Биотехнологическое производство ферментов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Биотехнологическое производство ферментов

Введение

В современной биотехнологии одно из видных мест принадлежит ферментам. Ферменты и ферментные системы широко используются в различных отраслях промышленности, медицине, сельском хозяйстве, химическом анализе и т.д.

Ферменты - вещества белковой природы и поэтому неустойчивы при хранении, а также чувствительны к тепловым воздействиям. Кроме того, ферменты не могут быть использованы многократно из-за трудностей в отделении их от реагентов и продуктов реакции.

Одним из важных направлений современной биотехнологии является получение на основе культивирования микроорганизмов и использование в сельском хозяйстве различных ферментных препаратов, которые могут применяться в процессе приготовления кормов для сельскохозяйственных животных как добавки к кормам для улучшения их усвояемости, а также в ветеринарии для профилактики и лечения желудочных и паразитарных заболеваний. Производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к отраслям, объём продукции которых постоянно растёт, а сфера применения неуклонно расширяется. Такое быстрое развитие связано с тем, что ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространены в природе, без них невозможны осуществление многих биохимических процессов и жизнь в целом.

Познание роли ферментов для всего живого на Земле послужило основой для становления и развития технологии ферментных препаратов как науки и для создания промышленного производства наиболее широко используемых ферментных препаратов. Применение этих препаратов помогло существенно изменить, интенсифицировать и усовершенствовать многие существующие технологии или даже создать принципиально новые высокоэффективные процессы. Применение ферментных препаратов различной степени очистки позволило не только улучшить показатели и выходы в различных биотехнологических процессах, но позволило усовершенствовать кормопроизводство, повысить усвояемость кормов, сделать более целенаправленным и эффективным действие синтетических моющих средств, улучшить качество косметических препаратов, создать целый арсенал специфических, чувствительных и точных аналитических методов, фналадить производство лекарственных и профилактических средств для медицинской промышленности и т. д.

Большим и неоспоримым достоинством ферментов перед химическими катализаторами является то, что они действуют при нормальном давлении, при температурах от 20 до 70 °С и рН в диапазоне от 4 до 9 и имеют в большинстве случаев исключительно высокую субстратную специфичность, что позволяет в сложной смеси биополимеров направленно воздействовать только на определенные соединения. Все это свидетельствует о том, что производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии, которое будет и далее интенсивно развиваться, и расширяться.

1. Ферменты

Ферменты как биологические катализаторы нашли широкое применение в практике. Их использование в промышленности выгодно с экономической и экологической точек зрения, поскольку они нетоксичны, работают в мягких условиях, используют доступное сырье (в том числе и отходы).

По объему производства ферменты занимают третье место после аминокислот и антибиотиков. Основная часть ферментов, поступающих на мировой рынок, приходится на долю гидролаз, из которых 60 % составляют пептидогидролазы (в основном щелочные и нейтральные протеазы), использующиеся в качестве детергентов в производстве синтетических моющих средств, а 30 % - гликозидазы, применяющиеся в производстве кондитерских изделий, фруктовых и овощных соков. Ферменты находят применение в текстильной, кожевенной, целлюлозобумажной, медицинской, химической промышленности (табл.7.1). Основным потребителем ферментов является пищевая промышленность. Главное место среди энзимов, применяемых в пищевой промышленности, занимают глюкоизомераза и глюкоамилаза и составляют около 50 % рынка пищевых энзиматических препаратов.

Ферменты широко используют в медицине, например, в заместительной терапии в составе лечебных препаратов. Эффективно применение протеиназ в энзимотерапии злокачественных новообразований. Это объясняется большей проницаемостью мембран аковых клеток для гидролитических ферментов в сравнении с нормальными клетками, благодаря чему опухолевые клетки быстро лизируются при введении смеси протеиназ (препарат «папайотин»).

Таблица 7.1.Применение ферментов (по Т.А. Егорова, 2003)

Название	Источники фермента	Химический и биотехнологический процессы. Область использования фермента
Амилазы	Бактерии, грибы (Bacillus, Aspergillus niger, A. oryzae)	Гидролиз крахмала до декстринов, мальтозы и глюкозы. Спиртовая, пивоваренная промышленность, хлебопечение, получение патоки, глюкозы
Глюкоизомераза	Более 80 видов микроорганизмов (Bacillus, Streptomyces albus, S.griseus)	Изомеризация D-глюкозы в D-фруктозу. Кондитерская, ликероводочная, безалкогольная промышленность, хлебопечение
Глюкооксидаза и каталаза	Penicillium chrysogenum, P.casei, P.nigricans, P. notatum, P.vitale. Aspergillus niger, Corynebacterium	Удаление кислорода и глюкозы (из яичного порошка, мясных и других продуктов). Виноделие, пивоваренная, консервная, безалкогольная промышленность
Липазы	Поджелудочные железы животных, семена растений, микроорганизмы (Candida lipolytica, Streptomyces flavogriseus, Aspergillus, Saccharomyces lipolytica)	Гидролиз жиров и масел. Пищевая, легкая, медицинская промышленность, сельское, коммунальное хозяйства, бытовая химия
Пектиназа	Многие микроорганизмы (Aspergillus, Fusarium, Penicillum и др.)	Гидролиз галактуронана, осветление вина и фруктовых соков
Пептидогидролазы	Поджелудочные железы и слизистая желудка животных; плоды, и побеги, отходы переработки некоторых растений (дынное дерево, инжир, ананас), микроорганизмы (Ваcillus, Aspergillus, Penicillium, Streptomyces, Pseudomonas)	Лизис белка. Получение аминокислот, производство и получение сыра, мягчение мясных рыбных изделий, выделка кожи, активизация пищеварения. Пивоварение, виноделие, хлебопечение, пищевая промышленность, сельское хозяйство, медицина
Целлюлазы	Микроорганизмы (Clostridium, Trichoderma reesei, Т. viridae, Alternaria tenuis, Aspergillus oryzae, Fusarium culmorum)	Гидролиз целлюлозы до глюкозы. Производство пищевых и кормовых белковых препаратов, этанола, глюкозо-фруктозных сиропов. Спиртовая, пивоваренная, пищеконцентратная промышленность, хлебопечение, кормопроизводство
Фруктофуранозидаза	Микроорганизмы (Aspeigillus, Penicillium, Fusarium, Cercospora beticola, Bacillus subtilis, Е. coli, Saccharomyces cerevisiae, Streptococcus mutans)	Инверсия сахарозы Кондитерская, ликероводочная, безалкогольная промышленность, сиропопроизводство

