История создания и развития биоматериалов

Благодаря этим свойствам материалы на основе сульфатов кальция пользуются популярностью среди хирургов.

2. Методы получения и исследования

2.1 Получение биокерамических материалов

Получение цементных порошков в системах брушит - сульфат кальция с различным соотношением компонентов различными методами:

· химическое осаждение (в качестве основных осаждаемых реагентов предполагается использовать растворы на основе нитрата и ацетата кальция; в качестве осаждающих растворов - растворы, содержащие фосфат и сульфат аммония). Исследование влияния условий синтеза (температуры, pH) на дисперсность и фазовый состав порошка.

· механохимическим способом будут получены порошковые смеси в инертных органических жидкостях (ацетон, этанол). Исследование влияния условий синтеза (времени синтеза, среды) на дисперсность и фазовый состав порошка.

Порошки цементов синтезировали исходя из реакций 1 и 2

Са(NO₃)₂ + (NH₄)H₂PO₄ + NH₄OH = CaHPO₄ + H₂O + 2NH₄NO3 (1)

Ca(NO₃)₂ + (NH₄)₂SO₄ + 0,5H₂O= CaSO4 * 0,5H₂O + 2NH₄NO₃ (2)

Синтез проводили при поддержании рН 5,0-6,5. При выходе за пределы рН синтеза получали порошки, содержащие примесные фазы. Например, при синтезе в области щелочного рН образовывались апатитовые или трикальцийсодержащие фазы с низкой степенью кристаллизации. Для достижения требуемого состава рН поддерживали на одном уровне периодическим добавлением раствора аммиака.

Сушка материалов проводилась начиная с температуры 160 °С. Это было сделано из предпосылки получения смеси монетит - полуводный сульфат кальция т.е. смеси способной к схватыванию. Известно, что брушит и двуводный сульфат кальция начинают терять воду при температуре 100-160 °С. А именно, брушит переходит в монетит выше 100 °С, а двуводный сульфат кальция в полуводный при 128-160°С. В дальнейшем предполагалось получать цементы, в которых процесс схватывания будет проходить за счет поглощения воды (из цементной жидкости) с образованием кристаллогидратов - сульфата кальция двуводного и брушита, содержащего также две молекулы воды.

Из разработанных цементных порошков были получены цементные образцы, проведен анализ фазового состава, микроструктуры и прочности при сжатии.

Цементы получали при смешении синтезированных порошков с цементной жидкостью в соотношении 1/1 по массе. Смешение проводили на предметном стекле размером 60Х60 мм. В качестве жидкости использовали раствор фосфата магния, содержащий фосфат натрия. Фосфат магния добавляли для повышения прочности цементов, фосфаты натрия для придания затвердевшим цементам нейтральной реакции. Схватывание цементов, полученных с использованием нитрата кальция была с среднем 4-5 минут.

Процесс схватывания проводили в тефлоновых цилиндрических формах, куда после смешения цементных порошков с жидкостью помещали полученный цементный раствор. После схватывания цементные затвердевшие образцы вынимали из формы через 30-40 минут.

2.2 Методы исследования образцов

2.2.1 Рентгенофазовый анализ

Основной задачей рентгенофазового анализа (РФА) является идентификация различных фаз в их смеси на основе анализа дифракционной картины, даваемой исследуемым образцом. Определение вещества в смеси проводится по набору его межплоскостных расстояний и относительным интенсивностям соответствующих линий на рентгенограмме.

Когерентно рассеянные рентгеновские лучи интерферируют между собой, при этом дифракционной решеткой для рентгеновского излучения служит кристаллическая решетка, поскольку межплоскостные расстояния в кристалле сравнимы с длиной волны излучения.

Целью рентгенофазового анализа является идентификация вещества в смеси по набору его межплоскостных расстояний (d) и относительным интенсивностям (I) соответствующих линий на рентгенограмме.

Для этого, согласно закону Брегга -- Вульфа, необходимо определение углов отражения и.

