Вирусные и невирусные методы введения в организм рекомбинантных нуклеиновых кислот

Казанский государственный университет

На правах рукописи

РИЗВАНОВ Альберт Анатольевич

ВИРУСНЫЕ И НЕВИРУСНЫЕ МЕТОДЫ ВВЕДЕНИЯ В ОРГАНИЗМ РЕКОМБИНАНТНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

Казань 2010

Работа выполнена в Казанском государственном университете им В.И. Ульянова-Ленина

Научный консультант:доктор медицинских наук,профессор Исламов Р.Р.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Чернов В.М.

доктор медицинских наук, профессор Скороходкина А.В.

доктор биологических наук, профессор Купраш Д.В.

Ведущее учреждение: Учреждение Российской Академии Наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН г. Москва

Защита состоится 14 октября 2010 г. в 13⁰⁰ часов на заседании диссертациолнного Совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора биологических наук Д 212.081.08 в ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный) университете» по адресу: г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета.

Автореферат разослан «___» _________________ 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного Совета, доктор биологических наук, профессор З.И. Абрамова

ВВЕДЕНИЕ

Одна из актуальных задач современной биологии -- направленный контроль экспрессии генов с изменением отдельных признаков организма. Перспективным направлением для решения этой задачи считают генную терапию, т.е. введение в организм рекомбинантных генов с заданными свойствами. Актуальность генной терапии для практического применения очевидна, но существующие на сегодняшний день методы генетической модификации клеток имеют ряд существенных недостатков, связанных с биобезопасностью и малой эффективностью классических технологий.

Принцип генной терапии состоит во введении рекомбинантного генетического материала для коррекции генетического дефекта (мутации) или для влияния на отдельные свойства клетки, такие как синтез биомолекул. Методы генной терапии позволяют экспрессировать рекомбинантные гены, кодирующие терапевтические белки для лечения различных заболеваний либо с целью иммунизации организма, снижать уровень экспрессии или полностью подавлять экспрессию генов (нокдаун и нокаут, соответственно от «knokdown» и «knockout») при генетических или соматических заболеваниях, таких как онкологические, нейродегенеративные и инфекционные (Seow and Wood 2009). Первые клинические исследования по генной терапии были проведены в девяностые годы прошлого столетия (Anderson 1990). С тех пор в мире зарегистрировано более 1537 клинических исследований с применением методов генной терапии (http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/).

Существует два основных методических подхода для введения генетического материала в клетку-мишень -- вирусный и невирусный. Вирусный подход основан на способности вирусов взаимодействовать с клетками организма, что приводит к введению вирусной генетической информации внутрь клеток и экспрессии вирусных генов. Миллионы лет эволюции привели к тому, что процесс вирусного инфицирования стал чрезвычайно эффективным. Главный недостаток данного подхода -- высокая биологическая опасность вирусной инфекции. Опасность может быть связана с особенностями жизненного цикла вирусов. Например, интеграция ретровирусов в геном клетки-хозяина несёт риск вставочного мутагенеза и изменения экспрессии клеточных протоонкогенов, что может привести к опухолевой трансформации клетки. Кроме того, многие вирусные белки обладают сильным иммуногенным действием, что может привести к нежелательным побочным эффектам и снизить эффективность применения подобных генетических векторов. Более того, многие вирусы не обладают выраженной видоспецифичностью, что может привести к попаданию рекомбинантных генов в биосистему с неконтролируемыми последствиями для экологии и здоровья.

Невирусные методы доставки генетического материала основаны на введении рекомбинантных генов в клетку-мишень с помощью различных физических (электропорация, соникация, баллистика и т.д.) или химических (липофекция, катионные наночастицы и полимеры и т.д.) методов. Общий недостаток, присущий данным методам, -- относительно низкие специфичность и эффективность введения генетической информации.

Цель работы: разработка биологически безопасных систем доставки нуклеиновых кислот для использования в генной терапии.

В соответствии с целью работы определены следующие экспериментальные задачи:

1. Разработка нового видоспецифичного вирусного вектора на основе цитомегаловируса для введения генетического материала в клетки оленьих хомячков Peromyscus maniculatus.

2. Анализ экспрессии рекомбинантных белков с помощью цитомегаловируса P. maniculatus in vitro и анализ иммунного ответа у хомячков P. maniculatus при инфицировании рекомбинантным вирусом.

3. Анализ репликативной активности рекомбинантного цитомегаловируса in vitro и особенностей вирусной инфекции in vivo у хомячков P. maniculatus.

4. Анализ внутриклеточного взаимодействия и созревания гликопротеинов хантавирусов с помощью невирусных методов генной доставки.

5. Разработка плазмидных генетических конструкций, экспрессирующих различные терапевтические гены и их комбинации.

6. Разработка методов комбинированной генно-клеточной терапии на основе трансфицированния мононуклеарных клеток пуповинной крови человека плазмидными векторами для лечения бокового амиотрофического склероза.

7. Разработка методов доставки короткой интерферирующей РНК (siRNA) для терапии бокового амиотрофического склероза и оценка эффективности подавления экспрессии мутантного гена с помощью РНК-интерференции у трансгенных мышей G93A.

Научная новизна. Впервые создан видоспецифичный вектор на основе цитомегаловируса из Peromyscus maniculatus для экспрессии рекомбинантных белков с целью исследования иммунного ответа в организме хомячков на хантавирусные антигены. Впервые исследован эффект делеции гена р33 цитомегаловируса на вирусную инфекцию in vitro и in vivo. Впервые получены данные о взаимодействии гликопротеинов вирусной оболочки различных хантавирусов Южной и Северной Америки. Получены данные о внутриклеточном созревании хантавирусных белков. Впервые получены генетические конструкции, одновременно и независимо экспрессирующие нейропротекторные терапевтические белки VEGF и L1CAM. Показано, что клетки мононуклеарной фракции пуповинной крови человека (ядросодержащие клетки пуповинной крови, включая стволовые кроветворные клетки), генетически модифицированные нейропротекторными генами, способны к миграции в очаги нейродегенерации у трансгенных мышей G93A (модель бокового амиотрофического склероза) и дифференцировке в эндотелиальные клетки, участвующие в формировании новых кровеносных капилляров. Впервые показано, что аппликация короткой интерферерирующей РНК (специфичной к мутантной форме гена супероксиддисмутазы 1 человека) на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва у трансгенных мышей G93A, экспрессирующих данный мутантный ген, приводит к снижению количества мРНК супероксиддисмутазы 1 в поясничном отделе спинного мозга мышей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Цитомегаловирус хомячков Peromyscus maniculatus может служить эффективным вектором для создания генетических вакцин.