Протеолитические ферменты - плазмин и активирующие его стрептокиназу и урокиназу используют для растворения тромбов в кровеносных сосудах; коллагеназу - для рассасывания рубцовых образований; эластазу - для задержки развития атеросклероза; лизоцим - для лечения конъюнктивитов; дезоксирибонуклеазу из стрептококка (стрептодорназа) - для лечения заболеваний верхних дыхательных путей и роговицы глаза.

Важнейшую область применения ферментов в медицине составляет энзимодиагностика - тестирование патологии того или иного органа человека по уровню активности фермента или соотношению его множественных форм и изоферментов. Так, аспартатаминотрансфераза, изоцитратдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа и альдолаза служат для выявления инфаркта миокарда; аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза и лактатдегидрогеназа - для диагностики заболеваний печени; глутамилтрансфераза - для блокировки отторжения органов при их пересадке и т.д.

Большее развитие получают технологические процессы с участием сложных энзиматических систем, включающих коферменты.

Разработаны системы разделения рацематов посредством стереоспецифического активного транспорта.

Для деградации и модификации антропогенных органических соединений, поступающих в окружающую среду, используют ферменты разных классов и в том числе лигниназу, тирозиназу, монооксигеназу, диоксигеназу и др. Перспективна для очистки сточных вод новая технология, основанная на использовании реакции пластеинообразования. Сущность пластеинообразования заключается в синтезе белковоподобных веществ (пластеинов) под действием ряда протеолитических ферментов. Данная технология нацелена на производство в промышленных масштабах кормовых белков из аминокислот и пептидов сточных вод.

2. Источники ферментов

В качестве источников ферментов используют природные объекты, в которых содержание искомого энзима составляет не менее 1 %:

· растительные организмы только на определенной фазе их развития (проросшее зерно различных злаков и бобовых, латекс и сок зеленой массы ряда растений);

· отдельные ткани и органы животных (поджелудочная железа, слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта, сычуг крупного рогатого скота, семенники половозрелых животных);

· микроорганизмы (бактерии, грибы, дрожжи), содержащие набор большинства известных в настоящее время энзимов, количество которых можно повысить в десятки и сотни раз методами мутагенеза, селекции и индукции биосинтеза.

Существует ряд факторов, влияющих на биосинтез ферментов. В первую очередь, к ним относится генетический. Состав и количество синтезируемых ферментов наследственно детерминированы. Несмотря на определяющую роль генетического фактора в биосинтезе ферментов, производительность биотехнологических процессов зависит и от состава питательной среды. При этом важно не только наличие источников основных питательных веществ, но и веществ, играющих роль индукторов или репрессоров биосинтеза данного конкретного фермента или их групп (теория Ф.Жакоб и Ж.Моно). Например, при разработке процесса биосинтеза б-амилазы культурой Asp.oryzae замена сахарозы (как источника углерода) на крахмал увеличила активность фермента в 3 раза, добавление солодового экстракта (из проросших семян злаковых) ещё в 10 раз, а повышение концентрации основных элементов питательной среды на 50 % - ещё в 2 раза.

3. Технология получения ферментов микроорганизмов

В зависимости от источника технология получения ферментных препаратов имеет свои особенности. При извлечении ферментов из растительного сырья и животных тканей технология сводится к экстракции энзимов и очистке их от сопутствующих балластных веществ. Технология ферментных препаратов микробного происхождения более сложная, так как дополнительно включает этапы культивирования микроорганизмов - продуцентов ферментов, в том числе этапы получения посевного материала и производственной культуры соответствующего микроорганизма.

Глубинный метод культивирования продуцентов ферментов.

В этом случае микроорганизмы выращиваются в жидкой питательной среде. Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтрата перед его выделением.

