Энцефалитогенные Т-клетки в развитии эксперементального аутоиммунного энцефаломиелита

Антиген-сенсибилизированные лимфоциты, их генетическая модификация и индукция апЭАЭ. Выявление локализации клеток методом флуоресцентной микроскопии. Определение уровня экспрессии генов методом количественной ПЦР. Энцефалитогенные Т-клетки и апЭАЭ.

Рубрика Медицина
Вид диссертация
Язык русский
Дата добавления 05.09.2010
Размер файла 8,2 M

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

ЭНЦЕФАЛИТОГЕННЫЕ Т-КЛЕТКИ В РАЗВИТИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АУТОИММУННОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА

14.03.03 - патологическая физиология

Санкт-Петербург

2010 г.

Работа выполнена в Отделе общей патологии и патологической физиологии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН и Отделе нейроиммунологии Института нейробиологии Макса Планка

Научные консультанты:

академик РАМН, профессор Елена Андреевна Корнева

профессор Александр Флюгель

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.А. Кетлинский

доктор медицинских наук, профессор И.Д. Столяров

доктор биологических наук, Т.В. Кветная

Ведущая организация:

Российская Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова.

Защита диссертации состоится 19 октября 2010 г. в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.022.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

автореферат разослан “____”_______________2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д001.22.02.

доктор медицинских наук П.А. Дыбан

1. Общая хаpактеpистика pаботы

Актуальность проблемы

Нервная и иммунная системы постоянно взаимодействуют, что обеспечивается возможностью притока информации от иммунной системы к нервной через гуморальные и нервные пути, а так же восприимчивостью клеток иммунной системы к нейротрансмиттерам и гормонам нейроэндокринной системы, поскольку рецепторы к этим веществам представлены на мембранах иммуноцитов. С другой стороны, сигналы поступающие от иммунной системы, модулируют функции центральной нервной системы. Дисбаланс во взаимодействии нервной и иммунной систем может приводить к развитию различных форм патологии, проявляющихся соматическими, психическими или психосоматическими расстройствами. Одним из наиболее тяжелых и распространенных заболеваний, связанных с развитием аутоиммунного процесса в ЦНС, является рассеянный склероз (РС), этиология и патология которого изучены далеко не исчерпывающе.

Накопленные более чем за столетнюю историю изучения рассеянного склероза (РС) данные дают возможность выдвинуть предположение о существенной роли аутоиммунных Т-лимфоцитов в инициации воспаления в ЦНС. Анализ гистологических препаратов, полученных при аутопсии и биопсии у пациентов с диагнозом РС, позволяет постулировать, что практически во всех случаях при РС в период обострения очаги поражения инфильтрированы энцефалитогенными Т-клетками, которые локализуются вокруг сосудов головного мозга, что указывает на возможную роль этих клеток в нарушении разделительной функции гемато-энцефалического барьера (Booss, Esiri et al. 1983; Babbe, Roers et al. 2000).

Одними из факторов риска развития РС являются генетические особенности человека или животных, которые затрагивают гены, связанные с основным комплексом гистосовместимости II типа (MHC II), то есть с комплексом, который является ключевым механизмом активации эффекторных Т-клеток (Oksenberg, Barcellos et al. 2004; Lincoln, Montpetit et al. 2005). С другой стороны обнаружено, что лимфоциты больных РС несут специфическую последовательность в цепи Т-клеточного рецептора (Oksenberg, Panzara et al. 1993; Madsen, Andersson et al. 1999). Генетические особенности в генах, кодирующих MHC II комплекс, так же играют решающую роль в контроле восприимчивости различных линий крыс к индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) - модели рассеянного склероза (Madsen, Andersson et al. 1999). Обнаруженная зависимость между конкретной последовательностью генов, кодирующих компоненты MHC II, TCR и риском развития РС подтверждает предположение о важной роли Т-клеток в патогенезе РС и ЭАЭ.

Впервые, прямые доказательства роли аутоиммунных процессов в патогенезе заболевания были получены в 80-х годах прошлого столетия благодаря созданию экспериментальной модели РС - адоптивного переносного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (апЭАЭ) (Ben-Nun, Wekerle et al. 1981). В модели апЭАЭ, патология, схожая с таковой при РС, вызывается введением здоровому животному активированных энцефалитогенных Т-клеток (ЭГ Т-клетки), сенсибилизированных к антигенам ЦНС, в частности к основному белку миелина. Патогенез апЭАЭ характеризуется развитием воспаления в ЦНС и обратимым нарушением проводящей функции аксонов, хотя и протекает без выраженной демиелинизации в отличии от рассеянного склероза у людей (Linington, Bradl et al. 1988). Обратимое нарушение проводящей функции аксонов, а не полная ее потеря, объясняет монофазный характер течения заболевания, вызванного введением ЭГ Т-клеток, сенсибилизированных к основному белку миелина (MBP) у крыс линии Lewis, которое заканчивается полным восстановлением утраченных функций. Подобная ситуация напоминает симптоматику, характерную для ремитирующей формы РС, при которой периоды обострения заболевания сменяются полным восстановлением в начальный период развития РС. Хотя патогенез апЭАЭ не включает всей совокупности процессов, происходящих при развитии РС, например протекает без выраженной потери миелина, адекватность этой модели для изучения роли Т-клеточной составляющей в инициации и развитии патогенеза РС общепризнанна (Gold, Linington et al. 2006).

Течение апЭАЭ у крыс линии Lewis может быть разделено на 3 фазы: преклиническая фаза, клиническая фаза и восстановление. Преклиническая фаза наиболее важна для понимания механизмов инициации заболевания, опосредованного введением ЭГ Т-лимфоцитов. Несмотря на то, что, апЭАЭ вызывается введением активированных Т-клеток, сенсибилизированных к MBP и экспрессирующих необходимые молекулы для прямой экспансии в ЦНС, большинство Т-клеток достигает ЦНС только через 2-3 суток после введения. Применение методов генной терапии для доставки генов в энцефалитогенные Т-клетки предоставило возможность изучения роли ЭГ Т-клеток в патогенезе апЭАЭ (Flugel, Willem et al. 1999). По предположению A. Flugel, на преклиническом этапе апЭАЭ формируется «миграционный фенотип» энцефалитогенных Т-клеток, который необходим для их проникновения через ГЭБ и инициации воспаления в ЦНС (Flugel, Berkowicz et al. 2001). Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению патогенеза апЭАЭ, остается не до конца ясным, какие клеточные и экстраклеточные компоненты тканей, с которыми взаимодействуют энцефалитогенные клетки в ходе миграции на преклиническом этапе, вовлечены в формирование «миграционного фенотипа» и какие изменения, происходящие с энцефалитогенными клетками, его определяют. По-видимому, Т- лимфоциты, сенсибилизированные к MBP, играют роль провокатора воспаления в ЦНС, хотя непонятно какую роль они играют в патогенезе развития других этапов ЭАЭ. Для того, что бы ответить на эти и другие вопросы, мы использовали систему индуцированного клеточного самоубийства и скрининг функционального состояния энцефалитогенных Т-клеток на различных этапах развития ЭАЭ, а так же попытались вычленить компоненты тканей, вовлеченные в формирование «миграционного фенотипа» у энцефалитогенных клеток.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является определение роли энцефалитогенных Т-клеток в развитии различных стадий ЭАЭ и выявление факторов, обеспечивающих ЭГ Т-клеткам «миграционный фенотип», позволяющий им преодолевать гематоэнцефалический барьер и провоцировать развитие аутоиммунного воспаления в ЦНС. Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:

