Характеристика рН-метрії у виробництві кормового хлортетрацикліну

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

Національний авіаційний університет

Факультет екологічної безпеки інженерії та технологій

Кафедра біотехнології

Курсова робота

із дисципліни: «Методи аналізу біотехнологічних виробництв»

На тему: Характеристика рН-метрії у виробництві кормового хлортетрацикліну

Виконала:

студентка ІІ курсу 202-ї групи

Кускова Валерія Віталіївна

Київ-2019

Зміст

Вступ

Розділ 1. Характеристика технологічного процесу одержання хлортетрацикліну

1.1 Характеристика продуцента Streptomyces aureofaciens

1.2 Підготовка і стерилізація поживного середовища

1.3 Підготовка посівного матеріала

1.4 Основний процес ферментації

1.4.1 Аерація культуральної рідини у стерильних умовах

1.4.2 Регулювання параметрів процесу біосинтезу

1.4.3 Регулювання рівня піни

1.5 Обробка, сушіння та фасування

Розділ 2. Методи визначення рН

2.1 Електрометричний метод визначення

2.2 Визначення рівня рН за допомогою рН-метра ЛПУ-01

2.3 Колориметричний метод визначення рН

2.4 Визначення рН за допомогою індикаторних папірців

Розділ 3. Застосування методу рН-метрії на різних стадіях технологічного процесу одержання хлортетрацикліну

Висновки

Список використаної літератури

Додатки

Вступ

Актуальність теми. Антибіотики -- продукти життєдіяльності (або їхні синтетичні аналоги і гомологи) живих клітин (бактеріальних, грибкових, рослинного і тваринного походження), які вибірково пригнічують функціонування інших клітин -- мікроорганізмів, пухлин. Ця група включає сотні препаратів різної хімічної структури, що вирізняються спектром і механізмом дії, побічними ефектами і показаннями до застосування.

Антибіотики знайшли широке застосування в наукових дослідженнях в якості речовин, що використовуються при вивченні окремих сторін метаболізма організмів, розшифровки тонких молекулярних механізмів біосинтеза білка, механізму функціонування мембран та інших біохімічних перетворень як специфічні інгібітори визначених реакцій.

Наприклад, одні антибіотики специфічно інгібують окремі етапи синтезу білка на рибосомах , інші - синтез на різних рівнях нуклеїнових кислот, треті утворення клітинних стінок.

Вивчення шляхів отримання антибіотиків сприяє глибокому проникненню в механізми синтетичної діяльності продуцентів цих біологічно активних сполук, розкриття основних етапів їх метаболізму.

Тетрацикліни -- одна з найбільш застосовуваних груп бактеріостатичних антибіотиків широкого спектра дії. В основі хімічної структури -- ядро октагідронафтацену.

Хлортетрациклін був першим із виділених тетрациклінів. Тетрациклінові антибіотики являють собою амфотерні з'єднання , здатні утворювати солі як із кислотами так і з лугами. Вони погано розчинні у воді і водних розчинах при рН 4,5-7,5. При рН нижче 2,0 і вище 8,0 можна приготувати водні розчини високої концентрації. Хлортетрациклін нестійкий до дії окислювача, в тому числі кисню. Характерною особливістю є здібність флуоресціювати при УФ-світлі, це дозволяє застосовувати його в аналітичних цілях.

Метою роботи є дослідити технологічний процес виробництва кормового хлортетрацикліну та дати характеристику рН метрії у цьому виробництві.

Завданнями роботи є:

1. Дослідити технологічний процес одержання кормового хлортетрацикліну;

2. Охарактеризувати будову рН - метра та принцип його дії;

3. Дати характеристику використання методу рН - метрії у виробництві хлортетрацикліну.

Об'єкт дослідження - характеристика рН - метрії при виробництві хлортетрацикліну.

Предмет дослідження - технологічний процес одержання хлортетрацикліну.

Розділ 1. Характеристика технологічного процесу одержання хлортетрацикліну

Технологічний процес одержання хлортетрацикліну (додаток 1, рис.1.1) полягає у тому, що для цього використовують споровий матеріал недосконалого гриба Streptomyces aureofaciens.

Виробництво відбувається шляхом глибинного культивування продуцента Streptomyces aureofaciens в стерильних умовах. Воно включає вирощування посівного матеріалу на поживному середовищі, приготування ферментаційного середовища, внесення посівного матеріалу в ферментаційне середовище для вирощування промислової культури, підлужування культуральної рідини, фільтрацію з відокремленням міцеліальної маси і її сушіння.

Детальну схему стадій технологічного процесу одержання кормового хлортетрацикліну наведено у таблиці1.1.

Таблиця 1.1 Стадії одержання хлортетрацикліну

1. Підготовка пророщих спор Streptomyces aureofaciens
2. Підготовка поживного середовища і його стерилізація
3. Стерилізація повітря для аерації
4. Процес ферментації
5. Обробка ферментаційної біомаси
6. Процес відділення міцелію (фільтрування фільтр-пресом)
7. Перекристалізація
8. Упаковка, Маркування

1.1 Характеристика продуцента Streptomyces aureofaciens

У 1948 р з грунтів штату Міссурі Б. Дуггар виділив новий вид стрептоміцетів - Streptomyces aureofaciens, який утворює антибіотик ауреоміцин. Своє найменування Ауреоміцин отримав за видовим назвою продуцента цього антибіотика і золотистої забарвленням кристалічного продукту. Потім цьому антибіотику, виходячи з його хімічної будови, було дано загальноприйняту назву - хлортетрациклін. У промисловості хлортетрациклін випускається під назвами «біоміцин», «ауреоміцин», «дуоміцин».

S. aureofaciens - аеробний мікроорганізм, добре розвивається при температурі 26-28 ° С як на твердих (щільних), так і в рідких середовищах. Крім хлортетрациклина цей організм в значній кількості (до 0,5-0, 7 мкг / мл) утворює вітамін 12, тетрациклін, а також деякі інші антибіотичні речовини.

Для виробництва хлортетрацикліну використовують споровий матеріал S. Aureofaciens , який одержують із його міцелію.

На рисунку 1.1 наведено електронну мікрофотографію міцелію S. Aureofaciens , з якого виготовляють кормовий антибіотик хлортетрациклін.