2. Внутриклеточная локализация и модификация гликопротеинов G1 и G2 хантавирусов зависит от характера экспрессии вирусных белков.

3. Невирусные методы генной и клеточной терапии эффективны для лечения бокового амиотрофического склероза.

Теоретическая и научная значимость. Создание видоспецифичного генетического вектора на основе цитомегаловируса из Peromyscus maniculatus позволяет исследовать механизмы иммунного ответа организма хозяина на компоненты вируса. Полученные данные создают основу для создания биологически безопасных вакцин против хантавирусной инфекции как для человека, так и для видоспецифичной иммунизации естественного носителя вируса. Исследование взаимодействия и внутриклеточной модификации хантавирусных гликопротеинов вирусной оболочки позволяет глубже понять биологию данного семейства вирусов и оценить возможность межвидового генетического обмена в природе, что может привести к появлению вирусов с новыми инфекционными свойствами. Создание невирусных генетических векторов и разработка методов их применения для генетической модификации клеток пуповинной крови человека позволяет получить новый класс биологически безопасных генно-клеточных препаратов для лечения широкого спектра заболеваний человека, в том числе нейродегенеративных. Демонстрация активирования механизмов РНК-интерференции при периферической аппликации siRNA на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва у трансгенных мышей демонстрирует возможность ретроградного транспорта siRNA и открывает новые возможности в использовании генной терапии на основе siRNA для лечения наследственных форм нейродегенеративных заболеваний.

Связь работы с базовыми научными программами. Исследования по теме работы проведены в период с 1996 по 2009 г. в соответствии с НИР Казанского государственного университета 01200850995 и 01200952944. Работа поддерживалась грантами Национального Института Здоровья AI36418, HL63470, AI45059 и HLBI 63470. Работа поддерживалась грантами: молодёжный грант Академии Наук Республики Татарстан, №11-9/2009(Г) «Разработка современных биомедицинских методов лечения хронической артериальной недостаточности нижних конечностей с использованием клеточных, генно-клеточных и генных технологий»; грант НАТО NR.RIG.983007 «Combination gene and stem cell therapy for treating neurodegenerative diseases»; грант РФФИ 07-04-00746-а «Стимулирование регенерации аксонов в центральной и периферической нервной системе с помощью гелевых носителей для стволовых клеток, супрамолекулярных систем с самосборкой, сосудистого эндотелиального фактора роста и ксимедона»; грант Правительства Республики Татарстан по подготовке и переподготовке кадров в зарубежных научных центрах; государственный контракт ФЦП Федерального Агентства по Науке и Инновациям 02.512.11.2052 «Клеточная терапия генетически модифицированными стволовыми клетками пуповинной крови трансгенных мышей G93A, экспрессирующих фенотип бокового амиотрофического склероза»; грант РФФИ 06-04-49396-a «Состояние аксонного транспорта и внутриаксонного синтеза белка в условиях гравитационной разгрузки»; молодёжный грант Академии Наук Республики Татарстан, №11-9/2009(Г) «Разработка современных биомедицинских методов лечения хронической артериальной недостаточности нижних конечностей с использованием клеточных, генно-клеточных и генных технологий»; государственный контракт ФЦП Федерального Агентства по Науке и Инновациям 02.740.11.0302 «Исследование фундаментальных механизмов патогенеза нейродегенеративных заболеваний и разработка современных технологий для их лечения»; грант РФФИ 09-04-05079-б «Развитие МТБ для проведения исследований по области знаний 04»; государственный контракт ФЦП Федерального Агентства по Науке и Инновациям 02.552.11.7088 “Проведение поисковых научно-исследовательских работ в области физико-химии наноматериалов и молекулярных систем, включая биологические, в центре коллективного пользования научным оборудованием «Федеральный центр коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов»”. В 2009 году работа на тему «Вирусные и невирусные методы генетической терапии» отмечена премией Правительства Республики Татарстан для государственной поддержки молодых учёных.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на American Society for Virology, 17th Annual Meeting (Ванкувер, Канада, 1998), на ежегодных естественно-научных конференциях Университета Штата Невада, г. Рено (Лейк Тахо, США, 1999, 2000, 2002, 2006), Keystone Symposia (Cellular and Molecular Biology -- Genetics, Pathogenesis and Ecology of Emerging Viral Diseases) (Таос, США, 2000), 8th International Cytomegalovirus Conference (Monterey, США, 2001), American Society for Virology, 20th Annual Meeting (Мэдисон, США, 2001), 27th Internationsl Herpesvirus Workshop (Cairns Convention Centre, Австралия, 2002), American Society for Virology, 22nd Annual Meeting, (Дэвис, США, 2003), American Society for Virology, 23rd Annual Meeting, (Монреаль, Канада, 2004), 6th International Conference on HFRS, HPS and Hantaviruses (Сеул, Южная Корея, 2004), American Society for Microbiology Meeting: Viral Immune Evasion (Акапулько, Мексика, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине» (Казань, 2007, 2008, 2009), Международной конференции «Фундаментальные науки -- медицине» (Новосибирск, 2007), Gene Therapy Symposium (Стамбул, Турция, 2007), итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы" (Москва, 2007), 14th International Biomedical Science and Technology Symposium (Мугла, Турция, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), 3rd International Congress of Molecular Medicine (Стамбул, Турция, 2009), 13th Annual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009» (пленарная лекция, секционный доклад, ведущий круглого стола) (Казань, 2009), International conference on nanomaterials and nanosystems (NanoMats 2009) (Стамбул, Турция, 2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвящённой 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009), Пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 48 печатных работ, в том числе 16 отечественных и зарубежных работ в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских диссертаций, 32 тезисов докладов на Международных и Всероссийских конференциях и конгрессах.

Место выполнения работы. Основные экспериментальные данные получены автором за время работы в лабораториях профессора Стива Ст. Джоура в Университете штата Невада, г. Рено, США (1996-2006), на кафедре генетики биолого-почвенного факультета Казанского государственного университета (2006-2010) и в Казанском государственном медицинском университете (2006-2010).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав, заключения, выводов, приложения и списка литературы (302 ссылки). Работа содержит 62 рисунка и 25 таблиц.