Используя методы проточной цитометрии, количественной ПЦР и флуоресцентной микроскопии выявить органы, в которые мигрируют ЭГ Т-клеток на преклиническом этапе апЭАЭ. Провести сравнительный анализ распределения ЭГ Т-клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, in vivo на разных стадиях развития апЭАЭ, вызванного в/в или в/б введением ЭГ Т-клеток.

На основании данных молекулярного скрининга и количественной ПЦР выделить гены - потенциальные кандидаты, вовлеченные в процесс формирования функциональных изменений ЭГ Т-клеток на преклиническом этапе развитии ЭАЭ.

Исследовать влияние отдельных компонентов экстраклеточного матрикса на миграционную активность ЭГ Т-клеток. Разработать 3-х мерную модель для анализа подвижности ЭГ Т-клеток in vitro, используя метод флуоресцентной микроскопии.

Разработать систему, позволяющую селективно удалять ЭГ Т-клетки in vitro и in vivo, а именно создать трасгенную линию первичных MBP (основной белок миелина) специфичных Т-клеток, экспрессирующих суицидный (тимидин киназа вируса простого герпеса - HSV-TK) и маркерный (зеленый флуоресцентный белок - GFP) гены, а также линии клеток экспрессирующие GFP, RFP или белок - переносчик норэпинефрина (hNAT).

Изучить роль ЭГ Т-клеток в развитии различных стадий апЭАЭ, неинвазивно удаляя эти клетки методом, основанным на использовании токсических свойств синтетических аналогов тимидина (ганцикловир- GCV) на клетки экспрессирующие HSV-TK. Проследить взаимосвязь между количеством ЭГ Т-клеток в организме, интенсивностью провоцируемого ими воспаления в ЦНС и тяжестью клинических проявлений.

Используя свойство ЭГ Т-клеток, продуцирующих HSV-TK, специфически аккумулировать радиоактивные аналоги GCV, попытаться установить локализацию ЭГ Т-клеток в организме на различных стадиях развития ЭАЭ с помощью гамма-сканирования.

Особенностью данной работы является использование модели рассеянного склероза, позволяющей изучить функциональные перестройки ЭГ Т-клеток на ранних стадиях развития ЭАЭ непосредственно в организме и их роль в инициации патологических процессов.

Основные положения, выносимые на защиту:

Экспрессия транскрипционного фактора - Круппел-лайк фактор 2 (KLF2) и активирующего миграцию рецептора к гиалуронану (RHAMM) активируется в ЭГ Т-клетках в селезенке через 72 часа после введения непосредственно перед резким увеличением числа ЭГ Т-клеток в ЦНС и частично определяет повышение их миграционной активности.

Высокомолекулярный гиалуронан - один из компонентов экстраклеточного матрикса, стимулирует двигательную активность и ингибирует пролиферацию ЭГ Т-клеток, не влияя на их способность к активации в ответ на действие специфического антигена. Эти изменения сопряжены с увеличением уровня экспрессии KLF2.

Энцефалитогенные Т-клетки, сенсибилизированные к основному белку миелина, играют ключевую роль в инициации развития аутоиммунного воспаления в ЦНС, неинвазивное удаление их на клинической стадии развития заболевания не изменяет динамику его течения.

Клеточное самоубийство экспрессирующих HSV-TK ЭГ Т-лимфоцитов, спровоцированное введением GCV, вызывает гибель клеток через активацию р53 зависимого пути апоптоза, но протекает без активации каспазы-3.

Удаление чувствительной к GCV популяции энцефалитогенных клеток (TMBP-GFPTK) на преклинической стадии апЭАЭ ведет к увеличению инфильтрации ЦНС клетками оставшейся, не чувствительной к GCV, популяции энцефалитогенных Т-клеток (TMBP-RFP) при их совместном введении.

Накопление радиоактивно меченных аналогов GCV TMBP-GFPTK+ лимфоцитами, используемое для неинвазивного определения их локализации in vivo, ведет к потере пролиферативной и функциональной активности этих клеток.

Научная новизна работы.

В ходе работы была изучена роль ЭГ Т-клеток в развитии патологических процессов в ЦНС на ранних стадиях развития ЭАЭ, определены клеточные и экстраклеточные компоненты, влияющие на формирование миграционного фенотипа ЭГ Т-клеток и пути реализации развития этих изменений. Использование линий трансгенных ЭГ Т-клеток позволило изучить их роль и функциональные перестройки в процессе развития ЭАЭ in vivo, что открывает возможность для поиска путей регуляции функций энцефалитогенных клеток. Впервые описаны пути апоптоза экспрессирующих HSV1-TK Т-лимфоцитов, вызванного ганцикловиром и обнаружен токсический эффект аккумуляции радиоактивных аналогов ганцикловира на эти клетки, что необходимо принимать во внимание при проведении клинических и лабораторных исследований.

Практическая значимость работы.

Изучение перестроек, происходящих в иммунной системе в преклинический период развития РС, имеет не только теоретический интерес, но перспективно и для клинического применения. Знание механизмов формирования миграционного фенотипа энцефалитогенных клеток, обусловливающих развитие процесса воспаления в ЦНС, предоставляет возможность поиска путей их регуляции или компенсации. Выяснение роли клеточного окружения, влияющего на процесс созревания ЭГ Т-клеток, даст возможность не только влиять на их поведение, но и предотвращать созревание ЭГ Т-клеток in vivo.

Реализация результатов исследования.

Результаты работы могут быть использованы в научной практике, связанной с изучением молекулярных механизмов развития патогенеза рассеянного склероза и его экспериментальных моделей и могут войти в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии, иммунологии и неврологии. Полученные данные рационально использовать в фармакологии при разработке иммунокорригирующих препаратов.

Апробация работы.

Материалы исследования изложены в 10 публикациях и представлены на Российских и Международных конференциях и симпозиумах.

