Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов

Таким образом, за счет оптимизации и адаптации экспериментальных отечественных ПЦР тест-систем был предложен комплекс методов, дающий возможность проводить прямую, высокочувствительную, специфическую детекцию H. pylori в клиническом материале, осуществлять ранний контроль эффективности противохеликобактерной терапии, проводить маркирование клинических ПЦР-изолятов H. pylori по наличию у них генов факторов патогенности cagА и vacА и по степени гомологии гена cag А, определять устойчивость к антибиотикам - макролидам. Этот комплекс методов позволяет в значительной степени компенсировать отсутствие возможности культивирования хеликобактера.

Возможные направления использования ПЦР в диагностике парентеральных вирусных гепатитов.

Парентеральные вирусные гепатиты являются одной из важнейших проблем здравоохранения и их диагностике уделяется пристальное внимание. Основная масса задач по исследованию этих инфекций успешно решается различными иммунологическими методами. При анализе возможностей метода ПЦР в диагностике парентеральных вирусных гепатитов и сопоставлении результатов ПЦР исследований и ИФА тестов на ВГС и ВГВ показана нецелесообразность использования ПЦР для массового первичного скрининга. Вместе с тем установлено, что проведение ПЦР при обследовании больных без белковых маркеров инфекции, но с клиническими признаками гепатита позволяет выявлять ВГС даже в период «серонегативного окна».

Разработка полуколичественного варианта ПЦР для детекции ВГВ и ВГС и оценки вирусной нагрузки

Основное преимущество метода ПЦР перед другими диагностическими технологиями выявления ВГС и ВГВ состоит в том, он наиболее точно позволяет определить активность репликации вирусов, оценить их концентрацию в крови и других биологических жидкостях, что дает возможность объективно охарактеризовать стадию развития заболевания и контролировать эффективность противовирусной терапии. В связи с этим, разработка варианта ПЦР для обследования больных гепатитами С и В до начала лечения и последующего контроля терапии представлялась нам одним из наиболее существенных аспектов применения ПЦР в диагностике вирусных гепатитов. Предложенный нами вариант базируется на использовании классической ПЦР с элекрофоретическим выявлением продукта реакции и возможностью оценки вирусной нагрузки. Для оценки концентрации вирусов был применен метод десятикратных серийных разведений: кДНК для ВГС и ДНК, выделенной из крови (плазмы или сыворотки) для ВГВ. Такой подход, названный нами полуколичественным, оказался достаточно объективным и информативным при оценке эффективности противовирусной терапии.

Предложенный вариант ПЦР значительно дешевле исследований с применением тест-систем, использующих гибридизационно-ферментное выявление продукта амплификации и ПЦР, базирующейся на технологии «Real - time». Возможно, современные технологии более точно определяют концентрацию вируса. Но эти показатели также являются относительными, поскольку при определении концентрации вируса амплификация реального образца сравнивается с калибровочной кривой, построенной на основании результатов амплификации десятикратных разведений контрольной сыворотки, при этом не имеется возможности сопоставить степень ингибирования амплификации в пробе и контроле.

Изучение распространенности ВГС ведущих генотипов в Нижегородском регионе.

Одним из важных этапов диагностики ВГС является определение его генотипа. Генотипирование ВГС имеет как научное, так и практическое значение, поскольку лечение больных, инфицированных ВГС генотипа 1b отличается от терапии заболеваний, вызванных вирусами других генотипов. Использование мультиплексной ПЦР тест-системы проиводства фирмы «Интерлабсервис» (Москва) позволило дифференцировать четыре наиболее распространенных в Евразии генотипа ВГС - 1b, 1а; 2; 3а (табл.4 ).

Таблица 4

Выявление доминирующих генотипов ВГС на территории Нижнего Новгорода и Нижегородской области за период 2002-2006 гг.

В Нижегородском регионе за период 2001-2006 гг. чаще других у больных гепатитом С обнаруживались вирусы генотипов 1b и 3а. Частота выявления генотипов 1b и 3а варьировала по годам и составляла 51,8-54,3% и 46,1-49,5% соответственно. Вирусы генотипа 2 обнаруживались каждый год с невысокой частотой от 0,8 до 3,6%, а вирусы генотипа 1а были выявлены только в 2004, 2005, 2006 гг. с частотой от 0,5 до 2,3%. С 2004 г. наметилась тенденция возрастание частоты инфицирования пациентов ассоциациями ВГС двух генотипов. В 2001, 2002, 2003 гг. частота обнаружения ассоциаций не превышала 1,7% и они представляли комбинацию двух ведущих генотипов 1b и 3а. В 2004 г. ассоциации составили 4,6% и были представлены 2 видами - 1b 3а и 1а 1b. К 2005 году частота выявления ассоциаций разных генотипов достигла 8% и имелось уже 4 типа ассоциаций: 1b 3а; 1а 1b; 1b 2; 1а 2. Увеличение количества микст инфекций ВГС вероятно связано с неоднократным инфицированием больных. Высокая частота выявления вирусов генотипа 1b и вероятность реинфекции ими больных, ранее заразившихся ВГС других генотипов, свидетельствует не только о необходимости определения генотипа при первичном обследовании, но и о целесообразности повторного определения генотипа в случае активизации репликации вируса на фоне успешного лечения.

Активность репликации вирусов при разных формах вирусных гепатитов.

Метод ПЦР позволил оценить особенности репликации вирусов гепатитов при различных вариантах инфицирования. При вирусных гепатитах В, С, G (моноинфекции) частота выявления вирусных нуклеиновых кислот была не менее 47±2,3%. Гепатиты смешанной этиологии характеризовались более низкой интенсивностью течения процесса. При микст-инфекции ВГС+ВГВ вирусные нуклеиновые кислоты выявлялись достоверно реже - в 25,5±1,4%; при микст-инфекции ВГС+ВГG - 37,0±2,4% (t > 2,6).

Такое ингибирование вирусной репликации возможно обусловлено явлением интерференции вирусов в клетке-хозяине. В большинстве случаев размножается только один из компонентов ассоциации. Случаи выявления одновременной репликации двух вирусных нуклеиновых кислот составили максимально 19,0% от числа положительных проб при миксте ВГС+ВГG и минимально - 8,1% от числа положительных проб для пары ВГС+ВГВ. Не выявлено случаев одновременной репликации нуклеиновых кислот трех вирусов. Не установлено доминирования одного из вирусов в ассоциациях из двух или трех компонентов. Вирусные нуклеиновые кислоты выявлялись, как правило, с близкими или практически одинаковыми частотами. Исключение составила ассоциация ВГВ+ВГD. Репликация ВГВ при смешанной инфекции наблюдалась в 2 раза чаще, чем репликация ВГD. Вероятно это объясняется тем, что ВГD является сателлитом ВГВ, а не самостоятельным, полноценным вирусом. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости выявления нуклеиновых кислот всех вирусов ассоциации при проведении лечения гепатита смешанной этиологии.

