АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

РОЛЬ АНТИДИУРЕТИЧЕСКОГО ЗВЕНА РЕГУЛЯЦИИ

ВОДНОГО БАЛАНСА В ИЗМЕНЕНИИ РЕОЛОГИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ КРОВИ

03.03.01 - физиология

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время общепризнано влияние реологических свойств крови на состояние микроциркуляции - важное звено системы гомеостаза (В.В. Куприянов и соавт., 1975; П.Д. Горизонтов- ред., 1976; А.М. Чернух и соавт., 1984; В.И. Козлов и соавт., 1994). Значительный объем клинических и экспериментальных данных свидетельствует о важной роли изменений реологических свойств крови, проявляющихся повышением вязкости плазмы и цельной крови, усилением агрегации эритроцитов и снижением деформируемости как в условиях нормы, так и особенно, при наличии патологического процесса в организме (В.А. Левтов и соавт., 1982; С.А. Селезнев и соавт., 1985; В.А. Галенок и соавт., 1987; А.В. Муравьев и соавт., 1998; А.А. Мельников, 2004; O.K. Baskurt, 2003). Являясь подвижной тканью, кровь отвечает на любой повреждающий фактор как сложная система, в которой изменяются как реологические, так и физиологические свойства и исход любого повреждающего воздействия, таким образом, определяется совокупностью межклеточных взаимодействий эритроцитов, лимфоцитов, тромбоцитов, эндотелиоцитов и других клеток (А.М. Чернух, 1979; W. Palinski et al., 1983; E. Petitfrere et al., 1991; A.J. Marcus, 1994). Это дает основание рассматривать гемореологические сдвиги как элемент общей неспецифической стресс- реакции организма, имеющей защитный характер, но при чрезмерной длительности или интенсивности повреждающего воздействия способной трансформироваться в механизм патогенеза. С выраженными гемореологическими нарушениями связывают снижение кислородтранспортной функции крови, появление тканевой гипоксии, развитие тромбоза, венозные застои, периферические отеки, что в известной степени определяет прогноз и характер течения основного заболевания (Н.Н. Фирсов, П.Х. Джанашия, 2008; L. Dintenfass, 1976; A. Chabanel, M. Samama, 1994; R.S. Ajmani, 1997; J. Vekasi et al., 2001; S. Yedgar, 2002).

Условия потока во многом регулируют взаимодействие клеток крови друг с другом и с сосудистой стенкой (M.J. Pearson, H.H. Lipowsky, 2000; M. Anand et al., 2004; A. Jordan et al., 2004; M. Eugster, W.H. Reinhart, 2005; J.J. Hathcock, 2006). Важнейшим фактором, определяющим гемодинамические параметры, особенно в микроциркуляторном русле, является агрегация самой большой популяции клеток крови - эритроцитов (O.K. Baskurt, H.J. Meiselman 2003; A.R. Pries, T.W. Secomb, 2003; O. Yalcin, 2004; O. Yalcin et al., 2008). В этой связи есть основания предполагать наличие модулирующего влияния реологических свойств крови в общих защитных реакциях (V.T. Turitto, C.L. Hall, 1998; K.B. Abbitt, G.B. Nash, 2003; A.S. Popel, P.C. Johnson, 2005). С другой стороны, в последнее время все больше появляется данных об участии клеток крови в совместном контроле состояния гемодинамики. Составляя структурную основу для действия регуляторных процессов они участвуют в поддержании нормальных функций микроциркуляции (И.А. Тихомирова, 2006; А.В. Муравьев, С.В. Чепоров, 2009; G.B. Nash et al., 2001; S. Chien, 2006).

Несмотря на то, что эритроцитам присуща высокая специализация функций, принцип целостности системы крови предполагает существование ряда закономерных связей с другими типами клеток. Наличие этих связей, по-видимому, свидетельствует о существовании механизма стабилизации гемореологических параметров в микрососудах при физиологических условиях. Отчетливое проявление собственно адаптационных и компенсаторных реакций возможно лишь в ситуации напряжения и при патологии (А.М. Чернух, 1979; В.Б. Матюшичев и соавт., 2000). В этой связи важным является вопрос о механизмах регуляции таких реакций.

На сегодняшний день наряду с гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системой важная роль в адаптации организма к стрессу различной природы отводится гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе, состоящей из крупноклеточных ядер гипоталамуса, нейроны которых синтезируют антидиуретический гормон (АДГ) (Е.Б. Лискина, 2003; Е.Б. Месхидзе, 2008). Наличие специфических рецепторов к различным нейротрансмиттерам, нейропептидам и гормонам на клетках лимфоцитарного и моноцитарно-макрофагального ряда позволяет им через комплекс цитокинов активно объединять все системы организма в поддержании гомеостаза и обеспечивать развитие общих защитных реакций (В.В. Абрамов, 1988). Имеется ряд данных о способности эритроцитов непосредственно отвечать на действие циркулирующих цитокинов и простагландинов (I. Allen, H. Rasmussen, 1971; A. Rivera et al., 1999; 2002).

