Применение биоимпедансного анализа в тканевой инженерии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Применение биоимпедансного анализа в тканевой инженерии

В.В. Антипенко,

Е.А. Печерская,

С.А. Зарывахина,

О.В. Карпанин

Аннотация

Обосновывается обусловленная быстрым развитием области тканевой инженерии необходимость внедрения методов мониторинга для определения жизнеспособности и характеристик клеточных структур в режиме реального времени. Анализируются современные методы мониторинга, которые требуют маркировки и включают в себя деструктивные способы для определения жизнеспособности клеточных структур. Изучаются основные свойства электродов для измерения биоимпеданса. Рассматривается биоимпедансный метод, основанный на измерении проводимости биологических тканей.

Ключевые слова: биоимпедансный анализ, диэлектрическая проницаемость, электрод, неинвазивный метод.

Введение

Тканевая инженерия - это наука о создании тканей для замены больных тканей или органов в организме. Достижения в области биотехнологии и материаловедения привели к быстрому развитию тканевой инженерии. Полимеры, гидрогели и децеллюляризованные ткани животных представляют собой различные типы биоматериалов, которые используются для создания тканевых инженерных конструкций в комбинации с клетками. Благодаря способности генерировать дифференцированные клетки, тканевые инженерные конструкции обычно сначала культивируют в пробирке перед их трансплантацией в естественные условия. Для оценки тканевых инженерных конструкций следует использовать методы, которые могут предоставить информацию о морфологическом и функциональном поведении клеточных структур в режиме реального времени и неинвазивным способом. Из-за высокой стоимости и небольшого количества доноров методы мониторинга должны быть неразрушающими для клеточных структур. Используемая в настоящее время методика с целью исследования тканевых инженерных структур предоставляет полезную информацию о характеристиках тканевых инженерных конструкций. Однако такие методы, как гистологическое окрашивание, разрушительны и требуют много времени, фиксации и разрезания структур тканей. Следовательно, существует потребность в методах мониторинга в реальном времени и неинвазивного контроля для оценки качества тканевых инженерных конструкций [1, 2].

Основы биоимпедансного анализа

Биоимпеданс определяется как способность биологической ткани препятствовать электрическому току и считается пассивным электрическим свойством. Биоимпеданс может быть измерен путем определения реакции на электрическое возбуждение (ток или потенциал), которое прикладывается к биологической ткани. При измерениях биоимпеданса подача сигнала возбуждения и определение отклика выполняются электродами, которые преобразуют электронный заряд в ионный и наоборот. Электрический импеданс (Ј) представляет собой отношение напряжения (Ц) и тока (I):

Поскольку Z - сложная функция, ее можно выразить через сопротивление действительной части Я и мнимой части X, представляющей емкость. Важно отметить, что мнимая часть будет равна нулю при применении постоянного тока. Проводимость (У) является величиной, обратной сопротивлению. Импеданс и проводимость - основные параметры переменного тока.

Электрические свойства биологических тканей

В начале 1900-х гг. было показано, что жизнеспособность клеток может быть оценена путем измерения их электрических свойств. Электрические свойства биологических тканей зависят от физиологических, морфологических и патологических состояний ткани, а также от частоты применяемого электрического сигнала.

Электрические свойства биологических тканей, основанные на источнике электричества, могут быть как активными (эндогенными), так и пассивными (экзогенными). Активные свойства (биоэлектричество) возникают в результате ионной активности внутри клеток. Пассивные свойства появляются благодаря моделированию внешним источником электрического возбуждения.

Биологические ткани состоят из клеток с мембранами, окруженных внеклеточными жидкостями. Таким образом, дополнительное и внутриклеточное пространство разделяется клеточными мембранами, что создает два электропроводящих канала: дополнительный и внутриклеточный носитель. Внутриклеточные и внеклеточные жидкости создают резистивные пути. С другой стороны, клеточная мембрана липидного двойного слоя является очень тонкой (около 7 нм) и полупроницаемой, что благодаря изолирующей природе придает мембране высокую емкость и создает емкостное реактивное сопротивление.

Биологические ткани также могут проявлять индуктивные свойства, но по сравнению с сопротивлением и емкостным реактивным сопротивлением индуктивность очень мала на частотах ниже 10 МГц, поэтому ею часто можно пренебречь. Таким образом, электрический импеданс, создаваемый биологическими тканями, который также можно назвать биоимпедансом, является результатом как емкости, так и проводимости тканей, которые зависят от частоты.