Рис. 1.1 Мікрофотографія міцелію Streptomyces aureofaciens

1.2 Підготовка і стерилізація поживного середовища

Стадія підготовки поживного середовища та його стерилізація відіграють дуже важливу роль при виробництві хлортетрацикліну, хоча і не є головною.

Щоб отримати бажаний результат потрібно правильно підібрати склад поживного середовища та створити оптимальні умови для вирощування продуцента.

Streptomyces aureofaciens в якості джерела енергії може використовувати різні вуглеводи, однак для промислового виробництва цікаві лише сахароза, крохмаль і глюкоза. Максимальний вихід антибіотика достигають у результаті обмеження неорганічного азоту у середовищі і заміною його складними речовинами біологічного походження(борошно олійного насіння, арахісом, ядром кокосового горіха).

Поживне середовище для виробництва кормового хлортетрацикліну повинно складатися із таких компонентів: крохмаль, сахароза, мука із олійного насіння, м'ясні відходи, кукурудзяний екстракт, амонієві солі, вапно, поварена сіль.

Також у середовищі необхідна присутність катіонів мікроелементів Со, Сu, Zn, Mn, Fe).

Відсоткові співвідношення компонентів для приготування поживного середовища наведено у таблиці 1.2

Таблиця 1.2 Склад поживного середовища

Копоненти	Склад,%
Крохмаль	2-5
Сахароза	1-3
Борошно із олійного насіння	1-3
М'ясні відходи	0,2-0,5
Кукурудзяний екстракт	0,2-0,1
Амонієві солі	0,1-0,5
Вапно	0,5
Поварена сіль	0,1-0,5

Для того, щоб у середовище не попали інші небажані мікроорганізми, необхідно стерелізувати поживні середовища. У біотехнології найбільшого поширення набула термічна стерилізація. В технічних системах, що працюють в асептичних умовах, повинна забезпечуватися стерилізація всіх точок внутрішніх об'ємів апаратів, комунікацій, арматури, контрольно-вимірювальних приладів, які безпосередньо стикаються з чистими культурами цільових мікроорганізмів або зі стерильними матеріальними потоками. Для цього в кожній точці необхідно створити необхідну температуру і підтримувати її на протязі заданого проміжку часу.

Найбільшим бактерицидний ефект має насичена водяна пара під тиском. При стерилізації насиченою водяною парою спори найбільш стійких термофілів гинуть при температурі 121° C і часу експозиції 25 хв, при 132° С-за 4 хв. При використанні сухого пару час загибелі спор становить при 160° С - 60 хв., а при 180° С - 10 хв. Інактивація спор в киплячій воді при 100 ° С відбувається повільно, вони гинуть через 8-9 годин. Велике значення має вміст води в клітині мікроорганізму - чим більше води, тим нижче температура коагуляції білків. Саме цим пояснюється високий стерилізуючий ефект насиченої водяної пари - він не тільки нагріває, а й зволожує клітини, що підвищує їх термостійкість.

Стерилізацію поживних середовищ при роботі з невеликими обсягами потрібно вести в періодичному режимі в кілька етапів:

Ш стерилізація всіх комунікацій і ферментера гострим або глухим паром;

Ш наповнення апарату прогрітим гомогенезируючим середовищем;

Ш нагрівання живильного середовища до температури стерилізації;

Ш витримування при температурі стерилізації протягом часу, необхідного для загибелі всіх мікроорганізмів;

Ш охолодження стерильного живильного середовища в цій же ємності.

Цей спосіб стерилізації тривалий, і тому, щоб уникнути суттєвих змін в складі середовища, процес ведуть при надмірному тиску 0,5-1 атм при температурі 110-120° C протягом 1-1,5 годин з моменту досягнення заданої температури. Особливу увагу слід приділяти стерилізації апаратури і комунікацій, призначених для подачі піногасника (125-135° С протягом 1,5-2 годин). Стерилізацію здійснюють в наступній послідовності:

Ш вхідний і вихідний фільтри тонкого очищення, трубопроводи, арматура;

Ш ферментери;

Ш живильне середовище при наступних режимах: температура - 120-124° C, час витримки після досягнення заданої температури - 40-60 хвилин.

1.3 Підготовка посівного матеріалу

У біотехнологічних виробництвах, де відбувається посів на стерильні поживні середовища, дуже важливо правильно підготувати посівний матеріал. Це роблять для того, щоб одержана при вирощуванні культура була чистою і щоб з нею можна було виділити потрібний нам матеріал.

Посівний матеріал готують із пророщих спор продуцента Streptomyces aureofaciens. В умовах глибинного вирощування культури актиноміцетів розмножуються вегетативно, тобто частинами міцелію, шляхом відділення частин гіфів, у вигляді коротких ниток, паличок. На твердих поживних середовищах актиноміцети утворюють колонії міцелія, на поверхні яких потім розвиваються спорангії, які містять овальні або циліндричні спори.

В якості посівного матеріалу використовують спори, які при температурі 2-6°C можна зберігати до трьох місяців. Для розмноження культури в колбах використовують більш просте середовище(борошно та 3% кукурудзяний екстракт). Процес відбувається при рН 6,7-6,8, температурі 28-30° C на протязі 24 30 годин.

Розмноження посівного матеріалу (отримання міцеліальної маси) проводять в дві генерації в колбах (на 750 мл з 200 мл живильного середовища) на качалці (160-180 об / хв) і в посівному апараті. Тривалість кожної генерації 2-3 доби, температура вирощування 26-28 ° С(рис.1.2).

Міцеліальна маса, отримана після другої генерації, служить для засіву живильного середовища посівних апаратів з розрахунку 600-800 мл на 1 м3. Далі посівний матеріал розмножується в посівних апаратах (при постійній аерації, температури 26-28° С, протягом 45-50 год.) до кількості, рівного 10-12% робочого об'єму основного ферментатора.

Рис.1.2 Схема підготовки посівного матеріалу для одержання кормового хлортетрацикліну

Підвищення якості та продуктивності культури досягається за рахунок оптимального складу поживного середовища для посівних апаратів та застосування більш ефективних піногасників, як беруть в меншій кількості. Так, застосування пропінолу або свинячого жиру набагато покращує процес піногасіння, що дає змогу ефективно засвоювати культурою кисень ,повітря. Це в свою чергу впливає на якість і швидкість росту культури в посівному апараті. Підбір оптимального складу ферментаційного середовища є головним фактором, який забезпечує високий рівень активності культуральної рідини. Запропонований склад ферментаційного середовища дозволяє підвищити активність культуральної рідини до 5300 - 5800мкг/см3, що приводить до збільшення об'єму препарату і економії сировини та допоміжних матеріалів.

