Морфологические исследования зависимости структуры головного мозга (поле IV) от степени поражения вирусом простого герпеса (ВПГ) и построение по полученным данным математической модели заболевания

Морфологические исследования зависимости структуры головного мозга (поле IV) от степени поражения вирусом простого герпеса (ВПГ) и построение по полученным данным математической модели заболевания

ВВЕДЕНИЕ

Среди известных науке 500 разновидностей болезнетворных для человека вирусов вирус простого, или обычного герпеса (ВПГ)- один из самых распространенных. В последние годы герпетическая инфекция, обусловленная ВПГ, привлекает все большее внимание как медицинской, так и немедицинской общественности. Это связано с тем, что герпес, известный с давних времен как малораспространенное и малозначащее заболевание, характеризовавшееся высыпанием на губах и крыльях носа болезненных пузырьков, в последнее время значительно расширил свое значение в патологии человека. Повышенный интерес к герпетической инфекции обусловлен так же рядом других причин и прежде всего тем, что ныне она распространена в самых различных районах мира, поражая до 95% процентов населения, а вызывающий ее вирус способен поражать практически все органы и системы человеческого организма и вызывать различные формы инфекции- острую, латентную и хронически рецидивирующую. Клинически герпес протекает как разнообразное, сложное и нередко тяжелое заболевание с поражением многих органов и тканей, что позволяет рассматривать его как общее системное заболевание организма. В последние годы стали накапливаться данные о возможном участии ВПГ в развитии некоторых онкологических и сердечнососудистых заболеваний человека.

Одним из перспективных направлений является исследование геометрических характеристик клеток, пораженных ВПГ. Использование традиционных проекционных методов не дает качественных результатов, поэтому более точной и эффективной является компьютерная обработка изображений.

В наше время в медицине и научных исследованиях широко используют компьютеры, которые стали непременным атрибутом самых различных технических комплексов. Это касается и современных систем управления и сбора данных, контрольно-измерительного и лабораторного оборудования, т.е. любых комплексов, основной задачей которых является обработка и интерпретация информации, поступающей из "внешнего мира". Большинство этих устройств имеет дело с изображениями, получаемыми тем или иным образом, поэтому актуальной становится задача обработки и анализа изображений. Методы обработки изображений сейчас играют значительную роль, особенно при разработке систем искусственного интеллекта и технического зрения.

Процесс обработки изображений состоит из трех основных шагов: ввод, обработка и анализ изображения. Ввод изображения включает улучшение формы сигнала для уменьшения шума, преобразование сигнала из аналоговой формы в цифровую и запоминание изображения. После этапа ввода начинается этап обработки изображения. Анализ изображения представляет собой идентификацию объектов и получение их количественных и качественных характеристик.

В основу работы было положено исследование поражения вирусом простого герпеса ЦНС методом компьютерного анализа изображений. Целью работы является изучение геометрических характеристик пораженных клеток, измерение зависимости этих характеристик от длительности заболевания. Также ставилaсь задача на основе полученных результатов получить систему уравнений, описывающую модель течения заболевания.

В первой главе дипломной работы дана краткая характеристика свойств вируса, описана его роль в патологии человека. Рассмотрены особенности поражения вирусом простого герпеса нервной системы.

Во второй глaве описываются основные методы изучения нервных тканей, рассматривается методика исследования клеток, пораженных ВПГ. Приводятся основные принципы и методы математической обработки изображений, дается описание системы ввода изображений “Биоскан-АТ”

В третьей главе описана методика экспериментов, приведены результаты и проведен их анализ. На основе полученных результатов построена система уравнений, описывающая модель течения заболевания.

ГЛАВА 1. Герпес и его роль в патологии человека

Среди вирусных заболеваний герпес занимает одно из ведущих мест. Это обусловлено повсеместным распространением вируса простого герпеса , многообразием клинических проявлений заболевания и, как правило, хроническим его течением, а также различными путями передачи возбудителя инфекции. Герпес может сопровождаться поражениями ЦНС (энцефалит, миелит, энцефаломиелит), глаз (кератит, кератоконъюнктивит, увеит), печени (гепатит новорожденных и взрослых), слизистых оболочек (стоматит, афтозные язвы, поражение гениталий) и кожных покровов (экзема, везикулярные высыпания). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), заболевания, обусловленные ВПГ, занимают второе место (15,8%) после гриппа (35,8%) как причина смертности от вирусных инфекций Следует отметить уже выявленную этиологическую и патогенетическую роль ВПГ (особенно ВПГ типа 2 - ВПГ2) при раке шейки матки, что предопределяет онкологический аспект проблемы.

На территории бывшего СССР по данным, собранным вирусологами и специалистами по кожным, глазным и стоматологическим заболеваниям, число только госпитализированных в стационары больных превышает 2,5 млн. в год. Значительно больше больных лечатся в амбулаториях и поликлиниках.

Герпес (от греч, herpes - лихорадка) - самая распространенная вирусная инфекция человека, длительно существующая в организме, преимущественно в латентной форме. Было установлено, что, кроме вируса, поражающего человека, удается выделить из органов и материалов от больных животных сходные по морфологии и физико-химическим свойствам вирусы, поражающие только животных

Впервые ВПГ был обнаружен в жидкости элементов герпетических поражений в 1912 году, а условия его пассирования на чувствительных видах лабораторных животных и культурах клеток отработаны позднее. Это позволило получать достаточно большие количества вируса для изучения структуры и свойств ВПГ, а также разработать методы индикации возбудителя для установления эпидемиологических особенностей этой инфекции.