Диэлектрическая проницаемость (г) также является одним из электрических свойств биологических тканей. Х.П. Шван был первым, кто изучил диэлектрические свойства биологических тканей в 1957 г. и понял, что и диэлектрическая проницаемость (г), и проводимость (а) являются частотно-зависимыми. В линейных условиях для биологической ткани проводимость клеток (У), импеданс клеток (.Ј = 1) и диэлектрическая

проницаемость (г) дают одинаковую информацию. Диэлектрическая проницаемость в основном выражается как относительная диэлектрическая проницаемость и уменьшается с увеличением частоты. Это связано с неспособностью ткани реагировать на быстрые изменения приложенного электрического поля [3].

Анализируя свойства биологических тканей в широком диапазоне частот, Шван осознал, что диэлектрические свойства характеризуются тремя дисперсиями, включая дисперсию, в-дисперсию и у-дисперсию, которые происходят соответственно на низкой частоте, радиочастоте и в микроволновом диапазоне частот:

1) а-дисперсия (от 10 Гц до нескольких кГц): связана с мембранами;

2) в-дисперсия (от 1 кГц до нескольких МГц): вызвана поляризацией клеточных мембран, белка и других органических макромолекул;

3) у-дисперсия (> 10 ГГц): связана с поляризацией молекул воды.

На низких частотах клеточные мембраны действуют как изолирующие барьеры, демонстрирующие резистивные пути, поэтому малый ток не сможет проходить через них, тогда как на более высоких частотах будут созданы емкостные пути мембран и ток сможет проходить через клетки из-за высокой емкости клеточных мембран (рис. 1).

На очень высоких частотах резистивные или емкостные пути не имеют большого вклада, так как ток не успевает протекать через мембраны поверхности клеток. Для изучения поведения и активности клеток в клеточной конструкции, сконструированной тканью, очевидным методом было бы применение электрического поля переменного тока к клеточной структуре и измерение электрических свойств клеточной конструкции [3, 5-7].

Общие свойства электродов для измерения биоимпеданса

При измерениях биоимпеданса, когда применяется переменный ток, электрод оказывает сопротивление на своей границе с тканью, которое сильно зависит от частоты. Изменения типа материала, который находится в контакте с электродом, влияют на величину и фазу импеданса электрода. Поэтому конечный измеренный импеданс системы представляет собой сумму импеданса поляризации электрода и импеданса ткани. Для материала и типа электрода импеданс будет определяться величиной сигнала возбуждения, а также размерами электрода и геометрической структурой. Чтобы выполнить измерения биоимпеданса, необходимо минимальное количество двух электродов, которое создало бы замкнутую цепь для прохождения электрического тока. Для контроля характеристик конструкции, спроектированной из ткани, могут использоваться различные конфигурации электродов. Импеданс на границе раздела между электродом и структурой клеток в большей степени отражается конфигурациями двух и трех электродов и влияет на измерения [8-10]. При объединении двух- и четырехэлектродных конфигураций могут быть изучены разные объемные слои одной и той же тканевой инженерии с меньшим вкладом от поляризационного импеданса электрода. Эта комбинированная конфигурация электрода может быть использована для обеспечения структурной информации в процессе роста стволовых клеток неразрушающим способом. Кроме того, благодаря использованию комбинаций двух-, трех- и четырехэлект-родных конфигураций можно применять больше пар электродов с различными пространственными распределениями для изучения трехмерной конструкции ячейки. Следует отметить, что такие факторы, как движение и неправильное расположение электродов, могут быть источником ошибки при измерениях биоимпеданса.

Рис. 1. Прохождение электрического тока через биологическую ткань:

а - биологическая ткань; б - электрическая эквивалентная схема [4]

Общие методы измерения биоимпеданса, применяемые в тканевой инженерии

Важными являются постоянный и неинвазивный мониторинг и характеристика конструктивно-модифицированных тканей в процессе их разработки. Сложная структура ЭБ-клеточных структур делает этот процесс оценки тяжелым.

