Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Учреждение Российской академии наук

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.В.ОВЧИННИКОВА

(ИБХ РАН)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов

специальность - 03.00.23 - биотехнология

кандидата химических наук

Сизова Светлана Викторовна

Москва 2009 г.

Работа выполнена в лаборатории Полимеры для биологии Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Зубов Виталий Павлович

доктор физико-математических наук Олейников Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор

Бовин Николай Владимирович

доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович

Ведущая организация:

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Защита состоится « » _________2009 года в ______часов на заседании диссертационного совета при Институте биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Автореферат разослан « » ___________ 2009 г.

нанокристалл полупроводниковый полимерный синтетический

Характеристика работы

Актуальность проблемы. Интенсивное развитие методов анализа, основанных на использовании различных флуоресцентных меток, сделало их одними из важнейших экспериментальных методов во многих научных дисциплинах. В частности, их применение в биотехнологии и медицине привело к появлению и развитию методов, облегчающих изучение живых клеток и клеточных структур, фундаментальных клеточных процессов и методов регистрации биоспецифических взаимодействий, находящих применение в медицинской диагностике и разнообразных биологических анализах.

В последние годы интенсивно разрабатываются подходы к визуализации процессов на уровне клеток, тканей и целых организмов, основанные на введении специализированных флуоресцентных меток. Одними из наиболее перспективных меток нового поколения являются флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы (НК), состоящие из элементов групп II-VI, III-V и имеющие структуру ядро/оболочка.

Полупроводниковым НК присущи два основных достоинства, отличающие их от органических флуорофоров: 1) широкий диапазон узких полос флуоресценции, положение которых зависит от диаметра НК и является управляемым параметром при возможности возбуждения излучением с одной длиной волны; при этом длина волны возбуждения может варьироваться для получения максимального отношения сигнал/шум с учетом конкретного изучаемого объекта; 2) высокая фотостабильность НК, в 100-4000 раз превышающая фотостабильность лучших органических флуорофоров. Такие свойства делают НК перспективными флуоресцентными биомаркерами в анализах, основанных на биоспецифическом взаимодействии «лиганд-рецептор» в разнообразных in vitro и in vivo биоаналитических системах, в которых использование традиционных органических флуорофоров ограничено недостаточной фотостабильностью и невозможностью одновременной регистрации в многопараметрических (многоцветных) системах. Кроме того, такие НК весьма перспективны для создания новых флуоресцентных сенсоров, действие которых основано на использовании эффекта резонансной передачи энергии (FRET-эффект). Химический анализ многокомпонентных смесей, в частности, детектирование наличия в смеси определенных ионов металлов, биологических соединений и т.д., и анализ ряда физических параметров, таких как рН, электрохимический потенциал, температура в наномасштабных областях также является потенциальной областью применения данных сенсоров.

НК состава CdSe/ZnS с диаметром 2-6 нм, используемые в данной работе, являются альтернативой органическим флуоресцентным меткам, традиционно применяемым в биотехнологии и медицине благодаря высокой яркости, возможности регистрировать флуоресценцию по всему оптическому диапазону и доступности. Оболочка из широкозонного полупроводника ZnS предохраняет флуоресцирующее ядро от влияния окружения и позволяет получить НК с квантовым выходом до 70%.

Одной из основных проблем использования таких флуоресцентных НК является трудность получения биосовместимых, легко конъюгируемых с биологическими молекулами флуоресцентных комплексов на их основе, что ограничивает их применение в медицине и биотехнологии в качестве эффективных флуоресцентных биомаркеров и сенсоров. Для решения указанной проблемы в настоящей работе разработан ряд способов модификации и функционализации поверхности НК, а также иммобилизации НК в полимерные матрицы для создания высокоэффективных и специфичных флуоресцентных биомаркеров и продемонстрированы примеры их использования в таких видах биоанализа, как реакция латексной агглютинации (РЛА), проточная цитофлуориметрия, для визуализации клеток и клеточных рецепторов.

Цели и задачи работы. Цель работы заключалась в разработке серии специфичных, биосовместимых, флуоресцентных аналитических реагентов, содержащих флуоресцентные полупроводниковые НК для биотехнологии и их тестировании в биоаналитических методах.

В рамках данной работы были поставлены следующие задачи:

§ Исследование свойств НК в конденсированных средах.

§ Создание модифицирующих слоев на поверхности НК из синтетических и природных полимеров двумя способами:

1) модификацией поверхности НК бифункциональными тиолсодержащими молекулами путем замещения три-н-октилфосфиноксида (ТОФО), стабилизирующего НК в процессе синтеза, с последующим формированием изолирующего слоя из молекул биополимеров (полипептидов, полисахаридов и т.д.);

2) формированием полимерного слоя вокруг НК посредством гидрофобных взаимодействий c амфифильными полимерами без удаления молекул ТОФО с поверхности НК.

§ Разработка методов включения полупроводниковых НК в полимерную матрицу из синтетических (гомо- и сополимеры акролеина) и природных (наночастицы на основе этилцеллюлозы) полимеров;

§ Получение флуоресцентных реагентов и демонстрация возможностей их использования путем тестирования в биоаналитических методах.

§ Разработка методики получения пленок гидрофилизированных НК с двумя различными максимумами флуоресценции на поверхности оптических стекол - прототипов FRET-зондов для сканирующей ближнепольной оптической микроспектроскопии.

Научная новизна и практическая ценность работы

Исследованы свойства и поведение гидрофобных НК в конденсированных средах на примере пленок с различной концентрацией НК. Экспериментально установлены оптимальные и предельные концентрации НК в конденсированных средах, при которых не происходит падения квантового выхода и красного сдвига флуоресценции.

Разработаны способы получения флуоресцентных наноразмерных частиц в диапазоне диаметров 5-80 нм, коллоидно устойчивых в водных средах, содержащих функциональные группы путем модификации НК синтетическими и природными полимерами.