Структура и объем работы:

Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, из них отечественных - 12 и 234 - зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 36 рисунками.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Антиген-сенсибилизированные лимфоциты, их генетическая модификация и индукция апЭАЭ

Для получения антиген-сенсибилизированных лимфоцитов и их генетической модификации применяли методы, описанные в работе A. Flugel (Flugel, Willem et al. 1999). Лимфоциты выделяли из брыжеечных (mesenteric nodes - M LNs), парааортальных (para-aortic nodes - PA LNs) и паховых лимфатических узлов (inguinal nodes - Ing LNs) крыс иммунизированных суспензией образованной равными объемными долями MBP или овальбумина (OVA) (150 мкг.) и полного адъюванта Фронда. Лимфоузлы гомогенезировали и клетки отмывали HEPES буфером. 2х107 лимфоцитов высевали на 96 луночный планшет (круглое дно) с предварительно нанесенными 15х105, пакетирующими рекомбинантные ретровирусы, клетками (GP+E) в 10 мл. среды ТСМ (DMEM, L-glutamine, Asparagine, Pn/Str, NAA, в-меркаптоэтанол и 2% крысиной сыворотки) и в присутствии 100 мкг. MBP или OVA. На второй день к культуре клеток добавляли среду TCGM (DMEM, L-glutamine, Asparagine, Pn/Str, NAA, в-меркаптоэтанол, 10% инактивированной сыворотки лошади и 5-10% супернатанта, полученного из культуры мышиных спленоцитов активированных ConA). На седьмой день, лимфоциты переносили в 96 луночный планшет с плоским дном и рестимулировали в присутствии облученных тимоцитов (1,2х108 на планшет), 100 мкг соответствующего антигена и 0,4 мг/мл. G-418 (для позитивной селекции трансдуцированных клеток). На второй день после первой рестимуляции к культуре клеток добавляли среду TCGM. На третий день производили селекцию клонов по интенсивности флуоресцентного белка (если возможно). Выбранные клоны переносили в 6 см. чашки Петри и инкубировали в течение 2-4 дополнительных рестимуляций (для селекции по антигенной специфичности). Для трансдукции лимфоцитов были использованы векторы на основе ретровируса мышиных стволовых клеток pMSCVneo (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany), экспрессирующие GFP, RFP, GFP-IRES-TK или GFP-IRES-NAT под LTR промотором. апЭАЭ был индуцирован внутривенным или внутрибрюшинным введением активированных лимфоцитов (3 или 5х106 на крысу), после чего животных ежедневно осматривали для своевременного выявления клинических симптомов и взвешивали. Клинические симптомы определяли в соответствии со следующей шкалой: 0,5 - ослабление тонуса хвоста; 1 - паралич хвоста; 2 - нарушение походки; 3 - паралич задних конечностей; 4 - тетрапарез; 5 - смерть. В качестве контроля развитии апЭАЭ использовали введение 5х106 Т-клеток сенсибилизированных к овальбумину. Внутрибрюшинное введение физиологического раствора служило контролем к введению ганцикловира. Крысы инбредной линии Lewis были получены из вивария института Биохимии Макса Планка (Мартинсрид, Германия). Животные содержались в стандартных условиях, постоянной температуре окружающей среды (+220С), 12-часовом световом дне и свободном доступе к воде и пище.

2.2 Выявление локализации клеток методом флуоресцентной микроскопии

Для анализа распределения GFP позитивных ЭГ Т-клеток с использованием флуоресцентной микроскопии приготавливали 300 µм переживающие срезы ткани легкого и Оmentum предварительно перфузированных животных. Срезы анализировали на Флуоресцентном микроскопе Zeiss (Германия, Oberkochen, Axiovert 200M).

Подсчет клеток проточной цитометрией.

Для подсчета клеток методом проточной цитометрии, производили забор органов на различных сроках после внутривенного (хвостовая вена) или внутрибрюшинного введения 5х106 активированных MBP Т-клеток. Органы помещали на лед и взвешивали. Для анализа забирали: кровь, селезенку, околотимические лимфатические узлы (parathymic nodes - PT LNs), брыжеечные (mesenteric nodes - M LNs), парааортальные (para-aortic nodes - PA LNs) и паховые лимфаузлы (inguinal nodes - Ing LNs), а так же спинной мозг. 4 мл гепаринизированной крови использовали для получения лимфоцитарной фракции на градиенте Optiprep, после чего клетки отмывали и подсчитывали. Селезенку гомогенизировали через металлический фильтр, после чего обрабатывали ACK буфером для лизирования эритроцитов. Белые кровяные клетки отмывали и ресуспендировали в фосфатном буфере для дальнейшего подсчета. Лимфатические узлы выделяли, гомогенизировали и клетки отмывали фосфатным буфером. Спинной мозг гомогенизировали и клетки помещали на Nycodens градиент для выделения лимфоцитов. Флуоресцентные гранулы добавляли в пробу для проточной микроскопии в определенном количестве, что позволяло затем определять общее количество ЭГ Т-клеток в образце. Цитомитрию проводили на FACS Calibur (BD).

Определение уровня активации ЭГ Т-клеток и характеристика инфильтратов в ЦНС.

Клетки выделяли из органов, как было описано выше, или отмывали фосфатным буфером из культуры in vitro. Для иммуноцитометрического анализа использовали антитела против CD8a, CD45, W3/25 (anti-CD4), OX33 (CD45RA, B cells), CD11b, CD25 (IL-2R), OX40 (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany). В качестве контрольных антител использовали неспецифические IgG (Sigma, Munich, Germany). Детекцию первичных антител, осуществляли при помощи вторичных анти мышиных антител, конъюгированных с Allophycocyanin (Invitrogen, Karlsruhe, Germany).

Обработка лимфоцитов ганцикловиром и радиоактивными субстратами in vitro.

Использовали ганцикловир (GCV) производства Рош (Roche, Манхейм, Германия), коммерческое название - Цимовен (Cymoven®). Для обработки in vitro использовали GCV в концентрации 1 мкг/мл. Радиоактивно меченные субстраты 5-[123I]iodo-1-(2-deoxy-2-fluoro-в-D-arabinofuranosyl) uracil - [123I]FIAU, 9-[4-fluoro-3-(hydroxymethyl)butyl]guanine - [18F]FHBG и metajodobenzylguanidin - [123I]MIBG были получены из Института Радиационной Медицины Изар Клиники (Мюнхен, Германия). Клетки инкубировали 1 час при +370С и 5% СО2 в присутствии 0.25, 2.5, 12.5 или 25 µСi субстрата, отмывали и рестимулировали через 24 часа. Аккумулированную клетками радиоактивность определяли как процент от добавленной в культуру.

Инъекция ганцикловира.

Для титрования эффективной концентрации in vivo GCV вводили внутрибрюшинно в дозе 0, 5, 20 и 100 мг/кг веса животных, ежедневно в течение 4 - х дней, начиная с момента инъекции энцефалитогенных Т клеток. В дальнейших экспериментах использовали введение GCV в концентрации 20 мг/кг.

Анализ функциональной активности лимфоцитов.

