Закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при остром и хроническом гипокинетическом стрессе

На рис. 7(А) представлены данные по количеству ядросодержащих клеток (ЯСК) в тимусе экспериментальных животных, подвергшихся влиянию острого и хронического гипокинетического стресса. Через сутки количество ядерных клеток снизилось - на 22,53% (p<0,01), на 3-ьи сутки - на 56,81% (p<0,001). Максимальное снижение ЯСК в тимусе при гипокинетическом воздействии зафиксировано на 10-ые сутки - на 67,91%(p<0,001) (рис. 7А). Достоверное снижение ядросодержащих клеток в тимусе подтверждается гистологическими исследованиями.

Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на ядросодержащие клетки в селезенке представлены на рис. 7(Б). Количество ядросодержащих клеток селезенки, начиная с первых по 15-ые сутки, достоверно снижалось по отношению к контролю: на 1-ые сутки - на 28,78% (p<0,001), а на 3-ьи - на 46,04% (p<0,001). Максимальное снижение количества ЯСК в селезенке зафиксировано на пятнадцатые сутки гипокинетического воздействия - на 70,88% (p<0,001).

При просмотре гистологических препаратов селезенки выявлено, что на всех строках действия гипокинезии было увеличено число и диаметр лимфоидных фолликулов. При этом абсолютная и относительная площадь белой пульпы увеличена по сравнению с показателями группы контроля. Клеточная плотность в Т и В - зонах лимфоидных фолликулов снижена, диаметр лимфоцитов в них увеличен. Абсолютная и относительная площадь Т и В - лимфоидных зон увеличены.

Как следует из рис. 7(А), трехкратное введение препарата граноцит экспериментальным животным значительно увеличило количество ядросодержащих клеток в ткани тимуса на всех сроках действия гипокинетического стресса: через трое суток - на 49,69% (p<0,001) и составило 520,64±27,11•10⁶ по сравнению с гипокинетическим воздействием без препарата 347,81±18,64•10⁶; на 5-ые, 7-ые и 10-ые сутки увеличение составило - 39,68% (p<0,001), - 31,36% (p<0,001) и - 23,90% (p<0,01) соответственно. На 15-ые и 30-ые сутки количество ядросодержащих клеток оставалось выше контроля - на 15,55% (p<0,05) и - на 10% (p>0,05) (рис.7 А).

На рис. 7(Б) представлены данные исследования ядросодержащих клеток в ткани селезенки на фоне введения препарата граноцит экспериментальным животным, подвергшимся гипокинетическому воздействию. Достоверное увеличение ЯСК было зафиксировано с 3-х по 15-ые сутки в среднем на 10-20%, к 30-ым суткам количество ЯСК оставалось выше контроля - на 8,13% (p>0,05).

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки участвуют в формировании гемопоэзиндуцирующего микроокружения костного мозга и стромальных «ниш», в процессах пролиферации и дифференцировки миелоидных прекурсоров (Watt F.M., 2000). Следует отметить, что в процессе культивирования ММСК они приобретают все черты, характерные для фибробластоподобных стволовых клеток, т.е. округлую и отростчатую форму и дают положительную реакцию на остеопоэтин - специфический маркер мезенхимальных элементов (Р.М. Хаитов, 2001; В.А. Козлов, 2004; F.M.Watt, 2000).

2.6 Особенности взаимосвязей между параметрами системы крови экспериментальных животных на разных стадиях формирования адаптационных процессов при гипокинетическом стрессе

Устойчивость гомеостаза обеспечивается эволюционно закрепленными механизмами адаптации, которые проявляются на всех уровнях организации живой материи. Многофакторно организованные механизмы управления жизнеобеспечения работают по каскадному принципу (В.П. Шахов, 2004; Д.З. Шибкова, 2006).

Длительная гипокинезия приводит к перестройке прямых и обратных регулирующих связей между основными биохимическими параметрами, системой цитокинов и клеточных элементов крови, обуславливающих поддержание динамического равновесия в условиях хронического стресса.

Корреляционный анализ выявил исчезновение ряда связей, характеризующих состояние системы крови у контрольных животных и формирование новых нетипичных связей для группы контроля.

Общее количество корреляционных связей между исследуемыми показателями к 3-им суткам гипокинетического воздействия снижается - на 15,2%, а к 15-ым суткам - на 24%.

Перераспределение активности между компонентами системы крови является необходимым условием компенсации морфофункциональных нарушений в организме, вызванных действующим фактором.