ГЛАВА 1 Новый вектор на основе цитомегаловируса из Peromyscus maniculatus для видоспецифичной экспрессии рекомбинантных белков хантавирусов

1.1 Выделение и филогенетический анализ цитомегаловируса из Peromyscus maniculatus (PCMV)

Во время экспериментов по выделению эндогенных вирусов из тканей Peromyscus maniculatus с помощью эмбриональных клеток P. maniculatus (PMEC), мы наблюдали характерные патологические изменения в клетках, напоминающие инфекцию цитомегаловирусами (McAllister, Filbert et al. 1967). При электронной микроскопии найдены вирусные капсиды, напоминающие капсиды группы герпесвирусов (Berezesky, Grimley et al. 1971).

Для подтверждения принадлежности выделенного вируса к CMV, мы провели анализ тотальной ДНК, выделенной из инфицированных клеток, на присутствие гомологов ДНК-полимеразы и гена ul33 вируса HCMV. Эти гены были выбраны потому, что ген полимеразы высоко консервативен среди герпесвирусов (Chadwick, Yogev et al. 1989; Langan, Gautier et al. 1989; Pardee 1989; Capps and Zuniga 1990), и гомологичные формы гена ul33 HCMV описаны у многих вирусов CMV. UL33 не участвует в вирусной репликации в культуре клеток (Hartwell and Weinert 1989; Taylor 1989), что позволяет встраивать рекомбинантные гены в этот регион.

Амплификацию фрагмента гена р33 (аналог гена ul33 цитомегаловируса человека) вируса PCMV провели методом обратной транскрипции с последующей ПЦР-амплификацией с использованием в качестве матрицы общей мРНК, выделенной из инфицированных клеток РМЕС. Продукты ПЦР-амплификации клонировали в вектор pGEM-T Easy (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Секвенирование фрагмента гена р33 в полученной рекомбинантной плазмиде показало отсутствие интронной области.

Частичную нуклеотидную последовательность гена р33 использовали для синтеза короткой 31-мерной пробы для скрининга серии плазмидных клонов геномной библиотеки вирусной ДНК. Нуклеотидная последовательность, полученная в результате секвенирования геномного фрагмента BamHI размером 3000 п.н., содержала последовательность гомолога гена ul33 цитомегаловируса человека. Сиквенс показал высокую степень гомологии к гену m33 вируса MCMV и гена r33 цитомегаловируса крысы (RCMV). Известно, что ul33 и r33 не содержат интронов, тогда как гомолог вируса MCMV -- m33 содержит один интрон в кодирующей последовательности (Davis-Poynter, Lynch et al. 1997). Анализ первичной нуклеотидной последовательности гена р33 показал его прерывистую структуру, что предполагает необходимость сплайсинга. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) проведена с использованием праймеров на противоположных концах предполагаемого донорного и акцепторного сайтов. Эксперимент подтвердил присутствие интрона размером 85 п.н. в составе гена размером 1333 п.н., состоящего из двух экзонов размером 33 и 1215 п.н. Когда тотальную РНК из инфицированных клеток PMEC использовали в качестве матрицы для ОТ-ПЦР, были выявлены две полоски на геле, соответствующие процессированной и непроцессированной копиям мРНК гена р33. Гены m33, r33 и ul33 гомологичны рецептору, сопряжённому с G-белком (гомологичность аминокислотной последовательности 62,5, 59,9 и 39,1% соответственно). Транскрипционный анализ в присутствии фосфорномуравьиной кислоты (PFA) в концентрации 50 мкг/мл показал ингибирование транскрипции гена р33, что подтверждает его принадлежность к поздним генам.

Фрагмент гена ДНК-полимеразы ПЦР-амплифицировали с применением прямого праймера и обратного праймера. Нуклеотидную последовательность гена ДНК-полимеразы сравнили с соответствующими регионами описанных ранее ДНК-полимераз других видоспецифичных вирусов CMV. Как и ожидалось, открытая рамка считывания ДНК-полимеразы наиболее близко соответствовала уже описанным вирусам CMV грызунов; при этом ДНК-полимераза вируса MCMV показала наибольшую степень гомологии, в то время как второй по уровню гомологии была ДНК-полимераза вируса RCMV. Иные гомологи ДНК-полимеразы были сгруппированы в других кластерах: HCMV и вирус CMV макаки резус (RhCMV) в одной группе, а вирус CMV морской свинки и два других герпесвируса рода тупаи -- в другой группе. Этот анализ и тот факт, что PCMV не реплицировал в клетках NIH 3T3, подтверждают, что PCMV -- новый вирус CMV, гомологичный вирусам MCMV и RCMV.

1.2 Получение рекомбинантного цитомегаловируса для экспрессии гликопротеинов хантавирусов

Клонирование фрагмента геномной ДНК цитомегаловируса Peromyscus maniculatus, содержащего ген р33. Вирус PCMV выращивали на эмбриональных клетках Peromyscus maniculatus (PMEC). Вирусные маточные растворы получены инфицированием клеток PMEC в роллерных бутылях со средой Дульбекко (модифицированная Исковым -- IMDM). Вирусный титр определяли методом бляшек. Выделенную геномную ДНК вируса PCMV гидролизовали с помощью эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) NotI и полученные фрагменты ДНК клонировали в плазмиду pET29c.

Нуклеотидная последовательность, полученная в результате секвенирования одного из концов продукта ПЦР-амплификации гена р33, использовали для синтеза 31-мерного праймера. В олигонуклеотид ввели концевую метку [г-32Р]АТФ (NEN Life Sciences) с помощью Т4-полинуклеотидкиназы (Life Technologies). Скрининг NotI-геномной библиотеки PCMV на наличие гена р33 провели с помощью Саузерн-блоттинга. На основании авторадиографических результатов Саузерн-блота установлено, что NotI-клон №121 содержит ген р33 PCMV. Плазмидную ДНК NotI-клона №121 гидролизовали ферментом BamHI и после очистки BamHI-фрагмент размером 3 т.п.н. клонировали в линейный вектор pPUR (Clontech), что привело к созданию плазмиды pPUR3kb. Ген р33 секвенировали с помощью специфичных праймеров, созданных на основе нуклеотидной последовательности ранее секвенированного ПЦР-фрагмента р33. Полное секвенирование всего гена р33 было проведено методом праймерной «прогулки» в обоих направлениях.