функциональную активность лимфоцитов определяли по степени активации клеток в ответ на аппликацию антигена. Для этого 3х106 ЭГ Т-клеток инкубировали с 10 мкг/мл MBP и 107/мл облученных тимоцитов в течение двух дней. Степень активации оценивали по уровню пролиферации путем подсчета клеток на FACS-Calibur (Becton Dickinson, Хайдельберг, Германия) или по включению [H3]-тимидина.

Выявление локализации радиоактивно-меченных ЭГ Т-клеток в органах при помощи гамма камеры.

На первый или третий день после введения энцефалитогенных лимфоцитов животным вводили внутривенно по 250 µСi [123I]FIAU или [123I]MIBG. Через 2 или 20 часов животных наркотизировали, используя внутримышечное введение смеси Фентамил:Домитор:Дормикум (Fentanyl:Domitor:Dormicum - 0.06 мг/кг: 0.2 мг/кг: 2.5 мг/кг веса) и сканировали на гамма камере (Сименс, Германия). После сканирования крысам вводили внутрибрюшинно смесь Антиседан:Аноксат:Нарканти (Antisedan:Anoxat:Narcanti - 0.8 мг/кг: 0.25 мг/кг: 0.15 мг/кг) для купирования действия наркоза. Все животные после введения радиоактивного субстрата содержались в специальном виварии Института Радиационной Медицины (Мюнхен, Германия).

2.3 Определение уровня экспрессии генов методом количественной ПЦР

Для анализа уровня экспрессии про- и противо-воспалительных цитокинов в спинном мозге, лимфатических узлах и селезенке использовали метод количественной ПЦР. Органы забирали, гомогенизировали, клетки отмывали и ресуспендировали в TRIZol (Invitrogen, USA). RNA изолировали и синтезировали кДНК согласно протоколу производителя (RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas). Количественную ПЦР производили TaqMan методом с использованием Maxima™ Probe qPCR Master Mix (Fermentas) и FAM-TAMRA меченных специфичных олигонуклеотидов.

Анализ клеточной подвижности in vitro.

Анализ подвижности ЭГ Т-клеток проводили в разработанной нами камере с контролем температуры, влажности и концентрации углекислого газа и кислорода. Клетки помещали в 50% матригель в DMEM среде при 40С и инкубировали 30 минут при 370С до образования геля. Отслеживание миграции ТMBP-GFP клеток производили на флуоресцентном микроскопе (ZEISS, Германия, Oberkochen, Axiovert 200M) путем сканирования в течение 30 мин. с интервалом в 30 секунд. Полученные, микрофильмы анализировали при помощи программы ImageJ (National Institute of Mental Health (NIMH)).

Вестерн блот.

Клетки собирали, отмывали и ресуспендировали в лизисном буфере (50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% glycerol, 1%Triton X-100, 100 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 мM PMSF, and 1 мM Na3VO4 (Sigma-Aldrich, Munich, Germany). Концентрацию белка определяли с использованием метода Бредфорда (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California,USA). 50 микрограмм белка разгоняли в SDS полиакриламидном геле и переносили на Immobilon-P PVDF мембрану (Millipore,Bedford, Massachusetts, USA). Антитела против p53 (Pab 240, разведение 1:500) и p21 (c-19; разведение 1:200) получены из Santa Cruz (California, USA). Pan-actin-, bax- и puma-специфические антитела были получены из Cell Signaling Technology (Frankfurt, Germany) и использовались при разведении 1:1000. Вторичные анти-мышиные и анти-кроличьи антитела были конъюгированы с пероксидазой хрена (Serotec) и разводились 1:5000. Вторичные антитела детектировали с помощью ECL раствора (Perkin Elmer, Darmstadt, Germany) и рентгеновской пленки X-ray film (Amersham, Little Chalfont, UK). Лизат, полученный из клеток, обработанных доксирубицином (200нг/мл, Sigma, Munich, Germany) использовали как позитивный контроль для активации р53 опосредованного апоптоза.

Изучение активации каспазы 3.

Ac-DEVD-AMC (BD Bioscience, Heidelberg, Germany) использовали как флуоресцентный субстрат для каспазы-3. Т-клетки или фибробласты инкубировали в течение 1 часа с Ac-DEVD-AMC (20µM). Пуромицин (3мкг/мл) или GCV (1µM) добавляли в инкубационную среду и скорость расщепления Ac-DEVD-AMC измеряли на спектрофотометре (VICTOR 2, Perkin Elmer, Massachusetts USA) при длине волны излученного света 430-460 nm при 37oC в течение 12 часов.

Данные, пpедставленные в pазделе "Pезультаты исследования", являются pезультатами 4-5 экспеpиментов, каждое опpеделение пpоводилось в 3-4 повтоpах. Результаты экспериментов обрабатывали с помощью стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Энцефалитогенные Т-клетки и апЭАЭ

Для достижения поставленных в работе задач были созданы линии трансгенных CD4+ Т-лимфоцитов, сенсибилизированных к основному белку миелина (MBP) и экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP) (TMBP-GFP), красный флуоресцентный белок (TMBP-RFP), тимидин киназу вируса простого герпеса I-го типа в бицестронной кассете вместе с GFP (TMBP-GFPTK+) или белок - переносчик норэпинефрина - hNET вместе с GFP (TMBP-GFPhNET+). CD4+ Т-лимфоциты, сенсибилизированные к овальбумину (OVA) и экспрессирующие GFP (TOVA-GFP) использовали в качестве контрольных. Гены были доставлены в Т-лимфоциты с помощью рекомбинантных ретровирусов, кодирующих интересующие конструкты под LTR промотором и ген устойчивости к неомицину. Функциональная активность доставленных в лимфоциты генов определяли количественной ПЦР, флуоресцентной микроскопией при анализе экспрессии GFP и RFP и в тесте по определению чувствительности к ганцикловиру для TMBP-GFPTK+ клеток. Селекцию клеток по антигенной специфичности осуществляли путем нескольких последовательных стимуляций антигеном в присутствии антиген-презентирующих клеток с цикличностью в 7 дней. После последовательных стимуляций, селекции по гену устойчивости к неомицину и селекции по экспрессии флуоресцентного белка, CD4+ Т-лимфоциты (GFP или RFP) составляли более 96% от всей популяции клеток.

Введение активированных Т-лимфоцитов животным приводило к развитию классической клинической картины апЭАЭ выраженной в ослаблении двигательной активности конечностей и параличах. апЭАЭ характеризуется воспалением, которое развивается в спинном и головном мозге и протекает со слабо выраженной демиелинизацией и повреждением проводимости аксонов. При апЭАЭ у крыс линии Lewis, вызванным введением специфических к MBP Т-клеток, нарушение проводимости аксонов имеет обратимый характер, что определяет монофазное течение заболевания с последующим полным восстановлением. У животных, которым вводили Т-клетки, сенсибилизированные к овальбумину развитие патологий не наблюдалось.