1.1 Краткая характеристика свойств вируса

Вирион ВПГ имеет форму, близкую к сферической, и характеризуется выраженным плеоморфизмом и значительными колебаниями в размерах (170-210 нанометров). Он содержит линейную непрерывную двухцепочечную ДНК (6,5%), белок (70%), фосфолипиды (20%), углеводы (1,6%) и имеет массу примерно 10^-15 граммов. Структура генома ВПГ является необычной для ДНК-содержащих вирусов. В составе ДНК обнаружены 2 типа повторов (концевые и внутренние), которые разделяют ее на два уникальных ковалентно связанных сегмента (короткий и длинный). Вирусные геном и ассоциированные с ним белки (нуклеоид) заключены в икосаэдрическую белковую капсулу (капсид), состоящую из 162 капсомеров, которая в свою очередь имеет внешнюю липопротеидную оболочку, происходящую из модифицированной мембраны ядра клетки-хозяина. В липопротеидную оболочку встроены 5-6 вирусных гликопротеидов, отсутствующих в ядерной и цитоплазматической мембранах неинфицированных клеток. Гликопротеиды обеспечивают прикрепление к клетке, проникновение в нее. Они изменяют антигенный состав поверхности инфицированной клетки, что важно в патогенезе инфекции и для индукции иммунного ответа (рис. 1).

По данным ряда авторов, в составе вириона имеется от 24 до 33 структурных белков. Сравнительное изучение белков и ДНК вирусных изолятов, их биологических свойств, а также путей передачи вируса в естественных условиях позволили условно выделить два типа ВПГ - ВПГ-1 и ВПГ-2. Несмотря на имеющиеся различия, представители обоих типов вируса имеют общие группоспецифические антигенные детерминанты. Наличие антигенных связей между штаммами ВПГ первого и второго типов требует определенной осторожности при идентификации выделяемых вирусов и интерпретации результатов сероэпидемиологических и диагностических исследований. Более того, общие с ВПГ антигенные детерминанты выявлены у всех патогенных для человека представителей семейства герпесвирусов: вирусов ветряной оспы - герпеса зостер и Эпштейна - Барра, цитомегаловируса и обезьяньего герпесвируса В, что также необходимо учитывать при эпидемиологических исследованиях.

1.1.1 Физико-химическая характеристика

Физико-химическая характеристика ВПГ изучена достаточно полно. Вирус чувствителен к высушиванию и тепловому воздействию: он инактивируется при 50-52 ⁰С в течение 30 минут, а при 37°С- в течение 10 часов. Однако имеются данные, что ряд штаммов вирусов первого и второго типов не полностью инактивируется даже при 56 ⁰С в течение 1 часа и при 70 °С в течение 30 минут. При изучении различных факторов, влияющих на термостабильность вируса, показано, что при добавлении в среду Na₂SO₄, Na₂HPO_4, увеличивается термостабильность, а при добавлении MgCl_2, MgSО₄, NaCI, КН₂РО₄ и KCI она резко уменьшается. Вирус, ресуспендированный в водной среде, содержащей аминокислоты или белок, был более стабилен. Наибольшая термостабильность вируса наблюдалась при рН 6,5-6,9.

С другой стороны, ВПГ устойчив к воздействию низких температур и сохраняет биологическую активность 1-2 года при -24 ⁰С. Вирус устойчив при 4°С в 5% растворе глицерина. Применение снятого молока позволяет сохранить инфекционный титр вируса без его изменения в течение 5 мес. при -70°С. В связи с тем что вирионы ВПГ более чем на 20% состоят из липидов( при чем все липиды локализованы в оболочке), они легко разрушаются под действием эфира, спирта и других органических растворителей (ацетон, хлороформ и др.), детергентов, протеолитических ферментов (например, трипсина). Вирус весьма устойчив к ультразвуку, а также к повторному замораживанию и оттаиванию. Наличие дивалентных катионов и рН среды менее 6,8 увеличивает инактивацию штаммов ВПГ при воздействии теплом.

Облучение ультрафиолетовыми и рентгеновскими лучами может разрушить вирус даже при небольших дозах воздействия. Аналогичное влияние оказывает и фотодинамическое воздействие красок. Штаммы ВПГ хорошо переносят лиофилизацию и в высушенном виде сохраняют активность в течение 10 лет и более. Хорошо сохраняется вирус в тканях животных в 50% растворе глицерина.

ВПГ способен размножаться практически во всех известных линиях клеток позвоночных. При заражении чувствительных культур клеток, интенсивно размножаясь (до 50 000 -200 000 вирионов на клетку), вирус подавляет синтез клеточных макромолекул, что приводит к гибели клеток. В ходе эволюции ВПГ выработал способность не только индуцировать в инфицированной. клетке синтез необходимых для его репродукции ферментов, но и координировать оптимальную активность особых ферментных состояний клетки (в том числе фазового характера), необходимых для генерации вируса, а также угнетать и даже полностью прекращать биосинтез клеточных ферментов, которые не используются для его воспроизводства. В составе ВПГ не найдены РНК- или ДНК-полимеразы, но ферменты, ассоциированные с мембранами, такие, например, как протеинкиназа, были обнаружены и могут быть вирусспецифическими. ДНК ВПГ, как показали исследования, инфекционна.

1.1.2 Морфология и внутриклеточное развитие

Морфогенез ВПГ можно представить следующим образом. В процессе размножения вируса исходная вирусная ДНК поступает в ядро; в ядре клетки происходит транскрипция вирионной ДНК, образуются крупные вирусспецифические мРНК, которые мигрируют в цитоплазму, расщепляются на более мелкие мРНК, ассоциирующиеся с рибосомами и формирующие полирибосомы. После синтеза структурные полипептиды транспортируются в ядро и ассоциируют с вирусной ДНК, формируя капсид вириона. Гликопротеиды, участвующие в образовании наружной оболочки вириона, встраиваются в состав ядерных и цитоплазматических мембран, заменяя клеточные белки, синтез которых в зараженной клетке подавлен. Нуклеокапсиды, выходя из клетки через специфически измененные участки ядерной и цитоплазматической мембран, захватывают их в качестве наружной оболочки вириона ВПГ. Продолжительность цикла репродукции ВПГ составляет около 10 часов. Помимо деструктивного эффекта на клетки при острой инфекции, ВПГ может оказывать трансформирующее действие.