Так, число стабилизирующих систему достоверных отрицательных связей снижается на 23% к 3-им суткам гипокинетического воздействия, появляются новые положительные связи, например, между провоспалительным интерлейкином ИЛ-4 с нейтрофилами (r=0,7) и моноцитами (r=8) периферической крови.

Отношение числа отрицательных и положительных связей к 7-ым суткам составляло 2,24 в пользу последних, тогда как в контроле, это соотношение было 1,26. Это свидетельствует о продолжающемся процессе активации системы крови в целях формирования новой функциональной системы, обеспечивающей активацию компенсаторно-адаптационного процесса в условиях гипокинетического воздействия.

В целом, корреляционный анализ показывает, что регуляторные связи в системе крови при 30-тисуточной гипокинезии подвержены и количественным, и качественным изменениям.

3 Обсуждение полученных результатов

В системе крови в период 30-ти суточной гипокинезии наблюдались гомеостатические сдвиги, указывающие на фазность включения адаптационных процессов.

Анализ результатов исследования, представленных в третьей главе (содержание кортикостерона, активность МАО, липопероксидация перекисного окисления липидов, содержание ядросодержащих клеток в иммунокомпетентных органах, состояние миелопоэза и др.), свидетельствует о том, что реакция системы крови на хронический гипокинетический стресс характеризуется как наличием синхронных, так и гетерохронных реакций. В частности, в острой фазе гипокинетического синдрома увеличивается количество лейкоцитов в периферической крови (достоверно на 40-50%); провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови и ткани костного мозга (на 25-70% выше контрольных значений), за исключением цитокина ИЛ-12.

Такие показатели, как абсолютное содержание кариоцитов в тимусе, селезенке, снижаются на всех сроках экспериментального воздействия, тогда как в костном мозге в период с 1-ых по 7-ые сутки количество кариоцитов удерживается на уровне 15-ти - 30-ти процентов выше контроля. Еще большие значения выявлены для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. Совершенно очевидно, что клеточное опустошение тимуса и селезенки компенсируется активацией адаптационно - компенсаторных процессов на уровне миелоидного ростка с 3-х по 7-ые сутки исследования.

В острой фазе гипокинетического синдрома значения показателей стресс - реализующей системы организма животных были повышены. Это подтверждается увеличением содержания кортикостерона в плазме крови на 55-73%, малонового диальдегида в ткани костного мозга, тимуса и селезенки на 20-22%; напротив, активность моноаминооксидазы в этих органах снижается на 27-35%, а интенсивность липопероксидации увеличивается, о чем свидетельствует повышенное содержание кетодиенов и сопряженных триенов на 12-15%. Так же повышалась активность стресс-лимитирующей системы на уровне антиоксидантных ферментов в острую фазу стресса в костном мозге, тимусе и селезенке.

Ограничение стресс-реализующей системы на уровне органов и тканей происходит за счет активации локальных стресс - лимитирующих систем (антиоксидантных систем), включающих в себя антиоксидантные ферменты: супероксиддисмутазу, каталазу, церулоплазмин, глутатионредуктазу. Падение их активности может привести к повреждению органов и организма в целом, что и наблюдается в хронической фазе гипокинетического стресса.

Повышенный уровень глюкокортикоидов (увеличение на 50%) способствует активации свободнорадикальных процессов. Наблюдается однонаправленность в функционировании стресс - реализующей системы: МДА на 10-ые - 30-ые сутки гипокинетического стресса в ткани костного мозга, тимуса и селезенки повышается до 29-32%, активность МАО - до 26-30%, содержание продуктов липопероксидации: диеновых коньюгатов, вторичных кетодиенов и сопряженных триенов было увеличено на 15 - 43%. Напротив, активность антиоксидантных ферментов, деятельность которых направлена на ограничение ПОЛ, в фазу хронического стресса снижалась. Для хронического гипокинетического стресса характерен дисбаланс про- и антиоксидантных систем, который проявляется в нарушении различных звеньев гомеостаза, а именно - в снижении: общего количества лейкоцитов в крови( на 18%), клеточности тимуса, селезенки( на 65-68%), клеток костного мозга( на 33%) и ММСК( на 16%).

Коррекцию нарушения со стороны кроветворных и лимфоидных органов можно осуществить за счет активации гемопоэза. Так, с помощью цитокина - гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) можно предупредить развитие стадии истощения адаптационного синдрома.