Использование трансгенных линий ЭГ Т-клеток, несущих маркерный ген, предоставило возможность для отслеживания локализации, поведения и функциональных перестроек непосредственно энцефалитогенных Т-клеток in vivo и ex vivo.

3.2 Локализация энцефалитогенных Т-клеток на ранних стадиях развития апЭАЭ

Согласно поддерживаемому нами предположению А. Флюгеля, миграция энцефалитогенных клеток через органы иммунной системы необходима для формирования миграционного фенотипа, который позволяет этим клеткам преодолевать ГЭБ (Flugel, Berkowicz et al. 2001). Поэтому знание путей миграции ЭГ Т-клеток до их проникновения в ЦНС важно для понимания процессов, протекающих в этих клетках, и для обнаружения факторов, которые принимают участие в формировании миграционного фенотипа. Несмотря на обнаружение ЭГ Т-клеток в околотимических лимфоузлах, селезенке и кровотоке на преклиническом этапе развития ЭАЭ, неясно, являются ли эти органы необходимыми для формирования миграционного фенотипа, и будут ли они адресатами миграции ЭГ Т-клеток при другом методе введения. Кроме того следует заметить, что в исследованных органах ЭГ Т-клетки наблюдаются только через 24 часа после введения и их распределение на более ранних сроках остается неизвестным. Для того чтобы ответить на эти простые, но принципиально важные вопросы, мы провели сравнение путей миграции ЭГ Т-клеток после их внутрибрюшинного и внутривенного введения, используя проточную цитометрию, флуоресцентную микроскопию, гамма-сканирование радиоактивно меченных Т-клеток и количественную ПСР. Совокупность использованных методов позволила определить, что селезенка и околотимические лимфатические узлы являются органами, вовлеченными в процесс миграции ЭГ Т-клеток на преклиническом этапе ЭАЭ независимо от способа их введения (Рис. 1). Более того, наибольшее количество ЭГ Т-клеток аккумулируется в селезенке непосредственно перед их миграцией в ЦНС и уменьшается обратно пропорционально увеличению их количества в ЦНС, что позволило предположить наличие миграционного фенотипа у ЭГ Т-клеток, обнаруживающихся в селезенке перед массовой миграцией в ЦНС (Носов М. и др. 2009).

Для анализа функциональных перестроек ЭГ Т-клеток на преклиническом этапе развития ЭАЭ, ЭГ Т-клетки были сортированы из тканей легкого, околотимических лимфатических узлов, селезенки, спинного мозга и крови через 6, 30, 58, 82 и 106 часов после их введения с помощью флуоресцентно активированной проточной цитометрии, и уровень экспрессии генов INFг, CD25 (рецептор интерлейкина 2), KLF2 (kruppel like factor 2) и S1P1 (sphingosine-1-phosphate receptor 1) был исследован с помощью количественной ПЦР. В качестве контрольных, использовались клетки инкубируемые in vitro. Активированные in vitro ЭГ Т-клетки экспрессировали маркеры активации (INFг и CD25) на высоком уровне в день их введения (0ч in vitro) (Рис. 2).

Рисунок 1 - Изменение количества ЭК Т-клеток в органах после их внутривенного и внутрибрюшинного введения

Распределение количества ЭГ Т-клеток через 24 (А и Д), 48 (Б и Е), 72 (В и Ж) и 96 часов (Г и З) после внутривенного (А, Б, В, Г) или внутрибрюшинного (Д, Е, Ж, З) введения в: 1 - Крови; 2 - Спинном мозге; 3 - Селезенке; 4 - Околотимических лимфатических узлах (parathymic nodes - PT LNs); 5 - Брыжеечных лимфатических узлах (mesenteric nodes - M LNs); 6 - Парааортальных лимфатических узлах (para-aortic nodes - PA LNs); 7 - Паховых лимфатических узлах (inguinal nodes - Ing LNs). *:р?0.001 по отношению к количеству клеток в селезенке через 72 часа после введения. #:р?0.005 по отношению к количеству клеток в спинном мозге через 72 часа после введения.

3.3 Функциональные перестройки энцефалитогенных Т-клеток на разных стадиях развития апЭАЭ

Тем не менее, экспрессия INFг и CD25 в культуральных клетках заметно снижалась со временем (82ч и 106ч in vitro). Постепенное снижение уровня CD25 мРНК наблюдалось в Т-клетках, сортированных из легких через 30, 58 и 82 часа после их введения. Снижение уровня экспрессии маркеров активации в ЭГ Т-клетках было зафиксировано в течение всего преклинического этапа ЭАЭ вплоть до их активной миграции в ЦНС, где ЭГ Т-клетки реактивировались в ответ на действие эндогенного миелина мозга (Рис. 2). Противоположная динамика изменения уровня экспрессии была обнаружена при изучении транскрипционного фактора KLF2. Экспрессия KLF2 усиливалась в течение преклинической стадии ЭАЭ и достигала максимума непосредственно перед началом миграции ЭГ Т-клеток в ЦНС (через 82ч в селезенке и околотимических лимфоузлах), где затухала обратно пропорционально степени активации клеток. Схожая динамика изменения экспрессии была обнаружена и для рецептора сфингозин-1-фосфата S1P1, который так же активировался непосредственно перед миграцией ЭГ Т-клеток в ЦНС (Рис. 2). Активация экспрессии KLF2 в процессе миграции на преклиническом этапе ЭАЭ нашла подтверждение и в ходе анализа данных, полученных с помощью ДНК-микрочипов (DNA microarray), которые использовали для определения паттерна экспрессии генов в активированных ЭГ Т-клетках in vitro и в клетках, изолированных из селезенки на преклиническом этапе ЭАЭ через 72 часа после введения.

Рисунок 2 - Динамика экспрессии генов ifnг, cd25, klf2 и s1p1 ЭГ Т-клетками сортированными из: ткани легкого - через 6 - (1), 30 - (2), 58 - (3) и 82 часа (4); из кровотока через 6 (5) и 82 часа (6); из околотимических лимфоузлов через 82 часа (7); из селезенки через 82 часа (8), из спинного мозга через 106 часов (9) после введения и из культуры клеток перед их введением (10) и через 82 - (11) и 106 часов (12) инкубации in vitro

Кроме KLF2, выраженную активацию экспрессии продемонстрировал ген rhamm, который кодирует рецептор к гиалуронану (RHAMM - receptor for hyaluronan-mediated motility) и, как известно, принимает участие в регуляции подвижности клеток (данные K. Heckelsmiller, не опубликовано). Исходя из факта, что экспрессия RHAMM активируется в ТMBP-GFP клетках непосредственно перед их миграцией в ЦНС, логично предположить, что HA может играть существенную роль в механизмах развития патологии при апЭАЭ через модуляцию функционального состояния энцефалитогенных Т-клеток.

