Лечение нейродегенеративных заболеваний, чей патогенез обусловлен мутациями конкретных генов, требует вмешательства в организм больного на генетическом уровне. Методы генной терапии позволяют снизить уровень экспрессии мутантного гена-мишени, что в теории должно привести к ремиссии. В настоящее время для коррекции экспрессии гена-мишени существует ряд подходов, таких как антисмысловые олигонуклеотиды и РНК-интерференция.

Нами впервые была выполнена трансфекция siRNA в аксоны мотонейронов поясничного отдела спинного мозга мышей G93A путём аппликации siRNA, комплементарной мРНК мутантного гена человека sod1, на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва. Аппликация sod1-специфичной siRNA приводила к значительному снижению количества мРНК sod1 в соответствующей части спинного мозга. Таким образом, siRNA путём интернализации попадает в аксоны мотонейронов, ретроградно транспортируется в перикарионы и блокирует трансляцию аберрантного SOD1.

Таким образом, нами разработаны различные вирусные и невирусные методы доставки в организм рекомбинантных нуклеиновых кислот. Методы генной терапии (в том числе предложенные нами подходы) позволяют решать широкий спектр задач, таких как иммунизация организма против вирусных инфекций, исследование молекулярных механизмов внутриклеточного цикла патогенных вирусов, регуляция экспрессии рекомбинантных белков, повышающих терапевтический потенциал генетически модифицированных клеток, и коррекцию наследственных заболеваний с помощью РНК-интерференции.

ВЫВОДЫ

2. Экспрессия рекомбинантных белков (гликопротеина G1 хантавируса Sin nombre и зелёного флуоресцентного белка EGFP) вызывает иммунный ответ у хомячков Peromyscus maniculatus. При этом существующий естественный иммунный ответ против цитомегаловируса P. maniculatus (PCMV) дикого типа не препятствует инфицированию рекомбинантным вирусом.

3. Делеция гена р33 приводит к снижению репликативной активности цитомегаловируса Peromyscus maniculatus (PCMV), но не влияет на способность рекомбинантного вируса инфицировать иммунокомпетентных животных и устанавливать латентную инфекцию.

4. Созданы генетические конструкции для экспрессии гликопротеинов хантавирусов ANDV и SNV в эукариотических клетках. Установлено, что раздельная экспрессии гликопротеинов приводит к их нехарактерной локализации в эндоплазматическом ретикулуме. В тоже время коэкспрессия гликопротеинов G1 и G2 вирусов ANDV или SNV приводила к их концентрации в аппарате Гольджи -- естественном месте локализации при хантавирусной инфекции, а коэкспрессия гликопротеинов G1 и G2 разных хантавирусов в одной клетке приводит к функциональному взаимодействию гликопротеинов с образованием гетеродуплекса, обладающего способностью к естественному процессированию и локализации в аппарате Гольджи.

5. Впервые создана невирусная генетическая конструкция, одновременно и независимо экспрессирующая нейральную молекулу адгезии (L1CAM) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF).

6. Клетки мононуклеарной фракции пуповинной крови человека, генетически модифицированные плазмидными векторами, экспрессирующими гены нейральной молекулы адгезии (L1CAM) и сосудистого эндотелиальногой фактора роста (VEGF), после трансплантации трансгенным мышам G93A дифференцируются в эндотелиальные клетки и участвуют в формировании новых кровеносных сосудов.

7. Впервые проведена операция по прямой аппликации препаратов siRNA на центральный участок перерезанного седалищного нерва трансгенных мышей, экспрессирующих фенотип бокового амиотрофического склероза, и показано, что siRNA приводит к специфическому снижению количества мРНК мутантного гена sod1 человека в поясничном отделе спинного мозга трансгенных мышей G93A.

Список основных публикаций по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК для защиты докторских диссертаций:

1. Rizvanov, A.A. Generation of a recombinant Peromyscus maniculatis cytomegalovirus for expression of a hantavirus glycoprotein / A.A. Rizvanov, A.G.M. Van Geelen, S.P. Morzunov, E.W. Otteson, G.S. Pari, M.C. Bohlman, S.C.St Jeor // Journal of Virology. - 2003. - V.77. - P.12203-12210.