Оболочка частиц имеет разнообразную форму. Иногда она повторяет гексагональную проекцию капсида. Ее диаметр колеблется от 170 до 210 нм. В некоторых случаях наблюдаются 2 и более нуклеокапсида, заключенных в общую оболочку. Часто оболочка бывает разрушенной, а у многих частиц отсутствует. Последние условно названы “голыми”. Капсид частиц в проекции имеет гексагональную форму со средним диаметром 160 нм. Каждая грань его - равносторонний треугольник, построенный из 15 субъединиц-капсомеров, уложенных с интервалом около 3 нм.

Сторона каждого треугольника (ребро икосаэдра) составлена из 5 капсомеров. Каждая из 12 вершин образована 1 капсомером, окруженным 5 соседними. Все другие капсомеры, составляющие грани треугольников, окружены 5 соседними. Каждый капсомер имеет форму удлиненной призмы. В поперечном сечении на вершинах икосаэдра они пентагональные. Остальные капсомеры, составляющие поверхность капсида, - гексагональные с внутренним отверстием около 4 нм. Таким образом, капсид вируса герпеса составлен из .62 капсомеров, уложенных с симметрией 5:3:2 .

На основании ряда согласующихся в общих чертах наблюдений установлено, что прикрепление ВПГ к клеткам происходит довольно медленно, время при этом часто трудно измеримо. Вирус непрочно прикрепляется к клеткам, поэтому около 50% его всегда можно отделить различными способами.

В месте адсорбции клеточная стенка образует своеобразный “карман”, который затем превращается в вакуоль и таким образом вирус оказывается в цитоплазме. Далее следует процесс дезинтеграции вируса, конечным его результатом является освобождение нуклеиновой кислоты от белков внешних оболочек. В течение 10-12 ч после заражения в клетках не удается обнаружить каких-либо характерных признаков формирования вируса. В это время происходит образование структурных вирусных белков и нуклеиновых кислот, из которых в дальнейшем происходит организация нуклеиновой кислоты и капсомеров в единую структуру, условно называемую нуклеокапсидом, или виронуклеоном. Считают, что это происходит, по-видимому, по принципу самосборки и осуществляется с помощью физико-химических процессов. По-видимому, нарушение процессов сборки приводит к формированию неполноценных форм вируса.

Развитие герпеса сопровождается образованием внутриядерных включений. Эти образования рассматриваются некоторыми исследователями как место собирания вируса.

Данные литературы позволили предположить несколько возможных путей формирования включений. Известно, например, что вирусное потомство включает не более 20% вновь синтезированной ДНК и около 35% белка. Исходя из этих данных, можно считать, что та часть нуклеиновой кислоты и структурных белков, которая остается неиспользованной при формирований вируса, и может образовывать включения. ВПГ вызывает постепенное подавление макромолекулярных синтезов в клетке. Свидетельством разрушения клеточной ДНК являются повреждения хромосом.

1.1.3 Эпидемиология герпетической инфекции

Герпетическая инфекция является примером пожизненного носительства человеком популяции ВПГ, который может передаваться в периоды обострения как вертикальным, так и горизонтальным путем.

Распространение герпетической инфекции не только в странах Европы, Азии н Америки, но и среди коренного населения таких малоосвоенных европейцами территории, как глубинные районы Новой Гвинеи, свидетельствуют о том, что герпес- древняя болезнь человека. В естественных условиях источником инфекции является только человек. После первичной инфекции ВПГ пожизненно персистирует в организме в латентной форме, а воздействие разнообразных факторов (переохлаждение, инсоляция, лихорадка, эмоциональные расстройства, бактериальные и вирусные инфекции л др.) может вызывать реактивацию латентного ВПГ с развитием рецидивов заболевания. При этом экскреция вируса происходит из ганглиев (тройничного нерва, из крестцовых ганглиев и др.) в результате временного прекращения латенции. Длительность периода, на протяжении которого возникают рецидивы, обеспечивает выживание ВПГ даже в небольших изолированных популяциях населения.

Восприимчивость населения к ВПГ необычайно высока. Первичное заражение обычно происходит внутриутробно, в раннем возрасте и у большинства протекает бессимптомно, оставляя после себя выраженный гуморальный иммунитет, который, однако, из-за персистенции ВПГ в организме нестерилен. Входные ворота ВПГ - неповрежденные или травмированные кожные покровы и слизистые оболочки губ и ротовой полости, желудочно-кишечного тракта, носа и конъюнктивы, гениталий. Возможна как вертикальная (врожденная; трансплацентарная инфекция), так и горизонтальная передача, осуществляемая контактно-бытовым и воздушно-капельным путем. Передача ВПГ путем прямого контакта предполагает физическую близость: ВПГ-1 чаще всего передается при поцелуе, со слюной, а ВПГ-2-в основном половым путем.

Определенное эпидемиологическое значение в распространении герпетической инфекции имеют различного рода медицинские манипуляции. Так, современные сложные хирургические операции, особенно пересадки органов и костного мозга, сопровождающиеся массивными переливаниями свежей крови, а также длительная иммунодепрессивная и лучевая терапия нередко приводят либо к активации латентной ВПГ-инфекции, либо к первичному заражению больных при контакте с вирусоносителями или инфицированными материалами. Возможно также развитие внутрибольничных вспышек инфекции, особенно в палатах интенсивной терапии, отделениях недоношенных и новорожденных. Снижение резистентности находящихся в таких палатах больных, постоянный контакт их с обслуживающим персоналом и частота различных инструментальных вмешательств - факторы, предрасполагающие к горизонтальному распространению герпетической инфекции.