Для подтверждения данного предположения было исследовано влияние различных компонентов экстраклеточного матрикса на подвижность ТMBP-GFP клеток in vitro, уровень их активации и пролиферативной активности, а также на энцефалитогенный потенциал.

3.4 Подвижность энцефалитогенных клеток и влияние на нее экстраклеточного матрикса

Гиалуронан (hyaluronan) это гликозаминогликан, который входит в состав соединительной, эпителиальной и нервной тканей. В ЦНС гиалуронан является одним из основных компонентов экстраклеточного матрикса и участвует в регуляции активации и миграции клеток через взаимодействие со своими рецепторами CD44 и RHAMM. Поскольку на преклиническом этапе развития ЭАЭ происходит активация рецептора к гиалуронану в ЭГ Т-клетках в процессе их миграции, логично предположить, что гиалуронан может играть роль в формировании «миграционного» фенотипа. Для изучения роли эктраклеточного матрикса (ЭКМ), гиалуронана в частности, в формировании «миграционного» фенотипа ЭГ Т-клеток, мы разработали метод для оценки подвижности клеток in vitro (см. методы). Используя флуоресцентный микроскоп, отслеживали миграцию ЭГ Т-клеток, которые были предварительно рестимулированы в присутствии различных компонентов ЭКМ в Матригеле в течение 30 мин при 37оС и при контроле уровня CO2 и O2 (Matrigel, BD). Полученные таким образом микрофильмы анализировали с помощью программы ImageJ (National Institute of Health, USA). Результаты представлены в виде совмещенных траекторий отдельных клеток, распределения клеток по скоростям и отношения количества быстро мигрирующих (средняя скорость >3.5 мкм\мин) и медленно мигрирующих клеток (средняя скорость <3.5 мкм\мин).

При сравнении миграционной активности ЭГ Т-клеток активированных in vitro (48 часов после стимуляции) и тех же клеток, но выделенных с помощью проточной цитометрии из ЦНС животных (на 4ый день после введения), c апЭАЭ (ex vivo), было обнаружено, что ex vivo ЭГ Т-клетки способны мигрировать через ЭКМ значительно интенсивнее, чем клетки, которые инкубировали in vitro (Рис. 3).

Рисунок 3 - Миграция культуральных ЭГ Т-клеток и клеток выделенных из ЦНС в экстраклеточном матриксе

А - Траектории миграции отдельных клеток, совмещенные в стартовой точке. Б - Распределение клеток по скоростям миграции. В - Процент клеток, мигрирующих медленно (со скоростью менее 3.5 мкм/мин.); и быстро (быстрее чем 3.5 мкм/мин.). *: p<0.05 по отношению к количеству «быстрых» клеток in vitro.

Рисунок 4 - Влияние ЭКМ на миграционную активность ЭГ Т-клеток после их стимуляции в присутствии Матригеля и без него

(А) Траектории миграции отдельных клеток, совмещенные в стартовой точке. (Б) Распределение клеток по скоростям миграции. (В) Процент клеток, мигрирующих медленно (со скоростью менее 3.5 мкм/мин.); и быстро (быстрее чем 3.5 мкм/мин.). *: p<0.05 по отношению к количеству «быстрых» клеток в контроле.

Рисунок 5 - Влияние ЭКМ на миграционную активность ЭГ Т-клеток после их стимуляции в присутствии высокомолекулярного или низкомолекулярного гиалуронана

А - Траектории миграции отдельных клеток, совмещенные в стартовой точке. Б - Распределение клеток по скоростям миграции. В - Процент клеток мигрирующих медленно (со скоростью менее 3.5 мкм/мин.); и быстро (быстрее чем 3.5 мкм/мин.). *: p<0.05 по отношению к количеству «быстрых» клеток после рестимуляции с высокомолекулярным гиалуронаном.

Средняя скорость миграции культуральных клеток составляла 3,4 мкм/мин. а максимальная 24 мкм/мин. против 5,74 мкм/мин. и 39 мкм/мин. для ex vivo изолированных клеток соответственно. Таким образом, разработанный нами метод позволяет визуализировать функциональные изменения ЭГ Т-клеток, выражающиеся в способности клеток мигрировать через ЭКМ. Используя описанный метод, было изучено влияние компонентов ЭКМ на миграционную активность ЭГ Т-клеток. В этих целях клетки рестимулировали в присутствии смеси компонентов ЭКМ и в присутствии высокомолекулярного или низкомолекулярного гиалуронана, а затем определяли миграционную активность этих клеток, степень их активации, пролиферации, а так же уровень экспрессии KLF2.

Оказалось, что присутствие в инкубационной среде Матригеля ведет к повышению миграционной активности ЭГ Т-клеток по сравнению с таковой у клеток, которые были рестимулированны без добавлений (средняя скорость 3,8 мкм/мин. и 6,3 мкм/мин.; максимальная 26 мкм/мин. и 39 мкм/мин. для ЭГ Т-клеток, стимулированных в присутствии Матригеля и без добавок соответственно) (Рис. 4). Большинство клеток, которые были рестимулированы в присутствии Матригеля, двигались со средней скоростью более 5 мкм/мин., то есть относились к «Быстрым». Присутствие высокомолекулярного гиалуронана в инкубационной среде так же стимулировало активацию миграции ЭГ Т-клеток через ЭКМ, в то время как аппликация низкомолекулярного гиалуронана не влияла на способность ЭГ Т-клеток к миграции (Рис. 5) (средняя скорость 3,3 мкм/мин. и 4,9 мкм/мин.; максимальная 23 мкм/мин. и 34 мкм/мин., для ЭГ Т-клеток, стимулированных в присутствии низкомолекулярного гиалуронана и высокомолекулярного гиалуронана, соответственно).Для того, что бы нивелировать неспецифическое влияние трехмерной структуры ЭКМ на функции Т-клеток, была произведена оценка воздействия биологически неактивного матрикса - Algi Gel и показано, что эффект действия экстраклеточного матрикса на миграционную активность ЭГ Т-клеток осуществляется через активное взаимодействие компонентов ЭКМ с клетками, а не за счет его геометрии. Рестимуляция ЭГ Т-клеток в присутствии ЭКМ ведет к снижению пролиферативной активности клеток. Присутствие в инкубационной среде гиалуронана снижает интенсивность пролиферации активированных Т-клеток по сравнению с контрольными, но наиболее выраженный ингибирующий эффект на пролиферацию клеток обнаружен при рестимуляции ЭГ Т-клеток в присутствии Матригеля. В этом случае пролиферация, определенная по уровню встраивания 3H-тимидина, снижалась на 50% (Рис. 6). Несмотря на снижение пролиферативной активности энцефалитогенных Т-клеток при их стимуляции в присутствии ЭКМ, уровень их активации соответствовал таковому у клеток в контроле. Уровень маркеров активации OX40 и CD25 сохранялся примерно на одном уровне после стимуляции клеток в присутствии Матригеля, гиалуронана или без добавок. Более того, клетки, которые были рестимулированы в присутствии ЭКМ, экспрессировали klf2 на более высоком уровне по сравнению с клетками, которые были стимулированы без добавок (Рис. 6 Б).

