Технология приготовления гипериммунных сывороток

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

Технология приготовления гипериммунных сывороток

По дисциплине: «Биотехнология»

Введение

Как известно, одной из важных задач прикладной иммунологии является разработка методов и средств сывороточной профилактики и серотерапии при инфекционных болезнях. Кроме того, для диагностики инфекционных заболеваний, решения некоторых вопросов криминалистики и судебной медицины, а также для решения вопросов, связанных с изучением эпидемиологии и эпизоотологии некоторых инфекционных заболеваний, используются иммунологические реакции (реакция агглютинации, реакция преципитации, пробирочная и диффузной преципитации в геле, реакция нейтрализации, реакция связывания комплемента и другие). С помощью серологических (иммунологических) реакций с применением специфических сывороток дифференцируют выделенные бактерии и вирусы.

Гипериммунные или специфические сыворотки, предназначенные для решения указанных задач, представляют собой сыворотки крови животных, систематически иммунизированных бактериальными и вирусными антигенами. Гипериммунные сыворотки содержат антитела, обладающие строго специфическими действиями на бактериальные токсины, патогенные бактерии или вирусы, против которых иммунизировали животных.

Изготовление лечебно-профилактических гипериммунных сывороток представляет сложный, длительный и многогранный технологический процесс, в котором участвуют врачи-микробиологи, биотехнологи, биохимики, инженеры и высококвалифицированные рабочие-аппаратчики, работники электротехнической службы.

сыворотка гипериммунный технология очистка

1. Структура сывороточного цеха

Технология производства гипериммунных сывороток объединяет ряд подразделений, главным из которых является сывороточный цех. Структура цеха должна включать в себя карантинное отделение, иммунизационные клиники, антигенные лаборатории и отделения получения, концентрации и очистки сывороток.

Производственные помещения и оборудование структурных подразделений сывороточного цеха зависят от количества ассортимента препаратов. По характеру технологического процесса при производстве гипериммунных сывороток требуется создание стерильных условий работы. Для этого боксовые помещения должны обеспечиваться притоком стерильного воздуха, рабочие места (столы, стулья), стены, потолок и пол подвергаться влажной уборке с применением дезинфицирующих веществ и УФЛ-облучения. Это обеспечивает получение высококачественных препаратов. Остальные рабочие помещения и иммунизационные клиники должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией.

Отделения по получению, концентрации и очистке сывороток должны быть оснащены специализированным высокопроизводительным оборудованием и аппаратурой с механизацией и автоматизацией основных технологических процессов, что улучшает условия труда и качество гипериммунных сывороток. Сжатый воздух, вакуум, холодная, горячая, дистиллированная, деминерализованная вода подаются по системе трубопроводов. Для сохранения нативных и концентрированных сывороток, антигенов должны иметься специально оборудованные помещения с низкой температурой. В сывороточном цехе должны иметься автоклавные, термостатные и рефрижераторные помещения со всем необходимым оборудованием.

Основными задачами иммунизационных отделений является отбор, заготовка, иммунологическая подготовка животных-продуцентов, а также их содержание, иммунизация, кровопускание, ветеринарно-санитарное и зоотехническое обслуживание.

Для приготовления иммунных сывороток чаще всего используют лошадей, крупный рогатый скот (волы), при производстве сыворотки против рожи используют свиней. С целью приготовления диагностических иммунных сывороток чаще всего используют кроликов, птиц, реже овец, коз.

2. Факторы, влияющие на получение высокоактивных лечебно-профилактических и диагностических сывороток

-- качество применяемых антигенов, в частности их чистота, объем и концентрация;

-- неспецифические раздражители и адъюванты;

-- индивидуальные особенности животных-продуцентов, в частности их способность к иммунобиологической перестройке при создании у них грундиммунитета, для чего необходим тщательный отбор животных-продуцентов;

-- метод и схемы гипериммунизации;

-- содержание и кормление животных в период их подготовки к эксплуатации.

Антиген.