При глубинном культивировании продуцентов ферментов выделяют, как и в любом биотехнологическом процессе, следующие этапы:

Приготовление питательных сред зависит от состава компонентов. Основными этапами подготовки питательной среды являются ее составлеине и стерилизация. Важнейшим фактором эффективности технологии ферментных препаратов является качество питательной среды. Основное требование к качеству питательной среды - полноценность ее состава, обеспечивающей рост соответствующего продуцента и биосинтез целевого фермента. Для культивирования ферментных продуцентов используют комплексные питательные среды, в состав которых входят отходы пищевых производств. Благодаря использованию отходов комплексные питательные среды доступны, дешевы и обеспечивают безотходность биотехнологических производств

Получение засевного материала. Для засева питательной среды материал готовят также глубинным методом. Вид его зависит от продуцента: для грибов это мицелиальная вегетативная масса, для бактерий - молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования. Получение посевного материала состоит в увеличении массы продуцента в 3 - 4 стадии. Объем посевного материала зависит от физиологических особенностей продуцента. Если продуцент размножается только вегетативно, он резко возрастает (до 5 - 20 %).

Производственное культивирование. Биосинтез ферментов в глубинной культуре протекает в течение 2 - 4 суток при непрерывной подаче воздуха и перемешивании. Высокая концентрация питательных веществ на первых этапах могут тормозить рост биомассы продуцента, поэтому часто свежая среда или некоторые её компоненты вводятся в ферментер на стадии активного роста. Температурный оптимум находится в интервале 22 - 32 ^оС. В современных технологических процессах ведется непрерывное автоматическое определение содержания в среде углеводов, количества образовавшихся метаболитов и концентрации клеток. Этим достигается максимальная производительность и наилучшее качество продуктов.

Выделение. В мицелии трёхсуточной культуры обычно остается не более 15 % ферментов. Остальные выделяются в окружающую клетки жидкую среду. В этом случае препараты ферментов выделяют из фильтратов после отделения биомассы.

Поверхностный метод культивирования продуцентов ферментов.

При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые частицы субстрата, из которого получают питательные вещества. Поскольку для дыхания клетки используют кислород, то среда должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим. Выращивание производственной культуры происходит обычно в асептических условиях. Преимущества поверхностной культуры: значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массу среды (при осахаривании крахмала 5 кг поверхностной культуры заменяют 100 кгкультуральной жидкости), поверхностная культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную форму.

Приготовление питательных сред. Основу питательной среды составляют пшеничные отруби, как источник необходимых питательных и ростовых веществ. Кроме того, они создают необходимую структуру среды. Для повышения активности ферментов к отрубям можно добавлять свекловичный жом, соевый шрот, крахмал, растительные отходы. Стерилизуют среду острым паром при помешивании (температура - 105 - 140 ^оС, время 60 - 90 минут). После этого среду засевают и раскладывают ровным слоем в стерильных кюветах. Кюветы помещают в растильные камеры. Культивируют в течение 36 - 48 часов.

Получение засевного материала. Посевной материал может быть трех видов:

ь культура, выросшая на твердой питательной среде;

ь поровый материал;

ь мицелиальная культура, выращенная глубинным способом.

Засевной материал получают в три этапа. Сначала музейную культуру продуцента пересевают на 1 - 1.5 г увлажненных стерильных пшеничных отрубей в пробирку и выращивают в термостате до обильного спорообразования. Второй этап - аналогично, но в колбах, третий - в сосудах с 500 г среды.

Производственное культивирование также делится на три периода, примерно равных по времени. Для создания благоприятных условий роста и развития продуцента необходима аэрация и поддержание оптимальной влажности (55 - 70 %):

ь набухание конидий и их прорастание (температура не ниже 28 ^оС);

ь рост мицелия в виде пушка серовато-белого цвета (необходимо выводить выделяемое тепло)

ь образование конидий.

Получение товарной формы. Выросшая в неподвижном слое при поверхностном культивировании культура представляет корж из набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся мицелием. Массу размельчают до гранул 55 мм. Культуру высушивают до 10 - 12 % влажности при температурах не выше 40 ^оС.

4. Выделение и очистка ферментных препаратов

Схема очистки сводится к следующему:

ь освобождение от нерастворимых веществ;

ь освобождение от сопутствующих растворимых веществ;

ь фракционирование (как правило, хроматографическими методами).

Исходным материалом для получения препаратов ферментов служат: биомасса продуцента, фильтрат культуральной жидкости, экстракт из культуры микроорганизма или из тканей и органов растений и животных, из которых готовят препараты различной степени очистки.

Выделение и очистка фермента как из культуры микроорганизма (выращенного любым способом), так и из других природных источников весьма трудоемкая и дорогостоящая процедура, поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищенного препарата, его не очищают. В промышленности широко применяют коммерческие препараты ферментов, чистота которых составляет всего 0,1 % (т.е. 99,9 % составляют примеси). К таким отраслям относятся спиртовая, кожевенная, текстильная промышленность, а также сельское хозяйство, производство бытовой химии. Например, ферментный препарат, употребляемый в пивоварении, представляет собой высушенную биомассу плесневых грибов.

В пищевой и особенно медицинской промышленности используются ферменты только высокой степени очистки.