Помимо общего регуляторного влияния гемореологический эффект АДГ несомненно связан с его ролью в регуляции водного баланса, осмолярности плазмы и артериального давления (G.A. Vlastos et al., 2003; J. Van Zanten et al., 2005; L. Schwabe et al., 2007). Тесная связь водного обмена и системы кровообращения существует как на уровне нейроэндокринных механизмов регуляции жидкостного объема (А.В. Бабичев, 2003), так и на уровне микрососудистой гемодинамики, обеспечивающей условия трансмурального переноса воды через эндотелий капилляров и баланс ее секторального перераспределения (Я.Г. Финкинштейн, 1990; В.В. Банин, 2000; H. Wiig et al., 2008). Важным основанием для изучения влияния АДГ на реологические свойства крови служит и то обстоятельство, что усиление его секреции может наблюдаться не только под воздействием осмотических стимулов, но и быть следствием стресса, гипоксии, гипотонии, и, в целом, является достаточно частым событием при большом числе патологических процессов наличие гемореологических нарушений при которых рассматривается в качестве важного звена патогенеза: сахарный диабет, кровопотеря, шок, ожоговая травма, воспалительный процесс и др. (Г.И. Козинец - ред., 1997; А.Е. Березин, 2008; J.G. Verbalis, 2006, 2007; H.P. Peters et al., 2007).

Таким образом, проблема изучения влияния АДГ на реологические свойства крови является актуальной, решение ее позволило бы расширить возможности управления микроциркуляцией при гемодинамических и метаболических сдвигах в организме.

Вместе с тем, любая патология или стрессовая ситуация вызывает целый ряд эндо-, пара- и аутокринных изменений часто с однотипной реакцией со стороны микроциркуляторной системы, что затрудняет выяснение истинной физиологической роли конкретного гормона (А.М. Чернух и соавт., 1984).

Учитывая тот факт, что концентрация в крови АДГ имеет тесную зависимость от осмолярности плазмы, водная нагрузка часто применяется как функциональная модель с практически полным, физиологически адекватным подавлением эндогенной секреции гормона (А.И. Григорьев и соавт., 2005). Дозированное введение на этом фоне синтетического аналога десмопрессина может быть использовано для интерпретации его эффектов, связанных с изменением реологических свойств крови при сдвиге водно- электролитного гомеостаза организма. Кроме того тонкое взаимодействие между осмотическим и объемным стимулами при длительной водной нагрузке может модулировать порог секреции АДГ (W.M. Barron et al., 1984; C.E. Wade et al., 1986). Представляется целесообразным использовать указанные особенности регуляции секреции гормона для выявления его роли в гемореологических перестройках в эксперименте, что позволило бы исключить влияние других повреждающих факторов.

Цель работы: исследование роли антидиуретического звена регуляции водного баланса в механизмах изменения реологических свойств крови.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние дозированного введения синтетического аналога АДГ - десмопрессина на реологические свойства крови в эксперименте in vivo и in vitro.

2. Исследовать срочную реакцию и изучить особенности гемореологических перестроек при длительном периодическом состоянии напряжения осморегулирующей системы организма, вызванным водной нагрузкой в сочетании с введением десмопрессина.

3. Провести сравнительный анализ гемореологических перестроек в эксперименте с однократной и длительной водной нагрузкой, как функциональной модели используемой для подавления секреции эндогенного АДГ.

4. Сопоставить изменения реологических свойств крови с гидратационным статусом организма.

5. Исследовать особенности гидратации соединительной ткани и их роль в адаптационных перестройках организма при разных вариантах изменения водно- электролитного баланса организма.

6. Изучить половые особенности гемореологических перестроек и гидратации тканей у крыс при разных вариантах изменения водно-электролитного баланса организма с учетом известного полового диморфизма в секреции и эффектах АДГ.

Новизна полученных результатов

На основе комплексного экспериментального исследования доказано, что антидиуретический гормон является важным фактором изменения реологических свойств крови. Впервые показано, что синтетический аналог АДГ - десмопрессин в дозах, рекомендованных для разового введения при клиническом применении способствует усилению агрегатообразования эритроцитов, повышению вязкости плазмы и цельной крови. При этом выявлена взаимосвязь гемореологических сдвигов с изменением содержания в плазме кислых гликозаминогликанов.

Впервые в эксперименте с длительным одновременным введением десмопрессина и водной нагрузки показано, что при состоянии напряжения осморегулирующей системы организма, выраженные гемореологические перестройки, сопровождаются также заметными сдвигами лейкоцитарной формулы и изменением состояния соединительной ткани дермы животных. При отсутствии повышенной концентрации в крови АДГ отмечена только специфическая реакция в ответ на сдвиги осмолярности среды, проявляющаяся, главным образом, изменением объемных характеристик клеток.

Впервые показано, что характер срочной реакции реологических свойств крови при водной нагрузке в сочетании с введением десмопрессина заметно отличается от реакции на изолированную водную нагрузку. На основе акваметрических методов исследования при водной нагрузке в сочетании с введением десмопрессина отмечены существенные изменения физико-химических свойств соединительнотканного матрикса дермы животных. В изменении всех исследуемых показателей при разных вариантах экспериментального воздействия выявлены различия, связанные с полом животных.

На основе результатов, полученных с помощью метода динамической десорбции воды, выявлены отличительные закономерности гидратации разных тканей (мозг, сердце, печень, дерма, кровь) животных, а также разных возрастных популяций эритроцитов, как в норме, так и при экспериментальном изменении водно-электролитного баланса организма. Установлены особенности гидратации тканей и клеток в зависимости от пола животных.

Теоретическое и практическое значение работы

Материалы диссертации расширяют представления о факторах и механизмах регуляции вязкости крови, создают новые направления в гемореологии, как важном разделе физиологии крови. Выявленная взаимосвязь агрегатообразования эритроцитов, вязкости крови и плазмы с изменением содержания в плазме кислых гликозаминогликанов может иметь важное значение для понимания общих механизмов гемореологических перестроек при разных функциональных состояниях организма. Установленное влияние активности антидиуретического звена регуляции водного баланса на реологические свойства крови в перспективе может быть использовано для разработки новых подходов к регуляции условий потока в микроциркуляторной системе с целью предупреждения или коррекции возможных негативных последствий гемореологических нарушений при стрессе или патологии. Исследование гемореологического эффекта десмопрессина - синтетического аналога вазопрессина, может иметь определенное значение для объяснения гемостатического действия этого препарата поскольку, наряду с огромным числом биохимических реакций, реологические факторы играют важную роль в модуляции ответа крови на повреждающие стимулы.

