На правах рукописи

Латюшин Ян Витальевич

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

ЗАКОНОМЕРНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫХ АДАПТАЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ В СИСТЕМЕ КРОВИ ПРИ ОСТРОМ И ХРОНИЧЕСКОМ ГИПОКИНЕТИЧЕСКОМ СТРЕССЕ

03.03.01 - физиология

Челябинск 2010

Работа выполнена в лаборатории молекулярной физиологии и иммунологии ГОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет» и ФГУ «Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук».

Научный консультант: Павлова Вера Ивановна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Ковальчук Людмила Ахметовна

доктор биологических наук, профессор

Пряхин Евгений Александрович

доктор биологических наук

Сашенков Сергей Львович

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация: Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской Академии наук.

Защита состоится «25» июня 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.295.03 при ГОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет» по адресу: 454080, г. Челябинск, пр. им. Ленина, д. 69.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинский государственный педагогический университет».

Автореферат разослан «___» _______________2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, доцент Ефимова Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Исследования гипокинезии как стресс-фактора началось в 60-70-годы ХХ века в связи с активным развитием космической биологии (В.В. Португалов, 1967; Г.П. Быков, 1970; И.В. Федоров и др., 1972; С.Е. Ли, О.И. Кириллов, 1974; Е.А. Коваленко, 1975). Экспериментальные работы 80-90-ых годов прошлого века характеризовались изучением адаптационных изменений на различных уровнях организации биологических систем (Е.А. Коваленко, Н.Н. Гуровский, 1980; П.Д. Горизонтов, 1983; В.Н. Швец и др., 1984; С.М. Иванова и др., 1986; Д.З. Шибкова, 1987; Ф.З. Меерсон, Н.А. Фомин, В.И. Павлова, Д.З. Шибкова, 1988; И.А. Попова, 1988; Д.И. Бельченко, 1990).

В работах Е.А. Воротниковой (1984), О.Г. Газенко и др. (1986), Ф.З. Меерсона и др. (1988), Р.А. Тиграняна (1990), А.Г. Грицука (1995), Е.А. Коваленко (2000), T. Kawata et. al. (1988) длительная гипокинезия являлась моделью, при которой реализуются резервные механизмы адаптации организма на морфо-функциональном, биохимическом и генетическом уровне (Ф.З. Меерсон, И.Ю. Малышев, Е.Б. Манухина, 1998).

В исследованиях Б.И. Кузника, Н.Н. Цыбикова (1981), Д.Н. Маянского (1991), В.П. Акопяна, Л.С. Баляна и др. (1997) показано, что, попав в экстремальные условия, организм мобилизует различные адаптационные программы, достигая полноценного приспособления к стрессирующим факторам внутренней и внешней среды.

В настоящее время известно, что система крови играет большую роль при ответной реакции организма на любое стрессорное воздействие (И.А. Волчегорский, 1993; Н.В. Васильев, Ю.М. Захаров, Т.И. Коляда, 1992;; Е.Д. Гольдберг и др., 2005; П.Д. Горизонтов и др., 1983; А.М. Дыгай и др.,2005; В.П. Шахов и др, 2008; В.Э. Цейликман, 1998; Б.Г. Юшков и др., 1996; А.П. Ястребов и др., 2009; В.А. Черешнев и др.2004,; Д.З. Шибкова , А.В. Аклеев, 2006, С.Л Сашенков и др., 2006, 2008).

В последние десятилетия активно изучаются влияния стресса на механизмы регуляторных процессов в организме человека и животных, показана их роль в адаптационном процессе при участии цитокиновой сети и антиоксидантов на моделях эмоционального, болевого, травматического и прочих стрессов. При действии стресса вся регулирующая информация идет от нервной системы через гипофизарно-адреналовую, лимфоидную систему и гемопоэтические органы. Существенно, что весь этот процесс реализуется на уровне исполнительных тканей и органов (Р.М. Хаитов, 2001; Ю.Б. Лишманов и др., 2003; А.С. Симбирцев, 2004).

Очевидно, что общий адаптационный синдром развивается на фоне перестройки активности локального микроокружения, в построении которого большую роль играют стромальные элементы и цитокины (Б.Г. Юшков, В.Г. Климин, М.В. Северин, 1999, В.П. Шахов и др., 2005, 2008).

В настоящее время разрабатываются новые схемы восстановления гемопоэза. Особая роль принадлежит мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам (ММСК). Они способствуют росту гемопоэтических предшественников путем секреции таких цитокинов как ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-14, ИЛ-15 (И.Ю. Маклакова, А.П. Ястребов, Д.Ю. Гребнев, 2009). Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки участвуют в формировании специфического микроокружения многих органов, включая и костный мозг. Они являются основой матричной единицы, так называемых «ниш», в которых происходят процессы хранения, созревания и дифференцировки предшественников эритропоэза, гранулоцитомонопоэза, тромбоцитопоэза и их малодифференцированных прекурсов (А.М. Дыгай, В.П. Шахов, 1989; Ю.А. Романов и др., 2005; Beyer et. al., 2006; L.M. da Silva et al, 2008; F.M. Watt, B.L. Hogan, 2000, 2006).

Исследований взаимодействия системы мезенхимопоэза и цитокиновой сети при хроническом стрессе крайне мало. Имеются противоречивые сведения об уровнях содержания цитокинов и костномозговых мезенхимальных стволовых клеток при хроническом стрессе, вызванном гипокинезией (И.Л. Чертков, О.А. Гуревич, 1984; А.С. Симбирцев, 2004; F.M. Watt, B.L. Hogan, 2000; Y. Miura, Z. Gao, M. Miu, 2006).

Также противоречивы сведения об участии системы крови и регулирующих её факторов в обеспечении резистентности организма к неблагоприятному действию гипокинезии (Г.И. Козинец и др., 1983; Г.Н. Дурнова и др., 1989; Б.И. Кузник и др., 1989; Р.А. Тигранян и др., 1990; С.Н. Теплова, Д.А. Алексеев, 2002). По-прежнему остаются открытыми вопросы коррекции повреждающего действия гипокинезии на организм человека, животных и систему крови, в частности.