Многие исследования были проведены для того, чтобы найти надежную неинвазивную методику для изучения характеристик различных клеточных структур, созданных тканями, и с иными целями, такими как оценка протоколов дифференцировки стволовых клеток. Оптические методы, основанные на флуоресценции, плотности, поглощении света и рассеянии, могут рассматриваться как надежные методы для клеточных суспензий, но их трудно внедрить для оценки клеток в микропористых каркасах. Сканирующая электронная микроскопия разрушительна для конструкции, спроектированной с точки зрения ткани, поскольку для ее оценки необходимы срезы в клеточной структуре. Ядерная и магнитно-резонансная томография, хотя и предлагают надежный метод мониторинга, но из-за их ионизирующей природымогут повредить структуру их клеток, а также являются дорогостоящими и имеют низкую портативность

В результате используются косвенные методы оценки роста клеток, которые измеряют содержание белка, ДНК или скорость поглощения кислорода.

С другой стороны, измерения электрического импеданса - простой и надежный метод для характеристики и оценки клеточных структур, их размера и формы, состояния клеточных мембран и состояния внутриклеточной и внеклеточной среды, что обусловлено тем, что в силу природы метода измерения импеданса можно обнаружить небольшие изменения электрических свойств ячеек.

Микросистемы могут обеспечить среду для клеточных структур, где возможен неинвазивный мониторинг поведения клеток с помощью электрических методов. Эти микросистемы могут быть использованы для обнаружения изменений электрических свойств клеток, подсчета и распознавания клеточной популяции, мониторинга клеточных функций, таких как рост и гибель клеток и клеточный цикл. Следовательно, можно сделать вывод, что измерение импеданса является неразрушающим и надежным методом мониторинга поведения клеточных структур с высоким временным разрешением [1].

Электрохимическая импедансная спектроскопия (EIS) была применена к биологическим тканям еще в 1925 г. Х. Фриком и С. Морсом и выполняется путем регистрации электрического импеданса ткани в диапазоне частот, где частотно-зависимые электрические свойства биологических тканей могут быть обнаружены. Поскольку электрические свойства биологических тканей связаны с их физиологическими и морфологическими свойствами, импедансная спектроскопия может быть использована в качестве метода оценки состава ткани.

Изменения, происходящие на границе раздела между электродом и тканью, имеют электрохимическую природу и являются результатом резистивных или емкостных свойств материалов. Изучение импеданса биологических тканей в частотном диапазоне показало, что действительная часть импеданса связана с резистивными путями в тканях, обычно велика на низких частотах, таких как 10 Гц или ниже, и уменьшается с увеличением частоты, тогда как мнимая часть импеданса связана с емкостными путями и уменьшается на высоких частотах.

В последние годы электрохимическая импедансная спектроскопия использовалась по-разному, включая тканевую инженерию, характеристику биологических клеток и мониторинг клеточных структур.

Показано, что наложение электрического поля импульсами высокого напряжения может вызвать разрушение клеточной мембраны, что приводит к изменениям ее целостности и удельного сопротивления. Поскольку характеристики клеточной мембраны и внутри- и внеклеточных пространств влияют на спектр импеданса, измерение электрического импеданса объема биологической ткани по частотному спектру дает информацию о количественных изменениях клеток, таких как их популяция [2-3].

Импедансная спектроскопия использовалась в качестве метода для мониторинга роста и дифференцировки стволовых клеток в различных направлениях тканевой инженерии. Например, исследователи изучали развитие стволовых клеток человека с помощью импедансной спектроскопии. При применении электрохимической импедансной спектроскопии было обнаружено значительное увеличение измеренной величины импеданса образцов, обработанных остеогенными стволовыми клетками человека, по сравнению с контрольными образцами.

Другие применения электрохимической импедансной спектроскопии включают количественную оценку размера ячейки, а также количество и классификацию типа и формы ячейки. Более того, этот метод может предоставить информацию о токсичности клеток, их инвазии или воспалении. Электрохимическая импедансная спектроскопия также может использоваться для мониторинга прикрепления и распространения клеток на субстратах в реальном времени и изучения изменений в эндотелиальных монослоях.