Выявленные половые особенности изменения реологических свойств крови и гидратации тканей и клеток могут быть привлечены для объяснения разной степени риска и характера течения сердечно-сосудистых заболеваний и острых состояний, связанных с нарушением водно-электролитного баланса у мужчин и женщин, а также послужить основой для разработки индивидуальной корригирующей терапии.

Разработанный комплекс экспериментальных воздействий позволяет получить выраженные реакции организма животных, сходные с наблюдаемыми в клинике при различных заболеваниях, сопровождающихся изменением реологических свойств крови. Это дает возможность использовать описанные экспериментальные модели для изучения адаптационных и компенсаторных механизмов при подобного рода нарушениях.

Проведение сравнительного анализа гидратации тканей в норме и при изменении водного баланса организма представляет важное направление исследований в рамках фундаментальной проблемы взаимодействия воды с биологическими структурами. Полученные в работе данные, связанные с гидратацией эритроцитов разного возраста позволяют лучше понять механизмы апоптоза клеток данного типа и объяснить особенности микрореологических свойств молодых, зрелых и старых эритроцитов.

Материалы диссертации могут быть использованы в лекционных курсах по физиологии крови и кровообращения для студентов биологических и медицинских факультетов вузов, для написания монографий и практических руководств, а также для организации и проведения дальнейших исследований в данной области.

Основные положения, выносимые на защиту

1. АДГ является важным фактором изменения реологических свойств крови. При повышении его концентрации в крови возрастает агрегация эритроцитов, повышается вязкость плазмы и цельной крови.

2. Изменение реологических свойств крови при действии десмопрессина связано с деструктивными изменениями матрикса соединительной ткани.

3. При состоянии напряжения системы осморегуляции организма изменение реологических свойств крови имеет характер общей неспецифической гематологической стресс- реакции, связанной с поддержанием гемопоэза, гемостатического потенциала и иммунной защиты организма.

4. Изменение состояния соединительнотканного матрикса, опосредованное действием АДГ играет важную роль в поддержании баланса посекторального распределение жидкости и адаптации организма в целом при сдвигах водно-электролитного баланса.

5. Реологические свойства крови, механизмы срочной и долговременной адаптации организма к изменению водно-электролитного баланса имеют различия у животных разного пола.

Апробация работы

Материалы работы были доложены и обсуждены на: межвузовской конференции, посвященной 10-летию кафедры МБОС (Ярославль, 1999); международной конференции «Микроциркуляция и гемореология» (Ярославль, 1999, 2001, 2005, 2007, 2009); межвузовской конференции «Медицина, биология, спорт» (Ярославль, 2000); 8-ой конференции молодых ученых ЯГПУ (Ярославль, 2000); ВСЕРОССИЙСКОЙ НАУЧНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно - сосудистой хирургии» (Москва, 2005, 2009); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005); Международной научной конференции «Актуальные проблемы адаптации организма в норме и патологии» (Ярославль, 2005); Четвертой Российской конференции (с международным участием) «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005); научно-практических конференциях «Методы исследования регионарного кровообращения и микроциркуляции в клинике и эксперименте» (Санкт Петербург, 2007); V Всероссийской конференции с международным участием, посвященная 100-летию со дня рождения академика В.Н. Черниговского, «МЕХАНИЗМЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ВИСЦЕРАЛЬНЫХ СИСТЕМ» (Санкт- Петербург, 2007); XХ съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); V Конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, 2008); VI Всероссийской конференции с международным участием «МЕХАНИЗМЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ВИСЦЕРАЛЬНЫХ СИСТЕМ» (Санкт- Петербург, 2008).

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 42 печатных работах, 11 из которых - в журналах, включенных в «Перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ».

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 251 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием методов исследования, главы с изложением полученных результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 203 отечественных и 277 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 55 таблицами и 20 рисунками.

1 ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА,

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в осенне-зимний период на 427 белых беспородных крысах обоего пола массой 260-390г, выращенных в виварии ГУ научного центра биомедицинских технологий РАМН «Андреевка» и содержащихся в стандартных условиях на сбалансированном рационе питания с соблюдением основных зоогигиенических требований.

Исследование включало в себя несколько серий опытов. В первой серии, на группе самцов (n=21) и группе самок (n=20) исследовали влияние синтетического аналога АДГ десмопрессина (препарат Адиуретин фирмы Ферринг - Лечива) в дозах, рекомендованных для разового введения при клиническом использовании. Десмопрессин отличается некоторой структурной модификацией молекулы вазопрессина, что позволяет максимально снизить влияние на гладкую мускулатуру сосудистой стенки и практически устранить его действие на артериальное давление с сохранением высокой эффективности при воздействии со специфическими V₂ - рецепторами в почке, что обеспечивает антидиуретический эффект десмопрессина (Ю.В. Наточин и соавт., 2003). Крысам подкожно вводили по 0,02 мкг/100г десмопрессина. Забор крови и других тканей осуществляли после декапитации наркотизированных этаминалом натрия (2,5мг/100г массы тела внутрибрюшинно) животных в течение 4 часов после инъекции гормона. На двух группах крыс (самцы (n=21) и самки (n=22)) изучали влияние десмопрессина через 24 часа после серии инъекций в течение 6 суток.

Кровь для in vitro экспериментов получали декапитацией от 17 крыс - самцов.