Разработаны методы получения флуоресцентных полимерных микросфер, содержащих полупроводниковые НК для различных вариантов биоанализа, которые характеризуются:

§ однотипной полимерной матрицей на основе гомо- и сополимеров акролеина с поверхностными функциональными группами;

§ широким диапазоном размеров частиц (100-500 нм) и узким распределением частиц по размерам;

§ коллоидной и химической стабильностью в широком диапазоне рН и физиологических жидкостях;

§ возможностью введения НК с различными длинами волн испускаемой флуоресценции, а также смесей НК для осуществления многоцветного оптического кодирования полимерных дисперсий;

§ фотостабильностью и высоким квантовым выходом;

§ возможностью возбуждения различных длин волн испускаемой флуоресценции одним монохроматическим источником;

§ единообразным протоколом иммобилизации белковых молекул на поверхности полученных полимерных флуоресцентных миикросфер.

Показана возможность введения НК в дисперсии частиц на основе полимеров природного происхождения на примере наночастиц из этилцеллюлозы.

Разработаны методики получения биоаналитических реагентов путем иммобилизации различных биологических объектов на частицы водных дисперсий НК, а также на полимерные микросферы, наполненные НК.

Продемонстрированы примеры использования данных флуоресцентных биореагентов в таких видах анализа, как РЛА, проточная цитофлуориметрия, для иммунофлуоресцентного мечения и визуализации клеток и клеточных рецепторов.

Разработана методика получения пленок гидрофилизированных НК с двумя различными максимумами флуоресценции на поверхности оптических стекол - прототипов FRET-зондов, обладающих воспроизводимыми флуоресцентными свойствами и высокой трибологической устойчивостью.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ссылок. Диссертация содержит рисунков и таблицы.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на международной конференции «Лазерная физика и оптические технологии» (Гродно, Белоруссия, 2006), Международной конференции по нанобиотехнологии NACBO (Урбино, Италия, 2006), Российской школе-конференции молодых ученых «Биосовместимые наноструктурные материалы и покрытия медицинского назначения» (Белгород, 2006), III Международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (Москва, 2008 ), 5 московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи в рецензируемых журналах.

Содержание работы

1. Исследование свойств НК в конденсированных средах

Основой многих сенсорных систем для многопараметрического анализа многих объектов, являются упорядоченные 2-х (планарные микрочипы) или 3-х мерные структуры (жидкие чипы на основе коллоидных спектрально кодированных микрочастиц). При создании таких систем на основе полупроводниковых CdSe/ZnS нанокристаллов в обоих случаях важно понимание - как изменяются свойства НК в конденсированных средах.

Для изучения свойств НК в конденсированных средах была разработана методика формирования пленок из НК на твердой подложке (оптические стекла). Были сформированы (1) пленки с предельно высокой концентрацией НК со средним расстоянием между НК ~ 4 нм, что соответствует плотной гексагональной упаковке НК, покрытых монослоем ТОФО и объемной концентрации 1.5*10¹⁹ см^-3 и (2) пленки, представляющие собой НК, распределенные в матрице ТОФО со средним расстоянием 9 нм, что соответствует объемной концентрации 1.3*10¹⁸ см^-3. Измерения среднего расстояния между НК осуществляли методом АСМ.

Рис. 1. Спектры поглощения (сплошная) и флуоресценции (пунктир) раствора и пленок CdSe/ZnS НК диаметром 4 нм. (1) Раствор НК гексане. (2) Пленка с "низкой" плотностью НК (объемная концентрация 1.3*10¹⁸ см^-3). (3) Пленка с "высокой" плотностью НК (концентрация 1.5*10¹⁹ см^-3). Точечной линией показана длина волны возбуждающего излучения. Толщина пленок - 100 монослоев.

Спектры поглощения и флуоресценции пленок НК размером 4 нм представлены на Рис.1, 2. Видно, что для пленок с высокой концентрацией НК спектры поглощения и флуоресценции испытывают сильный сдвиг в красную область по сравнению с дисперсией НК и пленками с низкой концентрацией НК, что свидетельствует о достаточно сильном взаимодействии между НК и, как следствие, о смещении положения максимума флуоресценции пленок НК. Было обнаружено, что по мере увеличения плотности пленки положение максимума спектра флуоресценции сдвигается в красную область, при этом ширина пика флуоресценции и поглощения практически не зависит от толщины пленки. Таким образом, данные результаты показывают, что даже при минимальном расстоянии между НК в формируемых пленках наблюдается эффект размерного квантования. При этом параметры флуоресценции и поглощения поверхностных конденсатов НК определяются расстояниями между НК.

Сравнение флуоресценции пленок НК и красителей родаминового ряда показало, что в конденсированной фазе квантовый выход флуоресценции НК на два порядка превосходит квантовый выход флуоресценции красителя (Рис. 2).

Далее было исследовано влияние плотности мощности возбуждающего излучения на интенсивность флуоресценции пленок с предельно высокой концентрацией НК методом лазерной индуцированной люминесценции. На Рис. 3 представлена зависимость интенсивности флуоресценции от плотности возбуждающего излучения. Как видно, положение максимумов и полуширины спектров флуоресценции пленок не меняются при увеличении плотности потока лазерного излучения до 110⁶ Вт/см². При высокой плотности возбуждения квантовый выход сильно падает, однако флуоресценция сохраняется. Важно отметить, что мощности возбуждения порядка 110³ предельны для органических красителей. Таким образом, полностью возможности флуоресцентных проб на основе полупроводниковых НК могут быть реализованы при использовании высоких плотностей мощности. В этом случае можно ожидать повышения чувствительности аналитических устройств, по крайней мере, на 3 порядка.

Рис. 2 Сравнение флуоресценции НК (CdSe/ZnS диаметром 4 нм) и флуоресценции ацетата родамина 6Ж: (а) - растворы НК и Р6Ж, (б) - пленки. Возбуждение - 532 нм, плотность мощности возбуждения - 4*10³ Вт/см².

Рис. 3 Спектры флуоресценции пленки с высокой концентрацией НК диаметром 4 нм. Толщина пленки 100 нм. Возбуждение флуоресценции лазерным излучением с л = 523 нм с различными плотностями потока.