1.2 Патогенез и лабораторная диагностика

Первичный герпес почти у 80 процентов больных протекает бессимптомно. Чаще наблюдается доброкачественное течение заболевания, которое заканчивается клиническим выздоровлением. Обычно через несколько дней после начала заражения в сыворотке крови появляются специфические антитела. У более 85% детей 3-летнего возраста имеются вируснейтрализующие антитела. При этом в течение всей последующей жизни отмечается наличие антител в сыворотке крови людей, которые не всегда защищают от вторичного или рецидивирующего проявления герпеса. Попав в организм, ВПГ сохраняется на протяжении всей жизни, периодически вызывая рецидивы болезни, которые, как и при первичном герпесе, протекают с разной тяжестью и с различной локализацией поражений.

Кроме антител, в патогенезе герпеса в качестве защитных факторов играет роль так называемый клеточный иммунитет, при котором имеет значение адсорбция вируса на клеточных элементах, подавление репродукции вируса интерфероном и другими ингибиторами, а так же выведение вируса из организма различными путями.

После первичного контакта организма с вирусом инфекция находится в “дремлющем” состоянии или происходит новое экзогенное заражение вирусом. Вирус, концентрируясь на границе первичного поражения (чаще всего на лице, в области губ), снова вызывает картину герпетических изменений.

ВПГ после первичного заражения сохраняется в латентном состоянии в мозге человека вследствие его высокой нейротропности. Покоящийся вирус в результате активизации (например, при повышении температуры) может вызвать развитие энцефалита у человека. Вирус, попав в организм ребенка, сохраняется в латентном состоянии всю жизнь, а иногда без проявления рецидивов бывает причиной возникновения энцефалита.

Многочисленные экспериментальные и клинические работы по изучению патогенеза герпетической инфекции свидетельствуют о том, что:

во-первых, ведущим биологическим механизмом, обеспечивающим персистенцию вируса на протяжении всей жизни в организме человека после первого заражения и особенности течения инфекции, является латенция ВПГ;

во-вторых, значительный полиморфизм клинических проявлений герпеса, поражение многих органов и тканей позволяют рассматривать его как общее системное заболевание организма.

Клинический полиморфизм герпетической инфекции обусловлен не только штаммовыми особенностями ВПГ или локализацией герпетического поражения, но и физиологическим состоянием организма, его иммунным ответом на проникновение и персистенцию вируса.

1.2.1 Первичная инфекция

Первичная инфекция-это первичное заражение человека ВПГ любого серотипа. Как уже отмечалось, происходит это в основном в раннем детском возрасте и у 80% больных протекает бессимптомно. Входными воротами инфекции являются слизистые оболочки и кожа. Инкубационный период колеблется от 1 до 26 суток (в среднем 6-8 дней). ВПГ размножается на месте первичной инокуляции, где образуются везикулярные высыпания. Затем независимо от механизма заражения развивается первичная вирусемия. При этом в гематогенном распространении вируса важную роль играют эритроциты и лейкоциты. В последних ВПГ может персистировать длительное время. Гематогенная диссеминация вируса может привести к развитию генерализованного герпеса, особенно у лиц с первичными или вторичными иммунодефицитами. Концентрация ВПГ в крови при генерализованном герпесе может достигать высоких показателей (10⁶ инфекционных единиц на 1 миллилитр крови). После первичной вирусемии ВПГ активно размножается в чувствительных внутренних органах и тканях, в которые он проникает через барьер капилляров, по-видимому, путем диапедеза. Массивный выброс вируса из пораженных органов и тканей в кровеносное русло приводит к развитию вторичной вирусемии и острой стадии герпетической инфекции. Длительность острой стадии обычно колеблется 7-14 дней. В большинстве случаев у лиц, перенесших острую стадию первичной герпетической инфекции, наступает полное клиническое выздоровление и в организме вырабатываются специфические антитела, которые, однако, не освобождают организм от вируса. Первичное заражение помимо гуморального стимулирует также и клеточный иммунный ответ.

Первичная герпетическая инфекция независимо от клинической формы проявления и места локализации поражения сопровождается проникновением ВПГ в ганглии дорсальных корешков и реже - в вегетативные ганглии и завершается их острой инфекцией с последующим установлением латентности в нейронах.

1.2.2 Латентная инфекция

Латентная инфекция-это присутствие ВПГ в неинфекционной форме в какой-либо ткани, в которой может быть индуцирована его репликация специфическими стимулами.

В формировании латентной герпетической инфекции решающую роль играет распространение вируса по нервным путям. Так, после прикрепления к нервным окончаниям вирионы ВПГ транспортируются внутри аксонов со скоростью до 1,5 миллиметра в час. Механизмы перехода острой герпетической инфекции в латентную, как и форма, в которой ВПГ способен к существованию в таком состоянии, точно не установлены. Известно, что этот переход обусловлен действием ряда факторов как со стороны вируса, так и организма хозяина, выработавшихся в течение длительной эволюции их взаимоотношений. В настоящее время наибольшее признание имеют две гипотезы - “статическая” и “динамическая”. Согласно первой, геном ВПГ способен под действием клеточных факторов (возможно, интерферона) сохраняться в нереплицирующихся нейронах ганглия. Согласно второй - латентная инфекция не связана с каким-то особым состоянием ВПГ, а представляет своеобразный вяло протекающий процесс.

В любом случае нарушение равновесия между клеткой и вирусом под влиянием провоцирующих факторов приводит к увеличению репликации ВПГ, что выражается в различных клинических проявлениях - обострении инфекции. Затем между вирусом и клеткой устанавливается новое равновесие, в результате чего образование ВПГ прекращается до тех пор, пока какой-нибудь провоцирующий фактор снова не нарушит этого сбалансированного состояния. Латентную инфекцию дифференцируют от острой (первичной или возвратной) на основании того, что в последнем случае ВПГ легко можно выделить из образцов исследуемых тканей.

Таким образом, латентную инфекцию можно определить как своеобразную форму взаимоотношений вируса, клетки и организма, при которой все известные нам защитные факторы оказываются не в состоянии полностью ликвидировать патологический процесс, а ВПГ, длительно персистируя в клетках хозяина, не вызывает их значительной деструкции.

1.2.3 Возвратная инфекция

Наряду с латенцией характерной особенностью патогенеза герпетической инфекции является способность к реактивации латентного ВПГ и развитию рецидива заболевания (возвратная инфекция).

