Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа

Курсовая работа

на тему:

Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа

Введение

Вирусы гриппа -- это содержащие однонитевую РНК оболочечные вирусы, вызывающие серьезные эпидемические заболевания человека и многих видов животных, в частности лошадей, свиней, тюленей и домашней птицы. Известны три типа данных вирусов, выделенные на основании различий между нуклеокапсидами в реакции связывания комплемента; они отличаются также по биохимическим и биологическим свойствам. Вирусы типа А, способные к быстрым и резким изменениям антигенных свойств, являются главной причиной пандемий гриппа человека; поэтому они исследованы наиболее подробно. Большинство методов выращивания, очистки и титрования вирусов гриппа разработаны именно для вирусов этого типа. Вирусы типа В, хотя и не способны к антигенному дрейфу, по всем остальным биохимическим и биологическим свойствам очень близки к вирусам типа А; поэтому их, как правило, можно выращивать и титровать, пользуясь теми же методами. С другой стороны, вирусы типа С по своим биохимическим свойствам весьма далеки от вирусов типов А и В; соответственно они имеют и другие ростовые свойства.

1. Системы для размножения вирусов гриппа

1.1. Куриные эмбрионы

Куриные эмбрионы -- очень дешевая и удобная система культивирования вирусов гриппа. В эмбрионах в той или иной степени размножаются почти все штаммы вирусов как человеческого, так и животного происхождения. Наилучшим образом адаптированные к этой системе лабораторные штаммы дают в эмбрионах достаточно высокие титры, или 10--10 БОЕ на 1 эмбрион). Кроме того, эмбрион изолирован от внешней среды, и поэтому для размножения в нем вируса не нужно создавать специальные стерильные условия.

Вирус обычно вводят в заполненную жидкостью аллантоисную полость яйца, откуда он может проникнуть в хорионаллантоисную оболочку и заразить образующие ее клетки. Вирусное потомство выходит в аллантоисную жидкость и может быть легко извлечено из яйца путем отсасывания этой жидкости. Некоторые штаммы, в частности новые природные изоляты, а также вирусы типа С плохо размножаются на хорио-каллантоисной оболочке, но размножаются при введении непосредственно в амниотическую полость; при этом вирус получает доступ к разнообразным тканям эмбриона, и образующееся потомство выходит в амниотическую жидкость, которую можно извлечь отдельно.

Вирус лучше всего размножается в 10--12-дневных эмбрионах. Следует закупать свежие оплодотворенные яйца и инкубировать их нужное время в лаборатории. Для этого не обязательно иметь специальное оборудование, однако инкубатор очень удобен. Тем не менее яйца можно успешно инкубировать и в обычном термостате во влажной атмосфере при 37 °С, если их регулярно переворачивать. Сортность яиц не имеет особого значения, но в отдельных случаях важно исключить возможность заражения яйца другими микроорганизмами; некоторые поставщики продают специальные незараженные яйца.

Перед заражением следует убедиться в том, что яйца действительно оплодотворены. Для этого достаточно рассмотреть яйцо вблизи яркого источника света в темной комнате. Через 4--5 дней после оплодотворения эмбрион должен быть ясно виден.

При стандартном пассировании лабораторных штаммов вирусный инокулят обычно представляет собой образец инфицированной аллантоисной или культуральной жидкости. Как правило, образцы перед использованием разводят солевым раствором Хэнкса до концентрации вируса 10--10 БОЕ/мл, поскольку введение в яйцо большого количества вируса способствует образованию ДИЧ. Если перед заражением разведенный вирус приходится хранить, то в раствор для разведения следует ввести желатин. Естественно, необходимо обеспечить стерильность вируса, используемого для заражения; в тех случаях, когда это затруднительно, к инокуляту добавляют антибиотик гентамицин.

Данные методы предполагают использование гомогенизации для измельчения образцов, низкоскоростного центрифугирования для их осветления и введение неразведенного супернатанта в амниотическую полость.

Заражение эмбрионов.

I. Введение вируса в аллантоисную полость

1. Яйца кладут на бок и протирают сверху спиртом для стерилизации участка вокруг точки заражения.

2. В скорлупе проделывают небольшое отверстие с помощью зубоврачебного сверла, снабженного режущим диском. Отверстие должно быть достаточно глубоким, чтобы в него можно было ввести иглу для инъекций, но желательно не повреждать внутреннюю мембрану скорлупы.

3. С помощью шприца с иглой № 25 в аллантоисную полость инокулируют 0,1 мл вируса, вводя при этом иглу непосредственно под скорлупу.

4. Отверстие в скорлупе запечатывают небольшим количеством расплавленного воска.

5. Зараженные яйца инкубируют в термостате во влажной атмосфере острым концом вниз. Во время инкубации нет необходимости переворачивать яйца.

II. Введение вируса в амниотическую полость

1. Тупой конец яйца стерилизуют, протирая спиртом, и проделывают небольшое отверстие, как показано на схеме.

2. Яйцо располагают вблизи яркого источника света в темной комнате так, чтобы был виден эмбрион.

3. Иглу № 23 длиной 4 см вводят в проделанное отверстие, а затем резким движением в направлении эмбриона -- в амниотическую полость. При этом вносят 0,1 мл вируса и осторожно извлекают иглу.

4. Отверстие в скорлупе запечатывают расплавленным воском и инкубируют яйца, как указано выше.

Время инкубации.

Оптимальное время инкубации, необходимое для получения максимального выхода вируса, зависит от конкретного штамма и должно быть определено экспериментально. Для некоторых штаммов вируса гриппа А, например вируса чумы птиц, максимальный выход достигается через 24--26 ч, в то же время большинство штаммов вируса гриппа А человека, а также вирусы типов В и С требуют 48--72 ч инкубации.

Сбор вируса.

Прежде чем пытаться извлечь из яйца вируссодержащую жидкость, рекомендуется охладить яйцо в течение 4--18 ч при 4°С или в течение 30 мин при --20 °С. При охлаждении эмбрион погибает, а окружающие его кровеносные сосуды сужаются. Таким образом, значительно уменьшается возможность контаминации вируссодержащей жидкости эритроцитами, которые могут связать часть вируса и тем самым уменьшить его выход. Если контаминации эритроцитами избежать все же не удается, потери вируса можно свести к минимуму, инкубируя материал 30 мин при 37 °С. В этих условиях вирионная нейраминидаза разрушает рецепторы эритроцитов, с которыми связывается вирус, и он освобождается.