Существует прямая связь между качеством антигена, силой антигенного раздражения и уровнем накопления специфических антител в крови животных. Особенно это положение выражено при получении противовирусных сывороточных препаратов. Для приготовления антигенов должны использоваться штаммы микроорганизмов, обладающие хорошо выраженными антигенными и иммуногенными свойствами.

Качество антигенов во многом зависит от их чистоты. Под чистотой понимается неконтаминированность их посторонней микрофлорой, в том числе агентами вирусной природы, а также степень очистки антигенов от балластных белков. К качеству антигена также относится состояние суспензии микробных клеток, ее объем и концентрация.

Адъюванты.

При изготовлении гипериммунных сывороток применяют антигены, специфическое действие которых усилено адъювантными веществами, в качестве которых используют гель гидроокиси алюминия, алюмокалиевые квасцы и другие (см. выше). При этом большое значение имеет качество адъювантов. Под качеством адъювантов понимают их чистоту по отношению к содержанию побочных химических соединений, качество и стойкость образования геля, полноту адсорбции антигенов и т. д.

В практике производства антитоксических сывороток широко используется хлористый кальций, алюмокалиевые квасцы, реже адъюванты типа Фрейда, тапиока. При изготовлении большинства противовирусных гипериммунных сывороток используют антигены без адъювантов, так как такие антигены готовятся из вирусосодержащих суспензий, из тканей куриных эмбрионов, лабораторных Животных или клеточных культур.

3. Отбор животных-продуцентов, грундирование

Животных, применяемых для получения сывороток, завозят из стационарно благополучных по заразным заболеваниям районов. При этом они должны быть клинически здоровыми, средней и выше средней упитанности, свободными от накожных паразитов. Всех завезенных животных выдерживают в карантине 45 суток. За это время их всесторонне обследуют с ежедневным (утром и вечером) двукратным измерением температуры тела и проверяют на пораженность гельминтами и при необходимости дегельминтизируют. Лошадей исследуют на сап, трихомоноз, бруцеллез, туберкулез, пироплазмидозы и инфекционную анемию; крупный рогатый скот -- на туберкулез, бруцеллез, лептоспироз; свиней -- на туберкулез, бруцеллез; овец -- на бруцеллез, туберкулез, паратуберкулез и другие инфекционные заболевания согласно требованиям нормативно-технической документации.

При отборе животных-продуцентов надо учитывать их физиологические и иммуннобиологические показатели.

При использовании лошадей для получения некоторых гипериммунных сывороток, нормальной сыворотки, сыворотки жеребых кобыл (СЖК) и желудочного сока чаще используют помеси донской и казахской пород в возрасте от 3 до 12 лет. От одного донора массой 450--500 кг за год в среднем получают около 360 л желудочного сока и 4000 овцедоз СЖК.

Для получения лечебно-профилактических сывороток против пастереллеза, сибирской язвы, рожи, анаэробных и других инфекций используют волов красностепной, калмыцкой, симментальской, швицкой, астраханской и других пород в возрасте от 3 до 8 лет и массой не менее 350 кг.

При получении противорожистой сыворотки используют лошадей, волов, а также свиней крупной белой породы в возрасте 5--6 месяцев и массой не менее 80 кг.

Овец, баранов и валухов в возрасте 2--3 лет и массой 30--45 кг используют для получения некоторых диагностических (например, листериозных) и нормальных (например, для приготовления сывороточных сред с целью культивирования лептоспир) сывороток.

Принято считать, что успех гипериммунизации в значительной степени зависит от породы и возраста животных. Более высокие титры антител получают при использовании для иммунизации породистых животных в возрасте от 3 до 10 лет. Пол животных не имеет существенного значения.

Учитывая, что введение антигенов и периодическое кровопускание приводят к нарушению обмена веществ и анемии, а в ряде случаев и к снижению титров антител, первостепенное внимание нужно уделять вопросам полноценного, сбалансированного кормления животных-продуцентов гипериммунных сывороток.