ПЦР в профилактике вертикального пути передачи ВГС и ВГВ

Одной из важных проблем парентеральных вирусных гепатитов является профилактика вертикального пути передачи инфекции и ранняя диагностика гепатита у новорожденных и детей первого года жизни. Проведенные нами исследования показали, что несмотря на снижение активности вирусного процесса у беременных (частота выявления вирусных нуклеиновых кислот существенно ниже, чем в других группах больных) эффективность инфицирования детей достаточно высока. У детей, рожденных женщинами больными ВГС, в первый месяц жизни в 10,1±3,2% случаев выявляется РНК ВГС (табл.5)

Таблица 5

Частота выявления РНК вируса гепатита С у детей разных возрастных групп

Аналогичный показатель при ВГВ составил 12,8±2,8%. Предварительная проверка больных ВГС беременных женщин (104 человека) на наличие вирусной РНК и проведение лечения при выявлении РНК позволили достоверно снизить вероятность инфицирования новорожденных. В этой группе частота выявления ВГС у детей составила 4,8±2,1%. Полученные результаты подтверждают необходимость проведения ПЦР-обследования на наличие вирусных нуклеиновых кислот женщин, имеющих белковые маркеры вирусных гепатитов, в дородовый период, а детей, рожденных ими, в первый месяц жизни.

Изучение эффективности метода минипулов при обследовании доноров.

Одним из возможных источников инфицирования вирусными гепатитами является контаминированная донорская кровь. В связи с этим, нами проведена оценка возможностей отечественных ПЦР-тест систем при проверке банков донаций крови методом минипулов. Анализ частоты встречаемости различных вариантов вирусных нагрузок у больных хроническим ВГС за период 1997-2006 гг. показал, что при использовании отечественных ПЦР тест-систем на ВГС, имеющих чувствительность 5х10³ -10³ частиц в мл, для проверки пулов донорской крови эффективность выявления вируса составит 60 - 85%. Этот показатель не позволяет рекомендовать данный вариант ПЦР-минипулов для практического применения.

В то же время показана высокая экономическая целесообразность ПЦР обследования на вирусные гепатиты постоянных доноров крови группы риска (повышенная активность ферментов печени). При анализе 1746 образцов крови РНК ВГС выявлена в 7,5% случаев, а ДНК ВГВ - в 2,8%. Стоимость лечения больных при минимальном инфицировании донорской кровью (90 доноров, у которых выявлены ВГС и ВГВ заразят только по 1 человеку) в 74 - 172 раза превысила бы стоимость данного исследования.

Таким образом, метод ПЦР в системе диагностики вирусных гепатитов наиболее целесообразен при обследовании больных перед лечением и для проведения контроля его эффективности. Для этой цели, на наш взгляд, с успехом может быть использован разработанный в данном исследовании экономичный полуколичественный вариант метода ПЦР. Кроме этого, имеется еще ряд важных аспектов, решение которых не возможно без использования методов РНК-ДНК диагностики, такие как - выявление мутантных форм ВГВ, детекция ВГС в период серонегативного окна, совершенствование профилактики вертикального пути передачи гепатитов и повышение безопасности манипуляций при переливании крови и трансплантации органов.

ПЦР в диагностике негонококковых урогенитальных инфекций

Наиболее сложным и масштабным этапом данной работы были исследования, посвященные диагностике НУГИ, поскольку подобные работы в Нижегородском регионе ранее не проводились. Объективная информация о распространенности возбудителей НУГИ отсутствовала.

Особенности распространения и циркуляции возбудителей НУГИ.

Нами проводилось изучение распространенности и особенностей циркуляции наиболее значимых и важных представителей этой группы: U. urealyticum, M. hominis, C. trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II. Было установлено широкое распространение этих возбудителей среди взрослого населения - здоровых и бессимптомных носителей. Они обнаружены у 68±1,3% женщин и 40±3,8% мужчин.

На протяжении всего двенадцатилетнего периода наблюдений сохранялось следующее распределение возбудителей по частоте их выявления: первое место занимали U. urealyticum (54,2% у женщин, 30,2% у мужчин); второе - M. hominis (25,8% у женщин, 14,5% у мужчин); третье - Cytomegalovirus у женщин - 10,8%; C. trachomatis у мужчин - 6,7%; четвертое - C. trachomatis у женщин - 8,4%, Cytomegalovirus у мужчин - 3,0%; пятое - Herpes simplex I/II (2,4% у жещин, 1,2% у мужчин).

Выявлена статистически достоверная разница в частоте выявления возбудителей НУГИ (за исключением хламидий) у женщин и мужчин. Инфицированность мужчин в 1,7 раза ниже. У женщин микоплазмы и уреаплазмы выявляются в 1,8 раза чаще, чем у мужчин; герпес - в 2 раза; цитомегаловирус - в 3,6 раза.

Выявлено широкое распространение ассоциаций возбудителей НУГИ. Так, у 38,8±1,7% инфицированных женщин выявлялись ассоциации микроорганизмов, у инфицированных мужчин ассоциации обнаружены в 29,9±5,6% случаев. Все инфекционные агенты, кроме U. urealyticum, чаще выявлялись в ассоциациях. Никаких преимущественных вариантов сочетаний и выраженных взаимоотношений возбудителей (симбиоз, антагонизм) не обнаружено. Вероятность выявления той или иной ассоциации определялась только частотами обнаружения составляющих ее микроорганизмов. Преобладали варианты из двух возбудителей (77,2±2,3% - у женщин и 80,0±8,9% - у мужчин) с доминированием ассоциации уреаплазма-микоплазма (45,4±2,8% всех ассоциаций у женщин и 45,0±11,1% - у мужчин). Варианты из 3 микроорганизмов составляли 20,7±2,3% у женщин и 20,0±8,9% - у мужчин. Смешанные инфекции, при которых обнаружены 4 или 5 возбудителей, выявлены только у женщин в 7 случаях, что составило 2,1±0,8%.