1.4 Основний процес ферментації

У біотехнологічному процесі одержання кормового хлортетрацикліну основним є процес ферментації. Ферментація (також зброджування) -- це анаеробний метаболічний розпад молекул за допомогою мікроорганізмів.

На рисунку 1.3 показано будову ферментатора із механічним перемішування.

Рис.1.3 Ферментатор із механічним перемішуванням

Ферментацію здійснюють у ферментаторі із нержавіючої сталі, який містить механічну мішалку із лопатями.

Протягом біосинтезу практично завжди спостерігається значне піноутворення, тому ступінь заповнення ферментерів рідко перевищує 50%, а в посівний і основний апарати передбачається періодична подача стерильного синтетичного піногасника.

Процес вирощування клітин продуцента можливо проводити в широкому інтервалі значень рН, проте накопичення антибіотика залежно від використовуваного штаму-продуцента здійснюється в строго контрольованих умовах: при певних значеннях рН середовища, температурі і аерації. Повний час біосинтезу хлортетрацикліну при 26-28°С складає 100-120 год.

У перший період спостерігається інтенсивне зростання міцелію, швидко споживаються джерела вуглецю, азоту і фосфору, потрібна підвищена аерація. Утворення антибіотика на цій стадії практично не відбувається. У культуральній рідині в невеликих кількостях накопичуються піровиноградна і оцтова кислоти, які надалі клітина використовує в біосинтезі тетрацикліну. У другому періоді спостерігається різке зниження швидкості росту клітин і споживання живильних речовин, накопичення піровиноградної і оцтової кислот не відбувається, здійснюється активний біосинтез антибіотика.

Покращення асептики виробництва досягається за рахунок того, що посівний матеріал та ферментаційне середовище подають в ферментатор з ліній, які знаходяться нижче купола ферментатора, що дає змогу не інфікувати культуральну рідину в процесі росту промислової культури.

Отриманий посівний матеріал передають на стадію основної ферментації в кількості 10-15% від об'єму середовища основних ферментерів. Технологічні параметри проведення процесу виробничої ферментації залишаються практично тими ж, що і на стадії культивування в посівному апараті. На всіх етапах культивування підтримуються строго асептичні умови.

Перед поданням культуральної рідини на ферментацію її додатково нагрівають до 60°С. Це дає змогу скоротити час ферментації до 4-8 годин, а також знизити втрати активності.

В процесі росту культури в ферментаторі може порушитись масообмін (змінюється густота, недостатньо повітря, розбалансування складу фе- рментаційного середовища). В результаті може знизитися рН культуральної рідини до значення 5,0 - 5,2 при нормі 5,7 - 6,0. При низькому значенні pH купьтуральна рідина стає рідкою, припиняється нагромадження антибіотика, її слід передати на фільтрацію. Згідно запропонованого способу, pH культуральної рідини контролюють в процесі росту промислової культури, і стабілізують значення рH до 5,7- 6,0 шляхом внесення в ферментатор необхідної кількості крейди. Це дає змогу продовжувати процес бioсинтезу до кінця і досягти активності культуральної рідини до 5000мкг/см3.

Культуральну рідину із ферментатора розсіваютъ на чашки Петрі з агаризованим середовищем. Чашки поміщають в термостат і вирощують на протязі 12-14 діб при температур 28°C. Відбирають чашки, на поверхні aгapy яких виросло 30 - 40 окремих колоній. Спори з поверхні кожної колонії переносять в пробірку з скошеним агаризованим середовищем. Пробірки поміщають в термостат на 12 - 14 діб і вирощують при температурі 28°С. Кожний моноізолят перевіряють на продуктивність шляхом ферментації культури в колбах з ферментаційним середовищем. Колби поміщають на качалки з обертами 240 - 260об/xв. Ферментацію ведуть на протязі 7- 8 діб при температурі 28°С. Визначають активність культуральної рідини однієї із колб і відбирають високоактивні моноізоляти. Активність моноізолятів досягає 11000мкг/см3. Високоактивні моноізоляти використовують для наробки робочих партій, які потім застосовують у виробництві.

Оскільки основним етапом мікробіологічного виробництва антибіотиків є процес ферментації продуцента, який здійснює синтез цільового продукту, особливу увагу необхідно приділяти конструкції ферментаторів їх автоматизації і забезпечення надійності виробничого процесу. Ферментатори повинні бути оснащені електронними стійками, які автоматично управляють процесом ферментації в автоматичному режимі і контролювати такі технологічні параметри, як значення рН, рівень розчиненого кисню, температу, тиск, число оборотів мішалки, рівень піни в апараті, витрату повітря, яке подається на аерацію. Також необхідно враховувати можливість послідовної передачі біологічного матеріалу з апаратів меншого обсягу в апарати більшого обсягу. Для забезпечення стерильних умов ферментації і захисту навколишнього середовища в складі ферментера повинні бути присутніми стерилізуючі фільтри тонкого очищення, наприклад, фірми РАLL або МILLIPORE (DURAPORE, MILIDISK), що забезпечують подачу в ферментер стерильного повітря і очищення відпрацьованого повітря, що викидається в атмосферу.

1.4.1 Аерація культуральної рідини в стерильних умовах

Ступінь бактеріальної очищення повітря, що подається на аерацію культуральної рідини, у багатьох випадках повинен бути вищим, ніж для повітря, що подається в «чисті» приміщення на більш відповідальних стадіях фармацевтичного виробництва хлортетрацикліну. У повному обсязі схема отримання стерильного стиснутого повітря багатостадійна і включає в себе фільтр на вході в компресор, компресop, теплообмінники для охолодження і нагрівання повітря, передфільтр, фільтр тонкого очищення.

Найбільш відповідальним вузлом в цьому переліку є фільтр тонкого очищення, який повинен задовольняти наступні вимоги:

v забезпечити гарантію 100% видалення бактерій з сухого і вологого повітря;

v мати досить тривалий термін служби (не менше 1 року);

v працювати при низькому вихідному перепаді тиску в продовженні тривалого періоду часу;

v мати властивості, що дозволяють періодично здійснювати стерилізацію паром;

v бути простим в обслуговуванні;

v мати надійне ущільнення фільтруючого елемента.