Во второй экспериментальной серии исследовали эффект длительного периодического состояния напряжения осморегулирующей системы организма (А.И. Григорьев и соавт., 2005), которое моделировали введением десмопрессина (0,02 мкг/100г массы тела) в сочетании с водной нагрузкой (дистиллированную воду (37?С) вводили в желудок без наркоза с помощью резинового зонда ежедневно в объеме 7мл/100г массы тела). Через 24 часа после очередного воздействия наркотизированных животных забивали путем декапитации и забирали для исследования образцы крови, мозга, сердца, печени и дермы. У самцов изменение исследуемых параметров отслеживали в динамике после 3 (n=22), 6 (n=21) и 9 (n=23) суток ежедневного воздействия. У самок (n=20) исследовали эффект воздействия в течение 6 суток.

При определении роли антидиуретического звена регуляции водного баланса в гемореологических перестройках, в качестве сравнения была включена экспериментальная серия, в которой исследовали влияние длительной регулярной водной нагрузки большого объема без введения десмопрессина. Как и в предыдущей серии, у самцов изменение исследуемых параметров отслеживали в динамике после 3 (n=25), 6 (n=20) и 9 (n=24) суток ежедневной водной нагрузки в объеме 7мл/100г массы тела. У самок (n=22) исследовали эффект водной нагрузки в течение 6 суток. Забор крови и других тканей производили через 24 часа после очередного воздействия.

Срочную реакцию организма на водную нагрузку и водную нагрузку в сочетании с введением десмопрессина изучали в двух сериях, включавших по две группы животных. Исследование сочетанного влияния водной нагрузки (7мл/100г массы тела) и гормона (0,02 мкг/100г массы тела) проводили на группе самцов (n=22) и группе самок (n=21). Забор крови и образцов других тканей осуществляли в течение 4 часов после воздействия. Исследование влияния изолированной водной нагрузки (7мл/100г массы тела) также проводили на группе самцов (n=23) и группе самок (n=22). Забор крови и образцов других тканей осуществляли в течение 40-50 минут после нагрузки. В качестве антикоагулянта использовали гепарин, при определении фибриногена и гликозаминогликанов (ГАГ) - цитрат натрия.

Объемная гипоосмотическая 7% водная нагрузка позволяла получить значительные отклонения показателей осморегуляции и выраженные адаптационные ответы гомеостабилизирующих систем, но в то же время, не приводила к развитию гипоосмотического шока. В плазме отслеживали отсутствие видимых следов гемолиза. Принимая во внимание рекомендации по проведению функциональных проб для оценки констант организма, касающихся осморегуляции, экспериментальные воздействия и определение исследуемых параметров у групп контроля выполняли утром натощак. На протяжении всего периода экспериментальных воздействий животные имели свободный доступ к пище и воде. Доступ ограничивали за 12 часов до проведения исследований (В.Б. Носков и соавт., 1978; Цзе Гао и соавт., 2004).

В качестве контрольных групп самцов (n=31) и самок (n=30) использовались крысы, содержащиеся в условиях вивария при стандартном пищевом и водном режиме. Разброс в группах крыс одного пола по исходной массе не превышал 10%. Работа выполнена с соблюдением принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным (1977).

1.1 Методы исследования реологических свойств крови

и гематологических показателей

Определение вязкости цельной крови, плазмы и концентрированных эритроцитарных суспензий

Для исследования вязкости цельной крови, плазмы и концентрированных эритроцитарных суспензий применяли капиллярный вискозиметр, предложенный А. Copley et al. (1960). Вязкость определялась путем оценки времени тока известного объема жидкости под влиянием приложенного давления в горизонтальном капилляре с радиусом рабочей части порядка 0,3мм и термостатированном при 37?С. Особенности конструкции вискозиметра позволяют наблюдать неньютоновское поведение исследуемых образцов крови и клеточных суспензий. Измерения проводили при напряжениях сдвига 98,1 Н·м^-2 (ВК₁) и 981 Н·м^-2 (ВК₂).

Определение гематокритного показателя

Гематокритный показатель (Ht) определяли общепринятым методом: цельной кровью заполняли гематокритные капилляры и центрифугировали в течение 7 минут при 12 000g.

Используя значения вязкости и гематокритного показателя рассчитывали индекс Het/ВК_1, отражающий согласно J. Stoltz (1991) реологическую эффективность доставки кислорода к тканям.

Расчет индекса Tk

Расчет индекса Tk, позволяющегося косвенно оценить способность эритроцитов к деформации (L. Dintenfass, 1977, 1985) производили по формуле:

Tk = (з_о^0,4 - 1) / з_о^0,4 ? Ht,

где Tk - индекс ригидности эритроцитов, з_о - относительная вязкость крови, рассчитанная как отношение вязкости крови к вязкости плазмы (з_о = з_крови /з_плазмы ), Ht - гематокритный показатель.

Определение концентрации гемоглобина в крови

Концентрацию гемоглобина определяли цианметгемоглобиновым методом с использованием набора реагентов ООО «Агат - Мед».

Определение концентрации эритроцитов в крови

Число эритроцитов в объеме крови определяли с помощью подсчета клеток в камере Горяева.

Расчет морфометрических индексов эритроцитов:

Среднюю концентрацию гемоглобина в эритроцитах (СКГЭ), (г%);

Среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (ССГЭ), (пг);

Средний объем эритроцитов (СОЭр), (мкм³).

Исследование агрегации эритроцитов

Индекс агрегации (ИА) эритроцитов определяли с помощью полуавтоматического агрегометра эритроцитов типа МА 1, разработанного на основе метода H. Schmid-Schоnbein (Myrenne, Германия).

