Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа

5. К смеси добавляют 1,0 мл арсенитного реагента и перемешивают до тех пор, пока выпавший в осадок иод не растворится вновь.

6. К смеси добавляют 2,5 мл тиобарбитуратного реагента, перемешивают и помещают на 15 мин в кипящую водяную баню. При этом смесь становится темно-розовой, но при охлаждении бледнеет.

7. К смеси добавляют 4 мл бутанолового реагента и интенсивно встряхивают, чтобы экстрагировать окрашенное вещество. Пробирки центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге при комнатной температуре, отбирают водную фазу и определяют на спектрофотометре величину поглощения при длине волны 549 нм с соответствующим контролем. Оптимальное поглощение составляет около 0,6 оптической единицы; полученный результат сопоставляют с калибровочной кривой.

Реагенты для определения нейраминидазной активности

Периодатный реагент:

периодат натрия -- 4,28 г ортофосфорная кислота -- 62 мл Н₂0 --38 мл

Периодат растворяют в воде, затем добавляют кислоту. Реактив хранят в посуде из темного стекла в прохладном темном месте; реактив стабилен.

Арсенитный реагент:

арсенит натрия--10,00 г

сульфат натрия --7,10 г

Н₂0 -- 100 мл

концентрированная H₂S0₄-- 0,28 мл Реактив фильтруют через бумагу Whatman № 1. Реагент стабилен.

Тиобарбитуратный реагент:

тиобарбитуровая кислота -- 1,2 г сульфат натрия -- 14,2 г Н₂0 --200 мл

Компоненты растворяют на кипящей водяной бане. При хранении образуется осадок.

4.3 Слияние вирусной и клеточной мембран

Гемагглютинин вируса гриппа обеспечивает связывание ви-рионов клеточными рецепторами и слияние вирусной и клеточной мембран. Последняя активность гемагглютинина проявляется только в кислой среде. Связанный вирус проникает внутрь клетки в составе мембранных пузырьков; затем вирус обнаруживается в более крупных эндосомах и, наконец, в лизосомах, внутренняя среда которых является кислой, что необходимо для инициации процесса слияния.

Точный механизм слияния вирусных и клеточных мембран остается неясным, однако показано, что для этого необходимо расщепление молекулы гемагглютинина на ГА1 и ГА2, N-концевая аминокислотная последовательность ГА2 чрезвычайно консервативна у разных вирусов и очень гидрофобна.

Предполагается, что при рН, близких к нейтральному, этот участок молекулы направлен внутрь глобулы. В кислой среде ГА2 претерпевает резкие конформационные изменения; предполагается, что при этом N-концевой участок ГА2 оказывается экспонированным на поверхности глобулы, и инициирует слияние мембран.

Эту активность вируса можно исследовать in vitro в реакции рН-за-висимого гемолиза.

Реакция гемолиза

1. Готовят ряд центрифужных пробирок, содержащих по 20 мкл содержащей вирус аллантоисной жидкости и 400 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов. Вместо аллантоисной жидкости можно использовать очищенный вирус. Пробирки инкубируют 30 мин при 0°С; за это время происходит связывание вируса с эритроцитами.

2. По окончании инкубации в пробирки вносят по 40 мкл 0,4 М буферного раствора и продолжают инкубацию 20--30 мин при 37 °С, периодически перемешивая.

3. Клетки осаждают 10 мин при 2000 g или 30 с при 10 000 g и измеряют поглощение при 540 нм против воды в качестве контроля. По поглощению можно определить значение рН, при котором происходит 50%-ный гемолиз, и сравнить графики зависимости полноты гемолиза от рН для разных штаммов вируса гриппа.

При постановке реакции следует ступенчато варьировать рН по 0,2 единицы и для каждого значения рН ставить по 2 параллельные пробы; следует определить и уровень гемолиза в отсутствие вируса, используя в качестве контроля незараженную аллантоисную жидкость. Для постановки данной реакции можно использовать эритроциты человека или морской свинки, но не курицы. Удобно ставить реакцию в пробирках для микроцентрифуги. Выбор буферного раствора определяется тем, в какой области рН проводится реакция. Наиболее удобны 2-этансульфоновая кислота и ее соль.