2. Khaiboullina, S.F. Regulation of cellular gene expression in endothelial cells by sin nombre and prospect hill viruses / S.F. Khaiboullina, A.A. Rizvanov, E. Otteson, A. Miyazato, J. Maciejewski, S.St Jeor // Viral Immunology. - 2004. - V.17. - P.234-251.

3. Rizvanov, A.A. Development of reassortant viruses between pathogenic hantavirus strains / A.A. Rizvanov, S.F. Khaiboullina, S.St Jeor // Virology. - 2004. - V.327. - P.225-232.

4. Deyde, V. Identification of a monoclonal antibody from Peromyscus maniculatus (deer mouse) cytomegalovirus (PCMV) which binds to a protein with homology to the human CMV matrix protein HCMV pp71 / V. Deyde, A. Rizvanov, E. Otteson, S. Brandt, M. Bego, G. Pari, T. Kozel, S.St Jeor // Journal of Virological Methods. - 2005. - V.123. - P.9-15.

5. Khaiboullina, S.F. Andes virus stimulates interferon-inducible MxA protein expression in endothelial cells / S.F. Khaiboullina, A.A. Rizvanov, V.M. Deyde, S.C.St Jeor // Journal of Medical Virology. - 2005. - V.75. - P.267-275.

6. Deyde V.M., Interactions and trafficking of Andes and Sin Nombre Hantavirus glycoproteins G1 and G2 / V.M. Deyde, A.A. Rizvanov, J. Chase, E.W. Otteson, S.C.St Jeor // Virology. - 2005. - V.331. - P.307-315.

7. Khaiboullina, S.F. Yellow fever virus strains Asibi and 17d-204 infect human umbilical cord endothelial cells and induce novel changes in gene expression // S.F. Khaiboullina, A.A. Rizvanov, M.R. Holbrook, S. St Jeor // Virology. - 2005. - V.342. - P.167-176.

8. Rizvanov, A.A. Replication and immunoactivity of the recombinant Peromyscus maniculatus cytomegalovirus expressing hantavirus G1 glycoprotein in vivo and in vitro / A.A. Rizvanov, S.F. Khaiboullina, A.G. van Geelen, S.C.St Jeor // Vaccine. - 2006. - V.24. - P.327-334.

9. Исламов, Р.Р. РНК-интерференция в регуляции аксонного транспорта / Р.Р. Исламов, А.А. Ризванов, Ю.А. Челышев, А.К. Мурашов // Успехи физиологических наук. - 2007. - Т.38, №3. - С.47-56.

10. Исламов, Р.Р. Генная и клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний / Р.Р. Исламов, А.А. Ризванов, Д.С. Гусева, А.П. Киясов // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2007. - Т.2, №3. - С.21-37.

11. Rizvanov, A.A. Human umbilical cord blood cells transfected with VEGF, L1CAM do not differentiate into neurons but transform into vascular endothelial cells and secrete neuro-trophic factors to support neuro-genesis - a novel approach in stem cell therapy/ A.A. Rizvanov, A.P. Kiyasov, I.M. Gaziziov, T.S. Yilmaz, M.S. Kaligin, D.I. Andreeva, A.K. Shafigullina, D.S. Guseva, S.L. Kiselev, K Martin, A. Palotбs, R.R. Islamov // Neurochemistry International. - 2008. - V.53. - P.389-394.

12. Исламов, Р.Р. Боковой амиотрофический склероз: стратегия генно-клеточной терапии / Р.Р. Исламов, А.А. Ризванов, А.П. Киясов // Неврологический вестник. - 2008. - Т.40, №4. - С.91-101.

13. Yalvac, M.E. Comparison and optimisation of transfection of human dental follicle stem cells with different chemical methods and electro-poration / M.E. Yalvac, M. Ramazanoglu, Z.O. Gumru, F. Sahin, A. Palotбs, A.A. Rizvanov // Neurochemical Research. - 2009. - V.34. - P.1272-1277.