Выделение ферментов из клеток продуцентов. Для выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохондрий, ядер и др., которые имеют в своем составе многие индивидуальные ферменты. Для этого используют специальные мельницы и гомогенизаторы, а также ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани. Для высвобождения ферментов из мембранных структур клетки к гомогенатам добавляют небольшие количества детергентов (твин, тритон Х-100) или обрабатывают их энзимами - лизоцимом, целлюлазой, лецитиназой С. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка (нейтральные значения рН, стабилизирующие добавки в виде белков, солей и специальных соединений).

Удаление балластных веществ. В зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствующих ему балластных веществ при получении очищенных препаратов ферментов комбинируют различные приемы и методы, такие, как термическое фракционирование, осаждение органическими растворителями, солями и тяжелыми металлами, фильтрация на молекулярных ситах, ионообменная хроматография, электрофорез, изоэлектрофокусирование.

На заключительных этапах очистки часто используют аффинную хроматографию (биоспецифическая хроматография, хроматография по сродству), основанную на способности ферментов избирательно связывать те или иные лиганды - субстраты коферменты, конкурентные ингибиторы, аллостерические эффекторы и т.п. Такое связывание весьма специфично, что позволяет выделить тот или иной энзим из множества других белков. Например, из желудочного сока человека методом одноэтапной аффинной хроматографии выделена кислая липаза, использующаяся в заместительной терапии при заболеваниях печени.

Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфичности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) присоединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители). Для уменьшения пространственных трудностей при взаимодействии фермента с матрицей лиганд присоединяют к носителю через промежуточное звено (вставку, ножку, спейсер).

В процессе выделения повышается доля фермента в массе тотальных белков, т.е. увеличивается его удельная активность. В производственных условиях активность получаемого ферментного препарата оценивается количеством субстрата, преобразованного 1 мг (1кг) препарата при оптимальных условиях за 1 мин, и измеряется в моль/мг или каталах/кг белка.

Очищенные ферментные препараты хранят при низкой температуре (до -80 °С). Для стабилизации ферментов в их препараты добавляют коферменты и субстраты. Ферментные препараты для промышленного применения стабилизируют, добавляя глицерин, моносахариды, дисахариды (глюкоза, сахароза, лактоза), HS-coединения (цистеин, глутатион, меркаптоэтанол, дитиотреитол и др.), отдельные аминокислоты, желатину и другие белки-наполнители.

Учитывая огромные перспективы применения ферментных препаратов в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине, можно сделать заключение о необходимости расширения исследований в этой области для оптимизации технологии и гарантийного получения высокоактивных и стабильных препаратов микробных ферментов.

5. Иммобилизованные ферменты

Одна из задач инженерной энзимологии состоит в разработке технологии получения и использования иммобилизованных ферментов.

Иммобилизованными ферментами называются ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитические свойства. Начало этому направлению биотехнологии было положено в 1916 году, когда Дж.Нельсон и Е.Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она сохраняет в таком виде каталитическую активность.

В настоящее время в понятие «иммобилизация» вкладывают более широкий смысл - полное или частичное ограничение свободы движения белковых молекул.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами:

* представляют собой гетерогенные катализаторы, легко отделяемые от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт;

* могут использоваться многократно и обеспечивают непрерывность каталитического процесса;

* изменяют свои свойства: субстратную специфичность, устойчивость, зависимость активности от параметров среды;

* долговечны в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов.

Все перечисленное обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты.

Иммобилизовать ферменты можно как путем связывания на нерастворимых носителях, так и путем внутримолекулярной или межмолекулярной сшивки белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также путем присоединения к растворимому полимеру.

Носители для иммобилизации ферментов. К носителям предъявляются следующие требования:

* высокая химическая и биологическая стойкость;

* высокая химическая прочность;

* достаточная проницаемость для фермента и субстратов, пористость, большая удельная поверхность;

* возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран);

* легкая активация;

* высокая гидрофильность;

* невысокая стоимость.

Для получения иммобилизованных ферментов используется ограниченное число как органических, так и неорганических носителей (рис. 7.1).

Рис. 7.1. Классификация носителей для иммобилизованных ферментов

Органические полимерные носители. Существующие органические полимерные носители можно разделить на два класса: природные (белковые, полисахаридные и липидные) и синтетические полимерные носители (полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные).

Преимущества природных носителей: доступность, полифункциональность и гидрофильность; недостатки: биодеградируемость и высокую стоимость.

Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для придания химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сетчатые структуры вводят различные ионогенные группировки. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) синтезирован новый носитель - губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью к гликозидазам.

Из природных аминосахаридов в качестве носителей применяют хитин. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру. Среди белков в качестве носителей применяют структурные протеины, - кератин, фиброин, коллаген и желатина (продукт переработки коллагена). Белки способны к биодеградации, что очень важно при конструировании иммобилизованных ферментов для медицинских целей. К недостаткам белков как носителей в этом случае следует отнести их высокую иммуногенность.

Синтетические полимерные носители. Большинство синтетических полимерных носителей обладают механической прочностью, и возможностью варьирования в широких пределах величины пор. Некоторые синтетические полимеры могут быть произведены в различных физических формах (трубы, волокна, гранулы). К ним относятся полимеры на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; полиамидные и полиуретановые полимеры.

Носители неорганической природы. В качестве носителей наиболее часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды металлов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей - легкость регенерации. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости.

Методы иммобилизации ферментов.