Известно, что применение граноцита вызывает усиление пролиферации и дифференцировки гранулоцитомакрофагальных колониеобразующих единиц, стимуляцию белого ростка системы крови, индуцирует развитие лейкоцитоза и поступление ММСК в кровь (Е.Д. Гольберг, А.М. Дыгай, В.В. Жданов и др., 2005; В.П. Шахов и др., 2005; P.Bianco et al; 1999). При введении граноцита в наших опытах достоверно увеличивалось количество ММСК начиная уже с 3-их по 15-ые сутки гипокинетического воздействия, кариоцитов в костном мозге достоверно увеличивалось с 1-ых по 15-ые сутки. Общее количество лейкоцитов увеличивалось с 3-х суток, ядросодержащих клеток в тимусе и селезенке с 3-х до 30 сутки. Усиление локальной продукции ММСК в костном мозге привело к запуску и активации каскадоподобных механизмов в ответ на введение граноцита, влияющего на миело- и мезенхимопоэз.

Так как стресс - реализующей системе при гипокинетическом стрессе противостоит антиоксидантная система, то для усиления активации последней мы вводили экзогенный гуморальный антиоксидант церулоплазмин (ЦП), который влияет на активность перекисного окисления липидов. Данный белковый фермент выступает в качестве перехватчика супероксидного анион-радикала и гипохлорида (А.Н. Закирова, Л.Н. Мингазетдинова и др., 1994).

Предварительное введение церулоплазмина предупреждает угнетение тканевых антиоксидантных ферментов, способствует снижению содержания молекулярных продуктов ПОЛ на всех сроках воздействия гипокинезии у экспериментальных животных.

Выводы

1. При моделировании длительного гипокинетического стресса в организме экспериментальных животных происходит активация стресс - реализующей системы:

· в периферической крови на 1-е, 3-ьи, 7-е сутки достоверно увеличивалось содержание кортикостерона соответственно на 55%, 80%, 73% относительно контроля;

· отмечалась фазность в динамике содержания МАО в костном мозге, тимусе, селезенке: достоверное снижение с 6-ти часов до 3-ех суток; достоверное повышение с 5-ых по 10-ые сутки (с максимумом на 7-ые сутки - на 26,11% , 20% и 30,12% соответственно) с последующим снижением на 15-ые - 30-ые сутки во всех органах;

· интенсивность процессов липидной пероксидации (ПОЛ) в костном мозге, тимусе и селезенке протекало в две фазы: в 1-ой фазе (начиная с 3-их суток) происходило снижение первичных гептанрастворимых молекулярных продуктов ПОЛ с последующей нормализацией к 30-ым суткам. Содержание вторичных молекулярных продуктов ПОЛ, растворимых как в гептане₂, так и в изопропаноле₂, было достоверно повышено; максимум повышения молекулярных продуктов ПОЛ, растворимых в гептане₂, зафиксирован в костном мозге - на 43,25%, в селезенке - на 40% (15-ые сутки), в тимусе - на 44,4% (30-ые сутки);

· малоновый диальдегид (МДА) - конечный продукт ПОЛ в ткани костного мозга, тимуса и селезенки достоверно повышался с первых суток гипокинезии, достигая максимума (130% от контроля) к 10-ым суткам.

2. Активность антиоксидантных ферментов в ткани костного мозга, тимуса и селезенки (СОД, каталаза, церулоплазмин, глутатионредуктаза) в течение первых трех суток гипокинетического воздействия достоверно увеличивалась (на 10-13% от уровня контроля), а с 5-ых по 30-ые сутки наблюдалось снижение их активности; минимальные значения активности каталазы отмечались на 7-ые - 15-ые сутки (74% от контроля), СОД 15-ые - 30-ые сутки (81-85% от контроля). Предварительное введение церулоплазмина предупреждало угнетение этих ферментов.

3. При действии острого и хронического гипокинетического стресса на организм экспериментальных животных достоверно уменьшилась масса тимуса до 45-55% на 10-ые - 30-ые сутки, масса селезенки - до 42-46% на 10-ые - 15-ые сутки. Предварительно введение граноцита на всех сроках действия гипокинетического стресса сопровождалось повышением массы этих органов.

4. Под влиянием гипокинетического стресса количество ядросодержащих клеток в тимусе и селезенке достоверно снижалось начиная с 10-ых суток, достигая минимума на 30-ые сутки (45% и 56% соответственно). Введение препарата граноцита приводило к достоверному увеличению количества клеток в этих органах (на 3-ье - 15-ые сутки) по сравнению с гипокинетическим воздействием.