Обучение рентгенофазовому анализу обычно начинается с промера рентгенограмм кубических веществ, на рентгенограммах которых легко различаются а- и р-линии, это позволяет приобрести навык в оценке интенсивностей. Ошибки в оценке интенсивностей существенны только тогда, когда они являются очень грубыми (например, когда а- и р-линии от одного и того же d оцениваются, соответственно, как очень яркая и яркая и т. д.). Следует также подчеркнуть, что при сравнении полученных данных с табличными надо учитывать ряд факторов, влияющих на интенсивность при разных способах съемки (подробнее этот вопрос рассмотрен ниже). Значительно проще определение интенсивностей линий по дифрактограммам. Интегральная интенсивность линии пропорциональна ее площади. Ширина линий до и = 30 --35° остается практически постоянной, поэтому интегральная интенсивность будет пропорциональна максимальной интенсивности. Для определения максимальной интенсивности достаточно измерить высоту линии над фоном. Конечно, в случае количественного фазового анализа необходимо пользоваться значениями Iинт.

Большое место отводится исследованию мелкокристаллических тел, так называемому методу порошка.

Идентификация кристаллических веществ методом порошка. Метод порошка представляет собой способ изучения кристаллической структуры порошкообразных кристаллических тел. Порошковая рентгенограмма кристаллического вещества является характерной для данного вещества, поэтому её можно использовать для идентификации кристаллических веществ.

Один из наиболее важных этапов обработки дифракционных картин связан с нахождением символов атомных плоскостей, отражение от которых рентгеновского луча приводит к появлению рефлекса на рентгенограмме. В рентгенографии эта процедура называется индицированием. Индицирование необходимо для определения параметров элементарных ячеек, их типа, пространственной группы и многих других характеристик кристалла. Приступая к индицированию, желательно иметь некоторое обоснование возможной сингонии кристалла.

Рентгенограмма кристаллического вещества характеризует расположение атомов в этом веществе. Не существует двух веществ, дающих совершенно идентичные рентгенограммы. Однако наличие общих структурных особенностей у группы соединений часто приводит к появлению общих для всей группы линий. Подобная картотека стандартных рентгенограмм может быть полезной при идентификации отдельных членов ряда изоструктурных веществ. Порошковая рентгенограмма характеризуется углом и и интенсивностью отражения.

Рентгеновский анализ был основным методом исследования образцов. Он позволяет не только установить наличие тех или иных соединений в материале, но и определить кристаллическую структуру этих соединений.

2.2.2 Сканирующая электронная микроскопия

В сканирующей электронной микроскопии используется пучок электронов высоких энергий (от 5 до 40 Кv). Взаимодействие пучка электронов высоких энергий с твердой массивной мишенью приводит к процессам упругого и неупругого рассеяния на атомах мишени. При этом упругое рассеяние (изменение траектории электронов при незначительной потере энергии) происходит при взаимодействии с ядрами атомов, а неупругое рассеяние (потери энергии при незначительном изменении траектории) происходит при взаимодействии электронов падающего пучка как с ядрами, так и со связанными электронами атомов.

При однократном упругом рассеянии под большими углами и многократном малоугловом упругом рассеянии возникают отраженные электроны. Неупругое взаимодействие с электронами внешних оболочек атома мишени приводит к эмиттации этих, слабо связанных с ядром, электронов (так называемые вторичные электроны).

Вблизи поверхности образца и, если их энергия больше энергии поверхностного барьера (2-6 эв), эти электроны могут покинуть образец. Из-за сильного поглощения выход вторичных электронов с глубины более 100Ao маловероятен. Если вторичные электроны рекомбинируют с дырками, то генерируются фотоны с длиной волны в видимой и ИК - области спектра - наблюдается эффект люминесценции.

Неупругое взаимодействие с ядрами, при котором электроны пучка теряют энергию в кулоновском поле ядра атома, приводит к генерации тормозного (непрерывного) рентгеновского излучения. В результате неупругих соударений могут возникнуть ионизационные процессы внутренних электронных оболочек атома, приводящие к генерации характеристического рентгеновского излучения (ХРИ).

