявления несколько варьировала по годам и составляла 51,8-54,3% и 46,1-49,5% соответственно.

Исследованы особенности распространенности наиболее значимых возбудителей НУГИ - U. urealyticum, M. hominis, C trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II. Они обнаружены у 68% женщин и 40% мужчин. Показано многолетнее стабильное сохранение распределения возбудителей по частоте выявления. В течение всего периода наблюдения чаще других обнаруживались U. urealyticum (54,2% у женщин, 29,7% у мужчин)и M. hominis (25,8% у женщин, 14,5% у мужчин). Остальные виды инфекционных агентов определялись существенно реже.

На основе анализа частоты выявления возбудителей НУГИ в разных возрастных группах установлены этапы колонизации макроорганизма уреаплазмами, микоплазмами и вирусами группы гепеса. Показана связь возбудителей НУГИ с нарушениями репродуктивной функции и воспалительными процессами в различных отделах урогенитального тракта.

На клонированные фрагменты генов термолабильного токсина (LT) фактора адгезии (CFA1) и на алгоритм использования метода ПЦР для выявления возбудителей НУГИ у детей первых лет жизни получены патенты Российской Федерации № 2031948 по заявке №5016860/13; №2049822 по заявке № 92 - 012954/13; №2271003 по заявке №2003132188 соответственно.

Теоретическое значение работы.

Работа является одной из первых в Российской федерации, в которой рассматриваются проблемы комплексного подхода к ПЦР диагностике инфекционных заболеваний, обусловленных широким спектром возбудителей.

Предложена система адаптации отечественных ПЦР тест-систем к решению задач практической медицины и эпиднадзора, а также разработки алгоритмов рационального использования метода ПЦР в диагностике актуальных инфекционных заболеваний.

Полученные новые данные о распространенности труднокультивируемых форм возбудителей расширяют представления об эпидемиологических особенностях ОКИ, хеликобактерной инфекции, НУГИ и вирусных гепатитах.

Предложенные алгоритмы диагностики НУГИ, ОКИ, парентеральных вирусных гепатитов, хеликобактерной инфекции с применением метода ПЦР могут быть использованы в дальнейшем при разработке новых диагностических стандартов. Перечни ведущих инфекционных агентов, предложенные для одновременного выявления при комплексной ПЦР-диагностике НУГИ и ОКИ могут служить основой комплектации мультиплексных ПЦР-тест-систем с детекцией продуктов амплификации методом биочипов.

Практическое значение работы.

Направления исследований были выбраны в соответствии с потребностями и пожеланиями учреждений практического здравоохранения Нижегородского региона. Внедрение в практику метода ПЦР и разработка алгоритмов их применения позволили усовершенствовать клиническую диагностику и систему эпиднадзора и мониторинга за возбудителями бактериальных ОКИ, хеликобактериоза, НУГИ и вирусных гепатитов.

Оптимизация использования тест-систем , проведение одномоментного выявления наиболее распространенных инфекционных агентов, пулирование исследуемых субстратов позволили повысить эффективность выявления возбудителей, уменьшить продолжительность и стоимость исследований.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Для успешного внедрения и использования метода ПЦР в диагностике бактериальных и вирусных инфекционных заболеваний необходимо проведение стадий адаптации, оптимизации диагностикумов, определение наиболее важных и существенных аспектов, требующих привлечения ПЦР.

2. ПЦР может успешно использоваться для первичной скрининговой детекции бактериальных возбудителей ОКИ в лабораторной диагностике и санитарно-эпидемиологическом надзоре. Эффективность этиологической диагностики возрастает при одновременном выявлении ведущих инфекционных агентов: бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Y. enterocolitica.

3. Использование отечественных ПЦР тест-систем позволяет проводить не только первичную индикацию H .pylori, осуществлять оценку количества инфекционного агента и контролировать эффективность антихеликобактерной терапии, но и получять ряд существенных характеристик микроорганизма, таких как наличие генов факторов патогенности сagA и vakА, устойчивости к антибиотикам - макролидам без культивирования микроорганизма.

4. Наиболее значимыми направлениями использования ПЦР в решении проблемы парентеральных вирусных гепатитов является определение результативности противовирусной терапии, интенсивности репликации вирусов при и моно- и смешанном инфицировании и совершенствование профилактики вертикального пути передачи вирусов. Для этого успешно может быть использован разработанный нами экономичный полуколичественный вариант ПЦР.

5. ПЦР является основным методом детекции возбудителей НУГИ, позволяющим эффективно выявлять любой из микроорганизмов этой группы (вирусы, бактерии). Наиболее эффективно и экономически оправдано одновременное выявление у пациента пяти наиболее значимых и распространенных возбудителей: U. urealyticum, M. hominis, C trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II в пуле субстратов (смеси соскобов слизистых уретры, вагины, цервикального канала у женщин; смеси соскоба слизистой уретры и осадка мочи у мужчин; смеси слюны, мочи, слезного отделяемого у детей), в которых наиболее вероятно их присутствие.