По механізму фільтрації фільтри тонкого очищення підрозділяються на поверхневі і глибинні.

Глибинні фільтри утримують відокремлювані частинки в усьому об'ємі фільтруючого матеріалу. Для їх виготовлення в даний час використовують волокнисті, порошкові і пресовані матеріали, а також пластик на паперовій або азбестовій основі. Імовірність затримки мікроорганізмів в таких фільтрах пов'язана з товщиною фільтруючого шару, внаслідок чого ступінь ефективності знаходиться в діапазоні 90-99%. Теоретично не можна видалити з повітряного потоку 100% мікроорганізмів, які в ньому перебувають. Тому застосування глибинних фільтрів можливо тільки на стадії попередньої фільтрації.

Поверхневим фільтрам властива абсолютна ефективність (100%). Механізм їх дії подібний до роботи сита. Частинки і мікроорганізми не можуть подолати мембрану, так як вона має пори, розмір яких менше, ніж розмір цих часток і мікроорганізмів. Як правило, мембрани виготовляють у вигляді простих листів з ефіру целюлози, чистої целюлози, неорганічних мікроволокон, покритих смолами, поліпропілена, нейлону, капрону, фторопласту та інших матеріалів, виготовленних як одне ціле. Розміри пор мембран в цих матеріалах лежать в широкому діапазоні від 0,1 мкм до 5 мкм. Для стерилізуючих фільтрів повітря, що подається в ферментери, як правило, використовують мембрани з розмірами пор 0,22мкм. Більшість фільтрів витримують протягом 1 року багаторазову стерилізацію при режимі 121° С протягом 30 хв, або 141° С протягом 10 хв.

1.4.2 Регулювання параметрів процесу біосинтезу

Управління технологічним процесом мікробіологічного синтезу полягає в підтримці на заданих рівнях значень основних технологічних параметрів.

Найбільш широко застосовують такі контури управління:

v регулювання температури культуральної рідини шляхом змін параметрів теплоносія;

v контроль і регулювання концентрації розчиненого кисню шляхом вимірювання витрати повітря, що подається на аерацію або числа обертів мішалки;

v підтримання тиску в ферментере шляхом відкриття або закриття клапана на лінії виходу повітря;

v стабілізація рН шляхом додавання кислоти або лугу;

v підтримання рівня піни у заданих межах шляхом внесення піногасника, зниження витрати повітря або зменшення числа оборотів мішалки;

v підтримку на заданому рівні концентрації інгредієнтів субстрату в культуральній рідині шляхом їх додавання в ферментер.

Регулювання температури суспензії в ферментаторі

Процес забезпечується за рахунок подачі в «рубашку» апарата теплоносія-суміші води і пари, що транспортується циркуляційним насосом. Регулювання температури теплоносія в діапазоні від 0 до 150° С з точністю до 0,5° С забезпечується за рахунок встановлення потрібної температури на стійці управління. Пароповітряна суміш, пройшовши через зворотний клапан і інжектор, в якому відбувається змішування води і пари, надходить у рубашку ферментера. Після виходу з рубашки, теплоносій надходить на вхід циркуляційного насоса. Надлишок теплоносія, що утворюється за рахунок конденсації пари, відводиться через відрегульований на певний тиск клапан. Контроль рівня розчиненого кисню

Розчинений кисень має винятково велике значення в процесах біосинтезу, характеризується інтенсивними швидкостями росту біомаси і підвищеними в'язкостями культуральної рідини, що характерно для процесів отримання антибіотиків. При анаеробному метаболізмі кисень відіграє роль акцептора електронів або водню за участю ферменту оксидази. Крім того, за допомогою оксигеназ кисень може вбудовуватися в молекулу вуглецевих субстратів при їх катаболизмі. Причому, кількість кисню, яка потрібна на одиницю біомаси, залежить від властивостей субстрата (вуглеводи вимагають меншої кількості кисню, а вуглеводні - значно більшого). Експериментально встановлено, що в разі ферментації бактерій і грибів, що використовують як джерело енергії вуглеводи, на 1 г сухої біомаси потрібно 1 г кисню (теоретично для біосинтезу 3,39 г сухої біомаси-1 г кисню). Кисень є важко розчинним газом (8 мг / л при 25 ° С%; 7 мг / л при 35 ° C), причому наявність солей у рідині суттєво знижує розчинність в ній кисню. При високому вмісті біомаси в культуральній рідині (споживання кисню може досягати 50 г / л) необхідно інтенсивно поповнювати середовище розчиненим киснем. Датчики, що реєструють концентрацію розчиненого кисню та витримують багаторазову стерилізацію, засновані на методі полярографічного визначення дифузійного потоку кисню через напівпроникну мембрану, під якою розміщується анод (матеріал свинець або срібло) і катод (матеріал платина) в розчині електроліту . Датчики мають температурну компенсацію в діапазоні 0 50° С.

Регулювання робочого тиску у ферментаторі

Робочий тиск в ферментаторі може змінюватися від 0 до 2,5 атм. Результуючий сигнал від датчика тиску перетворюється в електричний сигнал і по команді від блоку управління за допомогою клапана зворотного тиску підтримує його в заданих межах. Контур тиску додатково оснащений контрольним манометром.

Регулювання водневих іонів(рН)

Концентрація водневих іонів (рН) -важливий параметр, який впливає на ріст мікроорганізмів і утворення кінцевого продукту. Бактерії зазвичай ростуть в діапазоні значень рН 4-8, дріжджі при рН 3-6, мікроскопічні гриби при рН 3-7. З різних причин рН в ході ферментації мають тенденцію до зміни, тому необхідна схема управління і підтримки рН на оптимальному рівні. Регулювання рН здійснюється автоматично додаванням кислоти або лугу за допомогою перистальтичних насосів (температурна компенсація 0-100 ° C). 1.4.3 Регулювання рівня піни

Процес культивування аеробних мікроорганізмів супроводжується утворенням піни. Це пов'язано :

v по-перше, із введенням в рідину повітря;

v по-друге, з наявністю в складі культуральної рідини білків та інших поверхнево активних речовин, стабілізуючих бульбашки піни.