Большой интерес представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), который является ростовым фактором для гранулоцитарно-макрофагальных типов клеток - предшественников, способным усиливать процессы фагоцитоза в лейкоцитах. В отдельных работах по изучению действия Г-КСФ на пул мезенхимальных стволовых клеток показано, что под действием данного цитокина увеличивается выброс их количества из костного мозга в кровь (В.П. Шахов, И.А. Хлусов, Г.Ц. Дамбаев и др., 2004; R.W. Johnson et al, 1997). Однако эти работы касаются преимущественно заболеваний со стороны сердечно - сосудистой системы. При таком стресс-факторе, как гипокинезия, закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови изучены недостаточно и отражены лишь в единичных работах (Ф.И. Ершов и др., 2004).

В связи с отсутствием систематизированных данных о влиянии длительной гипокинезии на состояние костномозгового кроветворения (показатели миелопоэза), регулирующего влияния цитокинов на кроветворение актуальным является изучение молекулярно-клеточных изменений в крови при адаптации к гипокинезии и возможности коррекции повреждающего действия гипокинетического фактора. Указанные предпосылки определили цель и направления настоящего исследования.

Цель исследования: установить закономерности адаптации системы крови на молекулярно-клеточном уровне к действию острого и хронического гипокинетического стресса с целью обоснования коррекции аплостических нарушений.

В рамках этой общей цели решались следующие задачи:

1. Выявить динамику содержания гуморальных факторов регуляции в плазме крови и тканях костного мозга, селезенки и тимуса на разных этапах развития гипокинетического синдрома.

2. Определить активность системы «перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита» у экспериментальных животных в динамике 30-ти суточной гипокинезии.

3. Выявить характер взаимосвязей между исследуемыми параметрами системы крови экспериментальных животных на разных стадиях формирования адаптационных процессов при гипокинетическом стрессе.

4. Оценить возможность снижения деструктивных процессов в органах системы крови в условиях 30-ти суточной гипокинезии при использовании препарата церулоплазмина.

5. Оценить возможность ускорения репарационных процессов в органах системы крови в условиях 30-ти суточной гипокинезии при использовании препарата граноцита.

Научная новизна исследования

Установлен комплекс параметров, характеризующих состояние органов системы экспериментальных животных в зависимости от длительности воздействия гипокинетического стресса: на ранних сроках (1-ые - 7-ые сутки) в периферической крови достоверно повышается содержания кортикостерона, цитокинов (ИЛ-1в, ИНФ-г, ФНО-б, ИЛ-4), наблюдается выраженный лейкоцитоз; в костном мозге увеличивается содержание цитокинов (ИЛ-1б, ИЛ-6, ИЛ-4), отмечена активация антиоксидантных ферментов и миелопоэза; в хронической фазе гипокинетического синдрома в плазме крови повышается содержание цитокинов (ИЛ-1б, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-10), а в костном мозге - ИЛ-1в, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10.

С увеличением сроков гипокинетического воздействия достоверно нарастает уровень ПОЛ в костном мозге, селезенке и тимусе на фоне снижения содержания антиоксидантных ферментов.

Дестабилизация гомеостаза, выраженная в ранние сроки гипокинетического воздействия, сопровождается перестройкой регуляторных механизмов и включением процессов компенсации с участием мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), миелоидного ростка костного мозга.

Деструктивные процессы (клеточное опустошение и снижение массы) в кроветворных органах носят гетерохронный характер (эти явления наблюдаются в тимусе с 1-ых по 30-ые сутки, в селезенке с 1-ых по 15-ые сутки, в костном мозге - с 10-ых суток).

Впервые дана оценка соотношения провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в периферической крови и ткани костного мозга при остром и хроническом гипокинетическом стрессе: содержание провоспалительных цитокинов повышалось впервые 15-ть суток, а в дальнейшем нормализовалось к 30-ым суткам; содержание противовоспалительных цитокинов на всех сроках гипокинезии было достоверно повышенно.

Введение гуморального антиоксиданта церулоплазмина на ранних стадиях гипокинетического стресса сопровождалось повышением активности антиоксидантных ферментов (СОД, каталаза), снижением интенсивности липопероксидации и восстановлением массы исследованных органов, а регенеративные процессы, индуцированные граноцитом, уже к 3-им суткам сопровождались увеличением количества стромальных клеток и активацией миелопоэза в костном мозге. Баланс между продукцией и гибелью клеточных элементов в системе крови при действии гипокинетического стресса, таким образом, был обусловлен активацией процесса пролиферации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

Использование цитокиновой стимуляции с целью предотвращения срыва гомеостатических механизмов регуляции обеспечило повышение устойчивости организма к гипокинетическому воздействию.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования дополняют современные представления в области физиологии адаптации о закономерностях молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при остром и хроническом гипокинетическом стрессе. Установлена активация цитокиновой системы при адаптации системы крови к длительному 30-ти суточному гипокинетическому стрессу. Доказана эффективность использования препарата граноцита в качестве средства, предупреждающего клеточное опустошение костного мозга и лимфоидных органов при гипокинетическом стрессе. Установлено, что введение метаболита антиоксидантной системы - церулоплазмина защищает организм экспериментальных животных от аплостических повреждений. По данным исследованиям подана заявка №2009139735 (056294) на патент.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований нашли отражения в монографии «Принципы использования фундаментальных основ клеточной и молекулярной биоинженерии для повышения физиологических возможностей живых систем», включены в лекционный материал по дисциплинам «Общая физиология», «Физиология спорта», «Основы здорового образа жизни» в Челябинском государственном педагогическом университете, Южно-Уральском государственном университете, Уральском государственном университете им. Горького (г. Екатеринбург).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Содержание гуморальных факторов регуляции в периферической крови, ткани костного мозга, селезенки и тимуса экспериментальных животных зависит от срока гипокинетического воздействия и определяется последовательностью развития адаптационных процессов.

2. Реакции системы «перекисного окисления липидов - антиоксидантная защита» у экспериментальных животных в динамике 30-ти суточной гипокинезии характеризуются различными фазами активации.

3. Формирование адаптационных процессов при гипокинетическом стрессе сопровождается: количественно - качественной перестройкой взаимосвязей между параметрами системы крови, что отражает напряжение механизмов регуляции (с 1-ых по 7-ые сутки); изменением общего количества взаимосвязей и соотношения прямых (активирующих) и обратных (стабилизирующих) связей к 15-ым суткам эксперимента.