Существуют два принципиально различных метода иммобилизации ферментов: физические (без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем) и химические (с образованием ковалентной связи между ними) (рис. 7.2).

Абвгд

Рис 7.2. Методы иммобилизации ферментов

Физические методы иммобилизации: а - адсорбция; б - включение в гель; в - инкапсулирование; г - включение в липосомы;

Химические методы иммобилизации: д - ковалентные связывание

Физические методы иммобилазации представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов.

Адсорбция ферментов на нерастворимых носителях. Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. В качестве адсорбентов используют кремнезем, активированный уголь, графитовая сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. При адсорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Эффективность адсорбции определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя.

Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Активность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100 %, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя.

К недостаткам адсорбционного метода относится невысокая прочность связывания фермента с носителем (при изменении условий иммобилизации могут происходить десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов реакции). Прочность связывания фермента с носителем может повысить предварительная модификация носителя (обработка ионами металлов, полифункциональными агентами - полимерами, белками, гидрофобными соединениями, монослоем липида и пр.). Иногда, модификации подвергается молекула исходного фермента, однако зачастую это ведет к снижению его активности.

Иммобилизация ферментов путем включения в гель. Способ иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную структуру полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но и мулътиэнзимных комплексов и даже интактных клеток. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами:

· фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента; используют гели полиакриламида, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля;

· фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние; используют гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция.

К преимуществам иммобилизация ферментов в гелях относят:

· равномерное распределение энзима в объеме носителя;

· высокая механическая, химическая, тепловая и биологическая стойкость матрицы;

· возможность многократного использования фермента, включенного в его структуру.

Однако метод непригоден для иммобилизации ферментов, действующих на водонерастворимые субстраты.

Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры. Сущность этого способа иммобилизации - отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента.

Наибольшее распространение получили две модификации этого метода - микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы.

Микрокапсулирование состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером.

Размер получаемых капсул составляет десятки или сотни микрометров, а толщина мембраны - сотые доли микрометра.

Достоинства метода микрокапсулирования:

· простота;

· универсальность;

· возможность многократного использования нативного фермента (фермент может быть отделен от непрореагировавшего субстрата и продуктов реакции процедурой простого фильтрования);

· возможность иммобилизовать не только индивидуальные ферменты, но и мультиэнзимные комплексы, целые клетки и отдельные фрагменты клеток.

К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Включение водных растворов ферментов в липосомы. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента.

Ферменты, иммобилизованные путем включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях. Изучение липосом имеет большое значение для понимания закономерностей процессов жизнедеятельности клетки, поскольку значительная часть ферментов в клетке локализована в составе липидного матрикса биологических мембран.

Химические методы иммобилизации ферментов. Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем - наиболее массовый способ облучения промышленных биокатализаторов.

В отличие от физических методов этот способ иммобилизации обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.).

Принципиально важно, чтобы в иммобилизации фермента участвовали функциональные группы, не существенные для его каталитической функции. Так, гликопротеины обычно присоединяют к носителю через углеводную, а не через белковую часть молекулы фермента.

Все методы химической иммобилизации классифицируют в зависимости от природы реакционной группы носителя, вступающей во взаимодействие с молекулой фермента.

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксогруппами.

Наиболее распространенным методом образования ковалентной связи между ферментом и полисахаридным носителем или синтетическим диольным соединением является бромциановый метод. При обработке носителя бромцианом возникают реакционноспособные цианаты и имидокарбонаты, которые при взаимодействии с нуклеофильными аминогруппами фермента образуют производные изомочевины и уретанов:

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих аминогруппами. Первичные аминогруппы носителя, связанные с ароматическим кольцом, предварительно превращают в соли диазония, которые затем подвергают разнообразным реакциям сочетания. В реакции сочетания вступают фенольные, имидазольные, аминные, гуанидиновые, тиольньте группы белков.

Иммобилизация на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы. Наиболее часто для соединения аминогрупп белка с ацильными группировками носителя используют ангидриды, галогенангидриды, активированные эфиры и другие производные карбоновых кислот.

Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрильными группами. Сульфгидрильные группы носителя и фермента легко окисляются с образованием дисульфидных связей под действием кислорода воздух:

Н--SН +НS--Ф + О₂>Н-- S--S --Ф + Н₂О

Преимущества химической иммобилизации - высокая эффективность и прочность связи. Однако, методы ковалентной иммобилизации малодоступны для промышленного использования в связи со сложностью и дороговизной их применения.

6. Иммобилизация клеток

Использование иммобилизованных клеток исключает необходимость выделения и очистки ферментных препаратов, применение кофакторов; создает возможность получения полиферментных систем, осуществляющих многостадийные непрерывно действующие процессы.

В промышленных процессах чаще используют покоящиеся клетки (в стационарной фазе). Растущие клетки нарушают структуру носителя. Образующиеся при делении дочерние клетки, покидая носитель, загрязняют целевой продукт. Для подавления роста иммобилизованных клеток растений используют дефицит фитогормонов, а рост клетки бактерий тормозят добавлением антибиотиков.