В работу вошли результаты совместных исследований с Соринсоном С.Н., Бокаревым А.А., Бруснигиной Н.Ф., Черневской О.М. ,Маховой М.А., Орловой К.А., Немовым В.В., которые представлены публикациями в соавторстве. Автор выражает огромную благодарность сотрудникам лаборатории молекулярно-генетических методов надзора за инфекционными заболеваниями, сотрудникам ЛПУ, учреждений Роспотребнадзора, практических лабораторий, принимавших участие в проведении данных исследований и внедрении их результатов.

Апробация работы.

Диссертация апробирована на Ученом Совете ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 28.02.08 г., Протокол № 2.

Результаты работы доложены и обсуждены на II Съезде Биохимического общества РАН, г. Москва 1997 г.; на I Российском форуме «Мать и дитя», г. Москва, 1999 г.; на II Российском форуме «Мать и дитя», г. Москва, 2000 г.; на III Российском форуме «Мать и дитя», г. Москва, 2001 г.; на Научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика , протеомика и биоинформатика для медицины», г. Москва, 2002 г.; на Всероссиской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», г. Москва, 2002 г.; на Всероссиской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век», г. Саратов 2004 г.; на Всероссиской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней», г. Москва, 2004 г.; на Научной конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», г. Н.Новгород, 2004 г.; на VII Российском съезде инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней», г. Н.Новгород, 2006 г.; на Научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н.Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», г. Н.Новгород, 2006 г.; на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007», г. Москва, 2007 г.; на Международном симпозиуме «Папилломавирусная инфекция и злокачественные образования. Интегрированная система надзора и профилактики», г. С-Петербург, 2009 г.; на X Международном медицинском форуме «Профилактика заболеваний - основа качества медицинской помощи и благополучия человека», г. Н.Новгород, 2009 г.

Внедрение.

Получены патенты Российской Федерации: № 2031948 «Фрагмент ДНК LTf, предназначенный для выявления гена термолабильного энтеротоксина энтеробактерий» (27.03.95 г.); №2049822. «Фрагмент ДНК CFv, используемый для выявления энтеробактерий, обладающих фактором колонизации CFA I» (10.12.95 г.); №2271003 «Способ выявления наиболее значимых возбудителей негонококковых урогеннитальных инфекций (Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Cytomegalovirus, Herpes symplex I/II) у детей с использованием метода ПЦР» (27.02.2006 г.).

На основании материалов работы написаны: пособие для врачей «Полимеразная цепная реакция для выявления пилорического хеликобактера», 2000 г. утверждено Председателем секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии МЗ РФ академиком РАМН Покровским В.И., протокол №5 от 28.11.2000; методические рекомендации «Метод ПЦР-диагностики в обследовании новорожденных и детей первого года жизни», 2000 г.утверждены Главным государственным санитарным врачом Нижегородской области Петровым Е.Ю.; пособие для врачей «Принципы отбора, хранения и транспортировки биологических субстратов для проведения ПЦР-диагностики бактериальных и вирусных инфекций», 2002 г. утверждено Председателем секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии МЗ РФ академиком РАМН Покровским В.И., протокол №4 от 25.12.2001; пособие для врачей «Комплексное ПЦР-обследование на наличие возбудителей негонококковых урогенитальных инфекций женщин с гинекологической патологией и отягощенным акушерско-гинеколгическим анамнезом», 2005 г., утверждено Председателем секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии МЗ РФ академиком РАМН Покровским В.И., протокол №5 от 02.12.2005; медицинская технология «Комплексное ПЦР-обследование пациентов с инфекционно-аллергическими заболеваниями органов дыхания», 2008 г. рзрешение № 209/084 от 21.04.09 Минсоцздрава РФ; книга для практического врача «Диагностика и биокоррекция нарушений антиинфекционного гомеостаза в системе «мать-дитя», г. Нижний Новгород, 2004 г.; аналитические обзоры «Молекулярно-биологические методы в микробиологической диагностике», 1998 г.; «Современные методы диагностики ИППП», 2007 г.;

Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории молекулярно-генетических методов надзора за инфекционными заболеваниями ФГУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной» Роспотребнадзора. Исследования осуществлялись в рамках Федеральной Программы «Здоровье населения России», отраслевой научно-исследовательской программы МЗ РФ № 034 «Эпидемиология и микробиология» по договору «Новые технологии в профилактике, диагностике и лечении инфекционных заболеваний и использование их в эпиднадзоре» и ведомственной (отраслевой) целевой программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006-2010 г.г» по комплексной теме «Разработка комплексных мероприятий по диагностике, профилактике, лечению и эпиднадзору за актуальными инфекциями». В настоящее время предложенные нами алгоритмы ПЦР диагностики ОКИ, хеликобактериоза, вирусных гепатитов, НУГИ используются практическими лабораториями медицинских учреждений Нижнего Новгорода, применяющими метод ПЦР, что увеличивает точность индикации патогенов и приносит существенный экономический эффект, за счет оптимизации расхода диагностикумов. Публикации. По теме диссертации опубликовано 69 печатных работ, в том числе 20 в журналах из них 12 в рекомендуемых ВАК изданиях.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 94 отечественных и 306 зарубежных источников. Работа изложена на 334 страницах, компьютерного текста. Включает 47 таблиц и 36 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

Материалы.