4. Использование препаратов церулоплазмина и граноцита эффективно снижает деструктивные и ускоряет репарационные процессы в системе крови экспериментальных животных в условиях 30-ти суточного гипокинетического воздействия.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); XX съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); VIII World Congress International society for adaptive medicine (ISAM, Москва, 2006); II Международной научно - практической конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2008); IV съезде физиологов Урала (с международным участием) (Екатеринбург, 2009); итоговых научных конференциях ГОУ ВПО «ЧГПУ» (2006, 2007, 2008, 2009).

Публикации по материалам диссертации

По теме диссертации опубликовано 20 работ, из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, - 14.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 280 страницах печатного текста и включает: введение, литературный обзор (глава 1), описание материалов и методов исследования (2), результаты собственных исследований (главы 3, 4 ,5), заключение, выводы, иллюстрирована 21 рисунком и 20 таблицами. Список литературы включает 124 зарубежных источника и 281 отечественных.

1 Материалы и методы исследования

Исследования выполнены на 630 белых крысах-самцах линии Вистар массой 150-200 гр. Все животные содержались в одном помещении при температуре воздуха 23-24°С. Животные опытной и контрольной групп получали стандартный брикетированный корм с добавлением растительного масла, рыбьего жира, свежих овощей и воды в неограниченном количестве. В опыт отбирались здоровые животные, прошедшие двухнедельный карантин в виварии. В процессе эксперимента проводилось постоянное наблюдение за поведением и питанием животных; после завершения эксперимента животных декапитировали под эфирным наркозом.

Гипокинезию моделировали путем помещения животных в клетки-пеналы из органического стекла, соответствующие размерам животного, на 1, 3, 5, 7, 10, 15, 30 суток. Контрольных животных содержали в обычных клетках (Е.А. Коваленко, Н.Н. Гуровский, 1980; Р.А.Тигранян, 1985).

Иммунологические методы.

Уровень содержания цитокинов определяли на анализаторе «Multiscane Biotech» (США) в плазме крови с помощью наборов реактивов фирмы «Quanti Kine» (США), в ткани костного мозга с помощью тест-системы для ИФА производства ООО «Цитокин» (СПб.) (С.А. Кетлинский, Н.М. Калинина, 1998).

Гематологические методы.

Препарат граноцит фирмы «Авентус», содержащий рекомбинантный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), вводили в течение 3 суток однократно подкожно в дозе 10 мкг/кг с подсчетом общего количества лейкоцитов в периферической крови по общепризнанной технологии. В контрольной группе все животные получали эквивалентное количество растворителя данного препарата - физиологического раствора (Е.Д. Гольдберг, 2005; Г.Ю. Кнорринг, 2005). Анализ качественного и количественного состава клеток крови, костного мозга осуществляли с помощью общепринятых гематологических и цитологических методов с окраской препаратов азур-II эозином (В.П. Шахов, 2005).

Культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в системе in vitro осуществляли по модифицированному методу А.Я. Фриденштейна в течение 10-14 суток в полной питательной среде: 79% среды D-MEM с низким содержанием глюкозы, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% 100х концентрата L-глютамина, стрептомицина и пенициллина при 37^о С, 100% влажности и 5% СО₂ в СО₂-инкубаторе в 50 мл пластиковых флаконах фирмы «Falcon». Использованные среды и реактивы произведены фирмой «Sigma»(США). Через 3 суток неприлипшие клетки удаляли и заменяли полную среду свежей порцией, после чего каждую новую смену среды осуществляли в течение 5 суток. На 10-14-ые сутки культивирования с помощью инвертоскопа фирмы «Opton 2» (Германия), подсчитывали число образовавшихся колоний (клеточных агрегатов, содержащих более 50 кариоцитов) и окрашивали азур-II эозином (Р.М. Хаитов, 2001; В.П. Шахов, 2005). В ряде случаев идентификацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток осуществляли после снятия адгезирующих кариоцитов 0,5% раствором трипсина с последующим определением в них полимеразной цепной реакции (ПЦР-анализ) и набора реактивов на остеопонтин фирмы «Вектор» (Новосибирск) (В.П. Шахов, 2005; F.M. Watt, 2000).

Биохимические методы

Перекисное окисление липидов в тканях органов изучали по методике J. Stocks et al. (1974) в модификации И.А. Волчегорского и соавт. (1989, 2000), выявляя продукты ПОЛ спектрофотометрическим методом с выделением гептан- и изопропанолрастворимых липопероксидов (рассчитывали в единицах индекса окисления: Е232/220 - относительное содержание диеновых конъюгатов, Е278/220 - уровень кетодиенов и сопряженных триенов), малоновый диальдегид определяли по В.И. Орехович (1977). Активность супероксиддисмутазы (СОД) (К.Ф.1.15.1.1.)определяли по методу С. Чевари и др. (1985), каталазы (К.Ф.1.11.1.6.) - методом Н.С. Мамонтова и соавт. (1994). Определение церулоплазмина (ЦП) в сыворотке крови и костном мозге проводили по модифицированному методу Ревина (С. В. Бестужева, В. Г. Колб, 1976). Активность глутатионредуктазы определяли, руководствуясь методом Ф. Е. Путилина (1982).

Церулоплазмин (НПО«Иммунопрепарат»,г. Уфа) вводили внутрибрюшинно из расчета 3 мг на 100гр массы тела за 24 часа до опыта и дополнительно за один час до начала эксперимента в течение 3-ех дней.

Результаты исследований обрабатывались с использованием пакета лицензионных прикладных программ «Statistica for Windows 6.0». О достоверности различий средних величин судили по критерию Стьюдента (t). Для определения статистической значимости межгрупповых различий применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Статистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа по Спирмену (r_s) и Кенделлу (r_k) (С. Гланц, 1999; О.Ю. Реброва, 2002).

2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 Влияние острого и хронического стресса на продукты перекисного окисления липидов в костном мозге, тимусе и селезенке

Известно, что усиление перекисного окисления липидов и накопление продуктов липопероксидации, обладающих высокой реакционной способностью, может оказывать системное повреждающее действие на клетки (В.Е. Коган, 1983; М.В. Биленко, 1989; В.А Барабой, 1991; Ю.A. Владимиров, 1991; S. Thomas, 1998). Механизмы развития острого и хронического стрессов во многом обусловлены активацией процессов липопероксидации (В.Е. Коган, 1983; Н.В. Гуляева, 1989; Н.К. Зенков, 2001; L. Pronai, 1991; P.D. Thomson, 1991; К.S. Dhalla, 1996).