Возвратная инфекция характеризуется наличием ВПГ на поверхностях тела или в секретах в результате реактивации латентного вируса. Установлено, что у 75% лиц, перенесших первичную герпетическую инфекцию, в течение всей жизни отмечаются рецидивы, несмотря на высокий уровень иммунного ответа. При рецидивах герпетических поражений возникающие местные признаки и симптомы заболевания менее выражены, быстрее проходят и, за исключением отдельных форм (например, герпетического энцефалита, гепатита, генерализованной инфекции), реже сопровождаются общими клиническими проявлениями, чем при первичной инфекции. Отчасти это объясняется тем, что заболевание развивается на фоне имеющегося специфического иммунитета.

Механизмы реактивации герпетической инфекции изучены недостаточно. Тем не менее имеющиеся факты свидетельствуют о том, что реактивация латентного ВПГ в значительной степени связана с нарушениями защитных иммунных механизмов. Реактивация латентного ВПГ у лиц с первичными или вторичными иммунодефицитами - наиболее наглядное подтверждение ведущей роли иммунной системы в патогенезе хронической рецидивирующей герпетической инфекции. Более того, в клинической практике следует учитывать, что герпес - вторичное иммунодефицитное заболевание. Существует мнение, что клеточный иммунитет является ведущим фактором, обеспечивающим предупреждение развития заболевания. Значение его в устойчивости к ВПГ особенно четко прослеживается при врожденных дефектах Т-системы иммунитета, тимэктомии, иммунодепрессантной и лучевой терапии.

Реактивация ВПГ и возникновение рецидивов обычно связаны с наслоившимися бактериальными и вирусными инфекциями, охлаждением, переутомлением, воздействием солнечных лучей, удалением зубов. Так, например, по нашим данным, полученным при анализе материалов клиники глазных болезней Минского государственного медицинского института с 1978 по 1984 год, частота рецидивов герпетических кератитов значительно увеличивается в период эпидемий гриппа, а также на фоне роста заболеваемости острыми респираторными вирусными инфекциями. Реактивирующее действие ультрафиолетовых лучей на ВПГ связывают с высвобождением в коже простагландинов. К факторам риска относят травмы, оперативные вмешательства, изменения, связанные с менструальным циклом и беременностью, эмоциональные стрессы и др.

Изучение взаимодействий между нервной и иммунной системами показало, например, что механизмы защиты организма всегда ослабевают при подавленном моральном состоянии, и, следовательно, создаются условия для .возможной реактивации латентного ВПГ.

Таким образом, анализ приведенных данных свидетельствует о сложности патогенеза герпетической инфекции и недостаточной изученности ведущих механизмов, ответственных за формирование латентной формы инфекции и реактивацию ВПГ с развитием бессимптомных и клинически манифестных форм герпеса.

1.2.4 Лабораторная диагностика

ВПГ является одним из немногих вирусов, для выявления этиологической роли которого в инфекционных заболеваниях используются все лабораторные диагностические реакции - от цитологических исследований до молекулярно-биологических методов. Важное значение этого вируса в патологии человека и его возможная ассоциация с некоторыми формами рака у людей (РШМ), а также использование в современной клинической практике химиотерапевтических средств для лечения герпеса - все это продолжает являться важным стимулом для разработки все новых диагностических приемов.

Как и с другими лабораторными тестами преимущества имеют те, которые отличаются быстротой, специфичностью и чувствительностью в выявлении ВПГ. В то же время при интерпретации результатов вирусологических исследований возникает много трудностей. Это связано с целым рядом факторов:

антигенной, биологической вариабельностью изолятов ВПГ;

различными клинико-патологическими проявлениями герпеса, что обусловлено состоянием больного (например, особенностями течения герпеса у новорожденного или при иммунодефицитных состояниях организма);

субклиническим течением заболевания у большинства больных.

Эффективность лечебных и противоэпидемических мероприятий при герпетической инфекции зависит от своевременной ее диагностики. Клиническая дифференциальная диагностика герпетических поражений различной локализации в связи с широким спектром проявлений данной инфекции остается актуальной и важной задачей для практических врачей самых разных специальностей. Ключевое значение для решения названных проблем приобретают лабораторные методы и прежде всего методы экспресс-диагностики.

В зависимости от направленности поиска тех или иных признаков герпетической инфекции в клиническом материале эти методы условно можно подразделить на три группы:

методы обнаружения и выделения инфекционного ВПГ;

методы выявления вирусных частиц или их компонентов;

методы обнаружения антител к ВПГ.

При этом следует помнить, что качество результатов диагностических исследований определяется в основном сроками взятия проб после начала заболевания и во многом зависит от техники сбора, соблюдения условий первичной обработки материалов, а также от взаимодействия врачей разных специальностей (клиницистов, вирусологов, эпидемиологов) при обследовании больного. Так, частота выделения вируса наиболее высока в случае взятия материалов на исследование в ранние сроки с момента заболевания и транспортировки их в короткие сроки в оптимальных условиях (при 4⁰С, в среде со стабилизирующими веществами - 0,5%-ный желатин или 0,5%-ный альбумин бычьей сыворотки). Выбор конкретных методов диагностических исследований определяется характером течения инфекции. локализацией герпетических поражений.

1.3 Поражение нервной системы

Нейротропизм ВПГ обусловливает развитие различных поражений центральной и периферической нервной системы (ЦНС и ПНС). Комплексные клинико- вирусологические, иммунологические и морфологические исследования выявили широкий спектр проявлений и диапазон выраженности герпетических поражений нервной системы.

В зависимости от преимущественной локализации патологического процесса выделяют:

1) локализованные поражения ЦНС;

локализованные поражения ПНС;

сочетанные поражения ЦНС и ПНС;

сочетанные поражения нервной и других систем организма.