Измерение проводили после регулировки прибора (оценка собственного светопропускания блока вращающийся конус - неподвижная плоскость). Образец крови (20 мкл) подвергали вращению со скоростью сдвига 600 с^-1. После остановки ИА определялась автоматически для двух интервалов времени - 5 и 10с (М₅ и М₁₀). Затем ИА определяли при низкой скорости сдвига 3с^-1 для тех же интервалов времени (М1₅ и М1₁₀).

Для оценки влияния приложенных сдвиговых усилий на развитие процесса агрегации рассчитывали динамические параметры (H. Scmid-Schonbein et al., 1990):

D₅= М1₅ / М₅ и D ₁₀= М1₁₀/ М₁₀,

Дополнительно качественную оценку агрегатообразования производили методом микроскопии разбавленных суспензий клеток в аутологичной плазме с последующей видеорегистрацией.

Разделение эритроцитов по возрасту

Для разделения эритроцитов на субпополяции молодых, зрелых и старых клеток использовали метод J. Murphy (1973), основанный на различии в плотностях эритроцитов разного возраста.

Приготовление концентрированных суспензий эритроцитов

Концентрированные суспензии нативных клеток (Ht 0,985-0,995 без коррекции на остаточную плазму) получали центрифугированием крови в течение 15 минут при 1000g. Для получения концентрированных суспензий в буферном растворе отмытые клетки ресуспендировали в требуемой среде и снова центрифугировали в течение 15 минут. Для трехкратных отмывок применялись К-Na-фосфатный буферный раствор с осмолярностью 300 мосм/л (рН - 7,4). Контроль за изменением объема фракции клеток после отмывки осуществляли по измерению концентрации гемоглобина в суспензиях цианметгемоглобиновым методом.

Определение концентрации ретикулоцитов

Подсчет производили в окрашенных мазках периферической крови.

Определение лейкоцитарной формулы крови

Подсчет лейкоцитов разных классов производили в окрашенных мазках периферической крови.

Биохимические методы исследования плазмы крови

Определение концентрации общего белка в плазме крови

Концентрацию общего белка определяли биуретовым методом с использованием набора реагентов ООО «Агат - Мед».

Определение концентрации альбумина в плазме крови

Концентрацию альбумина определяли по реакции с бромкрезоловым зеленым с использованием набора реагентов ООО «Агат - Мед».

Определение концентрации фибриногена в плазме крови

Для оценки концентрации фибриногена использовали метод Рутберга (Г.А. Рутберг, 1961). Принцип метода заключается в свертывании известного объема цитратной плазмы раствором хлорида кальция с последующим взвешиванием сгустка. При взвешивании использовали весы типа R160P (Sartorius, Германия).

Определение концентрации ионов натрия в плазме крови

Концентрацию натрия определяли колориметрическим методом с использованием набора реагентов ООО «Ольвекс Диагностикум».

Определение концентрации ионов калия в плазме крови

Концентрацию калия определяли колориметрическим методом с использованием набора реагентов ООО «Ольвекс Диагностикум».

Определение концентрации гликозаминогликанов в сыворотке

Для определения концентрации гликозаминогликанов в сыворотке крови использовали реакцию с карбазолом (А.Б. Зборовский и соавт., 1981). В ходе определения сыворотку предварительно депротеинизировали хлорной кислотой в конечной концентрации 0,62 моль/л. Осаждение гликозаминогликанов проводили фосфорно-вольфрамовой кислотой в конечной концентрации 1,27%.

Определение осмолярности плазмы крови

Осмолярность плазмы измеряли с помощью осмометра ОМ 801 (Vogel, Германия). Принцип работы прибора основан на изменении температуры замерзания биожидкости в зависимости от концентрации содержащихся в ней растворимых соединений.

Модельные эксперименты

Для изучения механизмов изменения агрегации эритроцитов проводили несколько серий опытов, в которых клетки инкубировали с десмопрессином в концентрации, сопоставимой с той, что могла быть в крови при инъекции лечебной дозы препарата.

Определение гидратационных свойств тканей и клеток

Метод динамической десорбции воды в потоке аргона

Метод основан на использовании принципа испарения влаги из объекта исследования в потоке газа носителя (десорбция в динамическом режиме) в сочетании с конверсией паров воды в водород и непрерывным детектированием по теплопроводности (А.Г. Панков и соавт., 1995).

Установка разработана на основе стандартной аппаратуры для газовой хроматографии ЛХМ-8МД. Принципиальная схема устройства включает рабочий блок, состоящий из испарителя (кварцевая трубка с нагревателем), конвертера, детектора по теплопроводности, измерительной схемы и регистрирующего устройства ЭПП-09М. Через последовательно соединенные испаритель, конвертер и детектор пропускается предварительно осушенный газ - носитель (аргон) со скоростью 45 мл/мин. Температура в испарителе в начале опыта равна 37?С. Под действием потока газа из образца выделяется вода в виде пара, который поступает в конвертер с нагретым до 600?С железом. В результате реакции взаимодействия с раскаленным железом вода дает эквивалентное количество водорода. Водород в смеси с газом - носителем поступает в детектор. Сигнал детектора преобразуется измерительной схемой и регистрируется самописцем в виде кривой. Запись продолжается до окончания процесса испарения, о чем судили по выходу пера самописца на нулевую линию. В изотермическом режиме записывались пики (плато) «1» и «2». После выхода пера на «0» температуру в испарителе поднимают до 110 - 115?С. Происходит выделение и запись прочносвязанной формы воды в виде пика «3» на диаграммной кривой (Рис. 1).