В наших исследованиях разные сроки гипокинезии значительно влияют на соотношение различных категорий продуктов липопероксидации.

В таблице 1 представлены показатели содержания продуктов липопероксидации в ткани костного мозга, тимуса, селезенки в различные сроки острого и хронического гипокинетического стресса на организм экспериментальных животных.

Содержание первичных и вторичных гептанрастворимых продуктов ПОЛ через 6 часов и одни сутки после острого гипокинетического воздействия в этих органах оставалось на уровне фоновых величин. Снижение первичных гептанрастворимых продуктов ПОЛ зафиксировано с 3-их по 15-ые сутки гипокинетического воздействия.

Таблица 1

Показатели содержания продуктов липопероксидации в ткани костного мозга, тимуса и селезенки у экспериментальных животных при воздействии острого и хронического гипокинетического стресса (M±m)

Параметры Сроки от начала ГК	Гептановая фаза
	Костный мозг	Тимус	селезенка
	Е 232/220	Е 278/220	Е 232/220	Е 278/220	Е 232/220	Е 278/220
контроль n=8	0,983±0,002	0,116±0,003	0,630±0,011	0,168±0,006	0,428±0,011	0,230±0,006
ГК6 часов n=8	0,990±0,031	0,120±0,024	0,623±0,065	0,169±0,024	0,432±0,062	0,236±0,040
ГК1 сутки n=8	0,988±0,060	0,118±0,036	0,617±0,019	0,173±0,042	0,419±0,016	0,241±0,013
ГК3 суток n=8	0,954±0,013*	0,123±0,001*	0,585±0,006**	0,175±0,033	0,407±0,011	0,239±0,012
ГК5 суток n=8	0,945±0,014*	0,127±0,002**	0,565±0,017**	0,188±0,004*	0,385±0,004**	0,248±0,004*
ГК7 суток n=8	0,939±0,012**	0,129±0,003**	0,545±0,021**	0,191±0,005*	0,364±0,012**	0,257±0,006
ГК10 суток n=8	0,958±0,011*	0,140±0,004**	0,548±0,017***	0,200±0,006**	0,377±0,006***	0,274±0,005**
ГК15 суток n=6	0,962±0,006*	0,166±0,003***	0,542±0,016***	0,234±0,004**	0,385±0,005**	0,322±0,004***
ГК30 суток n=6	0,960±0,040 0,975±0,002	0,118±0,014 0,157±0,011*	0,645±0,012 0,651±0,048	0,171±0,007 0,247±0,006***	0,441±0,006 0,419±0,078	0,245±0,010 0,318±0,020***

Примечание: достоверность отличий от соответствующего контроля: * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001, рассчитанные с помощью критерия Стьюдента (t).

1) В таблице отражен уровень первичных (ацилгидроперекисей и диеновых коньюгатов) и вторичных (кетодиенов и сопряженных триенов) продуктов ПОЛ;

2) Уровень продуктов ПОЛ определялся в У.Е. окислительного индекса, который рассчитывался как отношение оптических плотностей Е₂₃₂/Е₂₂₀ для первичных и Е₂₇₈/Е₂₂₀ для вторичных продуктов ПОЛ.

Напротив, повышение вторичных гептанрастворимых продуктов ПОЛ началось с 3-х суток и продолжалось до 30-ти суток гипокинетического воздействия. Увеличение содержания кетодиенов и сопряженных триенов, растворимых в гептане, было зафиксировано в период с 15-ых по 30-е сутки воздействия: в костном мозге - на 43,10% (p<0,001), тимусе - на 39,30% (p<0,01), селезенке - на 40% (p<0,001).

Через 30-ть суток после действия хронического гипокинетического стресса содержание первичных продуктов липопероксидации, растворимых в гептане_1, сопровождалось нормализацией и увеличением содержания вторичных продуктов липопероксидации, растворимых в гептане₂: в костном мозге - на 33,05% (p<0,05); в тимусе - на 44,4% (p<0,01), в селезенке - на 30% (p<0,001).

В таблице 2 представлены показатели содержания продуктов ПОЛ, растворимых в изопропаноле₁,₂, в ткани костного мозга, тимуса и селезенки при действии острого и хронического гипокинетического стресса на организм экспериментальных животных. Содержание первичных и вторичных изопропанолрастворимых продуктов ПОЛ на всех сроках действия стресса в этих органах было повышенно, за исключением 3-их суток эксперимента, на которые зафиксировано снижение (в костном мозге, тимусе и селезенке) соответственно на 4,07% (p<0,05), 2,5%, 4%(p<0,05). Кроме того, снижение продуктов ПОЛ в изопропаноле₁ было зафиксировано в костном мозге через ГК_5,7 суток соответственно - на 12%(p<0,01) и на 9,43% (p<0,01). Продукты ПОЛ, растворимые в изопропаноле₂, на всех сроках воздействия были повышены. Увеличение их содержания было зарегистрировано: на 10 - е сутки в костном мозге - на 27,10% (p<0,01), в тимусе - на 21% (p<0,001), в селезенке - на 18% (p<0,001); на 15-е сутки: в костном мозге - на 30,10%(p<0,01), в тимусе - на 37% (p<0,001), в селезенке - на 35% (p<0,001).

Таблица 2

Показатели содержания продуктов липопероксидации в ткани костного мозга, тимуса и селезенки у экпериментальных животных при воздействии острого и хронического гипокинетического стресса (M±m)

Параметры сроки от начала ГК	Изопропанольная фаза
	Костный мозг	Тимус	селезенка
	Е 232/220	Е 278/220	Е 232/220	Е 278/220	Е 232/220	Е 278/220
контроль n=8	0,615±0,011	0,432±0,012	0,680±0,01	0,505±0,012	0,658±0,010	0,570±0,011
ГК6 часов n=8	0,669±0,014*	0,490±0,010**	0,700±0,006	0,525±0,006	0,691±0,008*	0,600±0,006*
ГК1 сутки n=8	0,643±0,002*	0,468±0,006*	0,659±0,003	0,523±0,002	0,645±0,003	0,613±0,008**
ГК3 суток n=8	0,590±0,003*	0,465±0,004	0,663±0,063	0,530±0,004	0,632±0,005*	0,621±0,011**
ГК5 суток n=8	0,541±0,013**	0,473±0,014*	0,707±0,004*	0,555±0,006**	0,684±0,007	0,638±0,013**
ГК7 суток n=8	0,557±0,011**	0,484±0,010*	0,740±0,015**	0,575±0,023*	0,711±0,010**	0,655±0,014**
ГК10 суток n=8	0,657±0,010*	0,549±0,015**	0,754±0,021**	0,611±0,012***	0,724±0,012***	0,672±0,020***
ГК15 суток n=6	0,658±0,012*	0,562±0,012**	0,782±0,032**	0,692±0,014***	0,750±0,013***	0,769±0,023***
контроль n=6 ГК30 часов n=6	0,612±0,030 0,704±0,010**	0,430±0,010 0,550±0,020***	0,690±0,025 0,807±0,035*	0,515±0,014 0,669±0,042***	0,672±0,020 0,792±0,010***	0,590±0,021 0,761±0,035***

Примечание: достоверность отличий от соответствующего контроля: * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001, рассчитанных с помощью критерия Стьюдента (t).