Полученные результаты дают оценку оптимальной плотности НК в конденсированном состоянии: средние расстояния не должны быть меньше 2 диаметров НК, иначе они влияют друг на друга, что приводит к ухудшению оптических свойств НК (красное смещение, существенное снижение квантового выхода). Поэтому, для последующего включения в полимерную матрицу мы подбирали концентрации НК таким образом, чтобы красного смещения не происходило.

2. Получение водных дисперсий НК путем модификации НК природными и синтетическими полимерами

Для того, чтобы флуоресцентные наноразмерные частицы могли быть использованы в качестве флуоресцентных биомареров в in vitro и in vivo анализах для визуализации клеток, кодирования ДНК, направленной доставки наночастиц в клетки и т.д., они должны характеризоваться высокой коллоидной устойчивостью, малыми размерами частиц - до 100 нм, а также наличием функциональных групп на поверхности для визуализации образования комплекса «лиганд - антилиганд». Решение указанных задач и рассматривается данном разделе работы.

2.1 Модификация НК посредством замещения ТОФО бифункциональными лигандами с последующим формированием защитного слоя

Данный способ модификации основан на образовании дисульфидной связи между атомами, входящими в состав оболочки ZnS и меркаптогруппой тиолсодержащих соединений путем замещения стабилизирующего лиганда ТОФО на поверхности НК и последующим формированием дополнительного защитного полимерного слоя.

Рис. 4 (а) Интенсивность флуоресценции НК (диаметр 4 нм), НК, модифицированных цистеином (Цис-НК) и смесью меркаптоуксусная кислота/меркаптоэтанол (МУК-НК). (б) Распределение частиц по размерам для НК, модифицированных цистеином.

Изначально нами были реализованы и усовершенствованы известные методики по модификации НК с помощью цистеина и меркаптоуксусной кислоты. Исходные гидрофобные НК модифицировали тиолсодержащими молекулами, в частности цистеином и смесью меркаптоэтанол/меркаптоуксусная кислота (мольное соотношение 1/1). Полученные гидрофилизированные НК характеризовались средними размерами частиц 5 и 8 нм соответственно, то есть практически сохранялись размеры исходных частиц, что свидетельствует о модификации индивидуальных НК, а также высокой интенсивностью флуоресценции (рис. 4 а), однако в водном растворе сохраняли коллоидную устойчивость не более 1 месяца. Причиной снижения коллоидной устойчивости является, вероятно, динамический характер связи (Zn-S, S-S) бифункционального лиганда с поверхностью НК. Можно предположить, что солюбилизирующий лиганд постепенно переходит в водную среду, приводя к агрегации модифицированных НК. При этом ионы кадмия, входящие в состав ядра НК, также могут переходить в раствор и контактировать с окружением НК, что ограничивает их биосовместимость. Следует отметить, что модификация НК тиолсодержащими молекулами приводит к уменьшению квантового выхода более чем на 10% и красное смещение максимума флуоресценции составляет 5 - 10 нм (рис. 4 а).

С целью увеличения коллоидной устойчивости и повышения биосовместимости была разработана методика формирования дополнительного защитного слоя посредством образования ковалентных связей или электростатических взаимодействий между отрицательно заряженными карбоксильными группами гидрофилизированных НК и аминогруппами биомолекул или катионных ПАВ. В настоящей работе использовали полипептид поли-L-лизин, полисахариды (хитозан), а также синтетический поликатион полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПДАДМАХ). Образование дополнительного полимерного слоя контролировали методом ИК-спектроскопии. Такая способ дополнительной модификации гидрофилизированных НК привел к увеличению коллоидной устойчивости (частицы сохраняли стабильность в течение как минимум 2 месяцев) и интенсивности флуоресценции (Рис. 5, 6), однако размер частиц заметно увеличился - до 20 - 80 нм по сравнению с гидрофилизированными НК, что указывает на образование устойчивых кластеров гидрофилизированных НК.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 5 Интенсивность флуоресценции и положение максимума флуоресценции исходных НК (1), Цис- НК (2), Цис-НК, модифицированных хитозаном (3), поли-L-лизином (4), ПДАДМАХ (5).

Рис. 6 Сравнение и стабильность во времени квантового выхода Цис-НК, Цис-НК, модифицированных хитозаном и поли-L-лизином.

2.2 Модификация НК амфифильными полимерами

Данный способ модификации НК основан на использовании гидрофобных взаимодействий между октильными лигандами ТОФО на поверхности НК и гидрофобными группами амфифильных полимеров. Такой способ позволяет защитить и гидрофилизовать поверхность НК за счет гидрофильных групп амфифильных полимеров, не удаляя ТОФО с поверхности частиц. В отдельных случаях для создания более прочной и стабильной оболочки необходима дополнительная сшивка макромолекул в поверхностном слое диаминами.

В настоящей работе использовали следующие амфифильные полимеры: полиакриламидный конъюгат, содержащий 15% мол. в-галактозы и 10% мол. диолеоилфосфатидилэтаноламина (PHEAA-Galв(15%)-DOPE(10%)), чередующийся сополимер малеинового ангидрида и 1- тетрадецена (СМТ) и моногидрокси(1-меркаптоундецил)тетраэтиленгликоль (МГМТГ).

При модификации НК PHEAA-Galв(15%)-DOPE(10%) и СМТ были получены стабильные дисперсии НК, сохраняющие коллоидную устойчивость в водных средах в течение 3 месяцев, однако диаметр частиц также оказался несколько выше диаметра исходных НК, что свидетельствует об образовании кластеров НК.

Как видно из рис. 7, квантовый выход НК, модифицированных PHEAA-Galв(15%)-DOPE(10%) и СМТ значительно увеличился по сравнению с исходными гидрофобными НК. На основании проведенных экспериментов по гидрофилизации НК было установлено, что прирост квантового выхода сильно зависит от качества НК: относительное увеличение квантового выхода тем больше, чем меньше абсолютное значение квантового выхода исходных НК.