У стійкій піні тривалість існування бульбашки 1-15 хв. Інтенсивне піноутворення пригнічує максимальне використання ємності біореактора, так як сприяє викиду піни і втрати цільового продукту. Крім того викид піни часто призводить до не стерильності продукту. Для піногасіння в даний час використовую різні методи:

v механічні (руйнування піни за рахунок ударної дії твердих поверхонь, впливу струменями рідини або газу, різка зміна тиску і інш.);

v хімічні (додавання поверхнево активних речовин, що зменшують міцність плівок, додавання речовин, що пов'язують піноутворювачі в поверхнево-неактивні комплекси);

v фізичні методи (електричне піногасіння, вплив коливань звукової або ультразвукової частоти та ін.);

v стабілізація рівня піни шляхом тимчасового зменшення подачі повітря або тимчасового припинення механічного перемішування, виведення надлишкової піни з біореактора.

Найбільш ефективними на мою думку є хімічні і механічні способи піногасіння або їх комбінації. Проблему пінення можна вирішити, якщо залишити у верхній частині реактора достатній обсяг порожнього простору, в якому б лопалися бульбашки повітря, але це зменшить робочий об'єм реактора на 25-30%.

Таким чином, регулювання рівня піни здійснюється декількома способами вплив на піну хімічними та фізико-хімічними методами; Размещено на http://www.allbest.ru/

руйнування піни механічними, гідро- і аеродинамічними способами;

руйнування піни коливаннями зРазмещено на http://www.allbest.ru/

вукової та ультразвукової частоти; стабілізація рівня піни зменшенням витрат аеруючого повітря і зниженням числа оборотів мішалки.

1.5 Обробка, сушіння та фасування

Для хімічного піногасіння найбільшого поширення отримали поліефірні препарати Пропінол Б-400 і адеканоль, поліметилсилоксани АС-60 та ін. В ході культивування хімічні піногасники можуть подаватися або за заздалегідь заданою програмою, або в міру необхідності при підвищенні рівня піни.

Отриману культуральну рідину направляють на подальшу переробку по одному з двох способів.

Перший з них :

- культуральну рідину, що містить близько 3 % сухих речовин, концентрують вакуум-упарюванням до вмісту СВ 10- 12%;

- у отриманий концентрат додають консервант - піросульфат натрію з розрахунку 2-3 кг на 1 м3 культуральної рідини і висушують в розпилювальній сушарці.

Якщо вміст антибіотика в 1 кг сухого препарату виявляється вищим, ніж це встановлено технічними умовами (зазвичай воно коливається в межах 90-150 грама/кг), то отримуваний продукт підлягає стандартизації шляхом змішення з відповідною кількістю наповнювача. При стандартизації біовіта по активності як наповнювачі використовують тонкоподрібнені висівки, муку знежирену, кукурудзяну або соєву, або буряковий жом.

Інший спосіб припускає проведення наступних технологічних операцій:

v Культуральну рідину в окремому збірнику обробляють розчином гашеного вапна з метою переведення розчиненого у воді хлортетрацикліну в осад у вигляді кальцієвої солі. Отриманий осад направляють на фільтр-прес.

v Осад з фільтр-преса вивантажують в бункер і за допомогою шнекорозгрузочного механізму він йде на грануляцію, а потім на сушку.

v Висушені гранули по трубопроводу пневмотранспортом збирають в окремий збірник і далі поступають на стадії дроблення і подрібнення.

Отриманий продукт стандартизують також шляхом змішення з необхідною кількістю наповнювача.

Препарати хлортетрацикліну розфасовують по 10-20 кг в двошарові паперові - мішки, поміщені в мішки з бязі. Зберігають в сухих затемнених приміщеннях при температурі не вище 25°С. Термін зберігання біовіта-20 встановлений в 6 міс, біовіта-40 і -80 - 1 рік з дня виготовлення. Готову культуральну рідину, що містить до 4,5 % сухих речовин, направляють на вакуум-упарювання, яке здійснюють при 50-60°С до вмісту 12-15%.

Сконцентрована культуральна рідина поступає на розпилювальну сушарку і висушується при температурах вхідного теплоносія, що виходить, відповідно 160-200 і 70-80°С. В деяких випадках сушку культуральної рідини здійснюють спільно з наповнювачем, як який беруть сушений буряковий жом з розрахунку 250 кг на 1 м3 культуральної рідини. Отримувану при цьому пастоподібну масу висушують на вальцово-стрічковій сушарці або на сушарці з псевдокиплячим шаром.

Екстракцію антибіотиків з культуральної рідини проводять ацетоном, бутанолом і іншими органічними розчинниками. Необхідно відзначити, що при екстракції антибіотиків використовують різні значення рН.

Технологія виділення антибіотиків включає: екстракцію антибіотиків підходящими розчинниками, осадження і перекристалізація їх з різних середовищ, фракціонування на іонообмінних смолах, ліофільну і розпилювальну сушку готових препаратів. На екстракцію антибіотика в значній мірі впливає значення рН. Так, наприклад, при виділенні антрациклінових антибіотиків встановлено, що антраціклінові антибіотики взаємодіють із полімерними сорбентами по іонному і гідрофобному механізмах. Найбільш селективна сорбція відбувається на сегрегованому карбоксильному катіоні БДМ-12. Показано, що максимальне поглинання антрациклінового антибіотика знаходиться в області нейтральних значень рН, коли в системі сорбент - сорбат реалізуються як іонні, так і гідрофобні взаємодії. З культурального середовища антибіотики виділяють екстракцією органічними розчинниками, осадженням, адсорбцією. Очищення антибіотиків проводять повторною заміною розчинника, адсорбційно-хроматографічними методами, високоефективної рідини хроматографією(ВЕРХ). Від ступеня чистоти препарату, вологості, температури, рН розчинника залежить стабільність антибіотика.

Отже, технологічний процес одержання кормового хлортетрацикліну складається:

1) Підготовка і стерилізація апаратури та дрібного приладдя;

2) Підготовка і стерилізація поживного середовища;

3) Одержання посівного матеріалу із спорового матеріалу продуцента;

4) Ферментація посівного матеріалу із ферментаційним середовищем у ферментаторі;

5) Виділення хлортетрацикліну;

6) Фасування та маркування.