30-ые сутки действия стресса сопровождались повышенным содержанием первичных продуктов ПОЛ, растворимых в изопропаноле₁: в костном мозге - на 15,03% (p<0,01), в тимусе - на 17% (p<0,05), в селезенке - на 18% (p<0,001) и вторичных продуктов ПОЛ, растворимых в изопропаноле₂: в костном мозге - на 28% (p<0,001), в тимусе - на 30% (p<0,01), в селезенке - на 29% (p<0,001).

Кроме того, для более полного представления о динамике образования продуктов перекисного окисления в ткани костного мозга, тимуса и селезенки определяли вторичный продукт ПОЛ - малоновый диальдегид (МДА), содержание которого увеличивалось на всех сроках острого и хронического гипокинетического стресса (рис.1).

Рис. 1. Динамика показателей содержания малонового диальдегида в ткани костного мозга, тимуса и селезенки у экспериментальных животных при воздействии острого и хронического гипокинетического стресса

Увеличение МДА зафиксировано на 10-ые, 15-ые сутки с максимумом значений на 30-ые сутки действия гипокинезии: в костном мозге - на 20,40% (р<0,01), 23% и 36% (р<0,001) соответственно; в тимусе - на 22,22% (р<0,01), 25% (р<0,01), 29% (р<0,01). Однако, в селезенке максимум содержания МДА наблюдался на 10-ые сутки - 35,52% (р<0,01), с последующим незначительным снижением (33,27% (р<0,001), 32% (р<0,01)).

Результаты исследований содержания продуктов ПОЛ в разные сроки острого и хронического гипокинетического стресса отражают соотношение различных категорий продуктов липопероксидации в органах системы крови, обуславливающих степень повреждения тканей, в частности, при действии 30-ти суточной гипокинезии на организм под действием глюкокортикоидов и катехоламинов активируются ферменты (липазы, фосфолипазы), что ведет к повышению интенсивности процессов липидной пероксидации, носящих фазный характер. В первой фазе гипокинезии происходит снижение уровня первичных и вторичных молекулярных продуктов ПОЛ в ткани костного мозга, тимуса и селезенки: первичных гептанрастворимых продуктов ПОЛ, первичных изопропанолрастворимых продуктов ПОЛ в костном мозге, тимусе и селезенке. Повышение содержания вторичных продуктов в ткани костного мозга, тимуса и селезенки зафиксировано на 10-ые, 15-ые, 30-ые сутки действия гипокинезии.

Существенно отметить, что длительное ограничение двигательной активности рассматривается нами как фактор, способствующий «срыву» компенсаторно-адаптационных механизмов организма.

Полученные нами результаты согласуются с данными ранее выполненных исследований, в которых отражена ключевая роль перекисного окисления липидов в реализации стрессорных повреждений мембран клеток костного мозга при различных факторах воздействия (Ф.З. Меерсон, М.Г. Пшенникова, 1988; Львовская Е.И,1998; Ю.Г. Камскова, 2003).

2.2 Состояние стресс-лимитирующей системы у животных, подвергшихся действию острого и хронического стресса

Антиоксиданты, к которым относятся супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионредуктаза, находятся в крови и тканях, относятся к периферической стресс - лимитирующей системе. При стрессах, гипоксии, воспалении активируются свободно-радикальные реакции, которые находятся под контролем антиоксидантной системы (Т.Г. Сазонтова, Н.А. Анчишкина, Ю.В. Архипенко, 2007).

Полученные данные показывают, что при действии гипокинетического стресса на организм экспериментальных животных в ранней фазе(1-3-ьи сутки) активность антиоксидантных ферментов увеличивается соответственно: СОД - на 10,24% (р<0,01), - на 8% (р<0,05) в ткани костного мозга; в тимусе - на 10,66% (р<0,001), - на 8% (р<0,01); в селезенке - на 13,54% (р<0,05), - на 10,42% (р<0,05), каталаза увеличилась - на 9,51% (р<0,01) и - на 6% р<0,05) в костном мозге; в тимусе - на 8,30% (р<0,01) и - на 6% (р<0,05); в селезенке на этих же сроках - на 6,35% (р<0,05), - на 8% (р<0,05). Показатели тканевого церулоплазмина и глутатионредуктазы с первых по третьи сутки гипокинетического воздействия также были увеличены. Через 5-ть суток эксперимента все антиоксидантные ферменты в ткани костного мозга, тимуса и селезенки снижались ниже контрольных значений.

Известно, что ферментативные антиоксиданты - супероксиддисмутаза и каталаза являются первым звеном внутриклеточной защиты от активных радикалов, что подтверждается результатами нашего исследования. В острой фазе стресса в костном мозге, тимусе и селезенке эти ферменты повышались, а в фазу хронического стресса - снижались. Поэтому возникла необходимость провести коррекцию для активации стресс-лимитирующей системы в ткани костного мозга, тимуса и селезенки. С этой целью мы осуществляли внутрибрюшинное введение препарата церулоплазмина за сутки до опыта и дополнительно за один час до начала эксперимента в течение 3-ех суток.

Из анализа полученных данных следует, что при применении церулоплазмина наблюдалось повышение показателей активности антиоксидантных ферментов в костном мозге через сутки: активность СОД увеличилась - на 14,28% (р<0,001), активность каталазы - на 12% (р<0,001); в тимусе активность СОД увеличилась - на 14,46% (р<0,001), активность каталазы - на 16% (р<0,001); в селезенке активность СОД увеличилась - на 15% (р<0,001), активность каталазы - на 11% (р<0,01). (рис.2).