При обработке диаграммы использовали принятый в хроматографии принцип: вся площадь под кривой на ленте соответствует общему содержанию воды в образце, а площади ее отдельных пиков - содержанию различных форм. Расчет содержания общей воды и различных ее фракций в исследуемом объекте производили по массе сухого остатка. Это исключало погрешность, связанную с испарением воды при взвешивании образца и оказывающую существенное влияние в микроанализе с микропробами. Градуировку прибора проводили, испаряя пробы дистиллированной воды известной массы и измеряя площади полученных пиков. При взвешивании микропроб использовали весы R160P (Sartorius, Германия).

Количественные характеристики общей воды и отдельных фракций рассчитывали по формулам 1 и 2:

(1) и (2),

где X - содержание общей воды, %

Xi - содержание i - ой формы воды, %

Si - площадь под кривой, соответствующая i - ой форме воды, см²

f - градуировочный коэффициент, мг/см²

m - масса сухого остатка, мг.

Вследствие большой разницы в теплопроводности водорода и аргона предел обнаружения воды составляет 1-2мкг. Это позволяло работать с образцами массой 1 - 2мг.

Рис. 1. Диаграммная кривая испарения воды из пробы эритроцитов белых крыс (концентрированная эритроцитарная суспензия с объемной долей клеток ~98%) (Формы 1-2 - при температуре 37?С, форма 3 - при 110?С)

Определение связанной воды в коже животных

Для определения количества связанной воды в коже использовали свойство этой фракции не удаляться под давлением (С.М. Гульдич, А.Н. Михайлова, 1977; В.А. Дубинская и соавт., 2007). Метод основан на опрессовывании свободной воды, в то время как связанная вода остается в составе отжимаемой ткани. Для исследования использовали демонстрационный гидравлический пресс. Образец анализируемой ткани помещали в вакуумную пресс-форму для калий-бром дисков (O 10мм) (Jasco, Япония) между несколькими слоями фильтровальной бумаги и проводили опрессовывание свободной воды при 600 атм. Затем влажную бумагу заменяли на сухую и образец отжимали еще раз. Оставшуюся после отжатия связанную воду количественно определяли при титровании с реактивом Фишера.

Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка результатов выполнена с применением пакета программ «Statistica 6.0» (О.Ю. Реброва, 2006).

Цифровые данные в таблицах при условии, что все величины имеют нормальное распределение представлены средней арифметической (М) и средним квадратичным отклонением (у). При отклонении распределения от нормального использовали формат - медиана (25:75 процентили) (С. Гланц, 1998). Для анализа вида распределения полученных величин использован критерий Шапиро-Уилка. Для множественного сравнения использовали тест Крускала-Уолиса. При подтверждении статистической достоверности при множественном сравнении, проводили парное сравнение по критерию U - Манна - Уитни или критерию Вилкоксона.

Корреляционный анализ производили с использованием ранговой корреляции Спирмена (r_s).

2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 Состояние гидратации тканей, гематологические, реологические и биохимические показатели крови крыс при введении десмопрессина

Результаты исследования показали, что введение животным десмопрессина привело к выраженным сдвигам гемореологических характеристик. Анализ вискозиметрических данных выявил повышение значений вязкости цельной крови и плазмы (табл. 1). При этом наиболее значимые изменения касались агрегатообразования эритроцитов. Индекс агрегации по сравнению с показателем группы контроля увеличился в несколько раз. Повышение агрегации эритроцитов при введении десмопрессина предполагает его опосредованное действие, и может быть связано как с изменением биохимического состава плазмы, так и функционального состояния мембран эритроцитов.

При анализе агрегирующих факторов плазмы основная роль традиционно отводится изменению концентрации фибриногена, однако его уровень в обеих экспериментальных группах (1,71 (1,56:1,85) г/л и 1,76 (1,65:1,80) г/л у самцов и самок соответственно) достоверно не превышал (р>0,05) значения этого показателя в контроле (1,65 (1,56:1,76) г/л и 1,75 (1,65:1,80) г/л у самцов и самок соответственно), что согласуется с данными по клиническому применению десмопрессина (P.M. Mannucci, 1997). Больший интерес в качестве агреганта, на наш взгляд, может представлять повышение содержания в крови компонентов соединительнотканного матрикса кислых гликозаминогликанов (ГАГ). Их концентрация при введении препарата возросла почти в 2 раза по сравнению с контролем (0,55 (0,39:0,60) против 0,29 (0,21:0,32) ед. опт. пл., при р<0,001). Повышенное значения этого показателя сохранялось и спустя 24 часа после серии инъекций (0,41 (0,39:0,55) ед. опт. пл. при р<0,001). Накопленная в течение двух последних десятилетий информация, относительно содержания ГАГ в плазме крови сделала эти молекулярные структуры интересным клиническим маркером при множестве патологических состояний, при этом появление их в кровотоке всегда сопровождается весьма разнообразными эффектами (А.Д. Турашев и соавт., 2009; T.C. Laurent et al., 1996;). Заметное повышение концентрации гликозаминогликанов в крови при введении десмопрессина мы связываем с его способностью активировать макрофаги и влиять на высвобождение биологически активных веществ, приводящих к дезорганизации основного вещества соединительной ткани (Я.Г. Финкинштейн, 1990; C.L. Balduini et al., 1999).

Несмотря на большую молекулярную массу, этот полисахарид достаточно мобилен и свободно оставляет тканевой матрикс через лимфатический дренаж (R.K. Reed, U.B Laurent, 1992). Учитывая сильно вытянутую конформацию, высокую молекулярную массу и ярко выраженную способность связываться не только с клеточной поверхностью, но и с плазменными белками, изменение содержания ГАГ в крови может оказывать существенное влияние на ее реологические свойства (С.М. Бычков, С.А. Кузьмина, 1993).

Таблица 1. Гемореологические показатели крыс при введении десмопрессина

Примечание: ^{a -} различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05); ^{c -} различия достоверны между группами животных разного пола (р <0,01).