В зависимости от характера течения процесса выделяют острое, подострое и хроническое (или рецидивирующее) течение. В последние годы высказывается предположение о том, что подострое и хроническое течение следует рассматривать как медленную форму герпетической инфекции ЦНС.

При герпетической инфекции нервной системы заболевание может протекать в виде полиганглионеврита (черепного, сакрального, черепно-сакрального), радику- логанглионеврита, полирадикулоганглионеврита, вегетативного полиганглионеврита, менингита, энцефалита (менингоэнцефалита), миелита, (менингомиелита), а также в виде психических заболеваний. Отдельными исследователями высказывается предположение о возможной этиологической роли ВПГ в развитии рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза, эпилепсии, шизофрении и др.

К числу самых тяжелых проявлений герпетической инфекции нервной системы относятся поражения ЦНС - энцефалиты и энцефаломиелиты, сопровождающиеся высокой летальностью и инвалидизацией выживших больных. В США на долю герпетических энцефалитов приходится от 10 до 20% всех случаев вирусных инфекций ЦНС, что составляет 2,3 случая на 1 миллион населения в год. Случаи заболевания регистрируются равномерно в течение года. В зависимости от возраста больного выделяют 2 пика заболеваемости: в возрасте 5-30 лет и свыше 50 лет. При этом считают, что ВПГ первого типа является этиологической причиной заболеваний в 95% случаев.

В большинстве случаев герпетические поражения ЦНС протекают в виде слабо выраженного диффузного энцефалита, герпетического менингита, малых или субклинических форм инфекции. Течение этих заболеваний относительно доброкачественное и диагностируется на основании данных вирусологических исследований. Со временем у таких больных могут развиваться хронические нервные заболевания, психические расстройства. Реже герпетические поражения протекают в виде тяжелых энцефалитов, среди которых можно выделить три формы:

диссеминированные диффузные менингоэнцефалиты (заболевание в основном наблюдается у новорожденных при генерализации первичной герпетической инфекции);

острые коматозные энцефалиты у детей;

очаговые поражения ЦНС у взрослых.

Клиника герпетических энцефалитов весьма схожа с клиникой других вирусных энцефалитов. Однако характерная черта некротического энцефалита - бурное течение и неблагоприятный исход. Заболевание в первые дни расценивается как респираторная вирусная инфекция. В последующем клиническая картина развивается быстро. Повышается температура, появляются общемозговые симптомы: интенсивные головные боли, вялость, апатия, дезориентация во времени и пространстве с нарушением сознания, вплоть до коматозного состояния и генерализованных некупируемых судорог.

Энцефалиты, вызванные ВПГ, имеют неблагоприятное течение и дают смертельные исходы в 50-90% случаев. Смерть может наступить на 7-20-й день болезни. Описан случай, когда смерть наступила через год от начала заболевания и была обусловлена подострым или рецидивирующим характером течения процесса. Остаточные явления, часто в виде тяжелых поражений ЦНС., остаются примерно у 50% переболевших.

Герпетический энцефалит у детей, как правило, протекает с бурной энцефалитической реакцией, почти обязательными судорогами и нарушением сознания. Меннигеальный синдром выражен относительно слабо, лишь в отдельных случаях наблюдается умеренная воспалительная реакция. Не отмечается прямой зависимости между выраженностью общеинфекционных проявлений и глубиной энцефалитических нарушений. Нормализация температуры еще не свидетельствует о регрессе инфекционного процесса. Раннее развитие коматозного состояния - неблагоприятный признак.

Патогенез герпетических энцефалитов в разных возрастных группах также различен. Так, у детей и молодых людей герпетический энцефалит- результат первичной инфекции. При этом экзогенный вирус проникает в ЦНС по нервным волокнам из первичного очага (например, по ольфакторному пути). В то же время большинство взрослых к моменту развития герпетического энцефалита имеют клинические или серологические признаки герпетической инфекции с поражениями различной локализации (например, кожи или слизистых), У этих больных поражение ЦНС может быть следствием реактивации латентного ВПГ и его последующего проникновения в ЦНС по нервным волокнам из первичного очага инфекции, длительное время находящегося в латентном состоянии непосредственно в ЦНС.

Диагностика герпетических поражений ЦНС и ПНС наиболее сложна. Она основывается на комплексном обследовании больного с целью выделения ВПГ из спинномозговой жидкости или биоптата мозга и на обнаружении внутримозгового синтеза антител к ВПГ, прежде всего вирусспецифических иммуноглобулинов, или нарастания титра антител к ВПГ в динамике заболевания.

Для ранней диагностики герпетического энцефалита наряду со специфическими методами экспресс-диагностики рекомендуется использовать неинвазивные пара- клинические методы исследования - электроэнцефалографию и компьютерную томографию.

Рис. 1. Схема структуры вириона ВПГ (гликопротеиды внешней оболочки): gB - ответствен за инфекционность; g.D - ответствен за инфекционность и индукцию нейтрализующих антител; gC - связывается с СЗb компонентом комплемента; gE - связывается с Fc - фрагментом иммуноглобулинов класса G; gG - по-видимому, ответствен за специфический серологический ответ (так как имеет небольшую перекрестную реактивность у ВПГ первого и второго типов); VP₅ - основной белок капсида; VR₁₆ - входит в состав оболочки; ДНК - геном ВПГ

ГЛАВА 2. Методика исследований

2.1 Гистологические препараты

В работе использовались препараты головного мозга (лобный полюс поле 4). Для получения подобных препаратов используется два основных метода изготовления срезов: заливка мозга в парафин и замораживание. Так как мозг содержит от 70 ( в волокнах ) до 80% воды ( в клетках ), то его нужно обезвоживать, заменяя воду заливочным материалом. Для удаления воды можно использовать соединения, обладающие большим сродством к ней ( например, этанол ). Чтобы свести повреждение ткани до минимума, эти соединения используют в возрастающих концентрациях. Тем не менее при обработке мозг уменьшается в объеме почти на 7%.