Образцы фекалий, ректальные пробы, смывы с объектов внешней среды, пробы воды и продуктов питания, клинические изоляты бактерий и музейные культуры бактерий для исследований по диагностике ОКИ поступали из Нижегородского предприятия по производству иммуно-биологических препаратов «ИМБИО», детской клинической инфекционной больницы №8, клинической инфекционной больницы №9 (г. Н. Новгород), Городского центра санэпиднадзора Н.Новгорода, Областного центра санэпиднадзора Нижегородской области, кафедры эпидемиологии Нижегородской государственной медицинской академии, кафедры молекулярной биологии и иммунологии биологического факультета Нижегородского государственного университета.

Биоптаты слизистых желудка и двенадцатиперстной кишки, желудочный сок, фекалии для исследований по диагностике хеликобактерной инфекции были предоставлены клиникой Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии, ФГУ «Нижегородский НИИ детской гастроэнтерологии Росмедтехнолгий», ГУЗ «Нижегородский областной клинический диагностический центр», кафедрой внутренних болезней Военно-медицинского института Федеральной пограничной службы, кафедрой общей и клинической фармакологии Нижегородской государственной медицинской академии, ООО «Санаторий имени ВЦСПС» г. Н. Новгород.

Пробы крови, сывороток крови, плазмы крови для исследований по диагностике гепатитов были получены из гепатологического центра ГУЗ «Городская инфекционная клиническая больница №2», ГУЗ «Городская инфекционная клиническая больница №23» (г. Н. Новгород), Медсанчасти №50 г. Сарова Нижегородской области.

Соскобы слизистой уретры, влагалища, цервикального канала, образцы крови, мочи, слюны, слезного отделяемого для исследований по диагностике НУГИ представлены из лечебно-профилактических учреждений г. Н. Новгорода (МЛПУ Женская консультация №5, №20; Медсанчасть Нижегородского автозавода, Роддом №3, №6, №7; ГУЗ «Нижегородская областная клиническая больница им. Н.А.Семашко»; ГУЗ «Нижегородская областная детская клиническая больница»; МЛПУ Городская детская клиническая больница №1; МЛПУ Городская детская клиническая больница №27, ФГУ «Нижегородский институт детской гастроэнтерологии Росмедтехнологии», МЛПУ Городская клиническая больница №39).

Объем выполненных исследований представлен в таблице 1.

Таблица 1.

Объекты и объем исследований

Раздел работы	Объект исследования	Объем исследования
		Количество объектов	Количество ПЦР исследований
Диагностические исследования ОКИ	Взрослые	108	432
	Дети	884	2214
	Объекты внешней среды	450	1084
	Чистые культуры бактерий.	1814	4240
Исследования на H.pylori	Взрослые	975	1462
	Дети	318	478
Исследования на гепатиты	Взрослые	3247	7143
	Дети	986	2170
Исследования на возбудители НУГИ	Взрослые	17860	39128
	Дети	7084	19836
	Секционный материал	364	1930
Всего		34090	80117

Методы.

Молекулярно-биологические методы

Проведение работ с ДНК зондами, выделение хромосомных и плазмидных ДНК, выделение фрагментов ДНК из плазмид, препаративный гель-электрофорез, трансформация плазмидной ДНК в бактериальные клетки, введение метки в состав зондов, дот-гибридизация, гибридизация колоний проводились с использованием методов, изложенных в руководстве Маниатис Т. с соавт., (1984).

Подготовку клинических проб к проведению ПЦР осуществляли методом ферментативного лизиса и фенольно-хлороформной депротеинизации (в модификации Марковой Г.А. с соавт.,1994). Выделение ДНК проводили также наборами «ДНК-сорб А», «ДНК-сорб Б», а выделение РНК набором «Рибо-сорб-50» (все разработки ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с наставлениями по их применению.

Выявление генов факторов патогенности энтеробактерий, бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter, Y. enterocolitica, H. pylori, вирусов гепатитов В, C, D, G, возбудителей НУГИ проводили методом ПЦР. Использовали диагностикумы авторской разработки, экспериментальные и коммерческие отечественные тест-системы производства ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, НИИМ МО РФ г. Киров, фирм «Литех» (г. Москва), «Лагис» (г. Москва), «Интерлабсервис» (г. Москва).