Корреляционный анализ выявил тесную взаимосвязь концентрации ГАГ с вязкостью плазмы и крови (соответственно 0,731 и 0,687 при р<0,01), а наличие тесной корреляции с индексом агрегации эритроцитов (r=0,796 при р<0,0001) свидетельствует о выраженных проагрегантных свойствах ГАГ.

Рис. 2. Корреляционная взаимосвязь ИА и концентрации ГАГ

Вместе с тем в последние годы все большее число экспериментальных данных указывают, что на процесс агрегатообразования заметное влияние могут оказывать и свойства самих эритроцитов (B.Neu et al., 2003). Наличие в крови клеток моноцитарно-макрофагального ряда, обладающих специфическими рецепторами к десмопрессину вполне допускает возможность их участия в качестве посредников, обуславливающих влияние гормона на изменение функциональной активности мембран эритроцитов, и как неспецифического проявления - изменения их агрегационной способности. Проведенная серия экспериментов in vitro не выявила достоверных изменений индекса агрегации. Однако это полностью не исключает опосредованного действия гормона на свойства мембран клеток. Один из возможных механизмов такого влияния может быть связан с повышением в крови концентрации катехоламинов при введении десмопрессина (S. Di Michele et al., 1998). Стимулирующее действие катехоламинов на процесс агрегатообразования объясняют именно взаимодействием с мембраной эритроцитов, а не влиянием на свойства плазмы (И.А. Тихомирова, 2006).

Следует отметить, что достоверное возрастание вязкости крови (р<0,01) и значений ИА эритроцитов (р<0,001) регистрировали и в группе, где забор крови осуществляли через 24 часа после серии инъекций. Поскольку к этому времени препарат в указанной дозе должен полностью выводиться из организма (Б.Г. Катцунг - ред., 1997), длительное сохранение эффекта может быть связано с каскадом тесно сопряженных многочисленными связями реологических, гемостатических и эндотелиальных реакций, вызванных десмопрессином. Известно, что в процессе циркуляции эритроциты непрерывно взаимодействуют как между собой, так и с другими клетками, находящимися в сосудистом русле: лейкоцитами, тромбоцитами и клетками сосудистого эндотелия. Анализ литературы свидетельствует о том, что подобного рода взаимодействие является начальным и важнейшим фактором развития разнообразных физиологических и патологических реакций (A.J. Marcus, 1994; M.J. Pearson, H.H. Lipowsky, 2000; M. Eugster, W.H. Reinhart, 2005; J.J. Hathcock, 2006).

Важной характеристикой эритроцитов, тесно связанной с ее микрореологическими свойствами является состояние гидратации этих клеток. При анализе данных, полученных методом десорбции, в контроле прослеживается общая возрастная дегидратация эритроцитов, отмеченная ранее и другими исследователями, по мнению которых потеря воды клеткой является основной причиной увеличения средней концентрации и вязкости гемоглобина в эритроцитах при старении (J. Stuart, G.B. Nash, 1990). В нашем исследовании в контрольной группе животных содержание общей воды в молодых, зрелых и старых клетках заметно отличалось. Возрастная зависимость выявлена и в соотношении воды, определяющей площади отдельны пиков на диаграммных кривых десорбции. Так, содержание воды, соответствующей форме 1 (рис. 1) достоверно уменьшалась с 56,91± 2,02 в молодых клетках до 40,06 ± 3,3 г/100г в старых (р<0,01). Содержание воды, соответствующей форме 2, наоборот возрастало с 10,82 ± 1,43 г/100г до 18,43 ± 2,04 г/100г (р<0,001). В целом, выявленные различия в характеристиках клеток, связанные с возрастной гетерогенностью популяции эритроцитов могут являться важным показателем состояния периферического звена эритрона.

Что касается половых особенностей, то клетки самок отличались несколько большим содержанием общей воды, хотя различия не превышали 5% (р<0,05). В соотношении площадей разных пиков выраженных различий выявлено не было. Вместе с тем, различия в гидратации, как известно, сочетаются с другими характеристиками клеток, определяющими их микрореологические свойства. Так, в контроле СОЭр у самцов и самок составил 55,7 (55,5:56,3) и 56,67 (56,18:57,04) мкм³ (р<0,05) соответственно, СКГЭ - 34,04 (33,8:34,61) и 33,21 (32,75:33,8) г% (р<0,05).

При исследовании влияния десмопрессина на гидратацию эритроцитов в разных возрастных группах клеток установлены сдвиги водного баланса и изменение соотношения площадей разных пиков на кривой десорбции. Отмечена общая дегидратация клеток. Различия с контролем по содержанию общей воды составили для зрелых клеток у самцов и самок около 3 и 4% соответственно (р<0,05). Выявленные изменения происходили главным образом за счет уменьшения площади формы 1 (р<0,05). Статистически достоверных различий в содержании воды, приходящейся на площади форм 2 и 3 не выявлено. Незначительная гипогидратация клеток могла быть следствием связывания молекулами ГАГ воды при их адсорбции на мембране и, таким образом, некоторого обезвоживания клеток. Учитывая ярко выраженную гидрофильность, изменение концентрации ГАГ в плазме, может играть существенную роль в регулировании распределения воды между разными водными секторами.

Для оценки общего гидратационного статуса исследовали также содержание воды в мозге, печени, миокарде и дерме животных. Полученные формы диаграммных кривых были специфичны для образцов разных тканей. Наличие разного количества пиков или плато при испарении в изотермическом режиме, по-видимому, отражает особенности их строения. Вместе с тем, важно отметить, что особенности десорбции воды из тканей были связаны с топографией и геометрией образца. Поэтому, несмотря на то, что в целом формы кривых хорошо воспроизводимы, стабильных количественных показателей площадей отдельных пиков добиться было очень сложно.