Другой перспективный вариант реализации данного способа модификации НК состоит в использовании МГМТГ, имеющего в составе меркаптогруппу, обеспечивающую связывание с оболочкой НК, гидрофобный фрагмент, имеющий сродство к оболочке НК и облегчающий проникновение меркаптогруппы к поверхности НК, а также гидроксильную группу для коллоидной стабилизации частиц в водных средах и последующего связывания биолигандов.

НК, модифицированные МГМТГ, характеризовались высокой коллоидной устойчивостью в водных растворах и малым размером частиц - 9±1 нм, при этом квантовый выход увеличился в 3 раза по сравнению с исходными гидрофобными НК (рис.7). Также стоит отметить, что данные дисперсии сохраняют свою коллоидную устойчивость в водной среде уже более года с сохранением флуоресцентных характеристик.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 7 Сравнение квантового выхода и стабильности во времени исходных НК в гексане, Цис-НК и НК, модифицированных СМТ, конъюгатом PHEAA-Galв(15%)-DOPE(10%) и МГМТГ.

Как было отмечено выше, модификация НК тиолсодержащими функциональными молекулами приводит к уменьшению квантового выхода более чем на 10%, при этом красное смещение максимума флуоресценции составляет 5-10 нм. В случае модификации НК амфифильными полимерами (без удаления стабилизирующего лиганда ТОФО с поверхности НК) смещения максимума флуоресценции не происходит.

Таким образом, были получены стабильные флуоресцентные частицы методом модификации НК цистеином и смесью меркаптоэтанол/меркаптоуксусная кислота с последующим формированием дополнительного полимерного защитного слоя (хитозан, поли-L-лизин, ПДАДМАХ), характеризующиеся высокими флуоресцентными свойствами. Использование полимеров с целью дополнительной стабилизации НК приводит к некоторому укрупнению частиц, но в то же время к увеличению коллоидной устойчивости и квантового выхода водных дисперсий НК. Однако лучшие результаты по коллоидной стабильности и увеличению квантового выхода демонстрируют НК (кластеры НК), модифицированные амфифильными полимерами (PHEAA-Galв(15%)-DOPE(10%), СМТ, МГМТГ.

Перечень разработанных типов флуоресцентных наноразмерных частиц и их характеристики приведены в сводной таблице 1. НК, модифицированные цистеином, были апробированы для иммунофлуоресцентного мечения клеток, а также в качестве контрастирующих агентов в методе флуоресцентной оптической томографии.

Таблица 1. Характеристики наноразмерных флуоресцентных частиц

№	Модифицирующий агент	Функциональные группы на поверхности модифицированных НК	Средний диаметр частиц, нм
1.1	Цистеин	NH2, COOH	5
1.2	Меркаптоэтанол/меркаптоуксусная кислота	OH, COOH	8
1.3	Поли-L-лизин гидробромид, (ММ 15000-30000)	NH2, COOH	65
1.4	Хитозан	NH2	76
1.5	ПДАДМАХ	-	24
1.6	Galв(15%)- PHEAA- DOPE(10%)	OH	68
1.7	Сополимер малеинового ангидрида и 1- тетрадецена (после гидролиза)	СООН	44
1.8	моногидрокси(1-меркаптоундецил)тетраэтиленгликоль	OH	9

3. Инкапсулирование НК в частицы полимерных дисперсий

Следующий вариант модификации заключался во включении гидрофобных НК в частицы полимерных дисперсий, которые нашли широкое применение в качестве носителей биолигандов в различных видах биоанализа. Использование флуоресцентных меток, которые выполняют индикаторную функцию, позволяет визуализировать появление биоспецифических комплексов, что значительно упрощает проведение анализа. Однако, использование традиционных органических красителей в качестве флуоресцентных меток, сопровождается трудоемким процессом подбора условий эффективного введения красителя и получения интенсивного сигнала флуоресценции (подбор природы полимерной матрицы, способа введения, концентрационных зависимостей и т. д.), а также осложняется диффузией красителя из полимерной матрицы в процессе хранения. Кроме того, использование многоцветных оптически кодированных органическими красителями полимерных микрочастиц осложняется сложностью их анализа, требующего несколько источников возбуждения с разными длинами волн. Все вышеуказанное снижает эффективность использования органических красителей в качестве флуоресцентных меток в полимерных дисперсиях.

Таким образом, разработка единообразных подходов к формированию флуоресцентных субмикронных полимерных дисперсий с заданным в зависимости от области применения диапазоном диаметров, узким распределением частиц по размерам (РЧР), наличием функциональных групп на поверхности для образования прочной связи с биолигандами, высокой фотостабильностью, сохраняющих коллоидную устойчивость в широком диапазоне рН и в физиологических средах, а также позволяющих реализовать многопараметрические методы анализа с использованием многоцветного флуоресцентного кодирования, является весьма перспективной задачей.

3.1 Включение НК в полимерную матрицу на основе акролеина

Анализ литературных данных и проведенные исследования показали, что перспективными для биоанализа являются полимерные микросферы на основе акролеина, принципиальным достоинством которых является наличие на их поверхности альдегидных групп, позволяющих в мягких условиях присоединять к их поверхности биологические молекулы.

В зависимости от способа полимеризации и сополимеризации акролеина в водных средах могут быть получены полимерные дисперсии в широком диапазоне диаметров - от 100 до 1,5 мкм с узким РЧР при сохранении коллоидной стабильности. Наличие поверхностных альдегидных групп для прямого ковалентного связывания с биолигандами, контролируемые параметры частиц на стадии синтеза, возможность расширения спектра получаемых частиц и их свойств путем сополимеризации со стиролом и последующим введением в них НК позволит использовать их в качестве флуоресцентных носителей биомолекул для дальнейшего использования в разнообразных диагностических тестах (различные виды РЛА, цитофлуориметрия).