Через трое суток гипокинетического воздействия на фоне введения церулоплазмина активность антиоксидантных ферментов была выше в костном мозге: СОД увеличилась - на 16% (р<0,001), активность каталазы - на 12,17% (р<0,001); в тимусе: СОД увеличилась - на 18,52% (р<0,001), активность каталазы - на 20% (р<0,001); в селезенке: СОД увеличилась - на 22% (р<0,001), активность каталазы - на 19% (р<0,010).

Через 15 суток действия стресса на организм экспериментальных животных на фоне коррекции церулоплазмином показатели активации антиоксидантных ферментов оставались выше уровня контроля.

Рис. 2. Динамика показателей антиоксидантных ферментов в тканях системы крови у экспериментальных животных при гипокинезии и на фоне введения церулоплазмина.

Тридцатые сутки действия хронического стресса при коррекции церулоплазмином характеризовались повышенным уровнем активности всех антиоксидантных ферментов в костном мозге, тимусе и селезенке по сравнению с уровнем контроля. Следует отметить, что и показатели активности глутатионредуктазы также были выше контрольных значений.

Таким образом, введение препарата церулоплазмина в условиях хронического стресса способствовало активации антиоксидантов в ткани костного мозга, тимуса и селезенки в период с 5-ых по 30-ые сутки гипокинетического воздействия. Необходимо отметить, что максимальные значения активности исследуемых ферментов зафиксированы на 3-ьи - 15-ые сутки на фоне церулоплазмина.

2.3 Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в периферической крови и ткани костного мозга у экспериментальных животных

Как показали исследования И.В. Нестеровой (1999), А.В. Шуршалиной, В.Н. Верясова, Г.Т. Сухих (2001), Е.Г. Громовой, А.Р. Тугуза (2002) некоторые цитокины обладают «дистантными» свойствами гормонов, циркулируя длительное время в крови и образуя - «гормон-цитокиновую сеть» (G.C. Bagby, 1989; E.N. Benveiuste, 1995).

Цитокины, вырабатываемые активированными лимфоцитами, макрофагами, мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками костного мозга и тимуса (фибробластами, эндотелиальными клетками, эпителиальными клетками тимуса) являются медиаторами межклеточных коммуникаций. Биологические эффекты цитокинов заключаются в реализации воспалительных и иммунных реакций и кроветворения. Они служат ростовыми факторами, участвуют в межсистемных взаимодействиях (А.А. Ярилин, 1997; А.С.Симбирцев, 2004, О.А. Гомазков, 2006)

С.Л. Кетлинский (1995), И.С. Фрейдлин (1995), И.В. Нестерова (1999), R.W. Johnson, S. Arkins, (1997) по механизму действия цитокины разделили их на провоспалительные (ИЛ-1б, ИЛ-1в ИЛ-6, ИЛ-12, ИФН-г, ФНО-б) и противовоспалительные (ИЛ-4, ИЛ-10).

В таблице 3 представлены результаты исследования содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови животных при действии острого и хронического стресса.

Из анализа результатов таблицы 3 следует, что уровень ИЛ-1б увеличивался на всех сроках действия острого и хронического гипокинетического стресса: через 3-ое суток - на 23% (р<0,01), на 5-ые - 33% (р<0,01), на 7-ые - 35,5% (р<0,01). Максимальное содержание данного интерлейкина зафиксировано на 10-ые сутки - 37% (р<0,001) эксперимента. Начиная с 15-ых и по 30-ые сутки действия ГК показатели содержания ИЛ-1б оставались выше значения контроля от 25% (р<0,01) и до 14,15% (р<0,05) соответственно (табл. 3).

Уровень содержания ИЛ-1в также увеличивался на всех сроках у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса, за исключением 30-ых суток ГК, когда снижение его содержания составило 12,31% от значения контроля (табл. 3).

Таблица 3

Показатели содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови у экспериментальных животных при действии острого и хронического стресса (M±m)

параметры время от начала ГК	ИЛ-1б (пкг/мл)	ИЛ-1в (пкг/мл)	ИЛ-2 (пг/мл)	ИЛ-6 (пг/мл)	ИЛ-12 (пг/мл)
Контроль n=8	20,00±1,23 100%	45,00±1,56 100%	1,06±0,12 100%	17,21±1,12 100%	7,00±0,52 100%
ГК1 сутки n=8	22,60±0,63 113%	50,23±1,46* 112%	1,38±0,04* 130,19%	20,43±0,67* 118,71%	5,4±0,34* 77,14%
ГК3 суток n=8	24,60±0,42** 123%	56,25±2,03*** 125%	1,80±0,21** 169,8%	18,53±1,44 107,67%	5,3±0,39* 75,71%
ГК5 суток n=8	26,60±1,53** 133%	58,50±2,26*** 130%	2,17±0,23*** 204,72%	20,40±0,75* 118,53%	4,90±0,14** 70%
ГК7 суток n=8	27,10±1,21** 135,5%	63,00±4,13*** 140%	2,24±0,16*** 211,32%	25,20±1,05*** 146,43%	3,6±0,70** 51,43%
ГК10 суток n=6	27,40±1,32*** 137%	58,50±2,34*** 130%	2,06±0,25** 194,34%	23,15±1,23** 134,51%	4,6±0,45** 65,71%
ГК15 суток n=6	25,00±1,03** 125%	55,80±2,04*** 124%	1,82±0,08*** 171,69	21,04±1,05* 122,25%	4,50±0,15*** 64,30%
контроль ГК30 суток n=6	18,45±0,84 21,06±0,44* 114,15%	40,23±1,03 35,28±1,09** 87,69%	1,30±0,04 1,75±0,11** 134,61	16,15±0,45 19,35±0,97* 119,81%	7,4±0,34 4,50±0,16*** 60,81%

Примечание: достоверность отличий от соответствующего контроля: * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001, рассчитанных с помощью критерия Стьюдента (t).

Изучение уровня ИЛ-6 выявило, что достоверное повышение его содержания в сыворотке крови экспериментальных животных, наблюдалось через трое суток на 18,71% (p<0,05). Максимальное увеличение содержания данного интерлейкина зафиксировано на 7-ые - 46,43% (р<0,01), а на 10-ые сутки наблюдалось снижение содержания ИЛ-6 до - 34,51% (р<0,01) по отношению к 7-ым суткам. Через 15-ть и 30-ть суток гипокинетического воздействия содержание ИЛ-6 оставалось повышенным по отношению к контролю на 22,25% и 19,81% (р<0,05). Таким образом, на всех сроках действия ГК зафиксировано повышенное содержание ИЛ-6 (табл. 3).