Кормление животных-продуцентов отличается от кормления животных вообще, что связано с особой, вышеозначенной и очень большой физиологической нагрузкой на их организм. Кормление животных -- доноров крови и желудочного сока на биопредприятиях осуществляется в соответствии с утвержденными рационами.

На активность выработки животным-продуцентом гипериммунной сыворотки антител влияют:

1. Тип нервной деятельности животного-продуцента.

2. Реактивность организма.

3. Порода.

4. Пол.

5. Конституция.

6. Возраст.

4. Гипериммунизация животных

Вторым этапом получения специфических сывороток является проведение гипериммунизации животных.

Гипериммунизация -- это метод парентерального введения животным нарастающих доз соответствующих антигенов с целью получения наивысшей ответной иммунологической реакции организма, а следовательно, и максимального увеличения в крови животных специфических антител, которое должно обеспечивать лечебный, профилактический и диагностический эффект препаратов.

При гипериммунизации сыворотка крови животных изменяется. Обычно нарастает количество общего белка, увеличивается количество гамма- и бета-глобулиновых фракций, уменьшается содержание альбуминов. Так, если в нормальной сыворотке крови лошади альбумины составляют 50% общего количества белков, то в иммунной сыворотке их бывает 35% и ниже.

Успех гипериммунизации животных-продуцентов во многом зависит не только от тщательного их подбора, качества антигена и адъювантных веществ, но и от правильно выбранной схемы гипериммунизации, правильной технологии выполнения этих схем иммунизации, а также технологии кровопускания и обескровливания продуцентов в конце их эксплуатации.

Антиген вводится обычно подкожно и внутримышечно в несколько мест с таким расчетом, чтобы точки инъекции находились вблизи лимфатических узлов. При этом в иммуногенез быстрее вовлекается большое количество лимфоузлов, что повышает общую и иммунологическую реактивность организма. Введение антигена одновременно в несколько мест, кроме того, обеспечивает лучшую рассасываемость его и появление более равномерных и менее бо-лезненных инфильтратов.

Антигены в небольших дозах (5--25 мл) обычно вводят подкожно в верхнюю часть шеи животного, а в больших количествах -- в область спины и крупа внутримышечно. Нужно иметь в виду, что при введении животному больших доз антигена образуются большие инфильтраты и даже абсцессы. Но абсцессы обычно бывают стерильными.

Места введения антигена или крововзятия протирают дезинфицирующими растворами.

Для гипериммунизации, как было показано выше, чаще всего используют лошадей. Цикл гипериммунизации обычно длительный и составляет 1--2 и более месяцев. Впрочем, в каждом случае цикл иммунизации во многом зависит от вида гипериммунной сыворотки.

Гипериммунизацию лошадей начинают с малых доз: 0,5; 1,0; 2,5 и 5,5 мл с интервалом в трое суток. Затем культуры возбудителя сибирской язвы вводят с интервалами в 3--4 суток и в дозах 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0; 110,0; 120,0; 130,0; 140,0; 150,0. Обычно бывает достаточным ввести антиген 13 раз, и сыворотка лошадей- продуцентов становится активной. При введении доз от 10 до 80 мл к культуре добавляют 0,2% квасцов, а к дозам от 100 до 150 МЛ'-- 0,1% квасцов. При повышении у животных температуры интервал между инъекциями увеличивают до 4 или 5 суток.

В каждом конкретном случае схемы иммунизаций могут быть разными.

Не игнорируя значения вида, породности, возраста животных, качества рационов кормления, следует иметь в виду, что теоретически обоснованным и практически целесообразным является отбор продуцентов по иммунологическим показателям. Например, отбор лошадей-продуцентов для производства противодифтерийной сыворотки проводится по титру естественного противодифтерийного анатоксина в крови животных, выявляемого по реакции нейтрализации. Степень нарастания титров анатоксина в результате грундиммунизации использовалась как основание для отбора лошадей-продуцентов противостолбнячной, противоботулинической, противодифтерийной и других сывороток.