В том случае, когда падающий электрон имеет достаточную энергию, он может выбить электрон с внутренних K-, L- или M-оболочек и перевести атом в возбужденное (ионизированное) состояние. Атом возвращается в обычное состояние в результате перехода электрона с наружной оболочки на вакансию внутренней. При этом генерируется квант рентгеновского излучения. Поскольку электроны находятся на дискретных энергетических уровнях, излучаемый рентгеновский квант будет также иметь дискретную величину. По этой причине длины волн ХРИ имеют определенные значения для атомов с заданным атомным номером. Обнаруженные при анализе характеристические рентгеновские линии указывают на присутствие данного элемента в образце. Сканирующая электронная микроскопия построена на регистрации одного или нескольких типов излучений, описанных выше.

Электронно-микроскопические исследования материалов проводили при помощи сканирующих электронного микроскопа (Рис. 10). Спектрометр позволяет производить количественный и качественный анализы химических элементов, начиная с Be. Химический анализ осуществляли путем измерения энергии и интенсивности рентгеновского излучения, генерируемого при бомбардировке образца сфокусированным электронным пучком. Для уменьшения электрического заряда, образующегося на образце при его сканировании пучком электронов с высокой энергией, на поверхность керамики наносили токопроводящее покрытие.

Рис. 10 Строение сканирующего электронного микроскопа.

2.2.3Определение прочностных характеристик

В работе исследовали прочность при растяжении методом диаметрального сжатия цилиндрических образцов (Рис. 11). Испытания проводили на испытательной машине UTS-100 (Testsysteme GmbH) в соответствии со стандартом ASTM C 1161. Расчёт прочности при испытании цилиндрических образцов производили по формуле:

у=2Р/рdh,

где у - прочность при растяжении, МПа;

Р - разрушающая нагрузка, Н;

d - диаметр образца, мм;

h - высота образца, мм.

Рис.11 Форма, винты и зажим для приготовления образцов для испытания прочности на сжатие

2.2.4 Испытания на биосовместимость

Эксперименты на биосовместимость выполнены в ФГУ Московском научно - исследовательском онкологическом институте им П.А. Герцена.

Эксперименты in vitro по оценке острой цитотоксичности материалов и динамки нарастания на них клеток выполнены на модели клеточной линии иммортализованных нормальных фибробластов человека (ФЧ), полученной из Коллекции Типовых Клеточных культур Медико-Генетического научного центра РАМН, г. Москва.

Клеточную линию поддерживали в полной ростовой среде (ПРС) следующего состава: среда ДМЕМ (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова, РАМН, Москва), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ФУРО, Москва), глютамин (600 мг/л), гентамицин (50 мкг/мл).

В экспериментах использовали клетки в логарифмической фазе роста (предконфлюэнтный монослой).

Для получения суспензии одиночных клеток монослой ФЧ обрабатывали 0,25% раствором трипсина (Sigma,США), затем полученную взвесь клеток тщательно дважды отмывали центрифугированием в большем объеме ПРС, производили их подсчет и оценку жизнеспособности, окрашивая клеточную суспензию 0,04% раствором трипанового синего.

Затем в платы с подготовленными образцами ПКМ (опыт) и без них (контроль) помещали ФЧ (70 тыс.кл. на лунку) в объеме 200 мкл ПРС и инкубировали: для определения острой цитотоксичности в течение 24 часов, для оценки матриксных свойств пористых структур на основе хитозана и фосфатов кальция - 7, 14, 28, 56 и 112 и 180 суток.

Полную замену ПРС осуществляли до 7-х суток эксперимента дважды в неделю, далее, вплоть до окончания опыта, - ежедневно. Все операции осуществляли в стерильных условиях, культивирование - в атмосфере влажного воздуха, содержащего 5% СО2, при 37⁰С.

Жизнеспособность в динамике эксперимента оценивали с помощью МТТ метода, который основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать 3-(-4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (МТТ,Sigma, США) в голубые кристаллы формазана, нерастворимые в воде.

Количество образовавшегося формазана может характеризовать пролиферативную активность (жизнеспособность/количество) различных клеток человека и животных.