Электрохимическая импедансная спектроскопия - это неинвазивный метод мониторинга в режиме реального времени, который является относительно недорогим и может быть использован для характеристики конструкций, спроектированных тканями. Электрохимическая импедансная спектроскопия очень чувствительна к диэлектрической проницаемости клеточных мембран и поэтому может точно оценивать изменения в кл е- точных структурах при высоких напряжениях, используя передовые методы математического моделирования. Отсутствие меток является явным преимуществом электрохимической импедансной спектроскопии перед другими методами определения характеристик, которые требуют сложных процессов подготовки окрашивания образцов и обычно являются разрушительными. Тем не менее, электрохимическая импедансная спектроскопия менее специфична по сравнению с методами без меток, так как может выделить разные объемы ткани, и поэтому важно найти правильную конфигурацию электрода, которая обеспечила бы точные измерения [5].

Заключение

Перевод тканевых структур в клиническую практику часто ограничен отсутствием подходящих неинвазивных методов для визуализации параметров и поведения конструкций. В настоящее время мало неинвазивных методов, используемых для оценки характеристик или жизнеспособности тканей инженерных конструкций. Современные методы анализа и протоколы, применяемые в клеточной и тканевой инженерии, в основном являются гистологическими, требуют маркировки и включают деструктивные способы характеристики клеточных структур. Измерения импеданса могут предложить неинвазивный и надежный метод с высоким временным разрешением для мониторинга в реальном времени конструкций, сконструированных из ткани, на этапе производства, обеспечивая возможность мониторинга жизнеспособности, роста и дифференцировки клеток. тканевый инженерия клеточный

Библиографический список

1. Amini, M. Applications of Bioimpedance Measurement Techniques in Tissue Engineering / M. Amini, J. Hisdal, H. Kalv0y // J Electr Bioimp. - 2018. - Vol. 9. - P. 142-158.

2. Advances in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: Innovation and Transformation of Medicine: A Review Article / K. Dzobo, N. E. Thomford, D. A. Senthebane, H. Shipanga, A. Rowe, C. Dandara, M. Pillay // Stem Cells International. - 2018. - July.

3. Tabata, Y. Biomaterial technology for Tissue Engineering Applications / Y. Tabata // J R Soc Interface. - 2009. - № 6 (S311).

4. Николаев, Д.В. Биоимпедансный анализ состава тела человека / Д.В. Николаев, А.В. Смирнов, И.Г. Бобринская, С.Г. Руднев. - Москва: Наука, 2009. - 392 с.

5. Appel, A. A. Imaging Challenges in Biomaterials and Tissue Engineering / A. A. Appel, M. A. Anastasio, J. C. Larson, E. M. Brey // Biomaterials. - 2013. - № 34 (28). - 6615-6630.

6. Антипенко, В.В. Систематизация методов и средств измерения биоимпеданса / В.В. Антипенко, Е.А. Печерская // Инжиниринг и технологии. - 2020. - Vol. 5 (1).

7. Антипенко, В.В. Теория и основы биоимпедансного анализа в мониторинге клинического состояния и диагностике заболеваний / В.В. Антипенко, Е.А. Печерская // Методы, средства и технологии получения и обработки измерительной информации ("Шляндинские чтения - 2020", г. Пенза, 16-18 марта 2020 г). - Пенза: Изд-во ПГУ, 2020.

8. Грачев, А.Ю. Аппаратно-программный комплекс для автоматизированных измерений биоимпеданса / А.Ю. Грачев, О.В. Карпанин, Е.А. Печерская // Модели, системы, сети в экономике, технике, природе и обществе. - 2017. - № 1 (21). - С. 96-108.

9. Воробьева, Е.Ю. Факторы, влияющие на точность биоимпедансного анализа / Е.Ю. Воробьева, К.Ю. Крайнова, Е.А. Печерская, А.М. Бибарсова // Информационные технологии в науке и образовании. Проблемы и перспективы: сб. науч. ст. VI Всерос. межвуз. науч.-практ. конф. / под ред. Л.Р. Фионовой. - Пенза: Изд-во ПГУ, 2019. - С. 178-179.

10. Automated system for bioimpedance measuring / P. E. Golubkov, E. A. Pecherskaya, O. V. Kar- panin, K. Y. Kraynova, D. V. Artamonov, Y. V. Shepeleva // International Conference of Young Specialists on Micro/Nanotechnologies and Electron Devices, EDM - Proceedings. - Novosibirsk, 2018. - С. 641-644.

Размещено на Allbest.ru