Иммунологические методы.

Выявление антигенов вируса гепатита В, антител к вирусам гепатитов В, С, D, G; цитомегаловирусу, герпесу простому I и II типов, C. trachomatis проводили методом ИФА, Использовали тест-системы фирм «Диагностические системы» (г. Н. Новгород), «Имбио» (Н. Новгород), «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Выявление антигена C .trachomatis проводили методом ПИФ. Использовали тест-системы фирмы «Ниармедик» (г. Москва).

Микробиологические методы

Выявление бактерий родов Shigella, Salmonella проводили согласно Методическим указаниям, регламентирующим микробиологическую диагностику заболеваний, вызванных энтеробактериями.

Для выявления и культивирования U. urealyticum, M. hominis использовали дифференциально-диагностические среды фирмы «Диагност» (г. Омск) и клиники акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева (г. Москва).

Для визуализации клеток H. pylori использовали метод изучения парафинизированных срезов слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки (Аруин Л.И. с соавт., 1993); исследование мазков отпечатков биоптатов слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки (Анчукова Э.Г., 1992); микроскопирование отпечатков пристеночной слизи желудка и двенадцатиперстной кишки (Морозов И.А., 2000).

Статистические методы

Обработка данных выполнялась на компьютере с использованием программ Microsoft office (Excel), пакета статистических программ Statz, Statistica 6,0. Достоверность различий определяли общепринятым методом расчета ошибки среднего (m) и показателя существенности и вероятности (t).

В работу вошли результаты совместных исследований с Соринсоном С.Н., Бокаревым А.А., Бруснигиной Н.Ф., Черневской О.М. ,Маховой М.А., Орловой К.А., Немовым В.В., которые представлены публикациями в соавторстве. Автор выражает огромную благодарность сотрудникам лаборатории молекулярно-генетических методов надзора за инфекционными заболеваниями, сотрудникам ЛПУ, учреждений Роспотребнадзора, практических лабораторий, принимавших участие в проведении данных исследований и внедрении их результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Формирование материальной базы для проведения исследований.

На момент начала наших исследований в Российской Федерации достаточного опыта практической ПЦР диагностики не имелось, поэтому на исходном этапе работы значительное внимание было уделено решению ряда методических проблем - выбору оптимального материально-технического обеспечения ПЦР освоению и адаптации этого метода к практическим лабораторным исследованиям. Предпочтение было отдано отечественным разработкам.

При формировании приборной базы предпочтение было отдано амплификатору модели «Терцик МС2» («ДНК-технология, Москва). По рабочим параметрам он близок к зарубежным аналогам. В настоящее время этот прибор является базовым для большинства ПЦР-лабораторий Российской Федерации. Большая часть экспериментов проведена с использованием амплификаторов «Терцик МС2».

Среди изученных способов подготовки проб клинического материала были выбраны так называемые «сорбционные технологии», состоящие из стадий лизиса, сорбции ДНК на носителе, отмывки сорбированной ДНК от других макромолекул и элюирования ДНК с носителя. Этот способ технологичнее классического ферментно-фенольного метода, требует 2-2,5 раза меньше времени, получаемые препараты ДНК достаточно очищены и пригодны для постановки ПЦР. Для практических исследований нами использовались наборы для сорбционного выделения ДНК и РНК производства фирмы «Интерлабсервис» (Москва), которые обладали лучшими рабочими характеристиками по сравнению с аналогами.

Для выявления возбудителей ОКИ, хеликобактерной инфекции, НУГИ, вирусных гепатитов нами в основном использовались коммерческие и экспериментальные тест системы отечественных разработчиков и производителей. Однако на момент начала исследований некоторые необходимые диагностикумы, в частности, тест-системы для выявления генов факторов патогенности энтеробактерий в стране не производились. В связи с этим нами были созданы «in house» ПЦР тест системы для выявления генов термостабильного токсина (ST), термолабильного токсина (LT), шигаподобного токсина первого типа (VT1) и оперона инвазивности шигелл и энтероинвазивных эшерихий (Inv). Для этого на основании компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей ранее клонированных нами фрагментов генов факторов патогенности и имеющихся в банках данных аналогичных последовательностей были подобраны праймеры:

ST ТТ-1 5ґ- АTGACGGGAGGTAACATGAA - 3ґ (прямой)

TT-2 5ґ- TCCCTCTAAGCTTTTTAATA - 3ґ (обратный)

LT LT-1 5ґ- TCTCTATATGCACACGGAGC- 3ґ (прямой)

LT-2 5ґ- CCATACTGATTGCCGCAAT - 3ґ (обратный)

VT1 VT1/1 5ґ- GTCCTGCAGGGCGTGGAGGA - 3ґ (прямой)

VT1/2 5ґ- CGTAAAGCTTCAGCTGTCAC - 3ґ (обратный)

Inv SF-1 5 - GGAAGCTTAATACTCCTGAACGGCG - 3 (прямой)

SF-2 5 - GGAAGCTTAGGTGTCGGCTTTTCTG - 3; (обратный)

Праймеры синтезированы на базе Института биоорганической химии им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН (Москва). Праймеры на оперон инвазивности в дальнейшем успешно использовались для детекции бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Escherichia.