5. Хранение вирусных препаратов

Вирус гриппа следует хранить в концентрированном виде, поскольку разбавленный вирус нестабилен. При 4°С инфекцион-ность вируса сохраняется не более 1 нед. Для длительного хранения содержащую вирус аллантоисную жидкость или куль-туральную среду разливают порциями по небольшим сосудам и быстро замораживают с помощью метанола и сухого льда. Такое мгновенное замораживание практически не влияет на ин-фекционность. В лиофилизированном виде вирус легко транспортировать и можно хранить длительное время при комнатной температуре. Очищенный вирус, предназначенный для биохимического анализа, можно хранить при --20 °С около 6 мес без заметной потери ферментативных активностей. В этом случае для хранения вируса используют буферный раствор, содержащий 60% глицерина, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН7,4; концентрация вируса должна составлять примерно 5 мг/мл. В этом буфере вирус можно хранить до 2 нед при 4°С. В жидком азоте очищенный вирус хранится неопределенно долго.

При выделении нового изолята или при очистке вируса из бляшки для максимального снижения риска возникновения генетических вариантов при многократном пассировании следует придерживаться следующих рекомендаций.

1. Исходный изолят наращивают в оплодотворенных куриных эмбрионах, получая первичную заготовку в виде аллантоисной жидкости. Эту «первичную заготовку» рекомендуется разделить на небольшие порции и хранить в разных холодильниках на случай повреждения одного из них.

2. «Первичную заготовку» вновь пассируют через куриные эмбрионы, получая «вторичную заготовку»; эту «вторичную заготовку» опять делят на порции и хранят при --70 °С.

3. Вирус из «вторичной заготовки» вновь пассируют на эмбрионах, получая при этом «рабочую заготовку», используемую для дальнейшей работы.

Учитывая изложенные рекомендации, можно иметь практически неограниченное количество вируса, отделенного от первоначального изолята одним и тем же небольшим числом пассажей. Если при пассировании на эмбрионах в результате мутаций возникают генетические варианты, всегда есть возможность вернуться к «первичной заготовке» вируса, что особенно важно при работе с мутантами, поскольку не всегда удается избежать их контаминации вирусом дикого типа.

6. Радиоактивное лечение вируса

6.1 Введение метки в РНК

Введение радиоактивной метки в вирусную РНК наиболее эффективно при наращивании вируса в культуре клеток; в качестве метки используют -ортофосфат или -уридин. Можно пометить вирусную РНК -ортофосфатом и при культивировании вируса во фрагментах куриных эмбрионов, хотя в этом случае метка включается хуже.

1. Чтобы пометить вирус в культуре с помощью Р, необходимо истощить запас фосфата в клетках, инкубируя их в течение ночи в среде, не содержащей фосфатов и сыворотки. В состав среды должны входить гидролизат лактальбумина и глюкоза.

2. Клетки заражают вирусом по стандартной методике, но для промывания клеток и разведения вируса вместо PBS используют физиологический раствор.

3. После адсорбции вируса к культуре добавляют не содержащую фосфатов среду и 0,5 мКи/мл -ортофосфата.

4. Через 24 ч после заражения среду, содержащую меченый вирус, собирают и проводят очистку вируса одним из описанных методов.

Чтобы пометить вирусную РНК -уридином, клетки инкубируют в течение ночи со средой без сыворотки, заражают по стандартной методике, затем добавляют 0,1 мКи/мл -уридина в той же среде. Содержащую вирус среду собирают через 24 ч после заражения. Если в используемых клетках вирус размножается до высокого титра, то при очистке градиентным центрифугированием вирус, полученный, например, с одной чашки диаметром 10 см, в градиенте объемом 12 мл должен образовать видимую простым глазом зону. Если же выход вируса низок, в параллельном градиенте центрифугируют большее количество немеченого вируса и отбирают из градиента, содержащего радиоактивный материал, соответствующие фракции. Иногда раскапывают весь градиент и определяют радиоактивность в каждой фракции.

Если необходимо получить меченые вирусоспецифические РНК из зараженных клеток, заражение клеток и внесение метки осуществляют, как описано выше, и затем на нужном сроке инфекции из зараженных клеток выделяют РНК Для разделения сегментов РНК вируса гриппа удобно использовать 6%-ный полиакриламидный гель с 6 М мочевиной, приготовленный на буфере ТВЕ;. В этой системе 3 больших сегмента генома комигрируют. Для их разделения используют систему электрофореза в геле с низкой концентрацией акриламида, описанную Ленингом.

6.2 Введение метки в белки

Лучший радиоактивный предшественник для введения метки в белки вируса гриппа -- -метионин. Если необходимо получить меченые вирионы, клетки перед заражением следует в течение ночи инкубировать в среде без метионина, чтобы обеспечить максимально эффективное включение метки. После заражения к клеткам добавляют среду, содержащую 200 мкКи/мл -метионина, и через 24 ч после заражения собирают меченый вирус.