14. Rizvanov, A.A. Retrogradely transported siRNA silences human mutant SOD(1) in spinal cord motor neurons / A.A. Rizvanov, M.A. Mukhamedyarov, A. Palotбs, R.R. Islamov // Experimental Brain Research. - 2009. - V.195. - P.1-4.

15. Yalvac, M.E. Potential role of dental stem cells in the cellular therapy of cerebral ischemia / M.E. Yalvac, A.A. Rizvanov, E. Kilic, F. Sahin, M.A. Mukhamedyarov, R.R. Islamov, A. Palotбs // Current Pharmaceutical Design. - 2009. - V.15. - P.3908-3916.

16. Ризванов, А. Адипоциты костного мозга являются ингибиторами гемопоэтического микроокружения / А. Ризванов // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2009. - Т.4, №3. - C.31-32.

Список основных докладов и материалов конференций:

1. Van Geelen, A.G.M. The Deer Mouse-Specific Cytomegalovirus as a Vector for In Vivo Expression of Sin Nombre Virus Glycoproteins / A.G.M. Van Geelen, M.C. Bohlman, A.A. Rizvanov, S.P. Morzunov and S.C. St Jeor // American Society for Virology, 17th Annual Meeting. - Vancouver, B.C., Canada, 1998. - P.71.

2. Rizvanov, A. Cloning Of Sin Nombre Hantavirus Glycoproteins / A. Rizvanov, S. Morzunov, S. St. Jeor //The University of Nevada, Reno, Life Sciences Research Retreat. - Granlibakken, Lake Tahoe, California. 1999. - P.7.

3. Rizvanov, A.A. In Vitro and In Vivo Expression of Sin Nobre Virus glycoprotein G1 Using A Peromyscus Cytomegalovirus (PCMV) expression system / A.A. Rizvanov and S.C. St. Jeor // The University of Nevada, Reno, Life Sciences Research Retreat . - Granlibakken, Lake Tahoe, California. 2000. - P.11.

4. Van Geelen, A.G.M. Expression of Hantavirus Glycoproteins in Deer Mice / A.G.M. van Geelen, A.A. Rizvanov, S.P. Morzunov, M.C. Bohlman, G.S. Pari and S.C. St. Jeor // Keystone Sumposia (Cellular and Molecular Biology - Genetics, Pathogenesis and Ecology of Emerging Viral Diseases). - Taos, NV, 2000. - P.88.

5. Immunization of Deer Mice with a Cytomegalovirus Vector Expressing Hantavirus Glycoproteins - Exposure to Wild Type Virus Does Not Protect Against Infection with Recombinant Virus / St Jeor, S., A. Rizvanov, A. van Geelen and E. Otteson // 8th International Cytomegalovirus Conference. - Monterey, CA, 2001. - P.56.

6. Rizvanov, A.A. Expression of Sin Nombre Virus Glycoprotein Using a Peromyscus Cytomegalovirus (PCMV) expression system / A.A. Rizvanov, A.G.M. van Geelen, E. Otteson, S.P. Morzunov, M.C. Bohlman, G.S. Pari, S.C. St Jeor // American Society for Virology, 20th Annual Meeting. - Madison, Wisconsin, 2001. - P.103.

7. Rizvanov, A.A. Expression of Sin Nombre Virus Glycoprotein G1 Using A Peromyscus Cytomegalovirus (PCMV) Expression System / A.A. Rizvanov and S. St Jeor // The University of Nevada, Reno, Life Sciences Research Retreat. -Granlibakken, Lake Tahoe, California, 2002. - P.15.

8. St Jeor, S.C. Cytomegalovirus as a vector for expression and immunization against hantavirus glycoproteins / S.C. St Jeor, A. Rizvanov and A. vanGeelen // 27th Internationsl Herpesvirus Workshop. - Cairns Convention Centre, Australia, 2002. - P.65.