Показатели частоты выявления возбудителей НУГИ за 12 летний период исследования изменялись следующим образом: с 1998 года 2001 наблюдался рост числа инфицированных до максимума в 2000-2001 годах. В этот период соответствующие показатели увеличились: для U .urealyticum с 43,8% до 56,5%; M. hominis с 19,2% до 31,1%; Cytomegalovirus с 9,3% до 13,8%; C. trachomatis с 7,1% до 9,9%; Herpes simplex I/II с 1,1% до 2,6%. В период 2002-2003 годов отмечалось снижение частоты выявления инфекционных агентов до уровней, близких значениям 1998г. В 2004 -2005 гг. снова наметился рост. Второй максимум частоты выявления возбудителей НУГИ наблюдался в 2006 и 2007 гг., но показатели 2001 года достигнуты не были, после чего в 2008 и 2009 годах частота выявления инфекционных агентов снизилась. Как увеличение, так и уменьшение частоты обнаружения возбудителей НУГИ, как правило, проходило синхронно для большинства выявляемых возбудителей (рис. 4).

Рис 4. Частота выявления возбудителей НУГИ у женщин репродуктивного возраста по годам, в %

У - U. urealyticum; М - M. hominis; Х - C .trachomatis; Ц - ЦМВ; Г - ВПГ I/II

Зависимости частоты выявления возбудителей НУГИ от сезона года нами не выявлено. Средние показатели числа инфицированных за все зимние, весенние, летние и осенние сезоны по каждому из выявляемых микроорганизмов были практически одинаковы.

Особенности распространения возбудителей НУГИ при воспалительных заболеваниях урогенитального тракта и патологии репродукциии у женщин и мужчин.

По данным ряда отечественных и зарубежных авторов, в выборках больных людей частота выявления возбудителей НУГИ выше, чем в группе здоровых и бессимптомных носителей. При обследовании мужчин и женщин с воспалительными процессами в органах мочеполовой системы и женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом нами выявлено увеличение частоты выявления U. urealyticum, M. hominis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II - у женщин и U. urealyticum, M. hominis, C. trachomatis, Herpes simplex I/II - у мужчин.

Наиболее ярко это проявляется при уретрите у мужчин, вагините, кольпите у женщин, а также у женщин с первичным бесплодием.

Роль U. urealyticum, M. hominis, C. trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II в развитии воспалительных процессов в урогенитальном тракте подтверждается тем фактом, что при проведении лечения с учетом присутствия этих микроорганизмов удается достичь выздоровления пациентов. В то же время, выявление U. urealyticum, M. hominis с достаточно высокой частотой (40-60%) у здоровых людей и бессимптомных носителей свидетельствует о том, что их проникновение в организм не всегда сопровождается развитием заболевания.

При изучении распространенности папилломавирусов в Нижегородском регионе ВПЧ с генотипами высокого канцерогенного риска выявлены у 27,3±1,7% обследованных, не имевших признаков изменения эпителия слизистых. В группе женщин с признаками дисплазии и/или эрозии эпителия шейки матки онкогенные папилломавирусы выявлялись незначительно чаще - в 32,0±4,4% случаев.

Одной из важных проблем диагностики НУГИ является оценка эффективности проводимой терапии. Нами показано, что метод ПЦР позволяет проводить объективную оценку эффективности лечения. Среди возбудителей НУГИ наиболее устойчивыми к терапии оказались U. urealyticum, M. hominis. Они чаще других выявлялись при контрольных ПЦР исследованиях после лечения - 40,2±2,4% и 23,3±2,0% соответственно. Устойчивость, как было определено, связана с широким распространением антибиотикорезистентных форм этих микрорганизмов, в первую очередь, среди U. Urealyticum. Поэтому в алгоритм выявления возбудителей НУГИ, базирующийся на одномоментной ПЦР детекции U. urealyticum, M. hominis, C. trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II, в случае выявления U. urealyticum, M. hominis, нами был введен этап микробиологического исследования, одной из целей которого является определение спектра антибиотикорезистентности.

Вертикальный путь передачи возбудителей НУГИ. Этапы колонизации организма возбудителями НУГИ.

Одним из важнейших аспектов НУГИ является их влияние на развитие беременности и плода. Инфекционные агенты из данной группы могут в случае реализации вертикального пути передачи вызывать различные патологические процессы у детей.

Сравнение частот выявления возбудителей НУГИ у беременных женщин и новорожденных выявил высокую вероятность передачи возбудителей НУГИ от инфицированных матерей новорожденным внутриутробно и во время родов. Теоретически рассчитанная эффективность инфицирования составила 44,3% для U. urealyticum; 58,5% для M. hominis; 39,3% для C. trachomatis; 55,6% для Cytomegalovirus; 16,7% для Herpes simplex I/II. Сходные результаты получены при обследовании 60 пар мать-ребенок (до 1 месяца), у них в 46% случаев выявлены одинаковые инфекционные агенты, преимущественно микоплазмы и цитомегаловирусы.

Анализ распространенности возбудителей НУГИ у детей разных возрастных групп позволил установить этапы колонизации макроорганизма вирусами группы герпеса и бактериями представителями родов Mycoplasma и Ureaplasma.

Цитомегаловирус и вирус герпеса простого обнаруживается у новорожденных в 5,8±1,3% и 0,4±0,3% случаев соответственно, что свидетельствует о том, что вертикальный путь передачи не является ведущим при инфицировании человека этими агентами. В дальнейшем частота их выявления резко возрастает. Активная колонизация организма вирусами группы герпеса происходит в первые месяцы и годы жизни за счет других путей передачи (контактно-бытового, аэрозольного) и к 2-х летнему возрасту не менее 65% людей инфицированы цитомегаловирусом и не менее 8% - вирусом герпеса простого. Нами представлены максимальные значения частот выявления активной репликации вирусов. С учетом того, что герпесвирусы могут длительное время пребывать в латентной форме, не размножаясь, показатели истинной инфицированности, по видимому, еще выше.

От 23,9±2,4% до 30,9±2,6% новорожденных инфицируются U. urealyticum внутриутробно и в процессе родов. Однако, у большей части детей заболевание не развивается, а бактерии элиминируются из организма. Это следует из того, что у детей старше года и до 13 лет частота выявления уреаплазм существенно меньше, чем у новорожденных и составляет 4-8%. Большая часть человеческой популяции колонизируется U. urealyticum начиная с 14-ти летнего возраста в период полового созревания и активной репродукции, в основном, за счет полового пути передачи. Частота выявления этих микроорганизмов в данный период у здоровых людей и бессимптомных носителей может превышать 50%.