При производстве иммунных сывороток против диплококковой инфекции используют в качестве продуцентов быков (волов). По данным Г. Ф. Коломнина с соавторами (1985), у волов, заготовляемых для этих целей, содержатся антитела к возбудителю диплококковой инфекции в титре 1 :200--1 : 3200. Поэтому авторы не рекомендуют подвергать их грундиммунизации, а сразу используют для гипериммунизации. Если при исследовании отбираемых волов антитела не обнаруживают, то в таком случае их грундируют. Отбор животных и грундирование их обычно проводится в местах заготовки.

Всех животных, у которых при грундиммунизации не обнаруживают антитела, подвергают выбраковке.

Следовательно, получение иммунных сывороток осуществляется в два этапа.

Первый этап связан с подбором животных-продуцентов, а также отбором из числа завезенных животных особей и проведение так называемой грундиммунизации (основы иммунитета). Для этих целей животным вводят убитый антиген или живых аттенуированных микробов (убитые или живые вакцины). Эти антигены, как правило, вводят дважды с интервалом в 2--3 недели внутримышечно или подкожно. До начала грундиммунизации и через 7--8 суток после последнего введения антигена у животных берут кровь и определяют в ее сыворотке наличие антител к тому антигену, с помощью которого в последующем готовят гипериммунную сыворотку. Выявление в сыворотке антител в титрах 1 :800 и выше указывает на то, что данное животное может быть использовано как продуцент для получения гипериммунной сыворотки. Предварительное, правильно проведенное, грундирование животных обеспечивает повышение (в 5 раз и более) титров специфических антител при последующей гипериммунизации тем же антигеном, увеличивает «выход» высокоактивного препарата и создает условия получения сывороток в более короткие сроки. На этом заканчивается подготовка животных-продуцентов.

Эффективность иммунизации животных повышается при дробном введении антигенов одновременно в различные участки тела животного с охватом возможно большего количества лимфатических узлов.

По окончании гипериммунизации, когда в сыворотке крови животного установлен максимальный титр специфических антител, у него берут кровь обычно через 7--10 суток после последней инъекции антигена.

5. Приготовление гипериммунных сывороток

.

6. Технологическая схема получения гипериммунных сывороток

Сыворотку получают методом цитрирования крови с последующим сепарированием и дефибринированием плазмы.

Сыворотку крови консервируют 0,5 %-ным раствором фенола и от полноты адсорбции антител.

При получении большинства противовирусных гипериммунных сывороток используют антигены без адъювантов, отстаивают в специальных емкостях в течение двух месяцев. Отстоявшуюся сыворотку фильтруют вначале через пластины Ф, а затем через стерилизующие пластины СФ.

В последующем сыворотку расфасовывают во флаконах емкостью по 100 мл. Флаконы закрывают пробками и для герметичности их обкатывают алюминиевыми колпачками. На флаконы наносят этикетку и часть продукции сдают на контроль.

Гипериммунные сыворотки, получаемые из крови путем удалеформенных элементов и фибрина, называются нативными (в отличие сывороток, подвергнутых дополнительной очистке и концентрации специальными методами).

Этапы получения гипериммунных сывороток

Принципы очистки сывороток основаны на выделении из них активных белковых фракций (преимущественно гамма-глобулинов) и удалении балластных фракций, не являющихся носителями антител (например, альбумины).

Выделенные фракции растворяют в меньшем объеме растворите ля, по сравнению с исходным объемом, что позволяет препарат сконцентрировать и вводить в меньших дозах.

Необходимость в получении концентрированных сывороток связана:

· со значительными объемами выпускаемых лечебных сывороток исчисляемыми сотнями тонн. Для расфасовки сывороток требуете: большое количество флаконов, пробок, колпачков, ящиков для упаковки. Кроме того, большие затраты уходят на транспортировку такого объема сывороточных препаратов

· с недостаточно высокой активностью отдельных сывороток, ко торые вводятся животным в больших дозах (с профилактической целью - по 20 - 60 мл, с лечебной - по 40 - 120 мл). Уменьшения общего объема выпускаемых сывороток и повышения их активности можно достигнуть путем их очистки и концентрации иммуноглобулинновой фракции гипериммунной сыворотки.