I. Сбор аллантоисной жидкости

1. Яйца помещают на подставку тупым концом вверх и стерилизуют их поверхность спиртом.

2. Тупой конец яйца вскрывают, пользуясь при этом либо стерильным пинцетом, либо специальным приспособлением. Скорлупу вокруг воздушного мешка удаляют, открывая доступ к аллантоисной полости.

3. С помощью стерильного пинцета с тупыми концами разрывают хорионаллантоисную мембрану и отодвигают ее к краю яйца.

4. Эмбрион и желточный мешок осторожно отодвигают пинцетом и отсасывают аллантоисную жидкость пипеткой с широким концом. Из яйца среднего размера получают 7--10 мл бледно-желтой жидкости. Примесь желтка в аллантоисной жидкости мешает дальнейшей очистке вируса, поэтому при ее отборе следует избегать повреждения желточного мешка. Если вирус предназначен для биохимических исследований, например для анализа активности вирионных ферментов, аллантоисную жидкость следует собирать при 0 °С.

5. Аллантоисную жидкость осветляют центрифугированием 10 мин при 10 000 g и хранят супернатант при 4 или --70 °С.

II. Сбор амниотической жидкости

1. Поверхность яйца стерилизуют и вскрывают тупой конец, как описано выше. Удаляют возможно большую часть^ скорлупы, чтобы легко было извлечь содержимое яйца.

2. Хорионаллантоисную мембрану разрывают и выливают содержимое яйца в стерильную чашку Петри. При этом амнио-тическая полость должна остаться неповрежденной.

3. С помощью шприца с иглой № 25 из амниотической полости по возможности более полно извлекают содержимое.

4. Амниотическую жидкость осветляют и хранят так же, как и аллантоисную жидкость.

Ожидаемый выход.

Интенсивность размножения вируса в эмбрионах зависит от конкретного штамма. Дикие штаммы первоначально дают очень низкие титры, но после нескольких пассажей на эмбрионах титр значительно возрастает. Для разных лабораторных штаммов, адаптированных к размножению на эмбрионах, выход также существенно варьирует, но в большинстве случаев в аллантоисной жидкости накапливается 2000--5000, а иногда и до 20 000 ГАЕ/мл вируса. Очевидно, что адаптация к размножению в эмбрионах связана с селекцией генетических вариантов, поэтому следует иметь в виду, что результаты детального генетического и биохимического исследования штаммов, пассированных на эмбрионах, не обязательно характеризуют исходный изолят.

1.2 Наращивание вирусов в культурах клеток

Хотя для наращивания вирусов гриппа в больших масштабах обычно используют куриные эмбрионы, для детального генетического анализа вируса необходимо размножать вирус в культуре клеток. Наиболее распространенная и надежная система для размножения вирусов гриппа -- монослойная первичная культура фибробластов куриного эмбриона, однако используют и первичные культуры клеток почек обезьян, крупного рогатого скота и собак. Хотя к инфекции чувствительны очень многие клеточные культуры, большинство их не поддерживают размножение вируса. В некоторых типах клеток проходит только неполный цикл репродукций, при котором не формируются вирионы. В других клетках вирионы образуются и высвобождаются в среду, но не обладают инфекционностью.

Один из известных факторов, обуславливающих инфекционность вирионов вируса гриппа, -- это протеолитическое расщепление гемагглютинина. Расположенные на поверхности вириона молекулы гемагглютинина расщепляются эндогенными клеточными протеазами на молекулы меньшего размера, ГА1 и ГА2. В некоторых типах клеток, не имеющих соответствующей протеазы, продуктивное размножение вируса гриппа и образование бляшек могут быть индуцированы включением в агаровое покрытие трипсина. Разные штаммы вирусов гриппа отличаются друг от друга по чувствительности к действию протеаз, причем недавние исследования показали, что чувствительность к расщеплению определяется первичной структурой белка в районе соединения ГА1--ГА2. Аминокислотная последовательность в сайте расщепления молекулы ГА очень сходна с таковой в сайте расщепления белка F вируса Сендай, и было высказано предположение о том, что механизмы функционирования этих белков, обеспечивающие проникновение вирусов в клетку, аналогичны. Хотя расщепление ГА необходимо для проявления инфекционности, это не единственный фактор, определяющий патогенность вирусов гриппа. По-видимому, данное свойство контролируется несколькими вирусными генами.

Методы культивирования вируса.

Для культивирования вирусов удобно использовать монослойные культуры клеток, выращиваемые в пластиковых чашках или флаконах; лучшие результаты получают при заражении плотного монослоя.

Сыворотка крови, входящая в состав культуральных сред, содержит вещества, снижающие инфекционность вируса.

Поэтому перед внесением инокулята вируса, который обычно представляет собой аллантоисную жидкость, разведенную PBS для обеспечения необходимой множественности инфекции, с монослоя сливают среду и промывают его PBS. Адсорбцию вируса на монослое проводят при комнатной температуре в течение 30--60 мин; в этих условиях вирус связывается с клетками, но размножение не начинается. Несвязавшийся вирус удаляют и заменяют культуральной средой с пониженным содержанием сыворотки.

В тех случаях, когда особенно важно удалить весь несвязавшийся с клетками вирус, например для определения эффективности размножения, монослой следует обработать противовирусными антителами.

В этом случае монослой после удаления инокулята 3 раза промывают теплым PBS, добавляют свежую среду и инкубируют 60 мин при соответствующей температуре. Затем среду заменяют на 2 мл PBS, содержащего вирусную антисыворотку. Через 15 мин монослой опять трижды промывают теплым PBS, добавляют свежую культуральную среду и инкубируют клетки при требуемой температуре.

В тех случаях, когда для репродукции вируса необходим трипсин, его обычно добавляют в среду до конечной концентрации 10 мкг/мл. В этом случае подходит трипсин, используемый при пассировании клеток.

Трипсин следует хранить замороженным в виде концентрированного раствора и разводить непосредственно перед использованием. Важно контролировать каждый препарат трипсина на незараженной культуре клеток, поскольку его активность может варьировать от партии к партии. Типичное для вирусов гриппа ЦПД -- это округление зараженных клеток с последующим отделением их от субстрата; то же самое происходит с незараженными клетками при слишком высокой концентрации трипсина.