При проведении исследований рядом тест систем по инструкциям их разработчиков наряду со специфическими фрагментами синтезировались неспецифические фрагменты, которые затрудняли интерпретацию результата. Для снижения эффективности неспецифического синтеза проводили изменения программы амплификации и состава реакционной смеси по следующей схеме:

поградусное увеличении температуры отжига праймеров.

уменьшение продолжительности стадии синтеза цепи;

обеднение реакционной смеси (уменьшение количества праймеров, нуклеотидтрифосфатов, Taq-полимеразы);

Благодаря модификации доведены до приемлемых характеристик тест системы для выявления бактерий родов Salmonella фирмы «Ниармедик» (г. Москва); детекции генов патогенности холерных вибрионов НИИМ МО РФ (г. Киров); для выявления Н. pylori «Нelicobacter» фирмы «Ниармедик» (г.Москва); для детекции гена VacA Н.pylori «Хеликопол VA» фирмы Литех (г. Москва). В частности, наиболее качественные результаты при использовании тест-системы «Нelicobacter» были получены после увеличения температура отжига праймеров с 66^оС до 67^оС, уменьшения продолжительности стадии синтеза с 4 до 2,5 мин и уменьшения количества праймеров, трифосфатов и фермента до 80%.

Модификации при использовании других тест-систем были не столь значительны и ограничивались изменениями температуры отжига праймеров с целью улучшения качества электрофореграмм продуктов ПЦР.

Для оценки вирусной нагрузки при гепатитах В и С разработаны экономичные, полуколичественные варианты ПЦР с использованием коммерческих тест систем «АмплиСенс-HCV», «АмплиСенс-HBV» фирмы «Интерлабсервис» (г. Москва). Они базируются на исследовании десятикратных разведений кДНК для ВГС и десятикратных разведений ДНК пробы для ВГВ.

С целью определения концентрации Н.pylori и контроля эффективности противохеликобактерной терапии создан полуколичественный вариант ПЦР, основанный на определении возбудителя в десятикратных разведениях ДНК, выделенной из желудочного сока. Использована коммерческая тест-система «АмплиСенс-Helicobacter pylori-520» «Интерлабсервис» (г. Москва).

Поскольку ни одна из коммерческих ПЦР тест систем для выявления Н.pylori не комплектуется ВКО, предложен вариант оценки работоспособности используемых тест систем с помощью универсального ВКО для тест-систем на возбудители НУГИ.

Значимые направления использования молекулярно-биологических методов в диагностике бактериальных ОКИ.

Выявление генов факторов патогенности энтеробактерий.

Одним из важных аспектов диагностики бактериальных ОКИ является выявление штаммов, обладающих факторами патогенности (токсинами, факторами адгезии и инвазии). Они обуславливают эпидемическую значимость штаммов энтеробактерий и их способность вызывать инфекционный процесс в макроорганизме. Доказанная ранее возможность обмена генами факторов патогенности между разными видами энтеробактерий (Хесин Р.Б.,1985), позволяла предполагать их распространение в природных популяциях Enterobacteriaceae.

Для изучения этого вопроса могут быть применены только молекулярно-генетические методы исследования, так как классические методы выявления факторов патогенности неприемлемы из-за их сложности и невозможности исследования значительных количеств культур микроорганизмов. Впервые в Российской федерации в Нижнем Новгороде был проведен многолетний мониторинг (1985-2006 гг.) клинических изолятов энтеробактерий, с целью выявления генов наиболее значимых факторов патогенности. Всего было изучено 1814 штаммов. В разные периоды исследования использовались различные молекулярно-биологические технологии (по мере их совершенствования в стране): 1985-1994 гг. - ДНК зонды для выявления генов термолабильного и термостабильного токсинов, фактора инвазивности (собственная разработка) с радиоактивной и нерадиоактивной метками, 1994 - 1999 гг. «in hоuse» ПЦР-тест системы (собственная разработка), 1999 - 2005 гг. ПЦР тест-системы разработки отечественных производителей. Несмотря на существенную разницу диагностических возможностей этих методов и тест-систем получены непротиворечивые результаты. Показано, что для Нижегородского региона не характерна циркуляция токсигенных штаммов энтеробактерий. При изучении распространения четырех генов токсинов (термолабильного, термостабильного, шигаподобного 1 и 2 типов) отмечено только два эпизода появления в Нижегородском регионе токсигенных штаммов (в 1994 и 2003 гг). Все они содержали ген шигаподобного токсина 1 типа.