5. При действии гипокинетического стресса количество кариоцитов в костном мозге экспериментальных животных достоверно увеличивалось на 1-ые - 7-ые сутки и снижалось на 10-ые - 15-ые сутки, диапазон изменений составил ± 32% от контрольных значений. Увеличение клеточности костного мозга сопровождалось ростом количества мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на 48-74% (3-ьи - 7-ые сутки). Введение препарата граноцита лабораторным животным во время гипокинетического стресса оказывает протекторное действие на костномозговое кроветворение: количество кариоцитов достоверно увеличилось с 3-их по 10-ые сутки в 2,5-3 раза; количество мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток достоверно увеличилось, начиная с 3-их и по 15-ые сутки в 2-2,5 раза по сравнению с гипокинезией.

6. В периферической крови наблюдаются фазные изменения общего количества лейкоцитов: в ранние сроки (до 7-х суток) происходило достоверное увеличение с максимумом на 1-ые - 3ьи сутки, на 10-ые - 15-ые сутки - наблюдалась нормализация данного показателя. Количество лимфоцитов было достоверно снижено на всех сроках гипокинетического стресса. Анализ гемограммы животных, получавших граноцит, показал увеличение общего количества лейкоцитов в 3-3,5 раза по сравнению с гипокинетическим воздействием.

7. При воздействии гипокинетического стресса на экспериментальных животных динамика содержания провоспалительных цитокинов в крови и костном мозге (ИЛ-1б, ИЛ-1в, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-12, ИНФ-г) носила асинхронный характер, максимальные значения данных показателей были отмечены на 5-ые - 7-ые сутки. Содержание противовоспалительных цитокинов в крови и костном мозге (ИЛ-4, ИЛ-10) на всех сроках гипокинетического воздействия достоверно увеличивались, что способствовало развитию адаптации к гипокинезии.

8. Длительная гипокинезия приводит к перестройке регулирующих связей между основными биохимическими параметрами, системой цитокинов и клеточных элементов крови, обуславливающих поддержание динамического равновесия в условиях хронического стресса. Корреляционный анализ выявил исчезновение ряда связей, и формирование новых связей, характеризующих гомеостатическое состояние системы крови у экспериментальных животных.

Список публикаций по теме диссертации

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Латюшин, Я.В. Роль микроэлементов в организме животных / Я.В. Латюшин // Вестн. Челяб.гос.пед.ун-та.- Сер. 4, Естеств. науки.-2005.-№ 7. - С.150-156.

2. Латюшин, Я.В. Особенности влияния хронического стресса на перекисное окисление липидов в скелетной и сердечной мышцах / Я.В. Латюшин // Вестн. Южно-Урал.гос.ун-та. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. - 2005. - Вып. 5, т. 1.- № 4 (44). - С. 244-247.

3. Усова, Н.Е. Влияние профилактического введения гамма-оксимасляной кислоты на некоторые показатели обмена липидов у животных, подвергнутых стрессам / Н.Е. Усова, Я.В. Латюшин, Ю.Г. Камскова // Вестн. Южно-Урал.гос.ун-та. - Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. - 2005.- Вып. 5,.- т. 1,- № 4 (44). - С. 283-285.

4. Влияние эмоционально-болевого стресса на поведенческую активность крыс в тесте «открытое поле» / Я.В. Латюшин, Ю.Г. Камскова, Н.В. Мамылина, В.И. Павлова // Вестн. Южно-Урал.гос.ун-та. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. - 2006. - Вып. 7. - т. 1, - № 3 (58). - С. 178-179.

5. Анализ тревожно - фобического состояния крыс в результате действия острого и хронического стрессов / Я.В. Латюшин, В.И. Павлова, Н.В. Мамылина, Л.П. Щетинкина, Т.Б. Язовских // Вестн. урал. мед. академ. науки. - Екатеринбург, 2006. - № 3 (2). - С.109-110.

6. Латюшин, Я.В. Состояние перекисного окисления липидов и антиоксидантных ферментов у рабочих электроплавильного производства Челябинского абразивного завода в слюне, испытывающих стресс / Я.В. Латюшин, А.Ф. Андрианов // Вестн. урал. мед. академ. науки. - Екатеринбург, 2007. - № 1.- С. 46-48.

7. Физическая нагрузка в адаптации спортсменов и профилактике психофизического переутомления/ В.И. Павлова, Я.В. Латюшин, Н.В. Мамылина, М.С. Терзи // Теория и практика физической культуры. - 2007.-№ 10. - С. 11-14.