Розділ 2. Методи визначення рН

2.1 Електрометричний метод визначення рН

Метод заснований на тому, що при зануренні електроду в розчин відбувається обмін іонів між електродом і розчином, внаслідок чого на електроді виникає потенціал, величина якого залежить від концентрації водневих іонів в розчині. Його можна виміряти, якщо скласти гальванічний елемент з електрода, потенціал якого хочуть виміряти (індикаторний електрод), і допоміжного електрода з відомим потенціалом (електрод порівняння). У справжній час як індикаторний застосовують скляний і сурм'яний електроди, а в якості електродів порівняння - хлорсрібний і каломильний.

Скляний електрод відноситься до типу мембранних електродів. Він виготовляється у вигляді скляної трубки, що закінчується тонкостінною кулькою зі спеціального складу. Всередину кульки поміщають внутрішній контактний електрод, упаяний в скляну трубку. Контактний електрод виготовлений з амальгованого платинового дроту і грає роль провідника струму. Кулька заповнена 0,1 н. розчином соляної кислоти. Для захисту від механічних пошкоджень кульки поміщають всередину трубки з отворами через які здійснюється доступ досліджуваного розчину до кульки і промивка скляного електрода.

Скляна мембрана здатна обмінювати катіони, які в ній містяться (Na+, K +, Li +) на іони водню в розчині. Внаслідок цього обміну на внутрішній і зовнішній поверхнях скляної кульки встановлюється іонна рівновага, яка виділяє потенціал обох поверхонь кульки. Оскільки склад розчину всередині кульки залишається постійним, сума потенціалів внутрішнього контактного електрода і внутрішньої поверхні кульки постійна. Отже, потенціал скляного електрода залежить тільки від концентрації іонів водню в досліджуваному розчині. Потенціал скляного електрода в інтервалі рН від 1 до 10 є лінійною функцією величини рН і не залежить від присутністю в розчині окислювачів і відновників. Так як сума потенціалів внутрішньої кульки і контактного електрода невідома, то попередньо проводять калібрування скляного електрода по буферному розчину з рH, близьким до рH досліджуваного розчину.

Рис. 2.1 1 - скляна мембрана (сенсорна частина електроду); 2 - іноді може утворюватися осад; 3 - внутрішній розчин ( як правило, 0,1М соляна кислота); 4 - внутрішній електрод; 5 - корпус електроду, виготовлений з або напівпровідного скла або пластику; 6 - електрод порівняння; 7 - з'єднання з розчином, що досліджується

Сурм'яний електрод є металооксидним електродом, застосування якого засновано на наступному явищі. Якщо метал занурити в розчин, що містить іони цього ж металу, то внаслідок обміну між ними іонів на електроді виникне потенціал, величина якого залежить від концентрації іонів в розчині. Сурм'яний електрод являє собою метал, покритий тонким шаром оксиду металу. Необхідний шар оксиду виникає за рахунок окислення сурми киснем повітря. При зануренні електрода в розчин оксиду сурми (ІІІ) Sb2О3, перетворюється в слаборозчинний гідроксид Sb (ОН)з. Ступінь його розчинення, а отже, і величина потенціала електрода лінійно залежать від pH розчину, Перед визначенням рН перевіряють показання електрода по буферним розчинам.

Хлорсрібний електрод виготовляють з срібного дроту, який шляхом анодної обробки в хлоридному розчині покривають тонким шаром хлориду срібла. Виготовлену таким чином дріт занурюють в насичений розчин хлориду калію. Потенціал хлорсрібного електроду є лінійною функцією логарифма активності хлорид-іонів в розчині. Так як концентрація Cl-іонів в насиченому розчині хлориду калію завжди постійна, то і розчинність хлориду срібла в ньому є постійною величиною, отже, і величина потенціала хлорсрібного електрода стійка, що дозволяє використовувати його в якості електрода порівняння.

На рисунку 2.2 наведено детальну будову хлорсрібного електроду типу ЕВЛ-1-М3.

Рис. 2.2 Будова хлорсрібного електроду ЕВЛ-1-М3: 1 - срібна дротинка; 2 - кристали AgCl; 3 - гумовий корок і отвір для заливання розчину KCl; 4 - розчин KCl; 5 - азбестова нитка; 6 - корпус; 7 - капіляр.

У лабораторній практиці для вимірювання рН застосовують при- бори різних марок. Найбільш точними з них є рН-метри марок ЛПУ-01, РН-340(додаток 2), універсальний ЕВ-74 ( додаток 3).

2.2 Визначення рН за допомогою рН-метра ЛПУ-01

Принцип роботи приладу заснований на вимірі ЕРС гальванічного елемента, складеного із скляного (індикаторного) і хлорсрібного (допоміжного) електродів. Шкала прибору градуйована в одиницях рH і мілівольтах. Межі вимірювання рН від 2 до 14. Для підвищення точності вимірювання прилад має чотири діапазони з вузькими інтервалами значення рН. У цих інтервалах похибка приладу не перевищує 1%; в інтервалі рН 2-14 вище + 2,5% від діапазону вимірювань.

На рисунку 2.3 зображено схему рН - метра ЛПУ-01

Рис. 2.3 Схема рН - метра ЛПУ-01: 1 - кулька із електродного стекла; 2 - розчин, який заповнює внутрішню проміжність електрода; 3 - внутрішній контактний електрод; 4 - допоміжний електрод; 5 - електролітичний контакт; 6 - пориста перегородка; 7 - рН - метр ЛПУ-01; 8 - скляний електрод.

Прилад (рис. 2.3) складається з гальванічного елемента (датчика) і вимірювача. Всі частини датчика зібрані на штативі. На верхньому кінці штатива закріплений проточний допоміжний електрод, який помістили в поліетиленову посудину. У нижній частині штатива є рухомий столик для установки склянки з досліджуваним розчином і електродами. Електричний контакт між двома електродами здійснюється через стовпчик насиченого розчину хлориду калію, який витікає з поліетиленової посудини по гумовій трубці і скляному наконечнику в досліджуваний розчин. Розчин хлориду калію повільно (20 мл на добу) випливає через пористу перегородку наконечника, запобігаючи таким чином проникнення посторонніх іонів з досліджуваного розчину в посудину з допоміжним електродом. Необхідно стежити, щоб в трубці електроду не було бульбашок повітря, які порушують контакт контакт. Скляний електрод і наконечник кріпиться на кронштейн зажимами. У комплекті датчика є електролітичний контакт для вимірювань рН розчинів об'ємом до 1 мл.