Для проведения МТТ-теста в опытах in vitro по окончанию культивирования на культуральном пластике-полистерене (контроль) и на образцах из каждой лунки отбирали по 100 мкл среды и вносили по 25 мкл раствора МТТ в концентрации 5 мг/мл.

Через 3 часа инкубации (5% СО₂, 37⁰ С) из каждой лунки полностью декантировали ПРС и осуществляли растворение образовавшегося формазана с помощью изопропилового спирта (200 мкл на лунку).

От осадка, образующегося в результате преципитации белков в изопропаноле, освобождались центрифугированием плат в течение 10 мин. при 3000 об/мин. Далее из каждой лунки переносили по 100 мкл супернатанта в 96-луночный плоскодонный планшет (Сostar, США) и оценивали оптическую плотность раствора формазана на спектрофотометре МСС-340 (Швеция) при длине волны 540 нм.

В качестве спектрофотометрических контролей (бланк) использовали пробы с чистой ПРС и пробы, содержащие тестируемые образцы в ПРС (без клеток).

Для определения цитотоксичности материалов рассчитывали пул жизнеспособных клеток через 24 часа инкубации с ними по формуле:

ПЖК= ОПопыт/ОПконтр *100% (3)

где: - ОП - оптическая плотность раствора формазана

- ПЖК - пул жизнеспособных клеток

При оценке матриксных свойств пористых материалов на основе хитозана определяли изменение пула ( Д ) в конкретный срок по формуле:

Д =(ОПнаст - ОПпред)/ ОПпред *100% (4)

ОПнаст. - величина оптической плотности в конкретный срок;

ОП пред. - величина оптической плотности в предыдущий срок.

Заключение

Полученные новые биоматериалы внесли ряд преимуществ по сравнению с традиционными:

1. Сократилось время восстановления костной ткани в результате ее повреждения.

2. Получены новые цементные биоматериалы с большей резорбируемостью по сравнению с традиционными биоцементами.

3. Появилась возможность управлять кинетикой биорезорбции и механическими свойствами за счет введения второго компонента.

4. Применены новые и оригинальные способы получения композиционных порошков.

5. Проведены оригинальные исследования по выявлению влияния условий старения в процессе синтеза, а так же их термического старения на процессы схватывания, твердения, микроструктуры и фазового состава биоцементов.

6. Исследовано влияние различных цементных жидкостей в зависимости от их состава, концентрации и др. на процессы схватывания, фазового состава и микроструктуры синтезируемых цементов.

Список литературы

1) Гольдберг М.А. Основные этапы истории разработки для замещения дефектов костных тканей. // История науки и техники: Сборник рефератов/ НИТУ «МИСиС». М., 2010, с 82 - 89.

2) Баринов C.M. Биокерамика на основе фосфатов кальция / С.М.Баринов, В.С.Комлев; под ред. К.А.Солнцева. М.: Наука, 2005. - 204с.

3) Путляев В.И. Современные биокерамические материалы / В.И.Путляев // Соровский образовательный журнал.- 2004. -Т.8, №1. С.44-50.

4) Системы внешней фиксации и регуляторные механизмы оптимальной биомеханики Томск.-STT.- 2001.- 480 с. Карлов А.В., Шахов В.П.

5) Конев В.А. Изучение процессов реорганизации различных остеозамещающих материалов при заполнении костных дефектов: Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук/ Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский орден трудового красного знамени научно - исследовательский институт травмотологии и ортопедии имени Р.Р. Вредена» Министерства здравоохранения российкой федерации. Спб. 2014.

6) Туманов С.В. Формирование микроструктуры и свойств фторгидроксиапатитовой керамики: Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук/ Федеральное государственное бюджетное учреждение наук Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук. М., 2004.

7) Егоров А.А. Дисперсно - упрочненные материалы на основе гидроксиапатита: Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук/ Федеральное государственное бюджетное учреждение наук Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук. М., 2012.

8) Федотов А.Ю. Пористые композиционные материалы. Фосфатно-кальциевая керамика - биополимер для регенерации костных тканей: Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук/ Федеральное государственное бюджетное учреждение наук Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук. М., 2010.

Размещено на Allbest.ru