В производственных условиях очистку и концентрацию сывороток проводят чаще всего комбинированным способом, включающим:

· ферментативный гидролиз;

· прогрев ферментированных сывороток в кислой среде;

· солевое фракционирование;

· дополнительную очистку от неактивных белков с использованием органических растворителей, сорбентов;

-дополнительное выдерживание сывороток при пониженных температурах.

При такой обработке удаляется до 80 - 85 % балластных белков сыворотки.

Кроме указанных методов очистки и концентрации сывороточных препаратов, гамма-глобулиновая фракция выделяется из сыворотки крови методом ультрафильтрации. Для этого используются ультрафильтрационные модули на полых волокнах, отличающихся пределом задержания по молекулярной массе: 5000, 15000, 50000, 100000 дальтон. В соответствии с этим, в биопромышленности используются модули УФУ-5, УФУ-15, УФУ-50, УФУ-100.

Для задержания гамма-глобулинов лучше всего использовать УФУ100, обеспечивающую практически полную задержку гамма-глобулинов на фильтре, так как молекулярная масса гамма-глобулинов составляет 160000 - 900000 дальтон.

Производственные опыты по ультрафильтрации сывороток дали возможность сконцентрировать их в 3 раза и практически без потерь иммуноглобулинового компонента. Это позволяет сократить объем сывороточных препаратов в 3 раза и во столько же раз повысить их удельную активность.

Более того, ультрафильтрат, который в основном представлен альбуминовой фракцией, может быть использован в качестве компонента питательной среды для выращивания микроорганизмов, а также как протеиносодержащий препарат для лечения животных.

Отечественный метод приготовления сыворотки, известный под названием «Диаферм-3» (диализ, ферментация), был разработан в 1954 г. и затем усовершенствовался.

Метод «Диаферм-3» включает восемь стадий:

· стадия ферментативного гидролиза сывороточных белков пепсином в течение 1 ч при рН 3,2 и 1 ч при рН 4,2 при температуре 22 -25 °С;

· стадия термоденатурации в течение 45 мин, при рН 4,3 и 58 °С вприсутствии 14-14,5% сульфата аммония ;

· стадия высаливания активных глобулинов сульфатом аммония(34%) при рН 7,1;

· стадия стерилизующей фильтрации;

· стадия диализа и дополнительной очистки от балластных бел
ков в их изоэлектрической точке при рН 5,2-5,6 в присутствии хлороформа (СН);

· стабилизация очищенной сыворотки в течение 3 месяцев;

· повторная стерилизующая фильтрация

· расфасовка.

Линия производства сывороток.

1 - сепаратор; 2 - дефибринатор; 3 отстойник; 4 - фильтр предварительной очистки; 5 - фильтр стерилизующей фильтрации; 6 - сборник готовой продукции

Повторной стерилизации подвергают в случае необходимости ряд сывороток (противодифтерийные, противоботулинические) с появлением хлопьевидного осадка.

В промышленном производстве готовится множество различных сывороток. Технологические приемы приготовления их в общих чертах одинаковы. В то же время для приготовления отдельных сывороток имеются свои технологические особенности производства, которые для каждой сыворотки оговорены в соответствующей научно-технической документации.

7. Контроль качества сывороточных препаратов

Контроль за качеством сывороток осуществляют на всех стадиях их изготовления.

После производственного контроля каждая серия сыворотки проверяется по физическим показателям (цвет и консистенция), на стерильность, безвредность, правильность объема расфасовки в разные емкости (ампулы или флаконы), герметичность их укупорки, качество этикетировки, маркировки и упаковки, а также специфическую активность после 20-дневного выдерживания при (37 ± 1) °С.

Проводят также контроль сывороточных препаратов на содержание белка, водородных ионов (рН), электрофоретическую чистоту и др. (апирогенность, остаточное содержание солей).

Сывороточные препараты должны быть стерильными (не контаминированы бактериями и вирусами), безвредными и высокоактивными специфическими препаратами.