Рис. 2.4 Панель рН - метра ЛПУ-01

На панелі вимірювача (рис. 2.4) знаходиться шкала, яка показує 5 значень рН: від -2 до 2, від 2 до 6, від 6 до 10, від 10 до 14 і від-2 до 14, а також шкали для вимірювання EРС. На панелі також видно всі ручки для керування пристроєм. Перед початком роботи електроди ретельно промивають водою та висушують фільтрувальною папером. До гнізда за допомогою штекера підключають датчик, пристрій включений в мережу, тумблер встановлений "ввімкнуто"(при цьому загоряється контрольна лампочка) і прилад прогрівають 30 хв. Рукоятку перемикання «Види робіт» встановлюють в положення «рН», а рукоятку компенсатора температури - на потрібне значення температури. Вимірювання проводять при 20-30° С , так як при цій температурі відхилення в значеннях рH лежать в межах погрішності приладу. Після прогріву приладу приступають до його налаштуванні за стандартними буферним розчинам з відомим значенням рН.

Буферні розчини готують із спеціальних фіксаналів. Для настройки беруть буферний розчин, рН якого близький до рH досліджуваного розчину. Буферний розчин наливають у склянку на 200 мл, столик на штативі відводять вліво, стакан підставляють під електроди, повертають стіл і опускають на нього склянку. Столик встановлюють на такій висоті, щоб електроди були занурені в розчин на глибину 2 - 4 см. Перемикач меж вимірювань ставлять проти потрібного діапазона вимірювань і через 0,5-1 хв. ручкою настройки по буферному розчині стрілку на шкалі підводять до поділки, відповідного значення рH буферного розчину.

Вимірювання рН досліджуваного розчину проводиться в послідовності, прийнятій при настройці приладу. Якщо рН розчину абсолютно невідомий, то спочатку роблять орієнтоване визначення, ставлячи перемикач меж вимірювань в положення «2-14» і знімаючи відлік по шкалі, в одиницях рН від 2 до 14. Потім, не змінюючи розчину, перемикач встановлюють на позначку знайденого діапазону рH і відлік знімають за відповідною шкалою.

У перервах роботи електроди тримають в дистильованій воді, так як при висиханні змінюється їх характеристика. При появі плівок на електродах їх промивають органічними розчинниками, розчинами кислот і лугів, а потім дистильованою водою. Похибка приладу за стандартними буферним розчином не вище 0,02 рН, а чутливість не нижче 0,01 рН.

Перевірку нового приладу або нового скляного електрода проводять по буферним розчинам в перші кілька днів щоденно, а в подальшому - раз в тиждень. У виробничому контролі прилади використовують для визначення не тільки рН, а й титрованої кислотності методом електрометричного титрування.

2.3 Колориметричний метод визначення рН

Метод заснований на застосуванні індикаторів, забарвлення яких залежить від величини рН. Ці індикатори інакше називають pH-індикаторами. Згідно теорія електролітичної дисоціації індикатори являють собою слабкі органічні кислоти або луги, у яких іони і не дисоційованні молекули мають різне забарвлення. Індикатори бувають однокольоровими (забарвлена одна форма) і двохкольоровими (забарвлені дві форми). Так, наприклад, фенолфталеїн, який являє собою слабку кислоту, є одноколірним індикатором, молекули якого безбарві, а аніони пофарбовані в малиновий колір. Фенолфталеїн є слабким електролітом, тому у нейтральному середовищі рівновага зміщується вліво. У кислому середовищі дисоціацію молекул фенолфталеїна пригнічують присутні в розчині іони водню, внаслідок чого фенолфталеїн також залишається безбарвним і його не дисоційовану молекулу називають кислотною формою індикатора.

У лужному середовищі іони водню, які утворюються при дисоціації будуть зв'язуватися з гідроксильними іонами середовища і рівновага зміститься вправо, що призведе до накопичення аніонів індикатора, які забарвлять розчин в малиновий колір. У цьому випадку аніони індикатора, що зумовили забарвлення розчину, носять назву лужної форми індикатора. Аналогічним чином відбувається зміна забарвлення і основних індикаторів, до яких відноситься, наприклад, метил - оранж. Таким чином, забарвлення індикатора в розчині визначається співвідношенням концентрацій його іонів і не дисоціюючих молекул: R- / HR. У розчині завжди присутні обидві форми індикатора, але перехід забарвлення спостерігається тільки при визначеному співвідношенні обох форм. Отже, видима зміна забарвлення індикатора відбувається не при будь-якій зміні рН, а лише всередині певного діапазона його значень, які називаються інтервалом переходу індикатора. Інтервали переходу найбільш часто вживаних індикаторів наведені в таблиці 1.3.

Знаючи інтервал переходу індикатора, можна за забарвленням розчину наближено визначити рН. Для цього спочатку по лакмусу встановлюють реакцію середовища. Якщо після додавання лакмусу розчин забарвиться в червоний колір, значить реакція кисла і потрібно брати індикатори з інтервалом переходу в кислому середовищі. Потім, послідовно проводячи проби з різними індикаторами, знаходять такий, при якому забарвлення розчину відповідає лужній формі індикатора. Значення рH розчину буде перебувати між інтервалами переходу двох останніх індикаторів. Наприклад, якщо при добавці метиленового червоного розчин забарвлюється у червоний колір, а при добавці метилового оранжевого - в помаранчевий, то рН розчину лежить в межах 3,1-4,2.

Для орієнтуючого, визначення рН користуються універсальними індикаторами, що представляють собою суміш індикаторів з інтервалами переходу від сильно кислої до сильно лужної реакції середовища.

pН-індикатори застосовують у вигляді розчинів, індикаторних олівців і індикаторних папірців.

2.4 Визначення рН за допомогою індикаторних папірців

Заводи в Україні випускають два набори індикаторних папірців. Перший набір призначений для орієнтуючого виявлення рH. Він містить універсальну індикаторні папірці і кольорову шкалу порівняння. Для визначення рН смужку змочують досліджуваним розчином і порівнюють її колір зі шкалою. За збігом забарвлень знаходять приблизне значення рН розчину. Другий набір використовується для точного визначення рН. У ньому є кольорові смужки з цифрами, що вказують вузькі діапазони чутливості(1,8-3,6; 3,6-5,7; 5,7-7,4; ... 12,4-13,6 рH), і індикаторні папірці з відповідним інтервалом переходу. Встановивши наближене зпаченне рH розчину, беруть відповідну смужку індикаторного папірця, занурюють її в розчин до повного змочування, а потім колір середньої частини папірці порівнюють із забарвленням кольорових шкал, знаходячи межі рH, в яких відтінок шкали повністю збігається з забарвленням індикаторного папірця. Точність методу ке перевищує 0,1 рН.