Затем переходят к просветлению и пропитыванию тканей. Для просветления используют вещества, смешивающиеся как с парафином, так и со спиртом, например ксилол, в который помещают кусочек ткани, вынув его из спирта; при этом ткань несколько раз переносят в свежие порции ксилола, пока весь спирт не замещается ксилолом. Затем ткань помещают в жидкий парафин, в котором она остается до тех пор, пока весь ксилол не будет замещен парафином; этот этап называют пропитыванием. После того как блок затвердеет, залитый мозг готов для изготовления срезов. Для обычного исследования в световом микроскопе толщина срезов не должна превышать 5-8 мкм.

Другой метод- приготовление замороженных срезов занимает гораздо меньше времени, чем изготовление парафиновых срезов. Для их изготовления мозг обрабатывают растворами формалина с сахорозой в возрастающих концентрациях. В целом замороженные срезы менее удобны, чем парафиновые, так как кристаллики льда повреждают ткань. Замороженные ткани не удается нарезать так же тонко, и толщина приготовленных из них срезов обычно достигает 10 мкм.

Поскольку различные компоненты живых клеток имеют сходные оптические плотности, все они уменьшают амплитуду проходящих через них световых волн примерно в одинаковой степени, так что ни один из них не кажется темнее или светлее других. Поэтому для создания достаточного контраста между разными компонентами клеток и тканей, позволяющего исследовать их в обыкновенном световом микроскопе, используют метод окрашивания. Красители поглощаются разными компонентами клеток и тканей в различной степени и могут создавать контрастность различными способами. Обычно используют два красителя: сначала одним окрашивают часть компонентов в один цвет, а затем другим окрашивают остальные компоненты в контрастный цвет.

2.2 Система анализа изображений

Основными методами исследования нервных тканей являются удаление, стимуляция, электрическая регистрация, химический и гистологический анализ. Например:

а) Расположение нервных структур, отвечающих за определенное поведение, может быть установлено путем максимального удаления участков мозга, при котором это поведение сохраняется, и/или путем минимального удаления, при котором оно исчезает. Той же цели может служить и функциональная блокада нервных центров.

б) Нервный субстрат реакции можно проанализировать путем нахождения области и максимальных параметров электрической и химической ее стимуляции, вызывающих такую же реакцию.

в) Электрическая активность, сопровождающая поведенческий акт, может отражать процессы, важные для его реализации. Электрофизиологические методы могут использоваться для выявления распространения афферентных импульсов в мозге, активности, предшествующей возникновению внешней реакции, или для соотнесения вероятности и/или величины поведенческой и электрической реакции.

г) Активация и возможная модификация нервных цепей, вызванная обучением, может отражаться в локальных изменениях метаболизма медиаторов, нуклеиновых кислот и белков.

д) Гистологическое описание позволяет качественно охарактеризовать структуру ткани и получить ее количественные характеристики, что позволяет строить математические модели по различным функциональным процессам в исследуемой ткани.

2.2.1 Основы математической обработки изображений

Важную роль в гистологическом исследовании играет анализ изображений. Геометрические измерения анализа изображения появились из основных понятий стереологии [16], поэтому они активно используют понятия и методы этой науки. Основными геометрическими понятиями являются площадь, периметр, центр масс, моменты инерции и ориентация объекта. Изображение в памяти вычислительной техники дискретно и представляет набор пикселов, что вносит определённые поправки в измерения. Алгоритмы вычисления площади и периметра описываются на модели дискретизации [3]. В соответствии с этой моделью любая плоская непрерывная кривая представляется на дискретном растре с шагом дискретизации h множеством точек растра, для которых выполняется одно из следующих условий:

1) расстояние от точки растра до ближайшей точки пересечения кривой с некоторой линией растра, проходящей через эту точку меньше 0,5h.

2) если это ближайшее расстояние равно 0.5h, то есть кривая пересекает линию растра ровно по середине, говорят, что кривая содержит точку неопределённости и любая из них включается в дискретное представление кривой.

Чтобы избежать трудоёмкого просмотра контурных точек, для вычисления площади используют теорему Пика [3]: площадь произвольного треугольника со всеми вершинами в узлах ортогональной решетки равна сумме числа точек растра, лежащих внутри многоугольника и половины числа контурных точек, уменьшенной на единицу:

где - число внутренних точек фигуры; - число точек принадлежащих контуру фигуры:

.

Из описанной выше модели и определённых упрощений вытекает и формула для периметра [3,16,17]:

где - контурные точки только по горизонтальной оси, - по вертикальной оси, - одновременно по обоим осям.

Все остальные параметры легко вычисляются с помощью рассмотренных выше [2,7,9,11,16,17].

Важным моментом измерения является оценка или классификация объектов измерения. Необходимо различать четыре общих уровня измерения или оценки: номинальный, ординальный, интервальный и соотносительный. Низшим уровнем является номинальный, где такие символы, как буквы или цифры, используются просто для классификации объектов или явлений. В этом случае количество измерений, попадающих в различные классы в условиях эксперимента и контроля, сравниваются с использованием биномиальной статистики. Если возможно упорядочить наблюдения так, чтобы они находились в каких то отношениях ( например, больше чем , меньше чем и т.д.), то будем иметь дело с ординарной шкалой. Если , кроме того, можно обнаружить интервалы между числами на такой шкале, то будем иметь дело с интервальной шкалой, которая имеет произвольную нулевую точку( как в случае температурной шкалы). Если же шкала имеет еще и истинную нулевую точку в начале, как, например, шкалы высоты, массы, то будет достигнут наивысший уровень измерения, то есть соотносительная шкала. Параметры, измеряемые с помощью номинальной или ординарной шкалы, обрабатываются с применением непараметрической статистики, тогда как данные, измеряемые по интервальной и соотносительной шкале, кок правило, обрабатываются с помощью параметрических статистических методов. Параметры популяции, подвергаемые непараметрическим статистическим процедурам, не обязательно должны соответствовать определенным условиям, например, нормальному распределению.