Создание рекомбинантного цитомегаловируса Peromyscus maniculatus (РCMV ДР33:G1EGFP). Несмотря на то, что гомологи гена цитомегаловируса человека ul33 у цитомегаловирусов крысы (r33) и мыши (m33) не играют значимой роли при репликации вируса в культуре клеток, рекомбинантные RCMV и MCMV, у которых отсутствовал гомолог гена ul33, демонстрировали аттенуированный фенотип, что выражалось в понижении тропизма к слюнным железам (Davis-Poynter, Lynch et al. 1997) и повышенной на 50% LD50 (Beisser, Vink et al. 1998). Таким образом, мы выбрали ген р33 для гомологичной замены на экспрессионную кассету, кодирующую химерный белок, состоящий из полного гена гликопротеина G1 хантавиркуса Sin Nombre (snv-g1) (плюс нуклеотидная последовательность, кодирующая первые 50 аминокислот гена G2) с egfp на С-конце. Для этого фрагмент М-сегмента вируса Sin Nombre (SNV) длиной 2116 нуклеотидов ПЦР-амплифицировали с помощью Pwo-полимеразы. Полученный фрагмент перекрывал кодирующую область snv-g1 и часть snv-g2. Продукт ПЦР-амплификации клонировали в плазмиду pCRII (Invitrogen) с последующим субклонированием в экспрессионный плазмидный вектор pEGFP-N1-BHI (Clontech) с использованием сайтов рестрикции EcoRI, помещая ПЦР-фрагмент snv-g1 с 5'-конца по отношению к гену egfp с сохранением открытой рамки считывания. Правильность сборки конструкции, начиная с транскрипционного старта и захватывая всю область генов snv-g1 и egfp, подтверждена секвенированием. Уникальный рестрикционный сайт AseI в плазмиде pEGFP-N1G1 конвертировали в EcoRV расщеплением AseI, достраиванием липких концов фрагментом Клёнова и лигации EcoRV-линкера (5'-GGGATATCCC-3') в плазмиду.

Ген р33 расположен в середине BamHI-фрагмента размером 3 т.п.н. в клоне №121 геномной библиотеки PCMV и содержит два удобных сайта XhoI, расположенных в 575 нуклеотидах друг от друга (со стартом трансляции в 378 нуклеотидов выше от первого сайта и стоп-кодоном в 376 нуклеотидах ниже второго сайта). Плазмида pN1G1-fl получена вставкой XhoI-фрагмента, содержащего фланкирующие участки гена р33, в сайт EcoRV плазмиды pEGFP-N1G1.

Полученную плазмиду использовали для гомологичной рекомбинации с вирусом PCMV дикого типа (wtPCMV). При этом XhoI-фрагмент гена р33 размером 575 п.н. заменили с помощью гомологичной рекомбинации на экспрессионную кассету описанной выше плазмиды pN1G1-fl. Рекомбинантный вирус получили с помощью селекции в присутствии G418. Последующая очистка рекомбинантного вируса проведена с помощью флуоресцентно-активируемой клеточной сортировки (FACS) (Beckman Coulter). ПЦР-анализ места вставки показал отсутствие загрязнения препарата рекомбинантного вируса вирусом дикого типа. Саузерн-блот анализ с применением р33-специфичной пробы показал увеличения геномного фрагмента с 3 т.п.н. у wtPCMV до 10 т.п.н. у рекомбинантного PCMV. Рекомбинантный PCMV получил название РCMV (ДР33:G1EGFP).

1.3 Анализ вирусной инфекции рекомбинантным цитомегаловирусом Peromyscus maniculatus (РCMV ДР33:G1EGFP) in vitro

Анализ экспрессии рекомбинантных белков. Клетки, инфицированные рекомбинантным РCMV, экспрессировали улучшенный ген зелёного флуоресцентного белка (EGFP), что показано флуоресцентной микроскопией. Для того, чтобы показать экспрессию G1 в инфицированных клетках, мы провели иммуноцитохимическую реакцию с помощью АТ к SNV-G1. Иммуноцитохимический анализ клеток PMEC, инфицированных PCMV, выявил положительную реакцию с рекомбинантными АТ человека к SNV-G1. Белковые лизаты клеток PMEC, инфицированные РCMV (ДР33:G1EGFP), анализировали с помощью вестерн-блоттинга и моноклональных АТ к GFP. Интересно, что вестерн-блот обнаружил выраженную полоску, соответствующую ожидаемой молекулярной массе EGFP (27 кДа). Полученная молекулярная масса белковой полоски была меньше, чем ожидаемая молекулярная масса химерного белка G1-EGFP (>106 кДа). Анализ экспрессии EGFP с помощью вестерн-блотинга в клетках PMEC, инфицированных рекомбинантным PCMV, показал экспрессию низкомолекулярной формы EGFP через 72 часа после добавления вируса к клеткам. Анти-пептидные АТ к SNV-G1 выявили наличие белка размером 75 кДа на поздних сроках после инфицирования клеток. Экспрессионная кассета G1-EGFP находится под транскрипционным контролем непосредственно-раннего промотора HCMV, но экспрессия EGFP не установлена на ранних (до 48 часов) стадиях после инфицирования клеток.

Анализ репликации рекомбинантного цитомегаловируса. Накопление инфекционных вирусных частиц в культуральной среде определяли титрованием вируса методом бляшек. Результаты титрования вируса показывают, что wtPCMV присутствует в культуральной среде через 48 часов после инфицирования клеток. По мере протекания инфекции титр wtPCMV в культуральной среде возрастал и достигал 1,8х10⁸ PFU/мл через 192 часа после инфицирования клеток. Присутствие рекомбинантного вируса PCMV наблюдали в культуральной среде через 144 часа после инфицирования. Титр рекомбинантного PCMV в культуральной среде возрастал по мере протекания инфекции, достигая 6х10⁸ PFU/мл через 192 часа после инфицирования клеток.