9. Deyde, V.M. Expression and localization of Andes and Sin Nombre viruses' glycoproteins G1 and G2 / V.M. Deyde, E. Otteson, A. Rizvanov, and S. St. Jeor //American Society for Virology, 22nd Annual Meeting. - UC Davis, Davis, California, 2003. - P.79.

10. Rizvanov, A.A. Cell type dependent differences in hantavirus replication /A.A. Rizvanov, S.F. Khaiboullina, and S. St. Jeor // American Society for Virology, 22nd Annual Meeting. - UC Davis, Davis, California, 2003. - P.87.

11. Deyde, V.M. Interactions and trafficking of Andes and Sin Nombre virus glycoproteins / V.M. Deyde, A.A. Rizvanov, J. Chase, E. Otteson, and S.C. St Jeor //The University of Nevada, Reno, Life Sciences Research Retreat. - Granlibakken, Lake Tahoe, California, 2003. - P.5.

12. Khaiboullina, S.F. Andes virus stimulated MxA protein expression in endothelial cells / S.F. Khaiboullina, V.M. Deyde, A.A. Rizvanov, and S St Jeor // In Abstracts of the Sixth International Conference on HFRS, HPS and Hantaviruses. - Seoul, Republic of Korea, 2004. - P.94.

13. Khaiboullina, S.F. Andes virus stimulated MxA protein expression in endothelial cells / S.F. Khaiboullina, V.M. Deyde, A.A. Rizvanov, and S St Jeor // In Abstracts of the ASM Meeting. Viral Immune Evasion. - Acapulco, Mexico, 2005. - P.52.

14. Bego, M. Study of human cytomegalovirus latency in hematopoietic cells / M. Bego, J. Maciejewski, S. Khaiboullina, A. Rizvanov, and S. St Jeor // 30th International Herpesvirus Workshop -Turku, Finland, 2005. - P.46.

15. Association of Hantavirus Glycoprotein (Gn) with Nucleocapsids in the final stages of viral assembly / D.M. Boudreaux, S.F. Khaiboullina, A. Rizvanov, S. C. St. Jeor. // The University of Nevada, Reno, Life Sciences Research Retreat at Granlibakken. - Tahoe City, 2006. - P.14.

16. Ризванов, А.А. Клеточная терапия генетически модифицированными стволовыми клетками пуповинной крови трансгенных G93A мышей, экспрессирующих фенотип бокового амиотрофического склероза. / А.А. Ризванов, Т.М. Мазитов, Р.Р. Исламов // Всероссийская научно-практическая конференция “Молодые ученые в медицине”. - Казань, 2007. - С.304-305.

17. Abdullin, T.I. Nanomaterials In Biomolecules Delivery: Characterization Of Nucleic Acids - Carbon Nanotubes Interactions. / T.I. Abdullin, I.I. Nikitina, O.V. Bondar, А.А. Ризванов // Gene Therapy Symposium. - Yeditipe University campus, Istanbul, Turkey, 2007. - P.31.

18. Киясов, A.П. Клеточная терапия генетически модифицированными стволовыми клетками пуповинной крови трансгенных G93A мышей, экспрессирующих фенотип бокового амиотрофического склероза. ГК_02.512.11.2052. / A.П. Киясов, Р.Р. Исламов, А.А. Ризванов, Д.С. Гусева, Н.В. Бойчук, А.А. Гумерова, М.А. Титова, С.Р. Абдулхаков, Р.Ф. Гайфуллина, М.С. Калигин, И.М. Газизов, Т.С. Йылмаз, Д.И. Андреева, О.А. Назарова, Д.А. Бикмухаметов, Г.Р. Бурганова, Г.О. Певнеев, Т.М. Мазитов, Н.И. Ланник, Н.В. Кудряшова, А.К. Шафигуллина, Д.Ш. Юнусов. // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы". - Москва, 2007. - С.65-66.