Частота инфицирования детей M. hominis внутриутробно и при родах составляет 13,2±1,9 -15,2±2,0%. И в дальнейшем уровень выявления этого инфекционного агента стабильно поддерживается до 13-ти летнего возраста (12 - 15%). Второй этап колонизации макроорганизма так же, как и в случае с U. urealyticum, начинается с 14-ти лет и связан с половым путем передачи. Частота выявления M. hominis у здоровых людей в этот период может достигать 25%.

Особенности взаимодействия макроорганизма с возбудителями НУГИ.

Высокая частота выявления U. urealyticum и M. hominis у здоровых людей свидительствует о том, что проникновение этих мембранных паразитов в организм человека не всегда приводит к развитию заболевания. При инфицировании может происходить формирование своеобразного компонента общего микробиоценоза человека - микробиоценоза мембран клеток слизистых оболочек.

Развитие патологических процессов, обусловленных микоплазмами и уреаплазмами, является не только результатом внешнего заражения, а зачастую представляет собой сбой в сформировавшемся микробиоценозе, приводящий к нарушению нормального взаимодействия макро - и микроорганизма. По-видимому, это обусловлено нарушениями функционирования иммунной системы. Наряду с инфекционным компонентом при воспалительных процессах, ассоциированных с уреаплазмами и микоплазмами, обнаруживаются различные варианты аутоиммунных процессов. Нами было проведено одновременное обследование 38 больных женщин на возбудители НУГИ и антитела к нативной ДНК, кардиолипину, миоглобину, хорионическому гонадотропному гормону. Показано, что у всех инфицированных уреаплазмами и микоплазмами регистрировались повышенные концентрации аутоантител к одному или нескольким маркерам. Максимальные концентрации аутоантител и наибольшее их разнообразие отмечено для больных с ассоциацией уреаплазма - микоплазма. У пациентов, инфицированных C. trachomatis, аутоиммунные процессы не выявлены.

Проведенные исследования продемонстрировали, что ПЦР является основным базовым методом, позволяющим эффективно выявлять все виды возбудителей НУГИ. За счет его применения были получены оригинальные данные о распространении и особенностях циркуляции этих микроорганизмов, заключающиеся в высокой частоте выявления, значительном количестве ассоциаций инфекционных агентов и достаточно стабильном поддержании распределения возбудителей по частоте выявления. Анализ результатов ПЦР исследования позволил также установить этапы колонизации макроорганизма бактериями родов Mycoplasma, Ureaplasma и вирусами группы герпеса.

Нами установлены контингенты, которые целесообразно обследовать на наличие НУГИ. Предложен комлексный вариант ПЦР-детекции наиболее значимых возбудителей НУГИ, основанный на одномоментном выявлении U. urealyticum, M. hominis, C. trachomatis, Cytomegalovirus и Herpes simplex I/II. Для увеличения эффективности выделения инфекционных агентов рекомендуется исследовать смеси субстратов, в которых наиболее вероятно их присутствие: у женщин - смеси соскобов слизистых уретры, влагалища и цервикального канала; у мужчин - смеси соскоба слизистой уретры и осадка мочи; у детей - смеси мочи, слюны, слезного отделяемого.

На основании результатов проведенных исследований можно сделать вывод о том, ПЦР может рассматриваться как основной базовый метод в диагностике НУГИ и хеликобактерной инфекции и как метод первичного скрининга для выявления наиболее значимых бактериальных возбудителей ОКИ. Метод ПЦР нецелесообразно использовать в качестве стартового этапа обследования пациентов с подозрением на парентеральные вирусные гепатиты. По информативности и себестоимости он уступает тесту на HBs-антиген для ВГВ и тестам на антитела для ВГС. Но ПЦР является единственным из методов лабораторной диагностики, который дает возможность выявлять вирус в период «серонегативного окна», осуществлять контроль противовирусной терапии, проводить раннее выявление инфицирования новорожденных от больных ВГВ и ВГС матерей, отслеживать циркуляцию и смену генотипов вирусов.

Наиболее объективные результаты получаются при ПЦР диагностике тех заболеваний, при которых инфекционные агенты выходят в биологические жидкости организма (кровь, мочу, слюну, слезное отделяемое) или локализуются на кожных и слизистых покровах. При диссеминации инфекции и очаговой локализации возбудителя ПЦР диагностика не эффективна.

Повышение эффективности выявления инфекционных агентов, уменьшение продолжительности и себестоимости анализа достигается одновременным анализом пула (смеси) субстратов, в которых вероятно присутствие наиболее значимых для данной патологии возбудителей.

Применение в современных ПЦР тест-системах внутреннего контрольного образца, антиконтаминационной модификации ампликонов и разработка тест-систем с флюоресцентной детекцией ампликона (технологии PCR - Real time и PCR - End point) значительно снизили вероятность контаминации и получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Но все эти совершенствования затрагивают только стадии ПЦР и детекции продукта амплификации. Как показывает практика, наибольший риск перекрестной контаминации, вызывающей ложноположительные результаты и потеря исследуемого материала и разрушение инфекционных агентов в субстратах, приводящие к ложноотрицательным результатам, связаны со стадиями отбора, хранения и транспортировки образцов. Перекрестная контаминация возможна также и на стадии подготовки материала к ПЦР. Вести объективный контроль этих стадий сложно, их успех, главным образом, определяет квалификация исполнителя. Разработанные в ходе выполнения данной работы алгоритмы ПЦР диагностики НУГИ, ОКИ, парентеральных вирусных гепатитов, хеликобактерной инфекции с применением метода ПЦР могут быть использованы в дальнейшем при разработке новых диагностических стандартов. Предложенные перечни инфекционных агентов для комплексной диагностики НУГИ и ОКИ являются основой для комплектации мультиплексных ПЦР-тест систем с детекцией продуктов амплификации методом биочипов.