Противоположную направленность имела динамика содержания ИЛ-12 в сыворотке крови на всех сроках гипокинетического воздействия. Снижение содержания ИЛ-12 в среднем составило от 23% до 49%, что, вероятно, обусловило снижение миграции стволовых кроветворных клеток в циркуляцию и нарушение формирования экстрамедуллярных очагов кроветворения (табл. 3).

Содержание ФНО-б на всех сроках гипокинетического воздействия оставалось повышенным(рис. 3). Достоверное повышение монокина зафиксировано, начиная с первых и по 15-ые сутки, действия гипокинетического стресса. По спектру биологических эффектов ФНО-б близок к ИЛ-1 и ИЛ-6 и обладает антиапоптозными эффектами (E.Taoufik, 2008).

Уровень интерферона-г на всех сроках действия острого и хронического гипокинетического стресса был повышен, к 30-ым суткам его содержание снизилось до уровня контроля (рис. 3).

Таким образом, в процессе действия острого и хронического гипокинетического стресса на экспериментальных животных содержание провоспалительных цитокинов в сыворотке крови (ИЛ-1б, ИЛ-1в, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-12, ИФН-г) носило временные отличия: уровень ФНО-б, ИЛ-6, ИЛ-1б увеличился на всех сроках стресса; ИЛ-в, ИФН-г увеличивались на всех сроках, за исключением 30-ых суток; уровень ИЛ-12 в сыворотке крови падал на всех сроках. Повышение содержания провоспалительных цитокинов коррелировало с увеличением числа моноцитов и нейтрофилов в периферической крови.

В ткани костного мозга содержание провоспалительных цитокинов (ИЛ-1б, ИЛ-1в, ИЛ-6, ФНО-б, ИФН-г) увеличивалось на всех сроках действия стресса, кроме 30-ых суток, к которым содержание цитокинов нормализовалось.

Рис. 3. Динамика показателей содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови животных при действии острого и хронического стресса

Примечание: * - достоверные отличия от контрольного (исходного) уровня.

Результаты исследований провоспалительных цитокинов (ИЛ-1б, ИЛ-1в, ИЛ-6, ФНО-б) в ткани костного мозга у животных, подвергшихся гипокинетическому стрессу, представлены в таблице 4.

Из анализа результатов таблицы 4 следует, что содержание ИЛ-1б и ИЛ-1в было повышенно на всех сроках действия острого и хронического гипокинетического стресса в ткани костного мозга.

Максимальное увеличение содержания ИЛ-1б и ИЛ-1в было зафиксировано на 7-ые сутки гипокинетического воздействия - на 40,7% (р<0,01) и - на 43,02% (р<0,01) соответственно. К 30-ым суткам гипокинетического воздействия содержание ИЛ-1б и ИЛ-1в снизилось до контрольных значений.

Самые высокие значения содержания провоспалительных цитокинов были выявлены для ИЛ-2 в ткани костного мозга. Так, к 7-ым суткам воздействия гипокинезии его содержание было вдвое выше, чем в контроле. Даже к концу эксперимента уровень ИЛ-2 оставался выше контрольных значений - на 28,41% (p<0,01) (табл. 4).

Содержание ИЛ-6 достоверно увеличивалось в ткани костного мозга только в период с 1-ых по 7-ые сутки, на остальных сроках исследования показатели были близки к контрольным значениям.

Таблица 4

Показатели содержания провоспалительных цитокинов в ткани костного мозга при влиянии острого и хронического стресса (M±m).

параметры время от начала ГК	ИЛ-1б (пкг/мл)	ИЛ-1в (пкг/мл)	ИЛ-2 (пг/мл)	ИЛ-6 (пг/мл)	ФНО-б (пг/мл)
Контроль n=8	25,12±0,63 100%	21,06±0,44 100%	6,50±0,21 100%	12,45±0,67 100%	26,56±0,46 100%
ГК1 сутки n=8	31,65±1,06** 126%	26,11±1,43** 124%	9,10±0,55*** 140%	15,43±1,08* 124%	29,58±0,88** 111,37
ГК3 суток n=8	32,65±1,56*** 130%	27,00±1,63** 128,20%	10,92±0,92*** 168%	18,52±1,03*** 149%	33,12±2,03** 125%
ГК5 суток n=8	33,93±2,65** 135,07%	28,00±1,44*** 133%	12,38±1,03*** 190,46	14,12±0,32* 113,41%	31,09±1,24** 117,05%
ГК7 суток n=8	35,34±3,04** 140,7%	30,12±2,23** 143%	13,19±2,04** 203%	15,03±0,36** 121%	32,00±1,63** 120,48%
ГК10 суток n=6	30,14±1,55** 120%	25,58±1,21* 121,46%	11,93±1,32*** 183,54%	13,34±0,11 107,15%	30,68±1,51* 115,51%
ГК15 суток n=6	28,33±0,43* 112,8%	24,22±1,32* 115%	9,70±0,54** 149,23%	14,52±0,81 116,63%	30,01±1,48* 113%
контроль ГК30 суток n=6	26,00±0,83 27,14±1,53 104,4%	20,14±0,70 21,55±0,40 107%	6,30±0,33 8,09±0,45** 128,41%	11,53±0,74 11,05±0,86 95,84%	27,12±0,65 28,68±0,54 106%

Примечание: достоверность отличий от соответствующего контроля: * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001, рассчитанных с помощью критерия Стьюдента (t).

Диапазон увеличения содержания ФНО-б составил на разных сроках действия острого и хронического гипокинетического стресса от 111% до 125%. Максимальное увеличение ФНО-б зафиксировано на 3-ьи сутки воздействия - на 25% (р<0,01).

Исследование профиля противовосполительных цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных показало, что через сутки гипокинетического воздействия содержание ИЛ-4, ИЛ-10 было увеличено соответственно - на 28,66% (р<0,05), - на 32,03% (р<0,001); через ГК₃ суток - на 40,13% (р<0,01), - на 44% (р<0,001) соответственно; через ГК₇ - на 69% (р<0,01), - на 68% (р<0,001); через ГК₁₅ - на 35,03% (р<0,05), - на 57% (р<0,001) и через ГК₃₀ суток - на 29,03% (недостоверно), - на 34,44% (р<0,01) (рис. 4 А).