Скорость размножения вируса в культуре клеток, естественно, зависит от конкретного штамма вируса и типа клеток, но, как правило, при продуктивной инфекции выход вируса гриппа из клеток начинается через 4--6 ч после заражения и достигает максимума через 16--24 ч. Этот процесс легко контролировать титрованием гемагглютинирующей активности в образцах культуральной жидкости. Типичная кинетическая кривая размножения вируса приведена на рис. 2.

1.3 Органные культуры

Показано, что вирус гриппа размножается в органных культурах, тем не менее очевидно, что подобные системы более пригодны для экспериментальных целей, чем для наращивания вируса.

Следует отметить, что описано эффективное размножение вируса в тканях взрослых людей, таких как слизистая оболочка носа, конъюнктива, ткани матки и мочевого пузыря, а также в эмбриональных тканях, в частности в тканях трахеи, пищевода, кишечника, мочевого пузыря, конъюнктивы и легкого.

Для размножения вируса были использованы и разнообразные ткани животных, в частности ткани трахеи и кишечника птиц, а также ткани носовых выростов, матки, мочевого пузыря, яйцевода, пищевода, коъюнктивы, глотки и дыхательных путей хорька.

Органные культуры для размножения вирусов гриппа описаны в обзоре Свита и Смита.

2. Методы титрования вирусов

2.1 Титрование вирусов гриппа в реакции гемагглютинации

Как и многие другие вирусы животных, вирусы гриппа агглютинируют эритроциты. В основе агллютинации лежит взаимодействие гемагглютинина, одного из поверхностных вирусных белков, с рецепторами, расположенными на поверхности эритроцитов. Поскольку каждая вирусная частица содержит не одну молекулу гемагглютинина, образующего шиловидные выступы, при достаточно высокой концентрации вируса формируются крупные агрегаты эритроцитов со структурой типа сети.

Образование таких агрегатов легко наблюдать в лунке или пробирке с U-образным дном; в этом случае нормальные эритроциты образуют компактный осадок на дне пробирки, а агглютинированные оседают равномерно. Эта реакция исключительно удобна для количественного определения вируса.

Для постановки гемагглютинации определенное количество эритроцитов смешивают в лунках планшета с равным объемом исследуемой суспензии вируса в разных разведениях. Планшет затем инкубируют 30--45 мин при комнатной температуре без перемешивания. По результатам реакции можно определить, при каком разведении вирусного препарата утрачивается гемагглютинирующая активность. Количество вируса, агглютинирующее 50% эритроцитов, определяется как 1 гемагглютинирующая единица.

Таким образом, зная, какое разведение вируса соответствует одной ГАЕ, можно вычислить титр вируса в ГАЕ/мл. Значение ГАЕ зависит от условий анализа, в частности от объема реакционной смеси и концентрации эритроцитов; кроме того, постановка реакции в разных лабораториях может иметь свои особенности. Ниже приведена методика, постоянно используемая в лаборатории авторов.

ГАЕ -- удобная единица для сравнения разных препаратов вируса, однако она не определяет ни общего количества вируса в препарате, ни количества инфекционных частиц. Тем не менее для любого конкретного штамма вируса соотношение между ГАЕ и другими единицами измерения количества вируса может быть определено эмпирически; затем, если вирус не претерпел генетических изменений, титр в ГАЕ можно использовать для расчета других параметров. Для большинства лабораторных штаммов вируса гриппа выполняется следующее приблизительное соотношение:

1 ГАЕ = 2-10 единиц инфекционности для куриных эмбрионов =2 10 БОЕ = 10 физических единиц.

Подготовка эритроцитов.

В реакции можно использовать эритроциты различного происхождения, например человека или морской свинки, но чаще всего используют куриные эритроциты. 1%-ную суспензию готовят следующим образом.

1. Кровь фильтруют через два слоя муслина.

2. Фильтрат центрифугируют 5 мин в настольной центрифуге при 1500 об/мин.

3. Супернатант и верхний слой осадка, состоящий из лейкоцитов, удаляют с помощью пастеровской пипетки, присоединенной к водоструйному насосу. Клетки 3 раза промывают физиологическим раствором, суспензируя осадок и повторно осаждая эритроциты при 1500 об/мин.

4. Эритроциты ресуспендируют в физиологическом растворе и получают плотный осадок центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают, а осадок эритроцитов суспендируют в 100-кратном объеме физиологического раствора. Суспензию тщательно перемешивают и хранят при 4°С.

Постановка реакции.

1. В лунках планшета готовят последовательные двукратные разведения вирусной суспензии с неизвестным титром на физиологическом растворе; объем суспензии в каждой лунке должен быть равен 0,25 мл. В опыт включают также и контрольную лунку с физиологическим раствором.

2. 1%-ную суспензию эритроцитов интенсивно встряхивают и вносят в каждую лунку в количестве 0,25 мл. Смесь в лунках перемешивают, поворачивая планшет, и инкубируют планшет 45 мин без дальнейшего перемешивания на листе белой бумаги.

В предельном разведении, обладающем гемагглютинирующей активностью, наблюдается один из трех типов агглютинации, что можно использовать для приблизительного расчета титра вируса.

Более экономным методом определения титра является микровариант этой реакции, в котором используется по 0,05 мл суспензии вируса и эритроцитов; реакцию можно ставить в микропланшете для титрования. Следует, однако, иметь в виду, что в этом случае одна ГАЕ определяется как количество вируса в объеме 0,05 мл, агглютинирующее 50% эритроцитов в 0,05 мл 1%-ной суспензии.

Факторы, влияющие на результат реакции гемагглютинации.

Результаты реакции гемагглютинации могут искажаться лод действием ряда факторов.

1. Существенно, чтобы перед использованием кровь не хранилась слишком долго. Через 5--7 дней в ней начинается гемолиз, что делает исследование гемагглютинации сначала неточным, а затем вообще невозможным.

2. Поскольку при низкой концентрации эритроцитов получают завышенные значения титра вируса, суспензию эритроцитов перед использованием необходимо тщательно перемешать.