Для выбора оптимальной структуры дисперсии на основе акролеина синтезировали разными способами. Полимерные микросферы на основе гомополимеров акролеина получали методами как анионной полимеризации в водно-щелочной среде (ПА^А, соотношение фаз 1:20, рН 11, Т_комн.), так и радикальной полимеризации (ПА^Р_, соотношение фаз 1:9, водорастворимый инициатор персульфат калия K₂S₂O₈, Т=65°С). Как видно из данных, представленных в таблице 2, полимерные микросферы обоих типов характеризовались высокой коллоидно-химической стабильностью и низкой растворимостью в органических растворителях (не более 2%), при этом полимерные микросферы с минимальным диаметром и максимальным содержанием альдегидных групп получены методом радикальной полимеризации.

Таблица 2. Характеристики полимерных дисперсий на основе акролеина

№	Тип полиакролеиновых дисперсий	D, нм	Коэффициент вариации, %	C альдегидных групп, мкмоль/г пол.	Устойчивость в 0.2 M NaCl
1.1	ПАА	510	12	26,40	Стаб.
1.2	ПАР	230	8	41,25	Стаб.

Введение гидрофобных НК в полимерные микросферы на стадии синтеза приводило к тушению флуоресценции. Поэтому была разработана методика введения НК в уже синтезированные полимерные дисперсии, которая заключается в предварительном набухании полимерных частиц в органическом растворителе (этанол, изопропиловый спирт), добавлении НК в смеси того же растворителя с хлороформом, удалении растворителя и переводе полученных полимерных микросфер с включенными НК в водную среду.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 8 Сравнение интенсивности флуоресценции (норм.) полимерных дисперсий ПА^А (1) и ПА^Р(2).

Флуоресцентные полимерные дисперсии ПА^А и ПА^Р характеризовались высокой степенью включения НК; при примерно одинаковой интенсивности флуоресценции (рис. 8).

Оценку флуоресцентных свойств дисперсий ПА^А и ПА^Р проводили методом флуоресцентной лазерной микроскопии. Для этого дисперсии наносили на кремниевые подложки и высушивали. Флуоресценцию микросфер возбуждали аргоновым лазером с длиной волны возбуждения 488 нм и мощностью не более 0.01 мВт. Найдено, что включение НК в полиакролеиновые микросферы приводит к смещению пика эмиссии НК в синюю область в зависимости от состава микросфер и параметров НК (в случае НК с л_эм.=546 нм - смещение в синюю область на 12 нм, НК с л_эм.=583 нм - на 18 нм соответственно). Наиболее вероятной причиной синего сдвига пика эмиссии НК при включении в микросферы является устранение излучающих поверхностных состояний НК с энергией меньше энергии фундаментального перехода, вызванное формированием вокруг НК полимерной оболочки, обусловливающим, кроме того, подавление каналов тушения флуоресценции НК. Последнее, является причиной возрастания интенсивности флуоресценции по сравнению с флуоресценцией исходных НК.

Как и в случае с пленками НК, использованная в настоящей работе аппаратура (конфокальный флуоресцентный микроскоп и аргоновый лазер) позволяла работать при мощности возбуждения 10³ Вт/см². При такой плотности мощности обычные органические флуорофоры полностью теряют свои флуоресцентные свойства через несколько минут после начала облучения. Как было показано ранее, в отличие от органических флуорофоров, нанокристаллы флуоресцируют и при плотности мощности облучения до 10⁶ Вт/см². В диапазоне 10⁶-10⁷ Вт/см² квантовый выход несколько снижается, но НК продолжают флуоресцировать.

В случае дисперсий ПА^А, данные флуоресцентной лазерной микроскопии показывают присутствие не связанных с полимерными микросферами НК, что проявляется в виде флуоресцентного фона от участков подложки, свободных от микросфер. По видимому, присутствие единичных НК, обусловлено образованием значительного количества олигомеров акролеина, которые могут связываться с НК в объеме и, таким образом, приводить к снижению степени включения НК в микросферы и появлению общего флуоресцентного фона, что существенно ограничивает использование таких полимерных дисперсий в качестве носителей биомолекул. Дисперсии ПА^Р характеризовались высокой степенью включения НК в микросферы, однако агрегативная устойчивость дисперсий оказалась недостаточно высокой.

Полученные результаты показали необходимость повышения агрегативной устойчивости полимерных дисперсий и снижения образования олигомерных продуктов в процессе хранения дисперсий. С этой целью была проведена сополимеризация акролеина со стиролом. Во-первых, путем встраивания мономерных звеньев стирола возможно снизить количество образующихся полуацеталей, характерных для гомополимеризации акролеина, и таким образом повысить коллоидную и химическую устойчивость полимерных дисперсий, во-вторых, варьируя соотношения мономеров - акролеина и стирола, можно получить частицы в широком диапазоне диаметров для различных биологических приложений.

3.2 Включение НК в сополимерную матрицу на основе акролеина и стирола

Сополимерные дисперсии на основе акролеина и стирола с сотношением мономеров 1:1 (ПА¹:ПС¹), 5:1 (ПА⁵:ПС¹), 10:1 (ПА¹⁰:ПС¹) были синтезированы методом радикальной сополимеризации (соотношение фаз 1:9, инициатор K₂S₂O₈, Т=65°С) (рис. 9).

Наибольшая начальная скорость роста и минимальный диаметр частиц дисперсий были отмечены в случае максимального (10:1) содержания акролеина в исходной мономерной смеси.

Характеристики полученных сополимерных дисперсий приведены в таблице 3. Как видно, все полимерные дисперсии характеризуются высокой коллоидной стабильностью, содержат поверхностные альдегидные группы, а диапазон диаметров полученных микросфер (145 - 420 нм) позволит их использовать в качестве маркеров в различных биоаналитических тестах, например, РЛА в планшете и на стекле, цитофлуориметрии, а также для окрашивания и визуализации клеток и клеточных рецепторов.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 9. Микрофотографии полимерных микросфер, полученных сополимеризацией акролеина и стирола при соотношении мономеров акролеин:стирол 1:1 (а) и 10:1 (б).