Изучение профиля противовоспалительных цитокинов в ткани костного мозга (рис. 4 Б) выявило, что через одни сутки гипокинетического воздействия содержание цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10 увеличилось соответственно - на 32,39% (р<0,01), - на 23% (р<0,01); максимальное увеличение интерлейкина ИЛ-4 зафиксировано через семь суток, а интерлейкина ИЛ-10 - на десятые сутки гипокинетического воздействия - на 65,27% (р<0,001) и 60,09% (р<0,01) соответственно.

Биологические эффекты противовоспалительных цитокинов связаны со стимуляцией гемопоэза и способностью повышать выживаемость кроветворных клеток, а также с регулированием функций организма, обеспечением развития защитных реакций и поддержанием гомеостаза при различных воздействиях. Существенно отметить, что имеется ряд научных работ, в которых раскрывается влияние цитокинов, как провоспалительных, так и противовоспалительных, на поведенческую реакцию. Проведенный нами эксперимент подтвердил данные положения об изменении этологических показателей, в частности, наблюдались: снижение мотивационной деятельности в сочетании с агедонией, перестройка структуры поведения и связи между ними, усиливались тревожно-фобические состояния и др. при моделировании гипокинетического стресса у экспериментальных животных.

А Б

Рис. 4. Динамика содержания противоспалительных цитокинов в сыворотке крови и ткани костного мозга у экспериментальных животных в условиях гипокинезии.

Примечание: достоверность отличий от соответствующего контроля: * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001, рассчитанных с помощью критерия Стьюдента (t).

1 - ГК₁, 2 - ГК₃, 3 - ГК₅, 4- ГК₇, 5 - ГК₁₀, 6 - ГК₁₅, 7 - ГК₃₀.

2.4 Влияние препарата граноцит на общее количество лейкоцитов в периферической крови у животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стрессора

Препарат граноцит представляет собой колониестимулирующий фактор, относится к биологически активным протеинам, регулирующим дифференцировку и пролиферацию клеток органов. Под действием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора происходит стимуляция и миграция мультипотентных ГСК из костного мозга в кровь, что повышает возможность их поступления в поврежденные лимфоидные органы с последующей активацией в них процессов регенерации (D. M. Bodine et. al., 1994; T. Takahashi et. al., 1999; Van Os et. al., 2002, A. J. Wagers et. al., 2002).Основываясь на свойствах данного препарата, мы использовали его для коррекции нарушений в системе крови.

Общее количество лейкоцитов в периферической крови у экспериментальных животных в условиях гипокинетического стресса. Так, через 1-ые сутки у экспериментальных животных наблюдалось увеличение общего количества лейкоцитов - на 47,58% (p<0,01).

В последующие сроки ГК наблюдалось постепенное снижение общего количества лейкоцитов в периферической крови и к 10-ым суткам их количество снизилось - на 10,3%, а к 15-ым - на 17,47% по сравнению с контролем.

При введении препарата граноцит уже к 3-им суткам ГК зафиксировано повышение общего количества лейкоцитов в 3,5 раза, на 5-ые - 7-ые сутки в 3 раза по отношению к показателям экспериментальных животных, не получавших препарат граноцит. На 10-ые - 15-ые сутки действия гипокинетического стресса количество лейкоцитов оставалось выше на 28,37% и 23,0% (p<0,05) (рис. 5).

Рис. 5. Показатели относительного количества лейкоцитов в периферической крови у крыс, подвергшихся действию гипокинетического стресса в различное время после начала эксперимента (отношение показателей в группе гипокинезия к группе гипокинезия + граноцит)

Примечание: * - достоверные отличия от значения показателя в группе гипокинезия.

2.5 Влияние препарата граноцит на общее количество кариоцитов и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в костном мозге у животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса

На рис. 6 представлено общее содержание кариоцитов в костном мозге у экспериментальных животных при гипокинетическом воздействии. С 1-ых по 7-ые сутки содержание ОКК повышалось в среднем на 15,07% - 30% (p<0,01). На 10-ые - 15-ые сутки эксперимента общее количество кариоцитов в костном мозге снижалось на - на 30% (p<0,01) (рис. 6).

Рис. 6. Показатели относительного количества ОКК и ММСК в костном мозге у крыс в различные сроки гипокинезии (отношение показателей в группе гипокинезия к группе гипокинезия + граноцит).

Содержание кариоцитов в костном мозге, у крыс, подвергшихся гипокинетическому воздействию на фоне коррекции препаратом граноцит, значительно увеличилось по сравнению с гипокинетическим воздействием без препарата, начиная с 3-х и по 10-ые сутки увеличивалось в среднем 2,5-3 раза, а на 15-ые сутки - в 2 раза.

Содержание мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в костном мозге у животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса, представлено на рис. 6.

Процесс гиперплазии костного мозга (повышение содержания миелобластов, промиелоцитов и миелоцитов, общего содержания гранулоцитарных элементов в миелоидной ткани) сопровождался увеличением общего количества мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на 3-ьи, 5-ые и 7-ые сутки ГК. Аналогичные изменения со стороны гранулоцитарного ростка на фоне введения ММСК были получены в экспериментах на 5-ые сутки после острой кровопотери (И.Ю. Маклакова, А.П. Ястребов, Д.Ю. Гребнев, 2009). Максимальное значение количества ММСК в костном мозге было на 3-ьи сутки, что составило - 173,53% (p<0,01), а ОКК - 132,08%. На 15-ые сутки воздействия отмечалось снижение данного показателя на 16,0% относительно контроля.

Необходимо отметить, что препарат граноцит приводит к достоверному увеличению содержания ММСК костного мозга при действии острого и хронического гипокинетического стресса по сравнению с гипокинетическим воздействием без препарата. В период с 3-их по 10-ые сутки увеличение количества ММСК составило 2-2,5 раза. К 15-ым суткам эксперимента содержание ММСК превышало контроль на 48%, а ОКК на 107,54% (рис. 6).

Таким образом, отмечено стимулирующее действие граноцита на миелопоэз и мезенхимопоэз, реализующееся на уровне мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в костном мозге (рис. 6).

А Б

Рис. 7 (А, Б). Динамика показателей количества ядерных клеток в тимусе - А и селезенке - Б у крыс в различное время содержания животных в гипокинетических условиях и при введении граноцита