3. Учет результатов реакции не следует откладывать надолго. Помимо гемагглютинина на поверхности вирионов вируса гриппа локализован фермент нейраминидаза, отщепляющий *от олигосахаридов концевые остатки сиаловой кислоты. Поскольку гемагглютинин присоединяется к поверхности эритроцитов именно через остатки сиаловой кислоты, действие нейраминидазы нарушает связи между вирионами и клетками. Поэтому через некоторое время слой агглютинированных эритроцитов начинает разрушаться. Некоторые штаммы вируса гриппа имеют столь высокую нейраминидазную активность, что быстрое удаление клеточных рецепторов препятствует агглютинации при комнатной температуре. В этом случае рекомендуется ставить реакцию гемагглютинации при 4°С.

4. Результат реакции может быть искажен, если используемые планшеты недостаточно хорошо вымыты. Сразу же после окончания работы планшеты следует замочить на 1 ч в 4%-ном растворе NaOH, а затем тщательно промыть дистиллированной водой.

5. Вирусная суспензия может содержать вещества, специфически или неспецифически ингибирующие гемагглютинацию. Эта проблема особенно серьезна при титровании вируса в культуральной жидкости, поскольку входящая в состав питательных сред сыворотка крови содержит подобные ингибиторы. Многие из них могут быть инактивированы прогреванием сыворотки при 56 °С 30 мин; подробнее этот вопрос обсуждается в работе Хойла. В некоторых случаях, однако, возникает противоположная ситуация: некоторые препараты сывороток содержат факторы, вызывающие гемагглютинацию в отсутствие вируса. Поэтому необходимо одновременно с вирусом титровать образец среды от незараженных клеток.

6. Следует помнить, что и вирусы других семейств агглютинируют эритроциты и могут препятствовать проведению специфической реакции. Природу исследуемого вируса можно, разумеется, установить в реакции торможения гемагглютинации с использованием специфической антисыворотки против интересующего исследователя вируса.

Реакция торможения гемагтлютинации.

Способность вируса гриппа связывать и агглютинировать эритроциты можно использовать и для определения концентрации противовирусных антител в образцах сыворотки. Для этого проводят реакцию между последовательными разведениями сыворотки и известным количеством вируса, а затем добавляют суспензию эритроцитов; концентрацию антител определяют, исходя из последнего разведения сыворотки, еще способного тормозить гемагглютинацию.

1. Готовят последовательные двукратные разведения исследуемой сыворотки на физиологическом растворе. В зависимости от того, выполняется анализ в стандартных планшетах или в микропланшетах, объем каждого разведения должен составлять соответственно 0,25 или 0,05 мл.

2. В каждую лунку вносят по 4 ГАЕ стандартного вируса '. Антитела инкубируют с вирусом 30 мин при комнатной температуре.

3. В каждую лунку вносят нужное количество 1%-ной суспензии эритроцитов, перемешивают и продолжают инкубацию еще 30 мин.

4. Учитывают результаты и определяют концентрацию антител, исходя из последнего разведения сыворотки, еще способного тормозить гемагглютинацию.

Примечание. Следует включать в опыт соответствующие контроли, чтобы убедиться в правильности определения концентрации вируса, в том, что сыворотка сама по себе не вызывает гемагглютинации и что в отсутствие вируса эритроциты нормально оседают.

2.2 Титрование путем определения инфекционности для куриных эмбрионов

Количество инфекционного вируса в препарате можно определить по максимальному разведению, вызывающему инфекционный процесс в куриных эмбрионах. Минимальное количество вируса, заражающее 50% эмбрионов, называют единицей инфекционности для эмбрионов. Этот метод наиболее чувствителен и позволяет титровать небольшие количества инфекционного вируса, поскольку для многих штаммов 10 ЕИЭ₅о приблизительно соответствуют 1 БОЕ. По данным электронной микроскопии, 1 ЕИЭ₅₀ соответствует примерно 5--10 вирусным частицам.

Постановка титрования

1. Готовят последовательные 10-кратные разведения исследуемой суспензии вируса на растворе Хэнкса и вводят 0,1 мл каждого разведения в аллантоисную полость нескольких 11-дневных куриных эмбрионов. Количество эмбрионов, используемых для заражения каждым разведением, определяется требуемой точностью титрования, но, как правило, составляет не менее 10. Эмбрионы инкубируют в течение необходимого для размножения вируса времени.

2. Из каждого яйца отбирают аллантоисную жидкость и проводят реакцию гемагглютинации. При этом нет необходимости для каждого образца аллантоисной жидкости готовить последовательные разведения. В этом случае достаточно определить, размножался ли вирус в данном эмбрионе или нет. Для этого 25 мкл исследуемого образца разводят в 0,25 мл физиологического раствора в лунке планшета или в пробирке и добавляют 0,25 мл суспензии эритроцитов.

Расчет титра вируса

Имеется много способов расчета титра вируса в ЕИЭ50. Один из самых удобных методов описан Томпсоном. В примере, приведенном в табл. 1, по 0,1 мл каждого из последовательных 10-кратных разведений вируса вводили в 10 эмбрионов. Для каждого разведения в реакции гемагглютинации определяли количество эмбрионов, в которых размножался вирус, и вычисляли долю, которую они составляли от общего числа зараженных эмбрионов. Для каждого разведения рассчитывали «среднюю удельную инфекционность», представляющую собой среднее арифметическое удельной инфекционности данного и двух соседних разведений. Как правило, «подвижные средние» значения инфекционности образуют монотонно возрастающий ряд. Полученные средние значения используются для расчета дозы вируса со средней удельной инфекционно-стью 0,5. По определению эта доза содержит 1 ЕИЭ50. Точность результатов, полученных этим методом, можно оценить с помощью статистического анализа, описанного Томпсоном.

Таблица 1. Расчет титра вируса)

Разведение	Доза	log	Количество зараженных эмбрионов	«Удельная инфекциои-ность»	«Средняя удельная инфекционное™^
	Y-10-	--11+logY	0/10	0
ю-»	Y.10-	--10+logY	0/10	0	0,33
Ю-	Y-10-	-9 + logY	1/10	0,1	0,266
ю-	Y-10-	-8+logY	7/10	0,7	0,600
ю-	Y-10-	-7 + IogY	10/10	1.0	0,900
Ю-	Y-10-	-6+logY *	10/10	1,0

0,600-0,266 ⁼ 0,334 ⁼ ' я далее

--9+log Y+0,7--8,3+log Y-1 ЕИЭ50. Отсюда logY=8,3; Y-1,9910".