Рисунок 6 - Интенсивность пролиферации - А и экспрессии KLF2 - (Б) в ЭГ Т-клетках, рестимулированных в присутствии экстраклеточного матрикса

А - Связывание 3H-тимидина (cpm) при рестимуляции клеток в присутствии высокомолекулярного (HA HMW) и низкомолекулярного (HA LMW) гиалуронана и матригеля (MG). В Уровень экспрессии KLF2 в ЭГ Т-клетках, растимулированных с высокомолекулярным гиалуронаном (HA) или матригелем (MG). *: p<0.05 по отношению к контролю.

В завершении был исследован энцефалитогенный потенциал ЭГ Т-клеток после рестимуляции в присутствии Матригеля или гиалуронана. Введение ЭГ Т-клеток, которые были рестимулированны с ЭКМ, вызывало развитие ЭАЭ, начиная с 4-х суток после их введения у животных всех исследованных групп. Тем не менее, животные, которым вводили ЭГ Т-клетки, рестимулированные с Матригелем, продемонстрировали развитие более тяжелых клинических симптомов (Рис. 7). Введение клеток, рестимулированных в присутствии гиалуронана, вызывало развитие заболевания, которое протекало тяжелее, чем у животных контрольной группы, но менее тяжело, чем у животных, которым вводили клетки, активированные в присутствии Матригеля.

Таким образом, компоненты экстраклеточного матрикса играют существенную роль в формировании фенотипа ЭГ Т-клеток, в частности в активации миграционной активности клеток, подавлении пролиферации без влияния на их способность к активации и усиление энцефалитогенных свойств лимфоцитов, сенсибилизированных в антигену ЦНС.

Рисунок 7 - Клинические симптомы, проявляющиеся при введении ЭГ Т-клеток, рестимулированных в присутствии экстраклеточного матрикса (Высокомолекулярного гиалуронана - HMW HA и матригеля - MG). *: p<0.05 по отношению к контролю

3.5 Энцефалитогенные Т-клетки в развитии апЭАЭ

В настоящее время, не вызывает сомнения, что ведущая роль в инициации воспаления в ЦНС при развитии РС и ЭАЭ принадлежит энцефалитогенным CD4 лимфоцитам. Тем не менее, их роль и функция на клиническом и восстановительном этапе до сих пор остаются невыясненными. Более того, согласно устоявшемуся предположению развитие аутоиммунного воспаления в ЦНС в модели ЭАЭ опосредовано наличием двух волн миграции ЭГ Т-клеток в ЦНС (Wekerle, Linington et al. 1986; Hickey, Hsu et al. 1991). Во время первой волны Т-клетки мигрируют в ЦНС непосредственно после введения, причем количество этих клеток крайне незначительно (десятки, сотни). Вторая, массивная, волна инфильтрации ЦНС ЭГ Т-клетками происходит на 3-4 день после их введения и сопровождается проявлением клинических симптомов. Незначительное количество клеток - «пионеров» (“Pioneers cells”), которые проникают в ЦНС с первой волной, имеют фенотип активированных Th1 клеток и синтезируют провоспалительные цитокины, независимо от присутствия эндогенных антигенов. Согласно предположению, именно клетки - «пионеры» создают необходимые условия для развития второй волны проникновения в ЦНС антиген специфических энцефалитогенных Т-клеток и неспециализированных клеток иммунной системы (Flugel, Odoardi et al. 2007). Тем не менее, данный сценарий развития апЭАЭ не имеет строгого подтверждения до сих пор, из-за крайне небольшого числа клеток - «пионеров», мигрирующих в ЦНС.

Использование системы индуцибельного самоубийства позволило исследовать роль энцефалитогенных клеток на разных стадиях развития апЭАЭ. Для этой цели была выбрана система индуцибельного клеточного самоубийства на основе тимидин киназы вируса простого герпеса первого типа (Herpes simplex virus 1 thymidine kinase - HSV-TK) и нетоксичного агента Ганцикловира (GCV).

Следует отметить, что механизм клеточной гибели в системе HSV-TK/GCV не до конца ясен, хотя существуют предположения, что апоптоз, наряду с неапоптотическими механизмами клеточной гибели, может быть вовлечен в этот процесс. Индукция гибели клеток, экспрессирующих HSV-TK после обработки GCV происходит, главным образом, вследствии блокирования репликации в процессе деления клеток, и, следовательно, должна иметь место в культуре активно делящихся, пролиферирующих клеток. Оказалось, что система индуцибельного клеточного самоубийства (СИКС) на основе HSV-TK/GCV эффективна для удаления как активно пролиферирующих, так и слабо пролиферирующих ТMBP-GFP TK+ клеток (Рис. 12).

Для того, чтобы исследовать роль энцефалитогенных клеток на разных стадиях развития апЭАЭ, использовали введение GCV в различные сроки. Инъекции GCV начинались со дня введения, через 48 или 84 часа после введения TMBP-GFPTK+ или TMBP-GFP лимфоцитов, что соответствовало преклинической и началу клинической стадии развития апЭАЭ. Каждый курс введения GCV имел продолжительность 4 суток. Длительность и тяжесть течения заболевания были значительно меньше у животных, получавших GCV, на преклинической стадии (начиная с момента и через 48 часов после введении ЭГ Т- клеток) по сравнению с контрольными крысами, которым вводили физиологический раствор (продолжительность заболевания: 2±1,4 и 3,25±0,35 по сравнению с 6±0,7 днями; суммарные клинические симптомы: 1,5±1,4 и 3,75±2,4 по сравнению с 14,1±1,28 для животных, получавших GCV начиная с момента введения и через 48 часов после введения по сравнению с контрольной группой соответственно) (Рис. 8; Таблица 1). Применение GCV с момента первого проявления клинических симптомов, через 84 часа после введения энцефалитогенных Т-клеток, не сказывалось на развитии заболевания (продолжительность заболевания: 4,7±0,7 и 6±0,7 дней; суммарные клинические симптомы: 12,74±0,36 и 14,1±1,28 для животных, получавших GCV или физиологический раствор соответственно) (Рис. 8; Таблица 1).

Таблица 1 - Проявления клинических симптомов при введении GCV

Тип клеток и курс введения GCV

Кл-во

крыс

Продолжительность Дни

Максимальные Кл. Симптомы

Суммарный клинический индекс

Максимальное изменение веса в граммах

Физ.р-р.