Учитывая опыт использования институтом молекулярно-биологических методов, и на основании исследований, проводимых при выполнении данной диссертационной работы на базе Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии в соответствии с приказом №2 от 03.01.1995 г. Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации был сформирован первый в Волго-Вятском регионе многопрофильный ПЦР диагностический центр (Волго-Вятский региональный научно-практический центр по индикации, идентификации и таксономии микроорганизмов и организации противоэпидемической работы в экстремальных условиях). Основу деятельности центра составили направления нашей работы: выявление возбудителей НУГИ, ОКИ, хеликобактериоза, вирусных гепатитов. При проведении диагностических исследований используется комплексный подход, заключающийся в одновременном выявлении наиболее значимых возбудителей заболеваний. Разработанные алгоритмы диагностики инфекционных заболеваний и модификации технологий непосредственно после апробации внедряются в работу центра.

В настоящее время в Нижегородском регионе наиболее востребованными аспектами в работе центра являются:

-по диагностике НУГИ - обследование семейных пар, планирующих рождение ребенка, взрослых с проблемами репродукции и воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, детей с подозрением на ВУИ, секционного материала от мертворожденных и умерших новорожденных. У данного контингента проводится выявление U.urealyticum, M.hominis, C.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II, дополнительно проводится исследование на M.genitalium, T.gondii, папилломавирусы высокого канцерогенного риска.

- по диагностике ОКИ - исследование материала от больных с подозрением на ОКИ, анализ продуктов питания и смывов с объектов внешней среды при расследовании случаев вспышечной и спорадической заболеваемости. При этом, как правило, проводится одновременное выявление бактерий родов Salmonella, Shigella, Campylobacter и Yersinia enterocolitica.

-по диагностике хеликобактерной инфекции - обследование больных с гастродуоденальной патологией на наличие H.pylori до и после лечения; определение устойчивости H.pylori к макролидам.

- в диагностике вирусных гепатитов - контроль эффективности противовирусной терапии, раннее выявление инфицирования вирусами гепатитов В и С детей, рожденных больными матерями, контроль постоянных доноров, выявление вирусов гепатитов G и TTV у детей больных лейкозами.

На основании запросов органов практического здравоохранения сформировался ряд новых направлений. Наиболее важные среди них:

- выявление возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания. При этом исследовании проводится детекция как труднокультивируемых форм (M.pneumoniaе, C.pneumoniae, C.psittaci), так и традиционных инфекционных агентов (S.pneumoniaе, H.influenzae). Эффективность выявления срептококка и хемофилла методом ПЦР в 1,5-2 раза выше, чем бактериологическим методом.

- выявление возбудителей гнойных и серозных менингитов. Проводится комплексное исследование ликвора на бактериальные и вирусные инфекционные агенты: S.pneumoniaе, H.influenzae, N.meningitidis, эетеровирусы, герпес простой и цитомегаловирус.

- обследование часто болеющих детей и детей с полилимфоаденопатиями на наличие активной репликации вирусов группы герпеса (цитомегаловирус, герпес простой, вирус Епштейн-Барр, герпес тип 6).

В 90-е годы основными задачами центра являлись популяризация и внедрение в практику молекулярно биологических методов диагностики, подготовка специалистов и оказание методической помощи при организации ПЦР лабораторий в лечебных учреждениях и учреждениях санэпиднадзора. В настоящее время в условиях, когда работает множество лабораторий, использующих метод ПЦР, на первое место выходит референс функция (объективная оценка качества диагностики), а также проведение наиболее сложных и требующих высокой квалификации исследований при оперативном решении проблем, возникающих при диагностике инфекционных заболеваний в Нижегородском регионе.

Многопрофильность центра позволяет максимально эффективно использовать имеющуюся материальную базу, быстро и гибко реагировать на изменяющуюся ситуацию (осваивать новые объекты и направления). В настоящее время имеется возможность выявления возбудителей более 30 нозологических форм в режиме сопровождения лечебного процесса, а не ретроспективного исследования.

При участии и методической помощи Центра были организованы ПЦР лаборатории в Нижегородском НИИ детской гастроэнтерологии, Нижегородском областном диагностическом центре, Нижегородском областном центре переливания крови, Нижегородском областном кожно-венерологическом диспансере, инфекционной больнице №2 Нижнего Новгорода, кожно-венерологическом диспансере Сормовского района Нижнего Новгорода и в целом ряде коммерческих медицинских организаций.

Выводы

1. Научно обоснованы и разработаны оптимальные алгоритмы использования метода ПЦР для диагностики бактериальных ОКИ, хеликобактерной инфекции, парентеральных вирусных гепатитов и НУГИ на основе метода ПЦР. Показано, что диагностическая и экономическая эффективность выявления возбудителей повышается за счет одновременной ПЦР-детекции наиболее значимых патогенов в смеси информативных субстратов.

2. Разработка комплекса собственных тестов и использование экспериментальных отечественных ПЦР тест-систем позволили провести мониторинг клинических изолятов семейства Enterobacteriacea на наличие генов токсигенности, инвазивности за длительный период времени и определить особенности циркуляции таких штаммов. Использование скрининговых ПЦР-тестов для первичного обследования больных с подозрением на ОКИ более чем в 2 раза увеличило эффективность выявления основных возбудителей бактериальных ОКИ - бактерий родов Shigella и Salmonella по сравнению с классическим микробиологическим методом.

3. Выявлена высокая эффективность колонизации макроорганизма H. pylori, начинающаяся с первых лет жизни; установлены высокие показатели частоты выявления хеликобактера как у детей, так и у взрослых с различными формами гастродуоденальной патологии. Показано широкое распространение генов токсигенности сagA и vakA среди клинических изолятов H. pylori. Предложен экономичный полуколичественный вариант ПЦР-детекции H. pylori, позволяющий контролировать эффективность антихеликобактерной терапии и прогнозировать отдаленные результаты лечения.

4. Установлено, что на территории Нижнего Новгорода и Нижегородской области, на протяжении 6 лет (2000 - 2006 гг.) доминируют генотипы ВГС 1b и 3а, имеется тенденция к увеличению количества случаев инфицирования пациентов ВГС двух генотипов. Установлена высокая частота (10%) передачи ВГС внутриутробно и при родах. Показано, что возбудители вирусных гепатитов менее активно реплицируются при смешанном инфицировании (ВГВ+ВГС; ВГС+ВГG; ВГВ+ВГD; ВГВ+ВГС+ВГG)), по сравнению с моноинфекцией. Выраженного доминирования одного из вирусов над другим при микстинфекциях не установлено.