2.3 Титрование вирусов с использованием фрагментов эмбрионов

Использование фрагментов эмбрионов, т. е. кусочков скорлупы 11-дневных оплодотворенных яиц с присоединенной к ним хорионаллантоисной оболочкой, вместо целых эмбрионов лежит в основе весьма экономичного способа определения инфекционное™ препаратов, содержащих вирус гриппа. Данный метод, предложенный для титрования вируса гриппа еще до введения в практику культур клеток, и теперь весьма полезен для титрования штаммов вирусов, не размножающихся в культуре клеток или при отсутствии подходящей культуры.

Использование фрагментов хорионаллантоисной оболочки вместе со скорлупой существенно, поскольку скорлупа помогает сохранить ткань неповрежденной и действует как мощная буферная система, поддерживающая рН 7,5.

Получение фрагментов эмбрионов

1. Острые концы оплодотворенных 11-дневных яиц вскрывают ножницами и извлекают эмбрион. Если вместе с эмбрионом извлекается хорионаллантоисная оболочка, такое яйцо следует отбросить.

2. Скорлупу с оболочкой 2 раза промывают стандартной средой, и нарезают на продольные полоски шириной около 0,6 см. Эти полоски в свою очередь разрезают на квадратные кусочки.

3. Кусочки скорлупы хранят в чашках Петри со стандартной средой, Из каждого яйца можно получить до 100 квадратных кусочков площадью 6 мм.

Заражение фрагментов эмбрионов

1. Титрование можно проводить в небольших реакционных пробирках или, что более удобно, в планшетах для гемагглютинации.

2. Планшеты стерилизуют 95%-ным этанолом. Избыток этанола удаляют и заворачивают каждый планшет отдельно в стерильную бумагу. Планшеты выдерживают в термостате в течение ночи для полного испарения этанола. После этого планшеты готовы к использованию.

3. Фрагменты эмбрионов помещают в планшеты и добавляют в каждую лунку по 0,3 мл стандартной культуральной среды. Инкубация фрагментов эмбрионов при комнатной температуре в течение нескольких часов или при 37°С в течение 24 ч при перемешивании не влияет на последующее размножение вируса.

4. Готовят последовательные 10-кратные разведения исследуемого вируса и вносят в лунки по 0,025 мл каждого разведения.

Инкубация образцов

1. При исследовании большого числа вирусных образцов планшеты ставят стопкой один на другой, сделав между ними прокладки толщиной 0,3 см, для обеспечения эффективной аэрации.

2. Стопку планшетов помещают на подходящую подставку и окружают влажной ватой.

3. Всю конструкцию фиксируют клейкой пленкой или алюминиевой фольгой, помещают в термальную комнату и интенсивно встряхивают 2--3 сут в зависимости от исследуемого штамма вируса. Рекомендуется использовать горизонтальный шейкер. Интенсивное встряхивание позволяет избежать накопления токсичных метаболитов и обеспечить эффективную аэрацию клеток.

Учет результатов

По окончании инкубации из лунок планшета пинцетом с тонкими концами удаляют фрагменты эмбрионов и вносят в каждую лунку по 0,25 мл стандартной 1%-ной суспензии эритроцитов. Планшеты быстро встряхивают и оставляют на 30 мин на белом фоне. Гемагглютинация свидетельствует о размножении вируса. Титр вируса определяют так же, как и при использовании целых эмбрионов.

Приготовление стандартной среды

Готовят следующие навески: NaCl --8,0 г КС1 -- 0,6 г СаСЬ --0,8 г MgCl₂ -- 0,05 г Глюкоза -- 0,3 г

Желатин --2,0 г

Хлорамфеникол -- 0,1 г К навескам добавляют нейтральный красный и воду -- до 1 л. рН доводят приблизительно до 7,0, добавляя несколько капель 1 Н NaOH. Нейтральный красный действует как индикатор; при рН 7,0 раствор должен иметь желто-оранжевую окраску. Раствор стерилизуют автоклавированием 30 мин при 115°С.

2.4 Титрование вирусов гриппа методом бляшек

При работе данным методом последовательные 10-кратные разведения вируса готовят на PBS, содержащем 0,5% желатина. Культуру для титрования можно выращивать в любом культуральном сосуде подходящего объема, но удобнее всего использовать шестилуночные планшеты. Это позволяет провести все титрование в одном термостате и избежать ошибок из-за неправильной нумерации чашек. В тех случаях, когда необходимо строго контролировать температуру, например в опытах с температурно-чувствительными мутантами при неразрешающей температуре, планшеты можно соединить в стопку, запечатать в пластиковом мешке и поместить в термостатированную водяную баню. При этом резко снижается вероятность искажения результатов из-за падения температуры при открывании дверцы термостата.

Заражение монослойных культур

Существенно, чтобы перед началом титрования монослой клеток был плотным.

1. С культуры сливают среду и промывают монослой теплым PBS для удаления остатков сыворотки. Чтобы полностью покрыть монослой в чашке диаметром 4--5 см, вирус вносят в объеме 0,2 мл.

2. Вирус, начиная с максимального разведения, наносят в центр чашки по каплям и распределяют по поверхности монослоя. Если вирус наносят на периферию чашки, силы поверхностного натяжения не дают ему распределиться по поверхности, и образующиеся бляшки скапливаются на периферии.

3. Адсорбцию вируса проводят 30 мин при комнатной температуре. Полезно один или два раза во время адсорбции покачать чашки, чтобы обеспечить равномерное распределение вируса по монослою.

Нанесение покрытия

По окончании адсорбции вирус удаляют и наносят на монослой 2 мл покрытия, состоящего из культуральной среды с 0,7--1,25% агара. Необходимо следить, чтобы температура покрытия при заливке не была слишком высокой, в противном случае клетки погибнут. Однако не менее важно, чтобы агар не был и слишком холодным и не застыл в пипетке. Для клеток ФЭК оптимальная температура покрытия составляет 45 °С. Для приготовления покрытия смешивают равные объемы двукратного концентрата среды, нагретого до 45 °С, и двукратного концентрата агара, охлажденного до 60 °С. Готовое покрытие охлаждают до 45 °С.