19. Газизов, И.М. Пути миграции и дифференцировки генетически модифицированных стволовых клеток пуповинной крови человека после трансплантации G93A мышам. / И.М. Газизов, М.С. Калигин, Т.С, Йылмаз, И.М., Д.И. Андреева, А.А. Ризванов. // XIII Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2008. - С.197-198.

20. Шафигуллина, А.К. Генная и клеточная терапия бокового амиотрофического склероза. / А.К. Шафигуллина, Д.Ш. Юнусов, Н.И. Ланник, А.А. Ризванов. // Первая городская студенческая конференция «Междисциплинарные исследования в области естественных наук»: Сборник тезисов. - Казань, 2008. - С.15.

21. Yalvac, M.E. Transfection Optimisation of Human Dental Follicle Cells With Different Lipofection Methods and Electroporation. / M.E. Yalvac, M. Ramazanoglu, F. Sahin, R.I. Zhdanov, A.A. Rizvanov. // 14th International Biomedical Science and Technology Symposium. - Mugla, Turkey, 2008. - P.117.

22. Rizvanov, A.A. Human Umbilical Cord Blood Cells Genetically Modified With VEGF and L1CAM Differentiate Into Endothelial Cells Upon Transplantation In Mouse ALS Model. / A.A. Rizvanov, M.E. Yalvac, I.M. Gaziziov, T.S. Yilmaz, M.S. Kaligin, A.K. Shafigullina, D.S. Guseva, F. Sahin, R.I. Zhdanov, S.L. Kiselev, A. Palotas, A.P. Kiyasov, R.R. Islamov // 14th International Biomedical Science and Technology Symposium. - Mugla, Turkey, 2008. - P.122-124.

23. Шафигуллина, А.К. Генетически модифицированные клетки пуповинной крови дифференцируют в клетки эндотелия после трансплантации трансгенным мышам, экспрессирующим фенотип бокового амиотрофического склероза. /А.К. Шафигуллина, Д.И. Андреева, И.М. Газизов, Т.С. Йылмаз, М.С. Калигин, Д.С. Гусева, Д.Ш. Юнусов, Н.И. Ланник, И.И. Салафутдинов, А.П. Киясов, А.А. Ризванов, Р.Р. Исламов // I Всероссийский конгресс студентов и аспирантов биологов “Симбиоз-Россия 2008”: Сборник статей. - Казань, 2008. - C.123-125.

24. Ризванов, А.А. Трансфекция siRNA в аксоны мотонейронов поясничного отдела спинного мозга G93A трансгенных мышей селективно блокирует экспрессию мутантного гена SOD1 / А.А. Ризванов, М.А. Мухамедьяров, Н.И. Ланник, Р.Р. Исламов // Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии: Материалы II Международной научно-практической конференции. - Казань, 2008. - С.110.

25. Юнусов, Д.Ш. Трансфекция и Экспрессия изоформ сосудистого эндотелиального фактора роста человека VEGF121, VEGF165, VEGF189 в культуре мезенхимальных стволовых клеток / Д.Ш. Юнусов, И.И. Салафутдинов, А.К. Шафигуллина, М.Э. Ялвач, Н.И. Ланник, А.П. Киясов, Р.Р. Исламов, А.А. Ризванов // Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии: Материалы II Международной научно-практической конференции. - Казань, 2008. - С.144.

26. Челышев, Ю.А. Восстановление двигательной функции при трансплантации в область гемисекции спинного мозга крысы клеток обонятельной выстилки или мононуклеарных клеток крови пуповины человека / Ю.А. Челышев, Г.Ф. Шаймарданова, Г.А. Масгутова, И.В. Викторов, Е.А. Савченко, А.А. Ризванов, Р.Р. Исламов, А.П. Киясов, И.М. Газизов, Т.С. Йылмаз, М.С. Калигин, А.К. Шафигуллина, Н.И. Ланник, Д.И. Андреева // Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток. - Самара, 2008. - С. 232-234.