5. Показано широкое распространение возбудителей НУГИ (40-68%) среди взрослого населения как здоровых, так и больных с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта. Характерно широкое распространение ассоциаций этих микроорганизмов. За 12-ти летний период наблюдений распространенность инфекционных агентов сохранялась на высоком уровне, неизменными оставались средние показатели частоты выявления определенных видов микрооргнизмов по годам и сезонам.

6. Установлены возрастные этапы колонизации макроорганизма возбудителями НУГИ: для вирусов группы герпеса характерно инфицирование макроорганизма в первые годы жизни воздушно-капельным и контактно-бытовым путями передачи; частота выявления U. urealyticum резко возрастает в период полового созревания с преимущественным половым путем передачи инфекционного агента, для M. hominis показаны два этапа колонизации: первый происходит внутриутробно и/или в процессе родов, второй этап - в период полового созревания преимущественно половым путем.

7. Высокая частота выявления U. urealyticum и M. hominis у здоровых людей свидетельствует о том, что попадание этих бактерий в организм человека, как правило, не вызывает развитие заболевания, а приводит к формированию компонента общего микробиоценоза человека - микробиоценоза мембран.

Практические рекомендации

1. В диагностике бактериальных ОКИ применение ПЦР целесообразно для первичного обследования лиц поступающих в стационары при спорадической и вспышечной заболеваемости; для скринигового исследования продуктов питания, смывов с объектов внешней среды, материалов от контактных лиц с целью выявления источника, путей и факторов передачи инфекции при расшифровке вспышечной заболеваемости; для выявления труднокультивируемых форм возбудителей ОКИ; для выявления генов факторов патогенности у клинических изолятов возбудителей ОКИ.

2. При отсутствии информации о возбудителе наиболее эффективно применение комплексного ПЦР исследования с одновременным выявлением Salmonella, Shigella, Campylobacter и Y. enterocolitica.

3. В виду недостаточного развития микробиологического метода ПЦР детекция H. pylori является в настоящее время наиболее приемлемым вариантом прямого выявления данного микроорганизма. Препарат ДНК от пациента, в котором обнаружен H. pylori, на следующем этапе рекомендуется исследовать методом ПЦР на наличие генов факторов патогенности и устойчивость к макролидам.

4. При обследовании больных с гастродуоденальной патологией целесообразно применение полуколичественного варианта ПЦР исследования желудочного сока, разработанного в настоящей работе.

5. Основными направлениями применения ПЦР в диагностике вирусных гепатитов являются определение вирусной нагрузки у больных перед назначением терапии и при проведении последующего контроля лечения, детекция ВГС в период серонегативного окна, профилактика вертикального пути передачи гепатитов и повышение безопасности манипуляций переливания крови и трансплантации органов. Для решения этих задач рекомендуется использовать разработанный апробированный нами экономичный полуколичественный вариант метода ПЦР - детекции ВГС и ВГB.

6. Целесообразно проведение комплексного обследования на наличие возбудителей НУГИ следующих контингентов: семейные пары, планирующие рождение ребенка; мужчин с проблемами репродукции, воспалительными заболеваниями органов мочеполовой системы, заболеваниями опорно-двигательного аппарата; женщин, планирующих беременность, и беременных, женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом, воспалительными заболеваниями органов мочеполовой системы, заболеваниями опорно-двигательного аппарата; новорожденных от матерей, инфицированных НУГИ; новорожденных с подозрением на внутриутробное инфицирование; недоношенных детей; детей с гипотрофией, анемией, гепатоспленомегалией, гидроцефалией, энцефалопатией; часто болеющих детей; детей с инфекционно-аллергическими заболеваниями органов дыхания и опорно-двигательного аппарата; детей с дерматитами, конъюнктивитами, лимфаденитами.

7. Оптимально одновременное выявление U. urealyticum, M. hominis, C. trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II в смеси соскоба клеток слизистой уретры и осадка первой утренней порции мочи у мужчин; в смеси соскобов слизистых уретры, влагалища и цервикального канала у женщин, смеси слюны, мочи, слезного отделяемого (смыва с конъюнктивы) у детей. Использование смесей субстратов увеличивает вероятность выявления инфекционных агентов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Блохина, И.Н. Применение метода молекулярной гибридизации для изучения энтеротоксигенных свойств сальмонелл/И.Н.Блохина, Н.Ф. Бруснигина, В.Н.Мазепа [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- №6.-1990.- C. 20-24.

2. Мазепа В.Н. Разработка тест-систем (ДНК-зондов) для выявления факторов вирулентности энтеробактерий / В.Н.Мазепа, Д.А.Бессараб, Т.И.Уланова [и др.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.- №1.- 1995.-С.21-24.

3. Бокарев, А.А. Исследование H.pylori при деструктивной патологии в динамике заболевания / А.А. Бокарев, В.Н. Мазепа, К.М. Перфилова // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. 1996.- №4.- С.104-105.

4. Блохина, И.Н. Первичная структура ДНК и прикладная геносистематика бактерий с основами молекулярной эпидемиологии бактерий / И.Н.Блохина, Г.Ф. Леванова, В.Н. Мазепа // Материалы II Съезда биохимического общества Российской академии Наук, Пущино. -Часть I. - 1997.-С.101.

5. Панова, М.Г. Опыт работы диспансерного отделения по диагностике вирусных гепатитов В и С с учетом результатов предварительного скрининга М.Г. Панова, А.И. Цыбасова, В.Н.Мазепа [и др.] // «Актуальные вопросы медицины».-Материалы юбилейной научно-практической конференции врачей, посвященной 275-летию Нижегородского военно-гарнизонного госпиталя, Н.Новгород.-1997.- С.63-67.

6. Соринсон, С.Н. Гепатит С: многолетние механизмы персистенции вируса и фазы течения инфекционного процесса / С.Н. Соринсон, Н.А. Селиванов, О.В. Корочкина, Ю.Е. Жданов, А.Ю. Афанасьев, А.В. Кривопустова, Н.М.Травина, В.Н.Мазепа // Клиническая медицина. -№10.- 1997.-С 27-30.

7. Соринсон, С.Н Пути совершенствования интерферонотерапии при HBV- и HCV-инфекции / С.Н. Соринсон, О.В. Корочкина, Н.А. Селиванов, Мукомолов, Ю.Е. Жданов, Ю.Л. Рыжова, М.В. Неумоина, Е.А. Фомин, А.Ю. Афанасьев, А.В. Кривопустова, Е.Е. Кузоватова, Н.И. Сивухина, П.Г. Зубаров, Н.М. Травина, В.Н. Мазепа // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии.- №5. -1997.- С.