Для быстрого плавления агара очень удобно использовать микроволновую печь. Важно избегать образования пузырей, поскольку они могут исказить конечные результаты, имитируя бляшки или, наоборот, маскируя их. Если титрование проводят на клетках, менее устойчивых к высокой температуре, чем ФЭК, вместо агара рекомендуется использовать агарозу с низкой температурой гелеобразования, застывающую при температуре ниже 37 °С. Можно использовать в качестве покрытия и среду с карбоксиметилцеллюлозой. При этом нет необходимости строго выдерживать температурный интервал, как при работе с агаром, однако использование КМЦ может приводить к искажению формы бляшек, если во время титрования чашки сдвигаются или наклоняются.

Окрашивание бляшек

Обычно через 2--3 дня после заражения бляшки достигают такого размера, что их можно обнаружить при окрашивании. Если инкубацию клеток проводят под агаровым покрытием, для окрашивания можно использовать нейтральный красный.

1. Содержащую агар среду для покрытия готовят, как описано выше, и добавляют нейтральный красный до конечной концентрации 0,1%.

2. На каждую чашку диаметром 4 см наносят 2 мл этой среды, как описано выше.

3. Чашки вновь помещают в термостат на 3--4 ч; за это время бляшки становятся видимыми.

Если нет возможности подсчитать бляшки сразу же после окрашивания, следует иметь в виду, что они остаются видимыми по крайней мере в течение 48 ч, причем их размер не увеличивается при помещении в герметически закрытый контейнер в атмосфере 5%-ного СОг при 4°С. Если необходимо получить более стабильный препарат, применяют альтернативный метод окрашивания. В этом случае агаровое покрытие удаляют и фиксируют клеточный монослой буфером с формальдегидом.

3. Очистка вирусов гриппа

Разработаны многочисленные методы очистки вирусов гриппа из аллантоисной жидкости или из культуральной среды. Выбор конкретного метода определяется требуемой степенью чистоты.

Чистоту полученного вируса можно установить с помощью электрофореза вирионных белков в полиакриламидном геле, но, как и в случае всех оболочечных вирусов, почкующихся через плазматическую мембрану, даже при самой тщательной очистке невозможно избежать контаминации вируса клеточными белками. Кроме того, вирус может быть плеоморфным, что осложняет его очистку центрифугированием в градиентах плотности.

Тем не менее при работе с вирусами, дающими высокий титр в культуре клеток или куриных эмбрионах, удается получить препараты, степень контаминации которых клеточными белками незначительна.

На первой стадии очистки из содержащей вирус аллантоисной жидкости или культуральной среды удаляют клеточный дебрис с помощью низкоскоростного центрифугирования. Все стадии следует проводить при 0°С, чтобы свести к минимуму потери инфекционное™ и протеолиз вирионных белков.

3.1 Концентрирование вируса

Поскольку вирус гриппа обычно содержится в большом объеме аллантоисной жидкости или культуральной среды, перед очисткой его необходимо сконцентрировать.

Существуют различные методы концентрирования вирусов, и выбор одного из них определяется оснащенностью лаборатории.

Центрифугирование.

Поскольку обычно работа ведется с большими объемами жидкости, для ультрацентрифугирования необходимо иметь роторы большой емкости. Существуют роторы емкостью 1--2 л, в которых можно осадить вирус гриппа при 50 000 g в течение 90 мин; при работе с небольшими объемами радиоактивно меченного вируса время центрифугирования можно сократить до 30 мин и проводить осаждение в роторе меньшей емкости при 200 000 g. Супернатант по возможности полностью удаляют и ресуспендируют осадок вируса в малом объеме буфера NTE с помощью шприца и иглы с широким просветом. Для разрушения вирусных агрегатов полученную супензию пропускают несколько раз через тонкую иглу или обрабатывают ультразвуком 1 мин. Объем NTE, в котором ресуспендируют осадок вируса, зависит от величины осадка и от того, какой объем можно использовать на последующих стадиях очистки. Обычно осадок из 1--2 л содержащей вирус жидкости ресуспендируют в 2--5 мл NTE.

Осаждение полиэтиленгликолем.

Осаждение ПЭГ широко используется для получения вируса из аллантоисной жидкости и культуральной среды при отсутствии подходящего ротора для ультрацентрифугирования. Сухой ПЭГ 6000 добавляют к содержащей вирус жидкости до конечной концентрации 8% и перемешивают суспензию 1 ч при 0° или 4°С. Затем вирус осаждают центрифугированием 20 мин при 10 000 g и ресуспендируют в небольшом объеме NTE. Ресуспендирование осадка при этом затруднено, поскольку он представляет собой желеобразную массу. Наиболее удобно ресуспендировать осадок в гомогенизаторе, а затем либо обработать ультразвуком, либо пропустить через тонкую иглу. Перед дальнейшей очисткой любые крупные частицы, которые не удается ресуспендировать, следует удалить центрифугированием при 10 ООО g в течение 10 мин.

Механическое концентрирование.

В продаже имеются разнообразные приспособления для концентрирования, позволяющие быстро уменьшить объем содержащей вирус жидкости с 1--2 л до 50--100 мл. Использование таких приспособлений выгодно, поскольку при этом не возникает проблем, связанных с ресуспендированием вирусного осадка. Однако получаемые при этом конечные объемы все же велики для дальнейшей очистки некоторыми из рассматриваемых ниже методов.

Адсорбция на эритроцитах

В основе этого исключительно простого и быстрого метода концентрирования вируса гриппа лежит его способность связываться с поверхностью эритроцитов, что можно использовать как одностадийный метод очистки вируса.

3.2 Методы очистки вирусов гриппа

Ниже приведено несколько методов очистки вируса после концентрирования. Выбор метода определяется наличием соответствующего оборудования и необходимой степенью конечной очистки.

Осаждение на сахарозную подушку

Этот быстрый одностадийный метод используют при работе с малыми объемами содержащей вирус жидкости, например в случае радиоактивно меченного вируса. Его можно использовать и для предварительной очистки вируса, сконцентриро-ваванного из большого объема жидкости. Содержащую вирус жидкость, например культуральную среду, наносят на ступенчатый градиент, состоящий из 5 мл 15%-ного раствора сахарозы в NTE и 5 мл 60%-ного раствора сахарозы. Градиент центрифугируют 30 мин при 200 000 g. Вирус собирается в интерфазе между двумя слоями раствора сахарозы. Интерфазу извлекают, разводят NTE в 4 раза и затем осаждают вирус.