Наиболее распространеными оказались генетические детерминанты оперона инвазивности, что вполне логично, так как они являются обязательным атрибутом бактерий рода Shigella (табл. 2)

Гены факторов патогенности обнаружены только у шигелл и эшерихий. У представителей других изученных нами родов Enterobacteriaceae они не выявлены.

Таблица 2

Распространенность генов факторов патогенности у представителей семейства Enterobacteriaceae (1985-2006 гг.)

Энтеробактерии	Исследовано штаммов	Частота выявления генов факторов патогенности (в абс.ч.)
		vt1	vt2	lt	st	inv
Shigella	542	23	-	-	-	536
Еscherichia	284	21	-	-	-	6
Salmonella	505	-	-	-	-	-
Klebsiella,Enterobacte, Haffnia	297	-	-	-

Полученные результаты свидительствуют об отсутствии необходимости широких скрининговых исследований с целью мониторинга токсигенных штаммов и целесообразности избирательной проверки микроорганизмов, выделенных от больных с тяжелыми формами ОКИ. Нерешенной остается задача выявления токсигенных штаммов непосредственно в клиническом материале, продуктах питания и объектах внешней среды.

ПЦР-детекция бактерий родов Shigella и Salmonella.

Бактериальные возбудители ОКИ - бактерии родов Shigella и Salmonella представляют собой классические объекты медицинской микробиологии. Они давно и успешно выявляются бактериологическим методом, являющимся «золотым стандартом» их индикации. В своих исследованиях по изучению возможностей ПЦР при детекции этих микроорганизмов мы предполагали получить положительный эффект за счет уменьшения продолжительности анализа.

Для решения этой задачи была разработана «in hоuse» ПЦР тест-система для выявления бактерий рода Shigella, основанная на выявлении фрагмента ДНК оперона инвазивности, апробированы и адаптированы к практическим исследованиям экспериментальные отечественные ПЦР тест-системы фирмы «Интерлабсервис» (г. Москва).

Проведено обследование больных ОКИ - 165 человек на наличие шигелл и 526 человек на наличие сальмонелл. Эффективность выявления бактерий родов Shigella и Salmonella методом ПЦР была в 2,2-2,6 раза выше, чем бактериологическим методом. Исследование занимало не более одного рабочего дня.

Сходные результаты были получены при использовании метода ПЦР при проведении плановых противоэпидемических мероприятий (проверка санитарного состояния предприятий пищевой промышленности и торговли) и расследовании случаев вспышечной заболеваемости сальмонеллезами и шигеллезами. Частота выявления инфекционных агентов в смывах с объектов внешней среды, оборудования и продуктах питания (всего 450 образцов) ПЦР была в 2-2,5 раза выше, чем при бактериологическом исследовании. Высокая специфичность и чувствительность в сочетании с надежностью и простотой в применении позволили нам рекомендовать эти тест-системы для использования в практических лабораториях.

Комплексное ПЦР-исследование по выявлению основных бактериальных возбудителей ОКИ.

Внедрение нами в практическую диагностику экспериментальных тест-систем для выявления бактерий рода Campylobacter и Yersinia enterocolitica (разработки «ЦНИИЭ Роспотребнадзора») позволили проводить комплексное ПЦР-исследование одновременно на 4 ведущих возбудителя бактериальных ОКИ. В результате этого этиологическая расшифровка ОКИ возросла на 21,6% у детей и на 38,6% у взрослых больных. Этот показатель был достигнут за счет повышения эффективности детекции шигелл и сальмонелл и выявления бактерий рода Campylobacter и Y. enterocolitic, исследования на которые бактериологическими методами не проводятся. На рисунке 1 представлены результаты параллельного и одномоментного обследования 153 детей больных ОКИ методом ПЦР и бактериологическим методом

Shigella Y. enterocolitica

Salmonella Возбудитель не выявлен

Campylobacter

Рис.1. Выявление бактериальных возбудителей ОКИ у детей
1)методом ПЦР (данные в %),

2) бактериологическим методом (данные в %).

Следует отметить, что себестоимость комплексного ПЦР исследования на 4 инфекционных агента ниже себестоимости бактериологического исследования на бактерии родов Salmonella и Shigella. Все четыре ПЦР тест-системы могут успешно использоваться практическими лабораториями.

Продемонстрированное в настоящем исследовании столь значительное преимущество ПЦР детекции бактерий родов Salmonella, Shigella по сравнению с бактериологическим анализом (эффективность выявления выше в 2-3 раза), оказалось достаточно неожиданным. На наш взгляд имеется несколько причин, определивших большую разницу в эффективности методов.

Более высокая чувствительность метода ПЦР объясняется способностью выявлять погибшие клетки, а также «некультивируемые формы» бактерий. ПЦР является в настоящее время единственным надежным методом детекции подобных форм микроорганизмов. Обнаружение «некультивируемых форм» бактерий имеет важное практическое значение, так как при попадании в организм (или снижении концентрации антибиотика) они реверсируют в исходную форму, способную вызывать заболевание.