Таблица 3. Характеристики сополимерных дисперсий на основе акролеина и стирола с различным соотношением мономеров

Мольное соотношение мономеров акролеин/стирол	Содержание стирольных звеньев в сополимере, %	Диаметр сополимерных микросфер, нм	Концентрация альдегидных групп, мкмоль/г	Устойчивость в 0,2 M NaCl
1:1	48,8	420	19,8	Стаб.
5:1	14,3	250	25,5	Стаб.
10:1	8,1	145	32,1	Стаб.

Оценку флуоресцентных свойств проводили методом флуоресцентной лазерной микроскопии. Во всех трех случаях флуоресцентный фон от участков подложки, свободных от микросфер, отсутствовал полностью, что свидетельствует об отсутствии не связанных с микросферами НК и практически полном их включении в полимерную матрицу. Сополимерные дисперсии ПА⁵:ПС¹ характеризовались относительно невысокой интенсивностью флуоресценции, и в дальнейшем исследование их свойств не проводилось (рис. 10).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 10. Сравнение интенсивности флуоресценции (норм.) сополимерных ПА-ПС дисперсий с включенными НК (583 нм): ПА¹:ПС¹ (1), ПА⁵:ПС¹ (2), ПА¹⁰:ПС¹ (3).

Так же как и в случае микросфер на основе гомополимеров акролеина, для сополимерных микросфер было отмечено смещение пика эмиссии в синюю область спектра, при этом для микросфер ПА¹:ПС¹ со включенными НК с л_эм.=583 нм смещение составило 16 нм, а в случае микросфер ПА¹:ПС¹⁰ - 8 нм.

Сравнение флуоресцентных свойств единичной микросферы и агрегатов микросфер показало, что положение максимума и полуширина спектра флуоресценции практически одинаковы (рис. 11). Это свидетельствует о том, что НК внедряются в микросферы достаточно глубоко и переноса энергии между НК, находящимися в соседних микросферах, не происходит.

Рис. 11. Спектры флуоресценции единичных микросфер и агрегатов сополимерных микросфер, содержащих НК: ПА¹-ПС¹(а), ПА¹⁰-ПС¹(б).

3.3 Введение в полимерные дисперсии на основе акролеина смеси НК с различными длинами волн флуоресценции

Введение в полимерные микросферы смесей НК с разными длинами волн флуоресценции в разных соотношениях позволяет реализовать спектрально кодированные микрочастицы, получение которых открывает пути для разработки тест-систем для экспрессного многопараметрического анализа большого числа биологических объектов, основанного на технике микрочипов. Одним из преимуществ использования в качестве флуорофоров НК с разными длинами волн эмиссии является возможность возбуждения всех кодирующих компонентов одним монохроматическим источником.

В качестве модельного полимерного носителя для включения смеси НК с разными длинами волн флуоресценции мы использовали сополимерные микросферы на основе акролеина и стирола с диаметром частиц 420 нм. Для кодирования полимерных дисперсий использовали НК с максимумами флуоресценции 546 и 583 нм в различных соотношениях. Как видно из рис. 12, интенсивность флуоресценции сополимерных частиц с включенными НК не пропорциональна добавляемой концентрации НК. Вероятно, инклюзия зависит от диаметра НК: чем меньше диаметр НК, тем легче и глубже НК проникают внутрь полимерной частицы.

Рис. 12. Флуоресценция полимерных микросфер, кодированных НК двух цветов: НК с л_эм. = 583 нм (1); смесь НК с л_эм. = 583 и 546 нм в соотношении: 1:1 - (2), 10:1 - (3), 100: 1 - (4); НК с л_эм. =546 нм (5).

Полученные оптически кодированные полимерные микросферы сохраняли коллоидную и химическую устойчивость в течение, по крайней мере, 6 месяцев. Изучение флуоресцентных свойств показало, что спектры флуоресценции отдельных полимерных микросфер и агрегатов микросфер не отличаются между собой, что свидетельствует о практически полном отсутствии взаимодействия между НК, находящихся в разных полимерных микросферах (рис. 13).



Рис. 13 (а) Спектры флуоресценции отдельной полимерной микросферы (красная кривая) и агрегатов микросфер (зеленая и черная), содержащих НК двух цветов. (б) Разложение пика флуоресценции на полосы флуоресценции включенных в полимерные микросферы двух цветов НК.

Отсутствие взаимодействия между НК как внутри одной, так и между соседними полимерными микросферами является необходимым условием для разработки метода введения заданного количества НК разных цветов в полимерные дисперсии, т.е. оптического кодирования полимерных микросфер.

3.4 Включение НК в частицы на основе природных полимеров

Разработанная методика включения НК в полимерные микросферы на основе акролеина позволила использовать в качестве матриц и частицы на основе природного происхождения. В качестве флуоресцентного носителя для использования в тест-системах, разработке диагностикумов, а также для визуализации клеток и клеточных структур могут выступать и наночастицы на основе природных полимеров, в частности производные целлюлозы. В настоящей работе использовали наночастицы из этилцеллюлозы, полученные методом обращения фаз при постоянной температуре, любезно предоставленные проф. А.Л. Камышным (Hebrew University, Israel).

Включение гидрофобных НК в этилцеллюлозные (ЭЦ) наночастицы осуществляли аналогично включению НК в полимерные микросферы на основе акролеина, при этом прирост диаметра частиц после включения НК был незначительным. Изучение флуоресцентных свойств показало наличие сдвига максимума флуоресценции на 6 нм в синюю область. Квантовый выход НК, включенных в ЭЦ наночастицы, увеличивается более чем в 1,5 раза по сравнению с исходными НК (рис. 14 а).

Кроме этого, была разработана методика включения в этилцеллюлозные частицы НК, предварительно гидрофилизированных смесью меркаптоуксусная кислота/меркаптоэтанол (МУК-НК). Такой способ также позволяет получить флуоресцентные наночастицы на основе этилцеллюлозы, однако в данном случае прирост квантового выхода незначителен (рис. 14 б). Вероятно, гидрофильная природа НК препятствует непосредственному контакту полимера с поверхностью нанокристалла, что, соответственно, не приводит к подавлению дефектов поверхности НК.