Хроматография на микропористом стекле

Данный метод позволяет быстро очистить вирус гриппа после концентрирования.

1. Колонку подходящих размеров заполняют стеклянными шариками с фиксированным размером пор. Средний диаметр пор 72,9 нм, а размер частиц 125--177 мкм. При хроматографии на таком стекле частицы размером более 70 нм элюируются в свободном объеме; таким образом достигается эффективное отделение вирусных частиц от клеточных контаминантов меньшего размера. Для хорошего разделения при объеме образца 5 мл необходимо использовать колонку диаметром 0,9 см и высотой по крайней мере 100 см. Для разделения образцов больших объемов используют колонки размером 2,5ХЮ0см.

2. Перед заполнением колонки стекло 3 раза промывают дистиллированной водой и 2 раза буфером для хроматографии. Чтобы обеспечить равномерное заполнение колонки, при ее набивке следует непрерывно перемешивать слой стекла. Удобно поместить штатив с колонкой на круговой шейкер и заполнять ее через широкую воронку.

3. Для набивки колонки ее на /s объема заполняют NTE и удаляют пузырьки воздуха. Затем открывают выходной вентиль колонки и медленно через воронку заполняют ее суспензией стеклянных шариков. После заполнения выходной вентиль закрывают и дают стеклу осесть при вращении кругового шейкера, на котором расположена колонка. После оседания стекла колонку переносят в холодную комнату и уравновешивают NTE.

4. При хроматографии раствор пропускают через колонку с помощью перистальтического насоса. Скорость тока жидкости составляет 1--5 мл/мин в зависимости от размеров колонки.

5. Элюцию вируса контролируют с помощью спектрофотометра с проточной кюветой.

6. Собирают фракции объемом 2--10 мл в зависимости от размеров колонки. Вирус элюируется в свободном объеме и легко может быть идентифицирован по гемагглютинирующей активности. Вирус должен давать острый пик, хорошо отделенный от клеточных контаминантов. Вирус разводят в нужном объеме NTE и концентрируют центрифугированием; выход гемагглютинирующей активности в осадке при этом составляет 70--90%.

Заполненную стеклом колонку можно использовать неоднократно, каждый раз после хроматографии промывая ее NTE. После нескольких циклов очистки вируса стекло извлекают из колонки и перед дальнейшим использованием промывают кислотой.

Очистка вируса центрифугированием в градиенте плотности

При очистке этим методом сконцентрированный вирус сначала подвергают зональному центрифугированию в 15-- 60%-ном градиенте концентрации сахарозы в NTE.

1. В зависимости от объема вирусного препарата используют градиенты объемом 10 или 30 мл.

2. Градиенты центрифугируют 1 ч при 110 000 g и 4°С. Если количество вируса велико, его можно обнаружить визуально как белую диффузную зону, расположенную примерно посередине градиента.

3. Зону вируса извлекают из градиента с помощью иглы для инъекций, имеющей загнутый под прямым углом конец. Если количество вируса невелико, вирусную зону можно локализовать, освещая пробирку сверху на черном фоне. В этом случае положение зоны вируса отмечают снаружи на стенке пробирки, а затем, уже не освещая пробирку, отбирают эту зону градиента. Альтернативный подход состоит в том, что раскапывают весь градиент и затем определяют гемагглютинирующую активность в индивидуальных фракциях.

4. Дальнейшую очистку вируса проводят повторным центрифугированием в градиенте. Применяют либо зональное центрифугирование в 15--60%-ном градиенте концентрации сахарозы, либо, предпочтительно, изопикническое центрифугирование в 20--45%-ном градиенте плотности тартрата калия.

5. Перед вторым центрифугированием в градиенте плотности тартрата калия вирус либо разводят в равном объеме NTE, либо предварительно переосаждают центрифугированием 30 мин при 200 000 g и 4 °С и затем уже разводят в небольшом объеме NTE.

6. Градиенты тартрата калия центрифугируют по крайней мере 5 ч при 100 000 g; как правило, наиболее удобно проводить центрифугирование в течение ночи.

7. Зону вируса извлекают из градиента, как описано выше, разводят в 6 раз и осаждают вирус центрифугированием 30 мик при 100 000 g и 4°С.

8. Осадок вируса суспендируют в буферном растворе, используемом для хранения препаратов.

Адсорбция вируса на эритроцитах

Вирус можно сконцентрировать из осветленной аллантоисной жидкости или культуральной среды, добавляя формалинизированные эритроциты до конечной концентрации 5%. Суспензию, содержащую эритроциты и вирус, инкубируют 1 ч при 4 °С при осторожном перемешивании. После этого эритроциты с адсорбированным на них вирусом осаждают центрифугированием 10 мин при 2000 g и 2 раза промывают осадок охлажденным до 0°С физиологическим раствором. Эффективность адсорбции можно проконтролировать в реакции гемагглютинации с содержащей вирус жидкостью до и после адсорбции на эритроцитах. Если эффективность адсорбции ниже 90%, процедуру можно повторить с новой порцией эритроцитов. Адсорбированный вирус элюируют с эритроцитов, перемешивая суспензию в 10 мл физиологического раствора 30 мин при 37 °С. Затем эритроциты удаляют центрифугированием 10 мин при 2000 g и собирают супернатант, содержащий вирус. Эффективность элюции зависит от активности вирусной нейраминидазы, отщепляющей остатки сиаловой кислоты от клеточных рецепторов, что приводит к высвобождению вируса. Супернатант разводят NTE по крайней мере в 6 раз, вирус осаждают центрифугированием 30 мин при 200000 g и 4°С, а затем ресуспендируют в подходящем буфере для хранения.

Приготовление формалинизированных эритроцитов

1. Кровь фильтруют через 2 слоя муслина и осаждают клетки в настольной центрифуге 10 мин при 2000 об/мин.

2. Супернатант и состоящий из лейкоцитов верхний слой осадка отбрасывают, а осадок эритроцитов 3 раза промывают PBS в объеме, примерно равном исходному объему крови. По окончании промывки суспензию центрифугируют 20 мин, чтобы получить плотный осадок.