Количественный анализ репликации рекомбинантного РCMV (ДР33:G1EGFP) проводили с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Общую ДНК выделили из клеток PMEC, инфицированных wtPCMV или рекомбинантным PCMV. ПЦР-РВ с применением TaqMan MGB-проб проводили для определения количества копий геномов PCMV в клетках. Количество копий гена интерферона INF-г P. maniculatus использовали для определения числа копий клеточных геномов Peromyscus в образце. Ген 18S рибосомной РНК применяли в качестве внутреннего контроля для подтверждения точности количественного определения с помощью гена INF-г P. maniculatus. Количество геномной ДНК wtPCMV и рекомбинантного PCMV в культуральной среде через час после инфицирования клеток (фоновый уровень) составил приблизительно 1х10⁴ геномов/мл. Первоначальное увеличение количества геномной ДНК wtPCMV в культуральной среде наблюдали через 48 часов после инфицирования клеток, в то время как рекомбинантный PCMV показал увеличение количества геномной ДНК через 72 часа после инфицирования. Внутриклеточное количество ДНК wtPCMV и рекомбинантного PCMV достигало плато через 144 часа после инфицирования, а через 192 часа количество геномной ДНК PCMV в культуральной среде достигло 9,2х10⁶ геномов/мл для wtPCMV и 4,2х10⁶ геномов/мл для рекомбинантного PCMV. Анализ ПЦР-РВ внутриклеточной ДНК PCMV показал сравнимые концентрации wtPCMV и рекомбинантного PCMV через 1 час после инфицирования. Мы наблюдали снижение внутриклеточного количества ДНК wtPCMV и рекомбинантного PCMV в 10-15 раз через 24 часа после инфицирования. Количество ДНК внутриклеточного wtPCMV значительно возросло через 48 часов после инфицирования, в то время как увеличение количества ДНК рекомбинантного PCMV наблюдалось через 72 часа после инфицирования. Внутриклеточное количество ДНК wtPCMV в клетках PMEC достигло плато при 447 вирусных генома на клеточный геном (или 1,4х10⁴ геномов PCMV/нг тотальной ДНК) через 96 часов после инфицирования, тогда как количество рекомбинантного PCMV достигало плато при 491 вирусных генома на клеточный геном через 120 часов после инфицирования. Мы не наблюдали существенных различий во внутриклеточном количестве ДНК wtPCMV и рекомбинантного PCMV на поздних этапах инфекции. Нормализация результатов ПЦР-РВ по отношению к количеству копий генов INF-г и 18S рибосомной РНК P. maniculatus показали сопоставимые между собой результаты.

1.4 Анализ инфицирования хомячков Peromyscus maniculatus рекомбинантным цитомегаловирусом (РCMV ДР33:G1EGFP)

Инфицирование хомячков рекомбинантным цитомегаловирусом Peromyscus maniculatus (РCMV ДР33:G1EGFP): эксперимент 1. Эксперименты на животных проводили в соответствии с разрешением этического комитета Университета штата Невада, г. Рино, США. Оленьи хомячки Peromyscus maniculatus sonoriensis (в возрасте 6-7,5 месяцев) приобретены в виварии Университета Штата Южная Каролина. Для того, чтобы определить, может ли рекомбинантный вирус РCMV (ДР33:G1EGFP) инфицировать хомячков P. maniculatus и вызывать иммунный ответ к SNV-G1 и EGFP, двум группам хомячков сделали внутрибрюшинные инъекции 10 колониеобразующих единиц (PFU) wtPCMV (8 хомячков), либо 10 PFU рекомбинантного РCMV (ДР33:G1EGFP) (8 хомячков). Через год 3 хомячкам из wtPCMV-инфицированной группы и 6 хомячкам из РCMV (ДР33:G1EGFP)-инфицированной группы сделали повторную инъекцию 10 000 PFU РCMV (ДР33:G1EGFP). У хомячков производили систематический отбор крови для определения серологического статуса методом иммуноферментного анализа (ИФА). Рисунок 1 демонстрирует ранний иммунный ответ (15 дней после инфицирования) к PCMV и EGFP у хомячков, инфицированных рекомбинантным вирусом PCMV. Через 4 недели после инфицирования рекомбинантным PCMV хомячки показали слабый, но статистически достоверный (р=0,018) иммунный ответ к PCMV, ответ увеличивался на протяжении 12 месяцев. Реинфицирование хомячков, предварительно инфицированных рекомбинантным PCMV, новой дозой рекомбинантного PCMV, привела к значительному увеличению титра АТ к PCMV- и SNV-антигенам. Можно предположить, что уровень экспрессии G1 рекомбинантным вирусом достаточен для индукции гуморального иммунного ответа. Кроме того, введение хомячкам, предварительно инфицированных wtPCMV, рекомбинантного PCMV привела к значительному содержанию АТ к SNV (р=0,003).

Инфицирование хомячков рекомбинантным цитомегаловирусом Peromyscus maniculatus (РCMV ДР33:G1EGFP): эксперимент 2.

Хомячкам P. maniculatus делали внутрибрюшинные инъекции 5500 PFU wtPCMV (18 хомячков) или рекомбинантного PCMV (10 хомячков). Повторное инфицирование тем же количеством вируса провели через 130 дней после первичного инфицирования. Группа животных, инфицированных только wtPCMV, состояла из 7 особей, рекомбинантным PCMV -- 10 особей, и группа животных, одновременно инфицированная вирусами wtPCMV и рекомбинантным PCMV, -- 11 особей. При этом 11 из 18 хомячков, первоначально инфицированных wtPCMV, реинфицировали рекомбинантным PCMV. Образцы крови инфицированных хомячков получены из ретроорбитального венозного синуса. Все животные были ИФА-серонегативны по PCMV перед проведением экспериментов.

Рис. 1. Титр антител против вирусных и рекомбинантных антигенов у инфицированных цитомегаловирусами хомячков Peromyscus maniculatus. Панель А. Титр АТ к PCMV и EGFP у 6 хомячков, 15 дней после инфицирования рекомбинантным PCMV (ДР33:G1EGFP). Группы столбцов от 1 до 6 -- сыворотка крови индивидуальных животных. К -- контроль, моноклональные АТ к GFP и смесь сывороток инфицированных в естественных условиях диких хомячков. Панель Б. Титр АТ к PCMV-антигенам. 1 -- неинфицированный контроль (n=3); 2 -- 4 недели после инфицирования рекомбинантным PCMV (n=8); 3 -- 12 недель после инфицирования рекомбинантным PCMV (n=6); 4 -- 12 недель после инфицирования wtPCMV (n=5). Панель В. Титр АТ к SNV-G1. Разведение сывороток крови хомячков 1:100. 1 -- неинфицированный контроль (n=3); 2 --12 недель после инфицирования рекомбинантным PCMV (n=6); 3 -- 3 недели после инфицирования рекомбинантным PCMV и реинфицирования рекомбинантным PCMV (n=6); 4 -- 3 недели после инфицирования wtPCMV и реинфицирования рекомбинантным PCMV (n=3).