Иммобилизованные клетки микроорганизмов применяют для биотрансформации органических соединений, разделения рацемических смесей, гидролиза ряда сложных эфиров, инверсии сахарозы, восстановления и гидроксилирования стероидов. Иммобилизованные хроматофоры используют в лабораторных установках для синтеза АТФ, а пурпурные мембраны - для создания искусственных фотоэлектрических преобразователей - аналогов солнечных батарей. Разрабатывается реактор на основе иммобилизованных клеток дрожжей для получения этанола из мелассы в котором дрожжи сохраняли бы способность к спиртовому брожению в течение 1800 ч.

7. Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток

Для осуществления химических процессов с помощью иммобилизованных ферментов применяют колоночные, трубчатые, пластинчатые и танкерные реакторы разного объема и производительности. Иммобилизованные ферментные системы функционируют в биореакторе в виде неподвижной фазы, через которую протекает среда с субстратом, подлежащим химическому превращению (гетерогенный катализ). В таких реакторах наряду с непрерывным режимом используется и периодический. Для эффективного перемешивания и газообмена биореактор снабжают мешалкой. Повреждающее действие мешалки на биокатализатор устраняют, закрепляя определенным образом его гранулы. Например, в биореакторе «корзиночного» типа мешалка вращается в полом цилиндре из сетчатой структуры (корзина), в ячейках которой закреплен иммобилизованный фермент.

Процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток относятся нашли широкое применение в медицине, пищевой и фармацевтической промышленностях, биоэнергетике, а также в органическом синтезе и химическом анализе.

В настоящее время в мире разработаны следующие крупномасштабные производства с использованием иммобилизованных ферментов и клеток:

Получение глюкозофруктозных сиропов. Фруктоза важнейший в физиологическом и технологическом отношении природный моносахарид. Она в 2,5 раза слаще глюкозы и в 1,7 раза слаще тростникового сахара (сахароза), благодаря чему фруктоза - менее калорийный пищевой продукт по сравнению с последними. В отличие от глюкозы обмен фруктозы не контролируется инсулином, поэтому фруктовый сахар может потребляться больными диабетом. Фруктоза практически не вызывает кариеса зубов. В смеси с глюкозой фруктоза не кристаллизуется, поэтому широко используется для производства кондитерских изделий.

Исходным сырьем для превращения глюкозы во фруктозу с помощью, иммобилизованной глюкоизомеразы служит глюкоза, которую получают при гидролизе кукурузного или картофельного крахмала в присутствии минеральных кислот. Для конструирования промышленного биокатализатора глюкозоизомеразу сорбируют на пористых неорганических носителях или ионообменных смолах. Во многих случаях используют иммобилизованные клетки разного происхождения (Aspergillus niger, A. oryzae, Streptomyces phaeochromogenes, S. olivaceus, S. venezuelae). Производительность реакоров при получении фруктозы варьирует от 600 до 9000 кг глюкозофруктозного сиропа на 1 кг иммобилизованного фермента в зависимости от чистоты исходного сырья, а время полуинактивации катализатора - 20 - 50 суток. Возникающий в результате каталитического процесса глюкозофруктозный сироп содержит 42 - 45 % фруктозы, около 51% глюкозы, небольшое количество олигосахаридов и по сладости соответствует инвертному сахару, получаемому при гидролизе сахарозы. Глюкозофруктоз-ную смесь широко применяют для производства тонизирующих напитков, консервированных фруктов, кондитерских изделий, хлеба, мороженого и пр.

Ферментативная конверсия целлюлозы в глюкозу Неисчерпаемый и одновременно возобновляемый источник сырья представляет собой растительная биомасса (многолетние растения, вторичные продукты и отходы их промышленной и сельскохозяйственной переработки), основным компонентом которой служит целлюлоза. Благодаря плотной молекулярной упаковке целлюлоза устойчива к действию большинства растворителей и химических агентов, в том числе сильных кислот. В природе существуют целлюлолитические организмы (бактерии, плесневые грибы и некоторые виды насекомых), содержащие полиферментные комплексы целлюлаз, механизм действия которых на клетчатку оказался одинаковым для всех исследованных целлюлазных комплексов независимо от их происхождения. Попадая на целлюлозосодержащие материалы, микроорганизмы выделяют целлюлазы, которые, сорбируясь (иммобилизуясь) на субстрате, постепенно расщепляют его до глюкозы. Совершенствование эффективности метода конверсии целлюлозосодержащего сырья в глюкозу и далее в этанол и углеводороды позволит создать альтернативные пути получения ценных моносахаридов и жидкого топлива из возобновляемого сырья, а также решить еще одну важную проблему - утилизацию экологически опасных отходов производства.

Получение L-аминокислот из их рацемических смесей. Разделение рацемических смесей на составляющие их оптические изомеры (представляющее труднейшую задачу) явилось первым промышленным процессом с использованием иммобилизованных ферментов. Этот процесс был осуществляется с помощью аминоацилазы, иммобилизованной на целлюлозе. В качестве исходных соединений в данном превращении используют N-ацилированные производные D-,L-аминокислот, получаемые с помощью химического синтеза. Вследствие своей стереоспецифичности аминоацилаза гидролизует лишь N-ацил-L-стереоизомер, отщепляя от него ацильный радикал, в результате чего растворимость образующейся L-аминокислоты резко возрастает и ее легко можно отделить от своего антипода физико-химическими методами.