Таблица 2. Содержание воды в коже крыс при введении десмопрессина, г/100г образца

Примечание: ^{a -} различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,01); ^{c -} различия достоверны по сравнению с группой самцов (р<0,01).

Учитывая отмеченные методические трудности в образцах тканей мозга, сердца, печени и кожи фиксировали только суммарную площадь кривой десорбции, отражающую содержание общей воды в органах. Анализ полученных данных свидетельствует, что максимальное количество общей воды содержится в крови (81,96±1,08 и 82,93±1,17 г/100г образца у самцов и самок соответственно) и головном мозге (80,14±1,65 и 80,75±1,34 г/100г образца), а минимальное - в печени (67,98±1,5 и 71,9±1,73 г/100г образца) и дерме (65,34±1,27 и 67,91±1,8 г/100г образца) контрольных животных. Статистически значимые различия между самцами и самками по содержанию воды выявлены в крови, печени и дерме (р<0,05).

Гетерогенность в содержании воды в исследуемых тканях отмечена как в контроле, так и в экспериментальной группе. Значимых различий в содержании общей воды между группами выявлено не было. Однако если принять во внимание мнение ряда исследователей о том, что изменение гидратации эритроцитов подчиняется общим закономерностям, характерным для всего клеточного фонда организма (А.В. Литвинов, 1997), то, следовательно, введение десмопрессина приводит к перемещению воды из клеточного сектора в экстрацеллюлярный. С этим предположением хорошо согласуются данные об особенностях гидратации кожи, полученные методом опрессовывания. Достоверное снижение фракции связанной воды и возрастание свободной на фоне незначительного повышения общего ее содержания свидетельствует об увеличении проницаемости интерстиция. В свою очередь состояние основного межклеточного вещества является важным фактором транскапиллярного обмена жидкости, а значит, должно оказывать существенное влияние на реологические свойства крови.

2.2 Состояние гидратации тканей, гематологические, реологические и биохимические показатели крови крыс после длительной водной нагрузки в сочетании с десмопрессином

Введением гормона вместе с водной нагрузкой большого объема в эксперименте моделировали схожее в отношении нарушения водно-электролитного баланса состояние декомпенсации, имеющее место, например, при сердечной недостаточности. Целью экспериментальной серии было изучить изменение реологических свойств крови в ситуации объемного и осмотического сдвига при искусственном поддержании в активности антидиуретического звена регуляции водного баланса (А.И. Григорьев и соавт., 2005). Поскольку при окончании действия десмопрессина период задержки воды сменялся полиурией, причем время ингибирования выведения воды в ходе эксперимента постепенно сокращалось, через 24 часа после очередного экспериментального воздействия признаки гипергидратации организма отсутствовали. Поэтому в данной серии исследовали эффект длительного периодического состояния напряжения осморегулирующей системы организма.

Осмолярность плазмы (322 (313:325) и 314 (309:319) мосм/л у самцов и самок соответственно) и показатели, используемые для оценки общего функционального состояния организма свидетельствовали о заметной гипогидратации. Возможным объяснением этого факта может быть то, что осморецепторная и барорецепторная регуляция секреции АДГ тесно связаны. Повышение давления в левом предсердии (вследствие гиперволемии при водной нагрузке) повышает порог возбудимости осморецепторов и уменьшает чувствительность системы осморегуляции секреции эндогенного АДГ (W. M. Barron et al., 1984).

При анализе полученных результатов в экспериментальных группах животных выявлено существенное возрастание агрегатообразования эритроцитов по сравнению с контролем. Увеличение ИА у самцов (в 7 раз, р<0,001) отмечено как при измерении в стазе после высокосдвиговых вращений (М), так и в низкосдвиговом режиме (М1) (более, чем в 2,5 раза, р <0,001). У самок прирост ИА при всех режимах измерения был заметно ниже (Табл. 3).

О патологическом характере агрегации эритроцитов свидетельствуют и данные микроскопии разбавленных эритроцитарных суспензий. При видеорегистрации были выявлены крупные конгломераты сложной формы при наличии довольно значительного числа клеток в форме эхиноцитов. Известно, что в микроциркуляторном русле интенсивное агрегатообразование может иметь тяжелые последствия (O. Yalcin, 2004).

Таблица 3. Гемореологические показатели крыс при введении десмопрессина на фоне водной нагрузки после 6 суток эксперимента

Примечание: ^{a -} различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,001); ^{c -} различия достоверны между группами животных разного пола (р <0,01)

При анализе факторов, способных оказывать влияние на усиление агрегации в данном случае важно отметить, что под влиянием длительного воздействия водной нагрузки в сочетаннии с десмопрессином зафиксировано значительное повышение концентрации в сыворотке кислых ГАГ (0,87 (0,76:0,91) ед. опт. пл. при р<0,001), а также фибриногена (2,52 (2,36:3,1) г/л при р<0,001). Как и в случае изолированного введения десмопрессина корреляционная связь между концентрацией ГАГ в крови и степенью агрегации клеток была очень тесной (r_s=0,754 при р<0,01). Следует отметить, что у самок после 6 суток аналогичного воздействия повышение осмолярности плазмы составило всего около 5 %. Меньшим был прирост концентрации фибриногена (2,07 (1,97:2,20) г/л и ГАГ (0,70 (0,59:0,81) ед. опт. пл. при р<0,001 по сравнению с контролем). Выявленные сдвиги в макромолекулярном составе, вероятно, стали причиной повышения вязкости плазмы (р<0,05 по сравнению с контролем).