Рис. 2. Иммуноферментный анализ титра антител против рекомбинантных белков у хомячков, инфицированных цитомегаловирусом Peromyscus maniculatus. Стрелкой отмечено повторное инфицирование через 131 день после первичного. Панель А. Титр АТ к PCMV у инфицированных хомячков. ¦ -- wtPCMV (n=7); ? -- рекомбинантный PCMV (n=10); ^ -- животные, инфицированные wtPCMV и реинфицированные рекомбинантным PCMV. Панель Б. Титр АТ к EGFP у хомячков, инфицированных рекомбинантным PCMV. Р-значения даны для изменения титра АТ к EGFP между 128-160, и между 160- 192 днями после инфицирования. Панель В. Титр АТ к SNV-G1 у хомячков, инфицированных wtPCMV (n=7), рекомбинантным PCMV (n=8) или wtPCMV с реинфицированием рекомбинантным PCMV (n=11). Р-значения даны для изменения титра АТ к SNV-G1 по отношению к соответствующему wtPCMV контролю.

Для исследования иммунного ответа у P. maniculatus, инфицированных wtPCMV или рекомбинантным PCMV, мы применили ИФА с антигенами PCMV, EGFP и SNV. АТ к PCMV обнаружены у хомячков, инфицированных как wtPCMV, так и рекомбинантным PCMV (Рис. 2). Кроме того, АТ к EGFP обнаружены у 7 из 10 животных, инфицированных рекомбинантным PCMV через 128 дней после инфицирования. Реинфицирование этих животных рекомбинантным PCMV не привело к увеличению титра АТ к EGFP в сыворотке крови. Наоборот, титр АТ к EGFP уменьшался со временем.

Животные, первоначально инфицированные wtPCMV, но не инфицированные рекомбинантным PCMV, не показали наличия АТ к EGFP. Анализ титра специфичных АТ к SNV-G1 в сыворотке проводили через 28, 160 и 355 дней после инфицирования. ИФА не обнаружил присутствия АТ к SNV-G1 через 28 дней после инфицирования рекомбинантным PCMV, но мы наблюдали значительное увеличение титра АТ к SNV-G1 в сыворотке через 160 и 355 дней после инфицирования по сравнению с контролем (через 160 дней после инфицирования р=0,0015; через 355 дней р=0,015). Интересно, что животные, первоначально инфицированные wtPCMV и реинфицированные рекомбинантным PCMV, показали наличие АТ к SNV-G1, что свидетельствует о том, что предварительная инфекция wtPCMV не предотвратила реинфицирования рекомбинантным вирусом (Рис. 2).

Другой показатель вирусной инфекции -- накопление вирусного генетического материала в различных органах хозяина. Общую ДНК из разных органов хомячков (4 особи из каждой группы) выделили через 355 дней после инфицирования. Количественный анализ вирусной ДНК проводили методом ПЦР-РВ. Статистически достоверных различий количества вирусной ДНК в разных органах хомячков, инфицированных wtPCMV или рекомбинантным PCMV, не выявлено. Исключением стало повышение количества вирусной ДНК в сердечной ткани у животных, инфицированных рекомбинантным PCMV (р=0,04), и более высокое количество вирусной ДНК в селезёнке животных, инфицированных wtPCMV (р=0,05).

Реактивация латентного вируса Peromyscus maniculatus. Важным признаком цитомегаловирусов служит их способность к установлению латентной инфекции. Иммуносупрессия зачастую вызывает реактивацию CMV, что может привести к серьёзным последствиям у пациентов с ослабленной иммунной системой (Peckham 1991). Чтобы определить, может ли проходить реактивация рекомбинантного PCMV у латентно инфицированных животных, мы подвергли хомячков (3 особи) сублетальному гамма-облучению (Geginat, Ruppert et al. 1997). Тотальную ДНК из образцов крови до и через 12 дней после облучения анализировали с помощью ПЦР-РВ. Все 3 хомячка (одна особь, первоначально инфицированная wtPCMV и реинфицированная рекомбинантным PCMV, и две особи, инфицированные рекомбинантным PCMV) показали значительное увеличение (в 6-68 раз) количества вирусной ДНК в крови после облучения.

1.5 Обсуждение

В данной работе мы описываем новооткрытый цитомегаловирус (CMV) из P. maniculatus. Вирус классифицирован как CMV на основании следующих критериев: (i) цитопатология, типичная для CMV; (ii) электронная микроскопия, характерная для CMV; (iii) ДНК-полимераза и ген ul33 гомологичны MCMV; (iv) репликация вируса проходит исключительно в клетках, выделенных из P. maniculatus. Филогенетический анализ показал принадлежность данного вируса к группе, включающей MCMV и RCMV. ДНК-полимераза гомологична по аминокислотной последовательности на 60,2% и 56,9% соответствующим регионам ДНК-полимераз MCMV и RCMV.

Эволюционное родство PCMV с MCMV подтверждает наличие 85-нуклеотидного интрона, разделяющего 5'-конец кодирующей области первого экзона от 1215-нуклеотидного второго экзона, в гене р33 (гомолог гена ul33 вируса CMV человека). Для гена m33 сайт сплайсинга описан в той же позиции. Подобную структуру гена не описана у RCMV (ген r33) и HCMV (ген ul33), для которых характерна безинтронная структура генов. Ген р33 принадлежит к группе настоящих поздних генов, отличительная особенность которых - отсутствие транскрипции в присутствии PFA (ингибитора репликации вирусной ДНК, блокирующего экспрессию ICP36) (Everett and Dunlop 1984). Несмотря на то, что эти гомологи сопряжённого с G-белком рецептора не критичны для вирусной репликации в культуре клеток, они явно играют ключевую роль в патогенезе вируса, что видно из уменьшения тропизма к слюнным железам (Davis-Poynter, Lynch et al. 1997; Beisser, Vink et al. 1998) и увеличения на 50% LD50 вирусов CMV, дефектных по ul33.