Наряду с преимуществами метода ПЦР в детекции бактериальных возбудителей ОКИ, имеется проблема, решить которую данным методом не представляется возможным - это определение видовой принадлежности шигелл и серовариантов сальмонелл, а также внутривидовая характеристика этих микроорганизмов. Несмотря на этот недостаток, ПЦР может быть рекомендована в качестве метода экспресс-детекции на уровне родов для бактерий Shigella, Salmonella, Campylobacter и на уровне вида для бактерий Y.еnterocolitica, что позволит существенно повысить оперативность и качество диагностики ОКИ. Наиболее целесообразно комплексное ПЦР обследование пациентов с подозрением на ОКИ, заключающееся в одномоментном выявлении всех четырех выше названных инфекционных агентов.

В диагностике и профилактике ОКИ примение ПЦР целесобразо по следующим направлениям:

-обследование лиц, поступающих в инфекционные стационары при спорадической заболеваемости для выявления основных бактериальных

возбудителей ОКИ.

-оперативное скрининговое обследование лиц, обсемененности объектов внешней среды, продуктов питания для определения источника, факторов и путей передачи инфекции при расшифровке вспышечной заболеваемости ОКИ.

-выявлениетруднокультивируемых возбудителей ОКИ;

-обнаружение генов факторов патогенности клинических изолятов Shigella, E. coli, выделенныхот больных ОКИ

-определение эффективности проведенных санитарно-противоэпидемических мероприятий.

ПЦР в диагностике хеликобактерной инфекции и изучении ее возбудителя.

H. pylori открыт относительно недавно (1983 г.) и система индикации этого микроорганизма в Российской Федерации окончательно не сложилась. Основные затруднения связаны со сложностью прямой специфической детекции H. pylori. Используемые в лабораторной диагностике методы, основанные на микроскопии, неспецифичны и субъективны. В связи с этим, мы рассматривали метод ПЦР как один из наиболее перспективных вариантов решения проблемы выявления H. pylori. Кроме этого, в условиях отсутствия возможности культивирования хеликобактера, нами ставилась задача оценить возможности ПЦР в качестве способа получения штаммовой характеристики этих микроорганизмов.

Оптимизация ПЦР-детекции H. pylori.

Впервые освоение метода ПЦР для целей практической диагностики осуществлялось нами на модели хеликобактера. На подготовительном этапе апробированы и адаптированы к практической ПЦР-детекции H. pylori отечественные экспериментальные тест-системы, подобраны оптимальные температурно-временные режимы амплификации и состав реакционной смеси.

Усовершентсвованный вариант ПЦР-детекции с высокой эффективностью выявлял H. pylori в биоптатах слизистой и желудочном соке. Между показателями частоты выявления хеликобактера в желудочном соке и биоптатах (71,9±4,0% и 72,6±3,9%) статистически достоверных различий не обнаружено (t < 2,6). С учетом последнего, желудочный сок, как субстрат с менее инвазивным получением и как более интегративный материал, рекомендован нами для исследования при детекции H. pylori.

При сравнении выявления H. pylori с помощью ПЦР и традиционными методами, доступными медицинской практике, установлено существенное преимущество ПЦР. Она в 2,5 раза эффективнее выявляет H. pylori, чем метод световой микроскопии (табл. 3).

Таблица 3

Сравнение результатов выявления H. pylori методами ПЦР и световой микроскопии, полученных при параллельном исследовании (n =107)

Метод исследования	ПЦР	Микроскопия
Результат	Н.р.+	Н.р.-	Н.р.+	Н.р.-
В абс. значениях	81	26	33	74
В %	75,7±4,1	24,29±4,1	30,8±4,4	69,16± 4,5

«Н.р.+» - H. pylori выявлен; « Н.р.-» - H. pylori не выявлен

Наиболее близки к результатам ПЦР данные, полученные микроскопией пристеночной слизи (браш-биопсия), но и этот метод уступает ПЦР в чувствительности. Эффективность выявления H. pylori методом ПЦР составила 83,3±6,0% от числа всех положительных проб. При исследовании пристеночной слизи желудка методом brush-биопсии хеликобактер выявлен в 70,8±7,4% случаев.

Изучение распространения H. pylori в Нижегородском регионе.