3. Осадок ресуспендируют в PBS из расчета 200 мл буферного раствора на 25 см осадка и переносят суспензию в большой мерный цилиндр.

4. 50 мл 38%-ного формальдегида, рН которого предварительно доведен до 5,5--6,0, заливают в диализную трубку и помещают последнюю в цилиндр с суспензией эритроцитов. Суспензию эритроцитов осторожно, избегая образования пены, перемешивают на магнитной мешалке 3 ч при комнатной температуре. При этом происходит медленная диффузия формалина в суспензию эритроцитов.

5. Через 3 ч в диализной трубке проделывают отверстие, чтобы формалин смешался с суспензией эритроцитов, и продолжают перемешивание еще 12 ч.

6. Клеточную суспензию фильтруют через муслин, 5 раз промывают осадок PBS. Для суспендирования клеток следует использовать стеклянную палочку.

7. Осадок эритроцитов ресуспендируют в равном объеме 0,2 М трис-глицинового буфера и инкубируют суспензию 2 ч при 37 °С, затем добавляют сухой боргидрид натрия до концентрации 1 мМ.

8. Клетки осаждают при 2000 об/мин и по крайней мере дважды промывают PBS.

9. Эритроциты ресуспендируют в равном объеме PBS. Полученную 50%-ную суспензию эритроцитов хранят при 4°С, добавляя 0,01%-ный азид натрия. Такую суспензию можно хранить долгое время.

10. Перед использованием нужное количество эритроцитов отмывают трис-глициновым буферным раствором.

4. Определение активности вирионных ферментов

4.1 Вирионная транскриптаза

Геном вируса гриппа представлен РНК негативной полярности, т. е. для синтеза вирусных белков вирионная РНК должна транскрибироваться с образованием мРНК. Этот процесс осуществляется вирионной РНК-зависимой РНК-полимеразой. Вирионная РНК-полимераза способна in vitro транскрибировать геномную РНК с образованием мРНК нормального размера, синтез которых терминируется в нужной точке, и затем происходит их полиаденилирование. Активность фермента возрастает при внесении в реакционную смесь специфических динуклеоти-дов или кэпированных мРНК, например глобиновой, функционирующих как затравка при синтезе вирусных мРНК. При добавлении кэпированных мРНК к бесклеточной системе транскрипции наблюдается перенос 10--14 б'-концевых нуклео-тидов этих РНК вместе с кэпом на 5'-конец вирусных транс-криптов; этот механизм реализуется и при синтезе мРНК вируса гриппа в зараженной клетке.

Бесклеточная система транскрипции

Активность вирионной транскриптазы в составе очищенного вируса гриппа можно обнаружить, добавляя к вирионам подходящий буфер, рибонуклеозидтрифосфаты, двухвалентные катионы и детергент для пермеабилизации оболочки вириона. Стандартная реакционная смесь имеет следующий состав:

Трис-HCl, рН 8,2 -- 50 мМ

КС1 -- 150 мМ

MgCl₂ --8 мМ

Дитиотреитол -- 5 мМ

NP-40 --0,5%

АТР -- 2,0 мМ

GTP -- 0,2 мМ

СТР --0,4 мМ

-UTP --0,4 мМ

Очищенный вирус -- 0,5--1,0 мг/мл

1. Реакционную смесь готовят при 0°С, а затем инкубируют пробирки при 31°С.

2. Если используется затравка, ее преинкубируют 10 мин со всеми компонентами реакционной смеси, кроме MgCb; затем инициируют транскрипцию, добавляя MgCl₂.

3. Для исследования кинетики синтеза РНК из реакционной смеси через определенные промежутки времени отбирают аликвоты объемом 10 мкл и смешивают с 20 мкл 1н. хлорной кислоты, содержащей 0,125 М. пирофосфата натрия.

4. К пробам добавляют по 10 мкг ДНК тимуса теленка и инкубируют их 10 мин при 0°С.

5. Осадок РНК собирают на фильтры из стекловолокна и промывают их 0,88 М НС1 и 0,125 М пирофосфатом натрия, а затем этанолом и высушивают.

6. Радиоактивность определяют в толуоловом сцинтилляторе на жидкостном сцинтилляционном счетчике.

Скорость реакции зависит от исследуемого вируса, а также от того, включаются в состав реакционной смеси специфические динуклеотиды или кэпированная мРНК. Типичные кинетические кривые транскрипции в присутствии и в отсутствие затравки приведены на рис. 6.

4.2 Нейраминидаза

Вирионы вируса гриппа помимо гемагглютинина содержат фермент нейраминидазу. Молекулы нейраминидазы образуют на поверхности оболочки грибовидные выступы; каждый выступ представляет собой тетрамер полипептидных цепей. Фермент способен отщеплять от углеводных цепей гликопротеинов концевые остатки N-ацетилнейраминовой кислоты; по-видимому, его функция состоит в том, что он предотвращает агрегацию вирионов в процессе их морфогенеза и выхода из зараженной клетки. Активность нейраминидазы можно определить, инкубируя очищенные вирионы с соответствующим субстратом, например фетуином, который получают из ЭТС.

Определение активности нейраминидазы

1. Подготовка образца вируса. Лучше всего использовать очищенный вирус, однако следует иметь в виду, что глицерин и сахароза могут препятствовать определению активности нейраминидазы. Нейраминидаза некоторых штаммов вируса гриппа не активна в присутствии ионов Са+, в то время как нейраминидаза других штаммов, наоборот, требует присутствия этих ионов. Можно использовать вируссодержащую аллантоисную жидкость после удаления низкомолекулярных ингибиторов нейраминидазы с помощью диализа.

2. Для построения калибровочной кривой готовят ряд пробирок, содержащих от 5 до 40 мкг N-ацетилнейраминовой кислоты.

3. Готовят реакционную смесь в объеме 0,2 мл, содержащую» 0,1 мл исследуемого препарата и 0,1 мл фетуина в 0,2 М фосфатном буфере с рН 6,0. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 0,5--2 ч при 35 °С в зависимости от активности фермента. Температурные оптимумы для нейраминидаз разных штаммов также варьируют, поэтому следует подобрать оптимальную температуру для исследуемого фермента экспериментально.

4. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, добавляют 0,1 мл периодатного реагента, тщательно перемешивают и инкубируют 20 мин при комнатной температуре.