27. Мухамедьяров, М.А. Нанотехнологии в медицине: применение РНК-интерференции для лечения нейродегенеративных заболеваний. / М.А. Мухамедьяров, А.А. Ризванов, А.Л. Зефиров, Р.Р. Исламов // Материалы Международного Форума по нанотехнологиям'08: Сборник тезисов докладов участников Международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий. - Москва, 2008. - C.598-600.

28. Салафутдинов, И.И. Трансфекция и экспрессия ангиогенного и нейропротекторного фактора VEGF и нейральной молекулы адгезии L1CAM в клетки мононуклеарной фракции пуповинной крови человека / И.И. Салафутдинов, А.К. Шафигуллина, Д.Ш. Юнусов, А.П. Киясов, А.А. Ризванов // ХIV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2009. - C.174

29. Шафигуллина, А.К. Морфологический и молекулярно-генетический анализ мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из зачатков зубов мудрости человека / А.К. Шафигуллина, М.Э. Ялвач, Р.Р. Исламов, А.П. Киясов, Ф.Шахин, А.А. Ризванов // II Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов Симбиоз Россия 2009. - Казань, 2009. - С. 324-325

30. Rizvanov A.A. Current trends in Gene and Stem Cell Therapy applications / A.A. Rizvanov, A.P. Kiyasov // The 13th annual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of Borders». - Kazan, 2009. - P.41.

31. Челышев Ю.А. Клеточные технологии стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга / Ю.А. Челышев, Г.Ф. Шаймарданова, Р.Ф. Масгутов, Г.А. Масгутова, А.А. Ризванов, Я.О. Рубашкина // РАМН Международная ассоциация морфологов. VI съезд анатомов гистологов и эмбриологов России.- Морфология. - Саратов, 23-25 сентября 2009г. - Т.136, № 4. - С.150-151.

32. Ризванов А.А. Генная и клеточная терапия бокового амиотрофического склероза / А.А. Ризванов, М.А. Мухамедьяров, А.П. Киясов, Р.Р. Исламов // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, 28 сентября - 1 октября. - г.Москва - Пущино, 2009г. - С.202-203.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выделение, создание и анализ рекомбинантного цитомегаловируса из Peromyscus maniculatus выполнено совместно с Альбертом ван Гиленом (Университет штата Невада, г. Рено, США). Филогенетический анализ цитомегаловируса из Peromyscus maniculatus выполнен совместно с д.б.н. Морзуновым С.П. (Университет штата Невада, г. Рено, США). Исследование влияния вирусной инфекции на клеточные процессы проводили совместно с к.б.н. Хабибуллиной С.Ф. (Университет штата Невада, г. Рено, США). Исследования по взаимодействию и созреванию хантавирусных гликопротеинов проводили совместно с Деид В.М. (Университет штата Невада, г. Рено, США). Исследования по трансплантации генетически модифицированных клеток животным и последующий функциональный и гистологический анализ проводили на кафедре нормальной анатомии Казанского государственного медицинского университета (КГМУ) под руководством зав. каф. д.м.н., профессора Киясова А.П. и на кафедре гистологии КГМУ под руководством д.м.н., профессора Исламова Р.Р. Хирургические операции на седалищном нерве мышей и введение siRNA проводили совместно с ассистентом кафедры нормальной физиологии КГМУ к.м.н. Мухамедьяровым М.А.

Автор выражает глубокую благодарность профессору Андрею Павловичу Киясову, профессору Владимиру Алексеевичу Анохину, а также научному консультанту профессору Рустему Робертовичу Исламову за постоянную поддержку и наставничество; профессору Анатолию Ивановичу Голубеву и профессору Борису Ивановичу Барабанщикову за активное участие в выборе жизненного пути и в становлении, как учёного.

Автор тепло благодарит семью, супругу Фариду и дочурку Карину за поддержку и любовь. Автор посвящает работу своей матери Зайнаб Шамилевне Ризвановой, в которой он всегда находил поддержку и понимание, а также светлой памяти дау-ани (бабушки) Кафии Гаязовны Мансуровой, чьё самопожертвование и любовь не имели границ.