При нагревании оставшаяся N-ацил-D-аминокислота рацемизируется, т.е. превращается в исходную смесь, которая вновь подвергается воздействию фермента.

Аминоацилаза строго специфична к структуре только ацильной части субстрата, поэтому одна и та же установка с иммобилизованным ферментом используется для получения различных аминокислот, в том числе L-валина, L-фенилаланина и L-триптофана. Время полуинактивации иммобилизованного энзима составляет 65 суток; на японских предприятиях он используется без замены более 8 лет и обеспечивает снижение стоимости производства аминокислот на 40 % по сравнению с технологией, где применяются свободные молекулы фермента.

Получение 6-аминопенициллановой кислоты. Получение 6-АПК в промышленности путем химического гидролиза бензилпенициллина сопряжено с большими трудностями в связи с крайней неустойчивостью лактамного цикла его молекулы. Так, при щелочном гидролизе бензилпенициллина выход 6-АПК составляет всего 1 %. Продуктивность этого процесса удалось значительно повысить благодаря применению для гидролиза иммобилизованных в полиакриламидном геле бактериальных клеток, содержащих пенициллинамидазу. Переход к технологии, применяющей иммобилизованные бактериальные клетки, обеспечивает высокий выход 6-АПК, составляющий 80 - 85 %. Внедрение в промышленность биокаталитической технологии производства 6-АПК привело к существенному увеличению выпуска полусинтетических пенициллинов и снижению их себестомости.

Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов. Высокая эффективность биологических катализаторов и специфичность их действия делают ферменты идеальными реагентами для аналитической химии. Благодаря этим особенностям с помощью ферментов обнаруживаются вещества при предельно низкой концентрации в присутствии множества других соединений. К настоящему времени созданы искусственные аналитические системы различных конструкций (биосенсоры, датчики, ферментные электроды, проточные анализаторы), содержащие иммобилизованные ферменты и клетки и предназначенные для автоматического детектирования продуктов энзиматического превращения.

В зависимости от концентрации анализируемых веществ выбирают тот или иной способ их детекции.

Технологические варианты реакторов с иммобилизованными ферментами весьма разнообразны - колонки, трубки, полые волокна и пр. С их помощью на практике определяют концентрацию широкого спектра соединений - глюкозы, аминокислот, мочевины, пенициллина, АТФ, НАДН, ФМН, стероидов, триглицеридов, желчных кислот и многих других. Так, американскими исследователями сконструирован микродатчик с использованием субмикронных оптических волокон. Микробиосенсор, не вызывая повреждений, может быть введен в клетку и даже в отдельные ее компартменты для измерения содержания в них глюкозы и кислорода. Предложены датчики на базе иммунодетекции для проведения экспресс-анализов на присутствие производных диоксина и оценки содержания биогенных аминов в пищевых продуктах в связи с процессами их старения. Для определения мочевины ферментным электродом требуется всего 30 с.

Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов помогают выполнять десятки быстрых и точных анализов при диагностике заболеваний, контролировать содержание вредных веществ (инсектицидов, пестицидов, удобрений) в пищевых продуктах и в воздухе. Биосенсоры нашли применение в решении аналитических задач в химической и микробиологической промышленности, а также в научных исследованиях.

8. Иммобилизованные ферменты в медицине

Большой рынок сбыта в медицине занимают тромболитические ферменты, предназначенные для борьбы с сердечнососудистыми заболеваниями. Так, в отечественную клиническую практику внедрен препарат «стрептодеказа», содержащий стрептокиназу - активатор предшественника протеиназы плазмина, предотвращающий образование тромба в кровеносной системе.

Ферменты, разрушающие некоторые незаменимые аминокислоты (например, аспарагиназа), используют для борьбы со злокачественным ростом опухолей. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, субтилизин, коллагеназа), иммобилизованные на волокнистых материалах (целлюлоза, полиамидные волокна, декстран и др.), применяют для эффективного лечения ран, язв, ожогов, абсцессов, а их белковые ингибиторы - в заместительной терапии для лечения эмфиземы и панкреатитов.

Важны с практической точки зрения разработки, посвященные направленному транспорту лекарственных веществ. Так, микрокапсулы, стенки которых представлены оболочкой эритроцита («тень эритроцита»), а их содержимое заполнено ферментом аспарагиназой, переносятся кровотоком к зонам скопления аспарагина и поэтому применяются для лечения аспарагинзависимых опухолей, в частности саркомы. Колонки, заполненные микрокапсулами с ферментом, используют для диализа в аппарате «искусственная почка», которая работает в 100 раз эффективнее обычного аппарата.

Возможности и перспективы использования в медицине ферментов в иммобилизованном состоянии гораздо шире, чем достигнутые на сегодняшний день, именно на этом пути медицину ждет создание новых высокоэффективных методов лечения.

Заключение

Использование микроорганизмов в качестве источников производства ферментов стимулируется следующими основными факторами:

* высокой степенью специфической активности в пересчете на единицу сухого веса продукта;

* сезонными колебаниями количества и качества сырьевых материалов и возможностью их длительного сохранения в зависимости от климатических изменений;

* возможностью выбора нужного фермента из широкого спектра микробных катализаторов, характеризующихся различной степенью устойчивости к повышенным температурам рН среды;

* возможностями промышленной генетики оптимизировать количества выхода ферментов и способов селекции штаммов-продуцентов путем мутагенеза, изменения условий культивирования, а также (в последнее время) применения практически неограниченных возможностей методов генетической инженерии.