Рис. 14 (а). Сравнение интенсивностей флуоресценции исходных НК и НК, включенных в ЭЦ частицы (3.5 нм, л_эм. = 546 нм). На врезке изображения исходных НК в водно-метанольной (1:1) смеси и ЭЦ частиц с включенными НК. (б) Сравнение интенсивностей флуоресценции МУК-НК, включенных в ЭЦ частицы (1) и исходных МУК-НК (2).

Стоит отметить, что оба подхода позволяют получить флуоресцентные частицы на основе этилцеллюлозы, при этом способ введения гидрофобных НК в ЭЦ частицы приводит к большему приросту квантового выхода по сравнению с методом включения гидрофилизированных НК в ЭЦ частицы.

Введение НК в полимерную матрицу как из этилцеллюлозы, так и из полимеров на основе акролеина привело к увеличению квантового выхода и, следовательно, к подавлению каналов тушения флуоресценции НК. Кроме того, подавлением каналов тушения можно частично или полностью устранить флуктуации флуоресценции одиночных НК, которые весьма нежелательны при разработке многоцветных флуоресцентных реагентов для высокочувствительной визуализации в биоанализе, и таким образом стабилизировать сигнал флуоресценции.

Таким образом, получена серия флуоресцентных полимерных носителей на основе гомо- и сополимеров акролеина, а, также на основе наночастиц из этилцеллюлозы, содержащих полупроводниковые НК. Широкий диапазон диаметров частиц (100-500 нм), высокая интенсивность флуоресценции полученных флуоресцентных полимерных дисперсий, фотостабильность, возможность в широких пределах варьировать цвет флуоресценции, используя при этом монохроматический источник возбуждения, открывают широкие возможности их использования в различных видах биоанализа.

Перечень разработанных типов флуоресцентных полимерных носителей и их характеристики приведены в сводной таблице 4.

Таблица 4. Характеристики флуоресцентных полимерных дисперсий

№	Тип полимерных дисперсий	Функциональные группы на поверхности	Средний диаметр частиц, нм	Коэф-т вариации, %
2.1	ПАА	СНО	510	12
2.2	ПАР	СНО	230	8
2.3	ПА1-ПС1	СНО	420	7
2.4	ПА5-ПС1	СНО	250	11
2.5	ПА10-ПС1	СНО	145	8
2.6	ЭЦ	ОН	211	10

4. Примеры использования флуоресцентных полимерных частиц в биоанализе

4.1 Использование флуоресцентных полимерных микросфер в РЛА

Полученные флуоресцентные полимерные микросферы, содержащие альдегидные группы, которые могут вступать в реакции с белками, представляют большой интерес для использования в качестве флуоресцентных носителей в различных видах биоаналитических тестов, основанных на специфическом высокоаффинном взаимодействии между детектируемым лигандом и реагентом, содержащим антилиганд, к которому могут быть отнесены реакции «антиген-антитело», «биотин-стрептавидин», «углевод-лектин», «иммуноглобулин-белок А», «транспортный белок-рецепторный белок», «холестерин-дигитонин», «комплементарные олиго- и полинуклеотид» и др. Существуют различные методы проведения анализов с участием полимерных микрочастиц, такие как РЛА в планшете, на стекле, на фильтре, в объеме, стрип-тесты, микрочипы и т.д.

Нами была разработана единообразная методика получения конъюгатов полимерных флуоресцентных микросфер разного размера с антителами и пептидными лигандами и получена серия конъюгатов с моноклональными антителами к антигену Y.pestis, антителами IgG человека к ревматоидному фактору, антителами IgG человека к L.monocytogenes 1-й и 2-й серогрупп и т.д. Иммунохимическую активность полученных реагентов определяли с помощью РЛА в планшете как наиболее простом и хорошо отработанном методе регистрации результата взаимодействия антител и антигена.

В качестве примера приведены результаты РЛА с использованием конъюгатов флуоресцентных микросфер ПА¹-ПС¹ (2.1, табл. 4) с моноклональными антителами к антигену Y.pestis (рис. 15). Найдено, что при использовании ПА¹:ПС¹, наполненных НК, и концентрации добавленных антител 4.8 мг/мл, минимально детектируемая концентрация составляет 15 нг/мл, что несколько ниже чувствительности иммуноферментного анализа, в целом, более трудоемким по сравнению с процедурой проведения РЛА. Время проведения РЛА составляет не более 2 ч.

Рис. 15. Результаты РЛА флуоресцентных сополимерных микросфер ПА¹:ПС¹ с включенными НК (диаметр ядра CdSe 3,7 нм). Микросферы сенсибилизированы моноклональными антителами к Y.pestis (0,8 мг/г полимера). 1-й ряд - реакция агглютинация при добавлении антигена Y.pestis (начальная концентрация антигена 1 мг/мл). 2-й ряд - отрицательный контроль - при добавлении нормальной кроличьей сыворотки.

Флуоресцентные наночастицы на основе этилцеллюлозы с диаметром частиц 200 нм (2.6, табл. 4) тестировали в РЛА на стекле. Анализ, основанный на реакции пассивной агглютинации на стекле, позволяет быстро, в течение нескольких минут, дать ответ о присутствии детектируемого антилиганда. На поверхность флуоресцентных этилцеллюлозных частиц иммобилизовали моноклональные антитела к антигену Y.pestis. Антитела добавляли в количестве от 3 до 10 мг/г полимера. Результаты реакции РЛА в УФ-свете показали, что чувствительность анализа составляет 5 мкг/мл, а время проведения анализа не превышает 5 мин.