Однако чаще возникает необходимость в исследовании синтеза вирусных белков в зараженных клетках, например для анализа динамики размножения вируса или действия ингибиторов репликации. В этом случае нет необходимости в предварительном истощении внутриклеточного фонда метионина. Клетки заражают по стандартной методике; через нужный срок среду удаляют, 2 раза промывают клетки PBS и вносят среду, содержащую 10--20 мкКи/мл -метионина. Обычно для эффективного мечения всех вирусоспецифических белков достаточно 30 мин инкубации с радиоактивным предшественником. Однако за это время происходит и протеолитическое расщепление ГА с образованием ГА1 и ГА2.

Если это нежелательно, мечение проводят в течение меньшего времени и концентрацию -метионина соответственно повышают. При кратковременном мечении рекомендуется добавлять какой-либо сильный буфер, поскольку за это время содержащаяся в среде бикарбонатная буферная система не обеспечивает установления рН 7,5.

Затраты дорогостоящего -метионина можно свести к минимуму, если выращивать культуру для мечения белков в планшетах с 24 или 96 лунками. В такой лунке для введения метки в вирусные белки достаточно всего 50 или 100 мкл меченой среды; с использованием небольшого количества -метионина удается поставить одновременно многочисленные эксперименты по мечению вирусных белков.

Через определенное время после введения метки зараженные клетки промывают физиологическим раствором, снимают с поверхности культурального сосуда стерильной резиновой палочкой или струей физиологического раствора и осаждают 5 мин при 2000 g или при 10 000 g 30 с. Если меченые белки необходимо разделить электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na, осадок ресуспендируют в буфере для нанесения образцов, объем которого равен исходному объему культуральной среды. Альтернативный, упрощенный метод обработки зараженных клеток состоит в том, что буфер для нанесения образцов добавляют непосредственно к клеточному монослою и далее извлекают лизат из культурального сосуда. Если лизат оказывается очень вязким из-за высокой концентрации ДНК, его обрабатывают ультразвуком или пропускают через тонкую иглу для инъекций. Все вирусоспеци-фические белки хорошо разделяются в содержащих ДДС-Na 15--17,5%-ных полиакриламидных гелях с помощью диск-электрофореза Лэммли.

7. Среды и буферные растворы

7.1 Среды для культуры клеток ФЭК

Стандартные среды и среды, не содержащие какого-либо компонента, поставляются многими фирмами. В лаборатории авторов используются среды фирмы Biocult Ltd.. Ростовая среда:

К среде 199 поставляемой в виде 10-кратного концентрата) добавляют 10% сыворотки новорожденных телят, 1% пенициллина, 0,01% стрептомицина, 0,02% канамицина, 0,00025% фунгизона и 0,06% бикарбоната натрия. Среду доводят до нужного объема стерильной, дважды дистиллированной водой.

Поддерживающая среда:

Среда для размножения вируса в культуре клеток ФЭК готовится так же, как среда для выращивания клеток, но с 2% сыворотки.

Среда, не содержащая фосфатов:

В среду без фосфатов добавляют 0,5% глюкозы, 0,5% гидролизата лактальбуми-на, 2 мМ глутамина и антибиотики, как описано выше, но не добавляют сыворотки.

Среда без метионина:

В эту среду добавляют глютамин и антибиотики, как описано выше, а в качестве буфера -- HEPES до концентрации 20 мМ.

Среда с КМЦ:

Для приготовления раствора КМЦ 16 г порошка КМЦ размешивают в 300 мл PBS, инкубируют в течение ночи при 4°С, добавляют еще 200 мл PBS и 20 мин автоклавируют. 50 мл полученного раствора смешивают с 200 мл среды для покрытия.

7.2 Буферные растворы

PBS:

Раствор готовят путем растворения имеющихся в продаже готовых таблеток в нужном объеме дважды дистиллированной воды. После растворения таблеток раствор автоклавируют. Конечные концентрации солей в растворе следующие: 0,137 М NaCl, 0,027 М Ш, 0,032 М Na₂HP0₄, 0,015 М КН₂Р0₄.

Физиологический раствор:

0,9% NaCl.

Буфер NTE:

100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА. Солевой раствор Хенкса: NaCl --0,8 г КО -- 0,4 г MgSCv7H₂0 -- 0,2 г СаС1₂-2Н₂0 -- 0,185 г

Na₂HP0₄ --0,0475 г

KH₂P0₄ -- 0,06 г

NaHCOs --0,35 г

Глюкоза -- 1,0 г

Феноловый красный -- 0,017 г

Н₂0 --до 1 л

MgS0₄, СаС1₂, KH₂PCu и Na₂HPО₄ растворяют отдельно и медленно, при непрерывном перемешивании добавляют к основному раствору. Феноловый красный добавляют последним, после этого раствор доводят до нужного объема, делят на порции и автоклавируют.