8

6?0.7

3.7?0.06

14.1?1.28

-40.5?1,4

GCV с 0 часов

8

2?1.41*

1?0.7*

1.5?1.4*

-28?4.24*

GCV с 48 часов

8

3.25?0.35*

2.58?0.11*#

3.75?2.4*

-35.5?1.7

GCV с 84 часов

8

4.7?0.7

3.65?0.2

12.74?0.36

-42.3?6.08

GCV (20мг/кг) вводили внутрибрюшинно в течение 4-х дней начиная с момента введения (0 ч) и через 48 (48 ч) или через 84 часа (84 ч) после введения ЭГ Т-клеток. Контрольным животным вводили физиологический раствор, начиная с момента введения клеток.

*: p<0.05; проявление симптомов при введении GCV по сравнению с их проявлением при введении физ-го р-ра. #:p?0.05 проявление симптомов при введении GCV с момента введения Т клеток по сравнению с их проявлением у животных, получавших GCV после 48 часов.

Рисунок 8 - GCV опосредованное удаление TMBP-GFPTK+ клеток на преклиническом этапе развития ЭАЭ эффективно снижает тяжесть течения заболевания

Клинические симптомы апЭАЭ, вызванного введением 5х106 TMBP-GFPTK+ клеток. GCV вводили ежедневно, начиная с момента инъекции Т клеток (0 ч), через 48 (48 ч) и через 84 часа (84 ч). *: p<0.05; проявление симптомов при введении GCV по сравнению с их проявлением при введении физ-го р-ра.

Следует отметить, что животные, получавшие GCV, начиная с преклинической стадии (со дня введения клеток и через 48 часов), демонстрировали схожую динамику снижения тяжести течения заболевания по сравнению с контрольными, тем не менее, тяжесть симптомов заболевания, различалась.

Рисунок 9 - Изменение количества TMBP-GFPTK+ клеток и уровня экспрессии цитокинов в органах крыс с апЭАЭ, вызванным введением TMBP-GFPTK+ клеток при различных курсах введения GCV

Ежедневные инъекции GCV начинали с 0, 48 или 84 часов после введения TMBP-GFPTK+ клеток. А - отношение количества TMBP-GFPTK+ клеток у животных после инъекции GCV к количеству TMBP-GFPTK+ клеток у животных, которым вводили физиологический раствор. В - Уровень экспрессии IFNг, IL-17 и рецептора IL-2 (IL-2R) мРНК, определенных методом количественной ПЦР в спинном мозге крыс на 4 ый день после введения TMBP-GFPTK+ клеток. *:p<0.05 по отношению к соответствующим показателям у контрольных животных (введение физиологического раствора).

Исследовано соотношение особенностей проявления клинических симптомов у животных, которым вводили GCV в различных вариантах с количеством энцефалитогенных клеток в спинном мозге, селезенке и в лимфатических узлах. TMBP-GFPTK+ клетки подсчитывали в различных органах посредством флуоресцентной цитометрии на 4-й день у животных, получавших GCV в преклинической стадии (0 ч и 48 ч) и на 5-й день у животных, получавших GCV с 84 часов. Значительное уменьшение количества энцефалитогенных Т- клеток было обнаружено во всех органах и при всех курсах введения GCV (Рис. 9). У животных, получивших GCV c момента введения Т-клеток, TMBP-GFPTK+ клетки практически не обнаруживались во всех исследованных органах. При начале курса инъекций GCV через 48 часов после введения клеток примерно 80-90 % процентов инъецированных клеток были специфически удалены. Введение GCV с момента проявления клинических симптомов, то есть через 84 часа после введения клеток, вызывало 50 процентное уменьшение количества энцефалитогенных клеток в ЦНС и на 40% и 80% сокращалось количество клеток в селезенке и лимфоузлах, соответственно. Интересно отметить, что изменение количества энцефалитогенных клеток в исследованных органах было прямо пропорционально уровню экспрессии IFNг, IL-17 и IL-2R, определенному с помощью количественной ПЦР (Рис. 9 Б).


Подобные документы

  • Основное отличие деления здоровой и опухолевой клетки. Механизмы активации онкогена и инактивация генов-супрессоров. Опухолевый рост: определение, причины увеличения количества злокачественных заболеваний. Основная особенность малигнизированной клетки.

    реферат [14,1 K], добавлен 13.04.2009

  • Понятие грудной клетки. Коническая, цилиндрическая, плоская формы грудной клетки и их характеристика. Патологические формы грудной клетки. Порядок и методика проведения пальпации. Определение хода ребер и позвоночника, ширины межреберных промежутков.

    презентация [294,3 K], добавлен 21.05.2014

  • История изучения стволовых клеток, их типы и свойства. Стволовые клетки эмбрионов и взрослых организмов. Применение стволовых клеток в клинической практике: от регенерации поврежденных органов до лечения заболеваний, не поддающихся лекарственной терапии.

    презентация [1,3 M], добавлен 09.12.2013

  • Фазы жизненного цикла клетки. Общие механизмы повреждения клетки. Патогенез повреждения клеточных мембран. Стадии острого и хронического повреждения клетки. Специфические и неспецифические проявления повреждения. Виды гибели клетки. Некроз и апоптоз.

    лекция [12,4 M], добавлен 20.02.2013

  • Классификация аллергических реакций. Реагиновый механизм на поверхности мембран базофилов и тучных клеток. Реакции замедленного типа. Механизм воздействия попадающего в организм аллергена на сенсибилизированные лимфоциты с секрецией различных медиаторов.

    презентация [84,2 K], добавлен 24.05.2014

  • Основные проявления взаимодействия антиген — антитело. Иммунологический анализ антигенов и антител с помощью меченых реагентов. Сущность активности комплемента. Методы определения эффекторных клеток. Трансгенные животные и направленная доставка генов.

    реферат [20,3 K], добавлен 28.09.2009

  • Рассмотрение грудной клетки как одной из частей туловища. Ознакомление с нормальным строением грудины, ребер, позвоночника и мышц человека. Нормостеническая, астеническая и гиперстеническая типы грудной клетки. Изучение основных патологических форм.

    презентация [365,8 K], добавлен 24.04.2014

  • Строение грудной клетки и ее функции. Механизм дыхательных движений. Врожденные деформации грудной клетки у детей. Приминение индекса Гижицкой для определения степени деформации. Классификация воронкообразных деформаций грудной клетки и их коррекции.

    контрольная работа [1,7 M], добавлен 28.05.2009

  • Рецепторное взаимодействие вируса и клетки. Разработка методики нахождения кинетических параметров вирус-клеточного взаимодействия и определения эффективности ингибитора с применением флуоресцентной детекции. Применение построенной теоретической модели.

    дипломная работа [2,0 M], добавлен 22.04.2012

  • Различные по механизму повреждения грудной клетки. Нарушение функции грудной полости. Классификация повреждений грудной клетки. Основные клинические проявления посттравматического пневмоторакса. Сдавление и сотрясение грудной клетки, переломы ребер.

    презентация [1,6 M], добавлен 25.02.2015

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.