Отже, вимірювання показника рН можна проводити різними методами. Найбільш використовуваними є:

· Електрометричний метод (вимірювання за допомогою рН- метрів марок ЛПУ-01, 340, універсальний ЕВ-74);

· Колориметричний метод (вимірювання проводяться із додаванням індикаторів);

· Метод індикаторних папірців.

Розділ 3. Застосування методу рН-метрії на різних стадіях технологічного процесу одержання хлортетрацикліну

У біотехнологічних виробництвах водневий показник (рН) відіграє дуже важливу роль, адже майже на всіх стадіях технологічного процесу потрібно знати його значення. Це потрібно знати для того, щоб враховуючи цей показник ми змогли його змінити, якщо він нас не влаштовує.

На етапі підготовки поживного середовища показник рН повинен знаходитися у межах від 6,5 до 6,7. Для того, щоб у цьому переконатися ми маємо виміряти цей показник за допомогою електрометричного методу. Суть цього методу полягає у застосуванні рН - метра марки ЛПУ-01. Спочатку рН-метр відкалібровують ,промиваючи декілька разів електроди дистильованою водою. Потім готують поживне середовище, переливають його у склянку 100 мл і повільну занурюємо у нього електроди. Чекаємо доки на передній панелі остаточно зупиниться значення. Якщо отримане значення нас не задовольняє ми або підкислюємо середовище або додаємо крейду, для регуляції рН середовища.

На цій стадії технологічного процесу значення рН повинно знаходитися у межах від 6,7 до 6,8. Як бачемо значення відрізняються дуже маленьким інтервалом, тому саме тут потрібно приділити особливу увагу, щоб точно виміряти значення.

Вимірювання проводять на рН - метрі такої ж марки, як і у попередньому досліді.

Досліджуваний розчин готують із спорового матеріалу продуцента (недосконалого гриба) Streptomyces aureofaciens. Для зручності його переносять у мірний стакан об'ємом 100 - 200 мл. Прилад промиваємо після попереднього досліду шляхом занурення електродів у стакан із дистильованою водою. Потім відсуваємо столик рН - метра, знімаємо стакан із дистильованою водою і ставимо склянку із досліджуваним матеріалом. Столик повертаємо у вихідне положення і занурюємо електроди у нашу склянку із досліджуваним матеріалом. За аналогією чекаємо остаточної зупинки значення на передній панелі. Записуємо результат.

На стадії ферментації показник рН повинен знаходитися у межах від 5,8 до 6,0. Саме на цій стадії показник рН має найбільше значення оскільки при його раптовому зниженні може відбутися розплавлення культуральної рідини. Це призведе до зупинки нагромадження антибіотика, що не припустимо на цьому етапі.

Вимірювання проводять для ферментаційного середовища, яке разом із посівним матеріалом вносять у ферментатор із механічним перемішуванням.

Так як ми вже провили вимірювання рН посівного матеріалу, то потрібно провести таке ж вимірювання і для ферментаційного середовища.

Спочатку за аналогією промивають електроди рН - метра у дистильованій воді після попереднього вимірювання. Потім їх опускають у досліджуваний розчин і чекають остаточного зупинення значення.

Визначення показника рН можна проводити і іншими методами, наприклад, колориметричним (застосування індикаторів) або за допомогою індикаторних папірців. Але ці методи не відповідають нашим вимогам, оскільки нам потрібно знати не наближені значення рН а точні, що дозволяє ли електрометричний метод.

Отже, у біотехнологічних виробництвах антибіотиків на різних стадіях технологічного процесу потрібно вимірювати значення показника рН, для того, щоб уникнути окислювання середовище. Якщо це відбулося до досліджуваного розчину потрібно додати трішки крейди для устаткування значення рН.

Висновки

v Технологічний процес одержання кормового хлортетрацикліну складається:

1)Підготовка і стерилізація апаратури та дрібного приладдя;

2)Підготовка і стерилізація поживного середовища;

3)Одержання посівного матеріалу із спорового матеріалу продуцента;

4)Ферментація посівного матеріалу із ферментаційним середовищем у ферментаторі;

5)Виділення хлортетрацикліну;

6)Фасування та маркування.

Якщо, дотримуватися всіх вище зазначених рекомендацій щодо одержання хлортетрацикліну, можна домогтися максимального виходу антибіотику.

v Вимірювання показника рН можна проводити різними методами.

Найбільш використовуваними є:

* Електрометричний метод (вимірювання за допомогою рН- метрів марок ЛПУ-01, 340, універсальний ЕВ-74);

* Колориметричний метод (вимірювання проводяться із додаванням індикаторів);

* Метод індикаторних папірців.

v У біотехнологічних виробництвах антибіотиків на різних стадіях технологічного процесу потрібно вимірювати значення показника рН, для того, щоб уникнути окислювання середовище. Якщо це відбулося до досліджуваного розчину потрібно додати трішки крейди для устаткування значення рН.

кормовий хлортетрациклін посівний ферментація

Список використаної літератури

1. Великая Е.И., Суходол В.Ф.: В 26 «Лабораторный практикум по курсу общей технологии бродильных производств (общие методы контроля)».- 2-е изд., перераб. И доп.-М.: Легкая и пищевая промышленость, 1983. - 312 с.

2. Краснопольський Ю.М., Клещев Н.Ф.: К 78: Фармацевтическая биотехнология: Производство биологически активных веществ: учеб.пособие: в 2 ч. - Ч. 1 / Харьков : НТУ ХПИ, 2013. - 304 с.

3. Калтинский А.В., Сазыкин Ю.О., Орехов С. Н., «Биотехнология» Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова, 2005.- 215 с.

4. М.С. Мосичев, А.А. Складнев, В Б. Котов: М 81 « Общая технология микробиологических производств».- УДК 663.1.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. - 165 с.

Додаток 1

Рис.1.1 Технологічна схема одержання хлортетрацикліну

Додаток 2

Рис. 2.1 рН - метр марки РН-340

Додаток 3

Рис. 3.1 рН-метр марки ЕВ-74

Размещено на Allbest.ru