Рекомбинантный вирус PCMV получен путём вставки экспрессионной кассеты, содержащей ген химерного белка SNV-G1 и EGFP, в ген р33. Химерный белок создан таким образом, что он сохраняет сайт расщепления G1-G2 между кодирующими регионами генов G1 и egfp. Подобный подход применён для достижения экспрессии G1 в его нативной форме, что может быть важным фактором для получения адекватного иммунного ответа против G1, в тоже время позволяя проводить детекцию белка EGFP для наблюдения за экспрессией рекомбинантных белков и селекции рекомбинантного вируса. Экспрессия EGFP подтверждена с помощью флуоресцентной микроскопии. Иммуноцитохимический анализ с применением специфичных рекомбинантных АТ человека к SNV-G1 подтвердил экспрессию SNV-G1 в клетках PMEC, инфицированных рекомбинантным PCMV. Анализ лизатов инфицированных клеток методом вестерн-блотинга показал присутствие на ранних стадиях инфекции значительного количества белка с молекулярной массой 27 кДа, что соответствует мономерному EGFP. Вестерн-блотинг тех же образцов с использованием анти-пептидных АТ к SNV-G1 показал наличие белка G1 (75 кДа) на более поздних стадиях инфекции. Эти результаты подтверждают экспрессию и расщепление G1 и EGFP в результате процессинга пребелковой формы. Эффективная экспрессия G1-EGFP-кассеты происходила только на поздних этапах инфекции, что также наблюдалось при экспрессии EGFP-G1 с плазмиды при транзиторной трансфекции. Несмотря на то, что промотор HCMV принадлежит к группе непосредственно-ранних промоторов, этот процесс происходит в контексте жизненного цикла CMV и его позиции в вирусной ДНК. Вероятно, когда промотор присутствует в геноме PCMV и клетках из P. maniculatus, его временнбя регуляция претерпевает изменение. Экспрессия белков G1 и EGFP происходит в виде независимых полипептидных цепей, при этом в инфицированных клетках не обнаружен химерный белок G1-EGFP. Это свидетельствует об эффективном процессинге пребелка, скорее всего в районе сайта расщепления между G1 и G2 в гликопротеине SNV, сохранённым в химерной конструкции G1-EGFP.

Для инфицирования P. maniculatus вирусом РCMV (ДР33:G1EGFP) было достаточно внутрибрюшинного введения 10 PFU вируса на животное. Когда хомячков инфицировали рекомбинантным вирусом, мы наблюдали иммунный гуморальный ответ на SNV-G1 и EGFP, что служит доказательством того, что экспрессируемые формы G1 и EGFP способны вызывать иммунный ответ с образованием АТ, реагирующих с SNV-G1 и EGFP в инфицированных клеточных лизатах Vero-E6 (Рис. 1). Интересно, что существующий иммунный ответ против wtPCMV не мешает индукции иммунного ответа против рекомбинантного белка, экспрессируемого с рекомбинантного вектора.

Данные наблюдения согласуются с исследованиями, показывающими возможность одновременного инфицирования диких мышей множественными штаммами MCMV (Moro, Lloyd et al. 1999). Подобное не наблюдают при HCMV-инфекции у людей. Показано, что предварительное инфицирование здоровых людей вирусом HCMV дикого типа или вакцинным штаммом вызывает, по крайней мере частичную, защиту от последующих инфекций (Adler, Hempfling et al. 1998; Plotkin 1999; Plotkin 1999). Полученные нами данные демонстрируют преимущество системы на основе цитомегаловируса P. maniculatus, для которого иммунный ответ против вирусного вектора скорее всего не повлияет на эффективность экспрессии трансгена in vivo при многократном введении в организм, что происходит у других часто используемых вирусных систем генной доставки (Engelhardt, Litzky et al. 1994; Smith, White et al. 1996). Тот факт, что титр АТ у хомячков, инфицированных wtPCMV, выше, чем у животных, инфицированных рекомбинантным PCMV, можно объяснить тем, что последний имеет аттенуированный фенотип. По-видимому, делеция гена р33 и вставка экспрессионной кассеты G1-EGFP приводит к аттенуации рекомбинантного PCMV. Несмотря на аттенуацию, вирус был способен инфицировать хомячков при малых дозах порядка 10 PFU на животное. Однако, иммунный ответ против PCMV у хомячков, инфицированных рекомбинантным PCMV, был ниже, чем у животных, инфицированных wtPCMV.

Наши эксперименты показали, что PCMV не приводит к выраженной патологии у инфицированных животных и, по всей видимости, не оказывает эффекта на продолжительность их жизни, так как животные, инфицированные wtPCMV или рекомбинантным PCMV, выживали более 12 месяцев после инфицирования. Дальнейшие эксперименты определили характер распределения рекомбинантного PCMV и wtPCMV в различных тканях инфицированных хомячков P. maniculatus. Мы подтвердили, что иммунный ответ против рекомбинантного PCMV не так сильно выражен, как против wtPCMV. Мы провели дополнительные эксперименты по изучению аттенуации рекомбинантного вируса. Накопление внутриклеточной ДНК PCMV, а также накопление инфекционных вирусных частиц и накопление ДНК рекомбинантного PCMV в культуральной среде шли с задержкой по сравнению с wtPCMV. Эти данные свидетельствуют о том, что рекомбинантный PCMV имеет замедленный репликационный цикл по сравнению с wtPCMV. Однако, несмотря на более медленную репликацию рекомбинантного PCMV, он достигал приблизительно одинакового плато количества внутриклеточной вирусной ДНК на поздних этапах инфекции.

Механизмы аттенуации вирусной репликации могут иметь мультифакторную основу. Ген р33 -- гомолог гена ul33 HCMV, следовательно -- гомолог сопряжённых с G-белком рецепторов. Ранее было показано, что этот ген не участвует в вирусной репликации в культуре клеток, но может играть важную роль в тропизме вируса к слюнным железам (Davis-Poynter, Lynch et al. 1997; Beisser, Vink et al. 1998). Недавно была предложена гипотеза, что белок М33 MCMV может играть роль в раннем репрограммировании клеток хозяина для поддержания CMV-репликации во время вирусной инфекции (Waldhoer, Kledal et al. 2002). Одним из возможных функциональных гомологов Р33 служит белок US28 HCMV -- трансмембранный рецептор, сопряжённый с G-белком. Было показано, что US28 играет роль в слиянии клеток, демонстрируя свою потенциальную важность в межклеточном распространении CMV (Pleskoff, Treboute et al. 1998). Делеция гена р33 может привести к нарушению межклеточного распространения PCMV, приводя в конечном итоге к развитию более медленно прогрессирующей инфекции. Дополнительным фактором, оказывающим негативное влияние на вирусную репликацию, служит присутствие экспрессионной кассеты SNV-G1-EGFP, конститутивно экспрессирующей рекомбинантные белки под контролем сильного промотора цитомегаловируа человека.