Метод ПЦР позволил определить объективную инфицированность хеликобактером больных с гастродуоденальной патологией в Нижегородском регионе, она составила 58,9±2,9% у детей и 82,9±1,8% у взрослых. Высокая частота обнаружения H. pylori среди населения г. Нижнего Новгорода во многом обеспечивается за счет раннего инфицирования детей. При всех типах гастродуоденальной патологии наблюдается высокая инфицированность больных H. pylori, что свидетельствует о способности этого микроорганизма провоцировать развитие и осложнять течение различных форм гастродуоденальных заболеваний. Особо следует отметить практически 100%-ную частоту выявления H. pylori у лиц с резекцией желудка (обследовано 20 человек) и ушиванием перфоративной язвы (46 человек). Эти данные позволяют сделать вывод о неэффективности эррадикации H. pylori при хирургических вмешательствах и необходимости проведения своевременной специфической антибактериальной терапии.

Разработка варианта ПЦР-детекции H. pylori, направленного на оценку эффективности проводимой антихеликобактерной терапии.

Для раннего контроля эффективности противохеликобактерной терапии (через 1-2 недели после окончания курса лечения) нами разработан и апробирован полуколичественный вариант ПЦР-детекции H. pylori. Он основан на выявлении ДНК микроорганизма в 10-кратных разведениях ДНК, выделенной из желудочного сока. Анализ отдаленных последствий проведенной терапии показал, что результаты исследований полуколичественным вариантом ПЦР имеют прогностическое значение при оценке предполагаемого эффекта от антихеликобактерной терапии. У пациентов, которые имели в контрольном ПЦР снижение концентрации H. pylori более чем в 1000 раз или отрицательный результат, при проведении контрольной эзофагогастродуоденоскопии наблюдались эндоскопические и клинические улучшения: рубцевание язв, эпителизация эрозий, уменьшение активности гастродуоденита. В течение года больные данной группы отмечали хорошее самочувствие, не обращались за медицинской помощью. У трех больных без эффекта эррадикации H. pylori (титр H. pylori до и после лечения одинаков), отказавшихся от повторного курса лечения, через 17-18 месяцев отмечен рецидив язвенной болезни. На рисунке приведен результат полуколичественного исследования желудочного сока пациента на наличие H. pylori до и после лечения.

 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Линия старта

исх 10^-1 10^-2 10^-3 исх 10^-1 10^-2 10^-3 К+ К-

проба проба

до лечения после лечения

Рис. 2. Электрофореграмма разведений ДНК H. pylori из проб желудочного сока

Использование ПЦР для выявления факторов патогенности и антибиотикорезистентности H. pylori.

Изучена возможность применения экспериментальных отечественных ПЦР тест-систем для получения биологической характеристики штаммов хеликобактера. В частности, апробирована система для выявления гена токсигенности сagA H. pylori. Тест-система «Диаген-Helicobacter» (фирмы «Лагис», г. Москва) не давала неспецифического синтеза, была удобна в работе и пригодна для практических исследований. С ее помощью установлена широкая распространенность токсигенных сagA+ штаммов H. pylori (76,4%). Показано, что большая часть заболеваний желудка ассоциирована с токсигенными штаммами H. pylori (63,4±4,9% всех «сagA+»-вариантов были обнаружены в биоптате слизистой желудка), а при патологии двенадцатиперстной кишки чаще выявлялись сagA-отрицательные варианты (82% от всех сagA-отрицательных изолятов);

Для выявления гена фактора патогенности H. pylori vacA использована тест-система «Хеликопол VA» (фирма «Литех», г. Москва). Ген vacA выявлен у 66% ПЦР-изолятов H.pylori (у 33 из 50), и только у 55% из них (у 18 из 33) установлен полный аллельный вариант гена vacA. Сложность и нестабильность работы тест-системы «Хеликопол VA», затруднения с интерпретацией результатов, возникающие из-за неспецифического синтеза, существенно затрудняют использование этого диагностикума в практических исследованиях.

Устойчивость H. pylori к антибиотикам - макролидам определяли с помощью ПЦР тест-системы «Эритропол» (фирма «Литех», г. Москва). Исследованы 97 образцов в которых ранее выявлена ДНК H. pylori. Устойчивые варианты выявлены в 3 случаях, что свидительствует о низком уровне резистентности к макролидам штаммов H. pylori, циркулирующих в Нижнем Новгороде. Проблем с интерпритацией результатов не возникало. Диагностикум может быть рекомендован для использования в практике.

Изучение гетерогенности нуклеотидных последовательностей фрагментов гена CagA H .pylori методом гетеродуплексного анализа.

При изучении возможности использования фрагмента гена cagA для определения генетического разнообразия штаммов H. pylori методом гетеродуплексного анализа была проведена оценка вариабельности его нуклеотидной последовательности. Показано, что фрагменты гена cagA у разных ПЦР-изолятов отличались между собой нуклеотидной последовательностью. По результатам гетеродуплексного анализа выявлено два варианта фрагментов. Ген cagA является перспективным в качестве одного из возможных маркеров для изучения штаммового разнообразия H. pylori (рис. 3)



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 К+

Рис. 3. Электрофореграмма гомодуплексов и гетеродуплексов фрагментов гена cagA H. pylori. Треки 5 и 6 содержат гетеродуплексы