Контроль бактериальной стерильности проводят по общепринятой методике высевами из препарата на питательные среды МПА, МПБ с глюкозой, МППБ под маслом, на агар Сабуро или среду Чапека для исключения грибковой микрофлоры.

Безвредность каждой серии сывороточных препаратов проверяют на морских свинках массой по 300 - 400 г (беременных свинок в опыт не берут), которым подкожно вводят 10 мл сыворотки (по 5 мл с обеих сторон); иногда безвредность проверяют на кроликах. Животные должны оставаться здоровыми и не иметь заметной местной и общей реакции в течение 10-дневного наблюдения.

Специфическую активность сывороточных препаратов определяют биологическим и серологическим методами. Для определения биологической активности используют восприимчивых лабораторных животных, эмбрионы птиц или культуры клеток. Разведения для РН на животных делают 1/15 М фосфатным буферным или физиологическим растворами при рН 7,4 (с 0,2 % желатина).

Серологические исследования проводят в соответствующих реакциях (РН, РДП в агаровом геле, РТГА, РСК, РИГА и др.) с использованием в качестве контроля заведомо известных позитивных и негативных сывороток (референс-препаратов).

Активность сывороточных препаратов определяют по сравнению со стандартными (эталонными) референс-препаратами. Для этого сыворотку с неизвестной активностью используют параллельно со стандартной сывороткой, а затем рассчитывают дозу испытуемой сыворотки, эквивалентную по эффекту единице активности стандарта. Это позволяет исключать влияние на результаты оценки таких факторов, как особенности тест-агентов, чувствительность подопытных животных, сезонность и др., т.к. эти факторы в равной степени будут влиять на результаты, получаемые со стандартной и испытуемой сыворотками, и активность испытуемой сыворотки относительно стандартной будет оставаться постоянной.

Дальнейшие интенсивные исследования в области стандартизации сывороточных препаратов, усиление требований к системам лабораторного и биологического контроля вновь разрабатываемых и модифицируемых препаратов, выделение этого направления в самостоятельную проблему несомненно будут способствовать еще большему улучшению качества лечебно-профилактических и диагностических сывороточных препаратов.

Классификация гипериммунных сывороток

Заключение

В практике широко применяют как с лечебной, так и профилактической целью иммунные сыворотки. Иммунные сыворотки получают на биофабриках путем гипериммунизации животных (лошадей, волов, свиней, овец, кроликов и др.) соответствующими антигенами по специальным схемам. Этих животных называют продуцентами. Иммунные сыворотки содержат специфические антитела против соответствующих возбудителей. Лечебно-профилактическая эффективность иммунных сывороток зависит от титра антител, способа и кратности введения. При введении иммунной сыворотки больному животному она оказывает выраженное лечебное действие, при введении с профилактической -- создается пассивный иммунитет через несколько часов после введения, продолжительность которого до 14 дней. По направленности действия иммунные сыворотки подразделяют на антибактериальные, противовирусные и антитоксические, например, сыворотка против рожи свиней, сыворотка против болезни Ауески сельскохозяйственных животных и пушных зверей, антитоксическая сыворотка против анаэробной дизентерии ягнят и инфекционной энтеротоксемии овец. При введении гетерологичных (чужеродных) сывороток животным следует всегда помнить, что они могут вызвать анафилактический шок или сывороточную болезнь.

Список использованной литературы

1."Биотехнология", под редакцией академика Е.С. Воронина, изд. ЗАО ГИОРД, 2005 г.

2."Лабораторная диагностика", под редакцией В.В. Долгова, О.П. Шевченко, изд. Реафарм, 2005г.

3."Лабораторные исследования", справочник, изд. Интермедика, 2005 г.

4."Медицинские лабораторные технологии", под редакцией А. И. Карпищенко, изд: Интермедика, 2002 г.

5."Процессы и аппараты биотехнологии", С.В. Ковалев, Ю.И. Хрипков, изд. ВАХЗ, 1998 г.

Размещено на Allbest.ru