2.2.2 Основные принципы анализа изображений

Анализ изображения можно разбить на несколько основных шагов[ 2, 14 ] ( рис.1.2) :

1. захват и улучшение изображения,

2. сегментация ( бинаризация ),

3. обнаружение объектов ( идентификация ),

4. измерение,

5. анализ.

Под процессом захвата изображения понимают его преобразование в электрический сигнал, пригодный для оцифровки и хранения в памяти компьютера в виде битовой карты. В результате оцифровки получается серое изображение с квантованным пространством и интенсивностью (уровнем серого).

Процесс квантования пространства приводит к геометрическим искажениям, которые трудно поддаются учету и вносят определенную погрешность в измерения. Дискретизация оптической плотности структуры объекта по амплитуде также приводит к различного рода искажениям. Естественно, что квантование функции тесно связано с квантованием ее аргументов. Кроме того, во время захвата изображения не исключено возникновение точечных шумов, которые сказываются на качестве изображения. Для удаления таких шумов используется медианная и усредняющая фильтрация. Медианная фильтрация представляет собой метод нелинейной обработки сигналов. Одномерный медианный фильтр - это скользящее окно, охватывающее нечетное число элементов изображения. Центральный элемент заменяется медианой всех элементов изображения в окне. Медианой дискретной последовательности a1,a2,...,an для нечетного n является тот элемент, для которого существует (n-1)/2 элементов больших или равных ему по величине и (n-1)/2 - меньших или равных ему. Усредняющими являются низкочастотные пространственные фильтры, которые наиболее эффективны при сглаживании шумов. Они также, как и медианные фильтры представляют собой скользящее окно размера nn, где заменяется только центральный элемент по формуле:

,

где

- сглаживающий массив, часто называемый шумоподавляющей маской.



Одним из способов выделения границ объекта является метод статистического дифференцирования [ 15, 16 ], где значение яркости каждого элемента делится на статистическую оценку среднеквадратичного отклонения :

;

где - среднее значение яркости исходного изображения в точке с координатами ( j, k ).

Также для улучшения изображения используется функция контрастирования, осуществляемая варьированием масштабов частот серого уровня изображения [ 15, 16, 17, 18] .

Под сегментацией понимают получение бинарного изображения, требующего задания всего двух уровней яркости. Различают три метода сегментации:

1. выбор порога;

2. выделение границ;

3. выращивание регионов.

Итак, мы имеем бинарное изображение, в котором есть уровень, соответствующий пустому пространству, и уровень, соответствующий объектам. Далее необходимо выделить какой-либо индивидуальный признак для каждого объекта. Этот процесс называется идентификацией.

В результате проделанных операций будет получено изображение по которому можно проводить автоматические измерения с записью результатов в базу данных для дальнейшей обработки.

2.2.2 Анализаторы изображений

Работа автоматизированных систем анализа изображений основана на методах, которые относят к разделам технического зрения. Использование таких систем предоставляют исследователю ряд преимуществ. Во-первых, количественный учет и классификация признаков объектов более объективны, так как для электронно-вычислительной техники все признаки равноценны. Во-вторых, расчеты и измерения выполняются намного быстрее чем вручную. В-третьих, в течении длительной работы исследователь устает, в силу чего начинает пропускать интересующие его структуры. У автоматических анализаторов это исключено. В-четвертых, эти анализаторы могут применятся для обработки любого изображения, в чём заключается их универсальность.

В работе была использована компьютерная система обработки и анализа изображений "Биоскан-АТ", разработанная на базе Минского государственного мединститута. "Биоскан-АТ" представляет собой высокоинтегрированную гибкую аналитическую систему, основной принцип построения которой - получение предельно широких возможностей для обработки и анализа изображений за счет развитого и оптимизированного программного обеспечения при минимальной сложности аппаратной части.

Особенноссистемы "Биоскан-АТ" является одномониторное исполнение. “Биоскан-АТ” представляет собой многооконную интерактивную среду. Он содержит все функциональные возможности современных анализаторов изображений известных западных фирм при существенном снижении стоимости. Многооконная графическая среда дает ряд преимуществ: одновременное отображение нескольких кадров, работа с кадрами большого формата за счет скроллинга (прокрутки) изображения внутри окна , экономия места на экране при использовании накладывающихся окон. Проблема получения изображения непосредственно с телекамеры, что является необходимым для поиска объекта исследования, регулировки освещенности, наведения на резкость решена в системе "Биоскан-АТ" на аппаратном уровне установкой в компьютер специального устройства ввода изображения. Другой важной особенностью проектируемой системы является встроенный интерпретатор языка высокого уровня, позволяющий выполнять программу анализа изображений в автоматическом режиме. Система "Биоскан-АТ" комплектуется дигитайзером - устройством кодирования графической информации повышенной точности, использующимся для управления системой, редактирования изображений и полуавтоматических измерений. Возможна замена дигитайзера манипулятором "мышь", однако это увеличивает погрешность измерений и исключает возможность работы с фотографиями, картами и рисунками. Встроенные в систему функции обработки и анализа изображений реализуют большинство известных в настоящее время подходов к получению, коррекции, преобразованию, измерению, реконструкции и хранению изображений, в том числе методы математической морфологии нового поколения. Система находится в непрерывном развитии и постоянно расширяется новыми функциями и возможностями.

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть

3.1 Морфологическое исследование поражения нейронов вирусом простого герпеса

В ходе работы проводился анализ поражения коры головного мозга человека (поля 4) на поражение нейронов вирусом герпеса. Для исследования отбирался материал по возрасту 60-70 лет, форма хронического заболевания, использовалась классификация нейронов на поражение первого (ВПГ1) и второго типа (ВПГ2). Посредством анализатора изображений измерялись и подсчитывались характеристики ядер всех пирамидальных нейронов, одновременно проводилась их классификация по виду поражения. Измерялись следующие характеристики: количество клеток на единицу площади, площадь, фактор формы, средняя полутоновая величина и ядерно-цитоплазматическое отношение.