8. Миловидова, О.В. Использование методов обследования, основанных на ПЦР, в акушерско-гинекологической практике / О.В.Миловидова, В.Н. Мазепа, И.В. Соловьева [и др.] // «Человек и лекарство».-Материалы IV Всероссийского национального конгресса, Москва.- 1997.- С.226.

9. Блохина, И.Н. Использование метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для индикации бактерий рода Salmonella на объектах внешней среды / И.Н. Блохина, В.Н. Мазепа, Н.Ф. Бруснигина [и др.] // Мат. VII съезда Всерос. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол.- М.- 1997.- Т.1.- С.376-377.

10. Жданов, Е.Е. Рандомизированный подход к изучению эпидемиологического процесса при вирусном гепатите С // Е.Е.Жданов, В.Н.Мазепа, Н.М.Травина [и др.]// Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - Материалы 4-й Росс. гастроэнтерологической недели.- 1998.- Приложение 5.- С. 154.

11. Алексеева, О.П. Обнаружение HCV РНК в слюне у больных хроническим гепатитом С / О.П.Алексеева, О.В.Воробьев, Н.И. Сивухина, В.Н. Мазепа // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - Материалы 4-й Росс. гастроэнтерологической недели.- 1998.- Приложение 5.- С. 161-162.

12. Соринсон, С.Н О недостаточной информативности индикации суммарных антител HCV на разных этапах течения гепатита С / С.Н. Соринсон, А.Ю Афанасьев, А.В.Афанасьева, Н.М.Травина, В.Н.Мазепа // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - Материалы 4-й Росс.г астроэнтерологической недели.- 1998.- Приложение 5.- С. 166-167.

13. Соринсон, С.Н. Сравнительная оценка исходов острого гепатита С, протекающего с признаками желтухи и в их отсутствии / С.Н. Соринсон, О.В. Корочкина, А.Ю. Афанасьев, А.В. Афанасьева, В.Н. Мазепа // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - Материалы 4-й Росс.гастроэнтерологической недели.- 1998. -Приложение 5. -С. 164.

14. Мазепа, В.Н. Комплексное обследование женщин с урогенитальной патологией в условиях крупного промышленного центра / В.Н. Мазепа, В.В. Немов, О.М. Черневская [и др.] // «Экология и здоровье». - Материалы межрегиональной научно-практической конференции, Н.Новгород.- 1998.- С. 3.

15. Мазепа, В.Н. Опыт использования ПЦР-диагностики в санитарно эпидемиологической практике / В.Н.Мазепа, Н.Ф. Бруснигина, О.М. Черневская [и др.] // «Экология и здоровье».-Материалы межрегиональной научно-практической конференции, Н.Новгород.- 1998.- С 18.

16. Соринсон, С.Н. Острая фаза гепатита С: диагностика и перспектива интерферонотерапии / С.Н. Соринсон, О.В. Корочкина, Ю.Е. Жданов, А.Ю. Афанасьев, А.В. Кривопустова, Н.И. Сивухина, Н.М. Травина, В.Н.Мазепа // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии.- №1. -1999. -С.40-44.

17. Мазепа, В.Н. Динамическое исследование циркуляции внутриклеточных, мембранных паразитов, вирусов группы герпеса у женщин с гинекологической патологией, новорожденных и детей первого года жизни с подозрением на внутриутробное инфицирование / В.Н.Мазепа, Н.Ф. Бруснигина, О.М. Черневская [и др.] // Материалы II Российского форума «Мать и дитя», Москва.- 1999. -С.246-249.

18. Мазепа, В.Н. ПЦР-диагностика экологически обусловленных заболеваний / В.Н.Мазепа, Н.Ф. Бруснигина, О.М. Черневская [и др.] // Сб. «Естественные факторы защиты в профилактике экологически обусловленных заболеваний», Материалы научной конференции посвященной 70-летию Нижегородского НИИЭМ, Н.Новгород.- 2000.- С. 62-63.

19. Мазепа, В.Н. ПЦР-диагностика цитомегаловирусной инфекции у детей первого года жизни / В.Н.Мазепа, Н.Ф. Бруснигина, О.М. Черневская О.М [и др.] // Сб. «Естественные факторы защиты в профилактике экологически обусловленных заболеваний», Материалы научной конференции посвященной 70-летию Нижегородского НИИЭМ, Н.Новгород.- 2000.- С.63

20. Мазепа, В.Н. Создание мобильной ПЦР лаборатории и апробация ее на базе ЦРБ г.Бора / В.Н.Мазепа, К.А.Орлова, О.М. Черневская [и др.] // Сб. «Естественные факторы защиты в профилактике экологически обусловленных заболеваний», Материалы научной конференции посвященной 70-летию Нижегородского НИИЭМ, Н.Новгород.- 2000.- С.64

21. Мазепа, В.Н. Опыт работы центра индикации идентификации и таксономии Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной / В.Н.Мазепа, Н.Ф. Бруснигина, О.М. Черневская [и др]// «Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской биотехнологии», Материалы международной конференции, посвященной памяти академика РАМН и РАМТН И.Н.Блохиной, Москва.- Н.Новгород.- 2000.- С.64

22. Zubkova N.V. The use of the method of polymerase chain reaction for an estimation of efficacy of virus inactivation in model experiment / N.V.Zubkova, V.N.Mazepa, K.A.Orlova // Russian Jornal of HIV/AIDS and Related Problems.-2000.-V.4.-№1.-P.175.

23. Мазепа, В.Н. Обнаружение возбудителей негонококковых урогенитальных инфекций в секционном материале от мертворожденных и умерших новорожденных / В.Н.Мазепа, О.М. Черневская,Н.Ф. Бруснигина [и др.] // Материалы III Российского форума «Мать и дитя», Москва.- 2001.- С.566-567.

24. Мазепа, В.Н. Использование ПЦР-диагностики для выявления Helicobacter pylori в различном клиническом материале / В.Н.Мазепа, А.А. Бокарев, К.А.Орлова [и др.] // Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии», Материалы международной конференции, посвященной памяти академика РАМН и АМТН РФ И.Н. Болхиной, Москва.- Н.Новгород.- 2001.- С.124-125.