4.2 Иммунофлуоресцентное мечение клеток полимерными микросферами, наполненными НК

Для анализов, связанных с визуализацией специфических рецепторов на поверхности клеток, необходимо использовать флуоресцентные полимерные носители-маркеры, диаметр которых не превосходит 250 нм. Этому критерию соответствуют флуоресцентные полимерные микросферы ПА¹⁰:ПС¹ (2.5, табл. 4) с включенными НК с л_эм=610 нм. Указанные микросферы конъюгировали с мини-анителами 4D5scFv-His₅, взятыми в различных концентрациях, для визуализации онкомаркера HER2/neu, гиперэкспрессирующегося на поверхности многих раковых клеток (при раке молочной железы, предстательной железы, яичника, желудка, легких). Ранняя диагностика HER2/neu, гиперэкспрессия которого ассоциирована со злокачественными опухолями и неблагоприятным прогнозом у пациентов, является в настоящее время одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. После обработки полученными конъюгатами клеток SKBR-3, гиперэкспрессирующих онкомаркер HER2/neu, наблюдалось характерное свечение клеток, причем интенсивность флуоресценции коррелировала с концентрацией антител в образцах (рис.16).

После инкубации клеток с полимерными частицами, конъюгированными с овальбумином в тех же концентрациях, флуоресцентного свечения клеток не наблюдалось (рис.16). Таким образом, связывание полимерных частиц, конъюгированных с мини-анителами 4D5scFv-His₅ с HER2/neu-гиперэкспрессирующими клетками является специфическим, и полученные конъюгаты могут быть использованы для мечения и визуализации опухолевых клеток.

Рис. 16. Микрофотографии клеток SKBR-3, меченные флуоресцентными полимерными микросферами ПА¹⁰-ПС¹, конъюгированными с 4D5-His₅.

Концентрация 4D5scFv-His₅ в конъюгирующей смеси 0.425 мкг/мл 5% дисперсии (1) и 0.085 мкг/мл (2), (3) - контроль, клетки SKBR-3, меченные флуоресцентными полимерными микросферами ПА¹⁰-ПС¹, конъюгированными с овальбумином.

4.3 Иммунофлуоресцентное мечение клеток НК, модифицированных тиолсодержащими молекулами

НК, модифицированные тиолсодержащими молекулами, были испытаны как флуоресцентные маркеры для визуализации комплекса “лиганд-антилиганд”. Малый размер таких частиц (5-10 нм) даст возможность применять их в анализах in vitro и in vivo для мечения и визуализации клеток и клеточных рецепторов.

НК, модифицированные цистеином (Цис-НК) были использованы для специфического мечения клеток и идентификации онкомаркера HER2/neu в лаборатории молекулярной иммунологии ИБХ РАН (член-корр.РАН Деев С.М.). Цис-НК конъюгировали с белком барстаром методом карбодиимидной активации карбоксильных групп. Тест был выполнен на клетках человеческой аденокарциномы яичника линии SKOV-3 (рис. 17). После предварительной обработки клеток 4D5scFv-барназа-His₅ полученные конъюгаты гидрофилизированных цистеином НК с барстаром с высокой специфичностью окрашивали поверхность HER2/neu -гиперэкспрессирующих клеток линии SKOV-3.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 17. Микрофотографии клеток SKOV-3, окрашенных конъюгатом барстар - Цис-НК. а - SKOV-3, меченные конъюгатом барстар -Цис-НК после обработки клеток 4D5scFv-барназа-His₅. б - Контроль - SKOV-3, меченные конъюгатом барстар-Цис-НК.

Полученные результаты свидетельствуют о специфичности взаимодействия полученных конъюгатов, а также демонстрируют потенциальную возможность использования таких НК для визуализации опухолевых клеток, экспрессирующих онкомаркер HER2/neu.

4.4 Визуализация объектов внутри биологических тканей методом флуоресцентной оптической диффузионной томографии

Уникальные оптические свойства полупроводниковых НК, такие как фотостабильность и широкий диапазон полос флуоресценции в зависимости от диаметра ядра НК, в том числе и в ближнем инфракрасном диапазоне, делают их привлекательными для использования в качестве in vivo маркеров при визуализации глубоко расположенных тканей и органов. С целью определения принципиальной возможности детекции НК методом ФДТ гидрофилизированные цистеином НК с максимумом флуоресценции 620 нм в диапазоне концентраций 0.003-0.3 мг/мл запаивали в стеклянную капсулу и помещали в пищевод животных (имитация детекции опухоли, контрастированной мечеными НК лигандами, имеющими высокую афинность к рецепторам на поверхности опухолевых клеток). Исследуемый объект сканировали в конфигурации «на просвет» лазерным источником излучения во флуоресцентном оптическом диффузионном томографе (ФДТ-установке), разработанном в лаборатории биофотоники ИПФ РАН под руководством к.ф.-м.н. В.А. Каменского. В результате методом флуоресцентной оптической диффузионной томографии были получены изображения капсул с высоким контрастом, что хорошо видно на рис. 18.



Рис. 18. Стеклянная капсула с Цис- НК (концентрация - 0.003 мг/мл). Внутренний диаметр капсулы 2 мм. Флуоресцентный диффузионный томограф, экспериментальный прибор (ИПФ РАН). Характеристики прибора: лазерный источник излучения Nd:YAG с удвоением частоты, = 532 нм, детектор: Hamamatsu H7422-20.

Данный результат показывает, что полученные в работе гидрофилизированные НК могут быть использованы в качестве визуализирующих контрастирующих агентов - маркеров в методе оптической томографии in vivo на глубине 0,5- 1,5 см.

4.5 Цитофлуориметрический анализ

Другой вариант использования флуоресцентных полимерных дисперсий - проточная цитофлуориметрия, позволяющая анализировать спектральные свойства каждой из проходящих через детектор микросферы. Использование спектрально кодированных полимерных микросфер предполагает анализ каждой микросферы для выявления присутствия в анализируемой пробе каждого из детектируемых объектов.

Полимерные дисперсии ПА¹-ПС¹ и содержащие НК двух типов с максимумами флуоресценции 530 и 610 нм, использовали для мечения и регистрации клеток линии Jurkat (Т-лимфобластной лейкемии) методом проточной цитофлуориметрии. В результате инкубации в течение 20 минут на поверхности клеток Jurkat сорбировалось в среднем 10-15 флуоресцентных полимерных микросфер (рис. 19).