Методы, применяемые для производства ферментов, обычно осуществляются с использованием биореакторов (ферментеров), аналогичных по конструкции и функциях таковым, которые применяются при производстве антибиотиков. Выбор культуральной среды является весьма важным моментом в процессе производства, так как она обеспечивает растущий микроорганизм энергией, а также является источником необходимых элементов (углерода, азота и т. д.). Стоимость сырьевого материала непосредственно связана с ценой конечного продукта.

В процессе выращивания продуцентов ферментов, последние могут накапливаться внутри клеток или же секретироваться во внешнюю среду. Что в свою очередь влияет на способы выделения и очистки ферментов.

Концентрирование и очистка ферментов зачастую представляет собой весьма сложные процессы. И естественно, что стоимость препаратов ферментов зависит от всех перечисленных выше моментов.

Коммерческие препараты ферментов могут выпускаться в продажу либо в жидкой, либо в кристаллической форме; очищенными или же в виде "грубых" препаратов.

Учитывая огромные перспективы применения ферментных препаратов в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине, можно сделать заключение о необходимости расширения исследований в этой области для оптимизации технологии и гарантийного получения высокоактивных и стабильных препаратов микробных ферментов.

Список литературы

ферментативный препарат медицина

1. Jesse, Russell Ферменты / Jesse Russell. - М.: VSD, 2012. - 539 c.

2. Березин, И. В. Ферменты - химические катализаторы? / И.В. Березин, А.А. Клесов. - М.: Знание, 2012. - 326 c.

3. Болотов, Б. Лечение ферментами и соками по Болотову / Б. Болотов, Г. Погожев. - М.: Питер, 2015. - 224 c.

4. Болотов, Борис Лечение по Болотову. Ферменты, уксусы, квасы / Борис Болотов , Глеб Погожев. - М.: Питер, 2013. - 224 c.

5. Вольф, М. Лечение ферментами / М. Вольф, К. Рансбергер. - М.: Мир, 2017. - 290 c.

6. Высоцкая, Р. У. Лизосомы и лизосомальные ферменты рыб / Р.У. Высоцкая, Н.Н. Немова. - М.: Наука, 2008. - 288 c.

7. Гормоны и ферменты в кардиологии. - М.: Медицина, 2011. - 284 c.

8. Диксон, М. Ферменты / М. Диксон. - М.: Книга по Требованию, 2012. - 209 c.

9. Диксон, М. Ферменты: моногр. / М. Диксон, Э. Уэбб. - М.: Издательство иностранной литературы, 2007. - 730 c.

10. Кайрос, Наталия Пробиотики и ферменты -- суперфуд XXI века / Наталия Кайрос. - М.: Питер, 2013. - 224 c.

11. Коровкин, Б. Ф. Ферменты в жизни человека / Б.Ф. Коровкин. - М.: Медицина, 2016. - 770 c.

12. Макаров Биохимические Процессы. Белки, Ферменты: моногр. / Макаров. - Москва: ИЛ, 2009. - 621 c.

13. Нейландс, Дж. Очерки по химии ферментов / Дж. Нейландс, П. Штумпф. - М.: Государственное издательство иностранной литературы, 2007. - 391 c.

14. Опарин, А.И. Ферменты, их роль и значение в жизни организмов / А.И. Опарин. - М.: ЁЁ Медиа, 2017. - 666 c.

15. Палладин, В.И. Работа ферментов в живых и убитых растениях / В.И. Палладин. - Москва: СПб. [и др.] : Питер, 2015. - 189 c.

16. Першин, Г. Н. Влияние химиотерапевтических веществ на бактериальные ферменты / Г.Н. Першин. - М.: Государственное издательство медицинской литературы, 2016. - 230 c.

17. Протеолитические ферменты в гнойной хирургии. - М.: Медицина, 2011. - 408 c.

18. Реннеберг, Р. Эликсиры жизни. Новейшие результаты в области исследования ферментов / Р. Реннеберг. - М.: Мир, 2016. - 152 c.

19. Рогожин, Василий КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ / Василий Рогожин. - М.: LAP Lambert Academic Publishing, 2011. - 296 c.

20. Розенгарт, В. И. Ферменты - двигатели жизни / В.И. Розенгарт. - М.: Наука. Ленинградское Отделение, 2010. - 160 c.

21. Скоблов, Юрий Ферменты в синтезе нуклеотидов, меченных радиоактивным фосфором. / Юрий Скоблов. - М.: LAP Lambert Academic Publishing, 2011. - 144 c.

22. Теплы, М. Молокосвертывающие ферменты животного и микробного происхождения / М. Теплы, Я. Машек, Я. Гавлова. - М.: Пищевая промышленность, 2016. - 272 c.

23. Уэбб, Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма / Л. Уэбб. - М.: Мир, 2009. - 864 c.

24. Фершт, Э. Структура и механизм действия ферментов / Э. Фершт. - Москва: СПб. [и др.] : Питер, 2014. - 432 c.

25. Цыперович, А. С. Ферменты / А.С. Цыперович. - М.: Техника, 2016. - 360 c.

Размещено на Allbest.ru