8. Латюшин, Я.В. Влияние препарата «Граноцит» на общее количество клеток мозга и переферической крови при действии хронического стресса/ Я.В. Латюшин // Вестн. Челяб.гос.пед.ун-та. - 2008. - № 7.- С. 272-280.

9. Шахов, В.П. Представление о системе мезенхимопоэза и мезенхимальных стволовых клетках/ В. П. Шахов, Я. В. Латюшин // Вестн. Челяб.гос.пед.ун-та. - 2008 .- № 8. - С. 261-278.

10. Латюшин, Я.В. Особенности влияния хронического стресса на динамику перекисного окисление липидов в тканях костного мозга/ Я. В. Латюшин // Вестн. Челяб.гос.пед.ун-та. - 2008. -№ 9. - С.271-277.

11. Латюшин, Я.В. Влияние хронического стресса на динамику ПОЛ в ткани костного мозга. / Я.В. Латюшин // Вестник ЧГПУ.- 2008. - № 9 .- С. 264 - 271.

12. Латюшин, Я.В. Роль цитокинов и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в регуляции локального гомеостаза костного мозга на уровне мезенхимальных стволовых клеток при моделировании гипокинезии/ Я.В. Латюшин, В.П. Шахов, В.И. Павлова // Вестн. урал. мед. академ. науки. - Екатеринбург, 2009. - Т. 26. - № 3. - С. 7-29.

13. Стимуляция мезенхимальных стволовых клеток и костномозгового гемопоэза с помощью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при дезадаптации организма/ Я.В. Латюшин, Н.Ю. Шелгаев, В.И. Павлова, В.П. Шахов // Вестн. Южно-Урал.гос.ун-та. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. 2009. - Вып. 21, - № 39 (172). - С. 92 - 95.

14. Латюшин, Я.В. Динамика антиоксидантных ферментов в костном мозге животных на фоне коррекции церулоплазмином при действии эмоционально-болевого и гипокинетического стресса/ Я.В. Латюшин, В.И. Павлова, Н.В. Мамылина // Вестн. Челяб.гос.пед.ун-та. - 2009. - № 12 .- С. 319-325.

Монография:

15. Принципы использования фундаментальных основ клеточной и молекулярной биоинженерии для повышения физиологических возможностей живых систем/ В.П. Шахов, Я.В. Латюшин, С.В. Попов, А.П. Сипок. - М.: Изд-во МГОУ, 2008. - 252 с.

Публикации в других изданиях:

16. Латюшин, Я.В. Антиоксидантная защита костного мозга при действии стресса/ Я. В. Латюшин // Вестн. Южно-Урал.гос.ун-та. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. - 2007.-Вып.12, - № 16 [88]. - С. 142-144.

17. Угнетение поведенческой активности при длительной гипокинезии и защитные механизмы стресс - лимитирующих систем/ Я.В. Латюшин, Ю.Г. Камскова, В.И. Павлова И.В. Лактионова, Н.В. Мамылина, Д.А. Сарайкин, Н.Е. Усова // Научные труды I съезда физиологов СНГ. - М., 2005. - Т. 2. - С. 238-239.

18. Латюшин, Я.В. Роль цитокинов в процессе адаптации организма к хроническому стрессу / Я.В. Латюшин, Л.П. Щетинкина // Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды : материалы II научно - практ. конф., 8-11 нояб. 2008 г. : в 2 т. - Челябинск, - 2008. -.Т.2. - С. 384-387.

19. Latyushin, Ya. V. Adaptation of the organism to longtime hypokinesia by activation of stress-limiting systems / Ya. V. Latyushin, V. I. Pavlova, Yu. G. Kamskova //International society for adaptive medicine (ISAM) VIII world congress. June 21-24, Moskov, Russia. - 2006. - P. 103.

20. Latyushin, Y.V. The Disadaptive Action of the Nervous and Immune Systems in the Acute and Chronis Stress // Y.V. Latyushin / International Symposium «Interaction of the Nervous and Immune Systems in Health and Disease». - Saint-Petersburg, 2007. - P. 43.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГК - гипокинезия;

Г- КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ИЛ - интерлейкин;

ИФН - интерферон;

МАО - моноаминооксидаза;

МДА - малоновый диальдегид;

ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки;

ОАС - общий адаптационный синдром;

ОКК - общее количество кариоцитов;

ПОЛ - перекисное окисление липидов;

СМ - стромальное микроокружение;

СОД - супероксиддисмутаза;

ФНО - фактор некроза опухоли;

ЦП - церулоплазмин;

ЯСК - ядросодержащие клетки.