Для определения эффективности использования PCMV в качестве экспрессионного вектора, мы изучили иммунный ответ против PCMV и рекомбинантных антигенов у оленьих хомячков. Животные, инфицированные wtPCMV или рекомбинантным PCMV, демонстрировали иммунный ответ против антигенов PCMV уже через 2 недели после первоначального инфицирования (Рис. 2). Титр АТ против wtPCMV и рекомбинантного PCMV продолжал расти по мере развития инфекции. Реинфицирование хомячков соответствующим вирусом привело к увеличению титра АТ к PCMV у животных, инфицированных рекомбинантным PCMV (р=0,041), но это не влияло на титр АТ к PCMV у хомячков, инфицированных wtPCMV, что можно объяснить тем, что высокий титр АТ к PCMV у инфицированных wtPCMV животных предотвращал дополнительную репликацию вируса. Хотя мы наблюдали статистически значимое увеличение титра АТ к PCMV у хомячков, инфицированных рекомбинантным PCMV, после реинфицирования, это обстоятельство можно также объяснить продолжением развития иммунного ответа на первоначальное инфицирование wtPCMV. При этом рекомбинантный PCMV имеет аттенуированный фенотип, что может приводить к менее выраженному иммунному ответу против PCMV-антигенов. Отличие в иммунном ответе между EGFP и SNV-G1 можно объяснить различной иммуногенностью этих белков и более высоким уровнем экспрессии EGFP.

Наши данные свидетельствуют о том, что цитомегаловирус P. maniculatus - эффективный метод доставки рекомбинантных генов с целью иммунизации организма хозяина. Несмотря на обнадёживающие результаты, необходимы дополнительные исследования для определения эффективности вектора на основе PCMV в защите P. maniculatus от инфицирования патогенным SNV. В настоящее время мало что известно о значимости гуморального или клеточного иммунных ответов в защите от SNV-инфекции. Кроме того, неизвестна роль белков G1, G2 и нуклеокапсидного белка в создании иммунитета против SNV. Информация, полученная ранее в нашей лаборатории, показывает, что материнские АТ могут защищать молодняк P. maniculatus при инфицировании вирусом SNV (Borucki, Boone et al. 2000).

Известно, что слюнные железы выступают органом-мишенью для репликации цитомегаловируса мыши (MCMV) (Cheung and Lang 1977; Mims and Gould 1979). Вирус можно обнаружить в слюнных железах животных на протяжении первых 3 месяцев после инфицирования. В крови, селезёнке, лёгких и костном мозге локализация вируса происходит в течение первых нескольких недель после инфицирования. Исследование по персистенции вируса и определению количества вируса в различных органах было в основном ограничено ко-инкубацией суспензии органов с культурами клеток.

Наши результаты показывают, что wtPCMV и рекомбинантный PCMV присутствуют в относительно малых количествах во всех исследованных органах (за исключением крови и мозга). Наибольшие отличия в количестве wtPCMV от рекомбинантного PCMV выявлены в сердце (повышенный уровень рекомбинантного PCMV), в почках и селезёнке (повышенный уровень wtPCMV). Только следовые количества геномов PCMV обнаружены в слюнных железах. Предварительные результаты, полученные с использованием 2 хомячков на сроках 3 и 4 недели после инфицирования wtPCMV, показывают присутствие высокого количества PCMV в слюнных железах, в то время как вирус не обнаруживали у хомячков спустя 3 месяца после инфицирования рекомбинантным PCMV. Наши результаты согласуются с сообщениями о том, что MCMV присутствует в высоких концентрациях в слюнных железах только на ранних стадиях инфекции и не обнаруживается через несколько месяцев после инфицирования (Mims and Gould 1979), а делеция гена m33 вируса MCMV снижает тропизм MCMV к слюнным железам (Davis-Poynter, Lynch et al. 1997).

Известно, что MCMV может устанавливать латентную инфекцию у мышей (Reddehase, Podlech et al. 2002). В ответ на определённые раздражители может происходить реактивация вируса. Генотоксичный стресс в результате гамма-облучения -- один из методов исследования латентности у мышей (Balthesen, Messerle et al. 1993). Мы решили применить гамма-облучение для определения возможной реактивации PCMV у латентно-инфицированных хомячков P. maniculatus. Мы наблюдали значительное увеличение количества вируса в крови облучённых (4,12 Gy) животных, одновременно инфицированных вирусами wtPCMV и рекомбинантным PCMV или инфицированных только рекомбинантным PCMV. Эти наблюдения подтверждают предположение о том, что PCMV способен устанавливать латентную инфекцию у P. maniculatus наподобие латентной инфекции MCMV у мышей, и что делеция гена р33 вируса PCMV не влияет на способность устанавливать латентную инфекцию с последующей реактивацией после генотоксического стресса организма хозяина.

Итак, в ходе работы из хомячков P. maniculatus выделен новый цитомегаловирус, получивший обозначение PCMV. Проведён морфологический и молекулярно-генетический анализ PCMV. Молекулярно-генетическими методами создан рекомбинантный PCMV, экспрессирующий рекомбинантные белки SNV-G1 и EGFP. Полученные результаты свидетельствуют о том, что wtPCMV и рекомбинантный PCMV устанавливают латентную инфекцию у P. maniculatus. Рекомбинантный PCMV имеет аттенуированный фенотип в культуре клеток и вызывает более слабый иммунный ответ против PCMV-антигенов у хомячков по сравнению с wtPCMV. Однако мы не наблюдали статистически достоверных различий в титре или количестве геномной ДНК вируса между wtPCMV и рекомбинантным PCMV у персистентно инфицированных животных. Нами показано, что гамма-облучение хомячков, инфицированных PCMV, приводило к реактивации рекомбинантного PCMV у персистентно инфицированных хомячков. Инфицирование рекомбинантным PCMV приводило к сильному иммунному ответу против рекомбинантных белков EGFP и SNV-G1. Предварительный иммунный ответ против wtPCMV не предотвращал реинфицирование хомячков рекомбинантным PCMV и приводил к иммунному ответу против SNV-G1, что показывает перспективность применения векторов на основе PCMV для создания видоспецифичных генетических вакцин.

ГЛАВА 2. Особенности локализации и взаимодействия рекомбинантных гликопротеинов хантавирусов