25. Мазепа, В.Н. Выявление возбудителей негонококковых урогенитальных инфекций у женщин с гинекологической патологией и детей с подозрением на внутриутробное инфицирование / В.Н. Мазепа, Н.Ф. Бруснигина, О.М. Черневская // Материалы международной конференции, посвященной памяти академика РАМН и АМТН РФ И.Н.Блохиной, Москва.- Н.Новгород.- 2001.- С.122-124.

26. Быстрова, Т.Н. Опыт использования метода RT-ПЦР для обнаружения вируса гепатита А в воде / Т.Н. Быстрова, К.В Блохин, В.Н.Мазепа [и др.] // Вестник Нижегородского университета. - Серия Биология.- 2001.- Выпуск 1 (3).-С.74-75.

27. Мазепа, В.Н. Выявление методом ПЦР бактерий рода Shigella в фекальных пробах от больных с острыми кишечными инфекциями / В.Н.Мазепа, К.А.Орлова, О.М.Черневская [и др.] // Материалы международной конференции, посвященной памяти академика РАМН и АМТН РФ И.Н.Блохиной, Москва.- Н.Новгород.- 2001.- С.120-122.

28. Катышева, А.В. Значение эрадикации Helicobacter pylori при ранней реабилитации больных после ушивания перфоративных гастродуоденальных язв / А.В.Катышева, С.С.Белоусов, М.А. Махова, В.Н. Мазепа // Материалы III международного симпозиума «Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori».- Росс. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии.- 2001. - №2. - С.44-46.

29. Мазепа, В.Н. Репликативная активность вируса гепатита С у больных с различными классами антител к ВГС / В.Н.Мазепа, О.М. Черневская, Н.Ф. Бруснигина [и др.] // «Генодиагностика инфекционных заболеваний»-. Материалы 4 Всероссийской научно-практической конференции, Москва.- 2002.- С.159.

30. Орлова, К.А. Выявление методом ПЦР бактерий рода Shigella в фекальных пробах больных с острыми кишечными инфекциями / К.А. Орлова, В.Н. Мазепа, О.М. Черневская [и др.] // «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении», Сборник трудов научно практического симпозиума в рамках международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика для медицины», Москва.- 2002.- С.268-270.

31. Белоусов, С.С. Определение CagA-штаммов Helicobacter pylori в желудочном соке у больных с гастродуоденальной патологией / С.С.Белоусов, В.Н.Мазепа, М.А. Махова [и др.] // Материалы IV Российского научного форума c международным участием «Санкт-Петербург - Гастро-2002». - Гастробюллетень.- 2002. - №2-3.- С. 44.

32. Мазепа, В.Н. Гетеродуплексный анализ фрагментов гена CagA Helicobacter pylori, полученных из клинического материала методом ПЦР / В.Н. Мазепа, М.А. Махова // Тезисы III съезда биохимического общества, СПб.- 2002. - С. 298.

33. Мазепа, В.Н. Возбудители негонококковых урогенитальных инфекций и их роль в патологии репродукции / В.Н. Мазепа, Н.Ф. Бруснигина, О.М. Черневская. [и др.] // «Молекулярная биология, биотехнология, здоровье человека».-Материалы научных чтений, посвященных 80-летию И.Н. Блохиной, Н.Новгород -2002.- С.5.

34. Мазепа, В.Н. Многолетнее изучение циркуляции возбудителей негонококковых урогенитальных инфекций в условиях крупного промышленного центра / В.Н. Мазепа, Н.Ф. Бруснигина, О.М. Черневская [и др.] // Сб. «Здоровье населения Нижегородской области», Итоги региональной программы, Н.Новгород.- 2002.- С. 31-38.

35. Богданова, Т.А. Иммунологическая реактивность детей, больных бронхиальной астмой, отягощенной цитомегаловирусной и микоплазменной инфекциями / Т.А.Богданова, Н.И. Кубышева, А.В. Максимова, В.Н. Мазепа [и др.] // Сб. «Здоровье населения Нижегородской области», Итоги региональной программы, Н.Новгород.- 2002.- С.101-105.

36. Мазепа, В.Н. Выявление возбудителей негонококковых урогенитальных инфекций у новорожденных и детей разного возраста с подозрением на внутриутробное инфицирование / В.Н. Мазепа, О.М. Черневская, Н.Ф. Бруснигина [и др.] // «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Материалы 4 Всероссийской научно-практической конференции, Москва.- 2002.- С.50-52.

37. Махова, М.А. Апробация отечественных ПЦР-тест-систем для выявления факторов патогенности Helicobacter pylori / М.А. Махова, В.Н.Мазепа, К.А.Орлова // «Генодиагностика инфекционных заболеваний».- Материалы 4-й Всероссийской научно-практической конференции.- Москва.- 2002. С.218-219.

38. Мазепа, В.Н. Опыт применения ПЦР-тест системы для выявления Vibrio cholera / В.Н.Мазепа, К.А.Орлова, М.А Махова [и др.] // «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Материалы 4-й Всероссийской научно-практической конференции, Москва.- 2002.- С.282-283.

39. Зубкова Н.В. Эффективность тепловой инактивации вирусов в производстве внутривенного иммуноглобулина / Н.В. Зубкока, В.В. Анастасиев, В.Н.Мазепа [и др.] // Вестник службы крови России.- 2002. №1.-С.31-33.

40. Мазепа, В.Н. Выявление РНК HCV и ДНК HBV у беременных и детей первых лет жизни / В.Н.Мазепа, М.Г.Панова, Н.Е.Сенягина [и др.] // Материалы Всеросс. конференции по вопросам ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов, Суздаль.- 2003.- С. 72-73.

41. Орлова, К.А. Применение комплексного ПЦР - исследования клинического материала для выявления бактериальных возбудителей ОКИ / К.А. Орлова, В.Н. Мазепа, Н.В. Перфилова [и др.] // Сб. трудов Всероссийской V науч. прак. конф. «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва.- 2004.- т.2.- С.94-96.

42. Орлова, К.А. Выявление генов факторов патогенности в клинических изолятах энтеробактерий / К.А. Орлова, В.Н. Мазепа, М.А. Махова [и др.] // Сб. трудов Всероссийской V науч. прак. конф. «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва.- 2004.- т.2.- С.96-97.

43. Мазепа, В.Н. Применение метода ПЦР в диагностике вирусных гепатитов у беременных и детей / В.Н.Мазепа, Н.Ф. Бруснигина, О.М. Черневская [и др.] // Сб. трудов Всероссийской V науч. прак. конф. «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва.- 2004.- т.1.- С.244-246.