Формування і структура полімерних мембран з антибактеріальними властивостями

хітозан мембрана ацетатцелюлозний

У першому розділі, який є аналітичним оглядом літератури. описано методи формування та модифікування полімерних мембран. Показано, що найбільш перспективним для отримання мембран є метод фазової інверсії, а при модифікуванні поверхні мембран - прищеплення полімерів шляхом хімічного ініціювання.

У другому розділі наведено характеристики об'єктів досліджень та представлено методики проведення експериментів. Для формування мембран використовували ацетати целюлози з середньовґязкістною молекулярною масою 254 000. Розчинник - N,N - диметилсульфоксид (ДМСО). Осаджувач - дистильована вода.

Для дослідження процесу модифікування поверхні були використані промислові ацетатцелюлозні мембрани марки УАМ-300 (виробництво ЗАО Владипор, Росія) та целюлозні мембрани марок с005f, С010F, C030F, C100F (Виробництво Nadir, Німеччина).

Як антибактеріальні речовини використовували:

1) Полігексаметиленгуанідинхлорид (ПГМГ-хлорид) з середньов'язкістною молекулярною масою - 5 000.

2) Налідиксова кислота - синтетичний антибіотик класу хінолонів. Для модифікування мембран використовували натрієву сіль налідиксової кислоти, яку отримували в лабораторних умовах:

3) Йод.

4) Хітозан - природний полісахарид. Використовували пластівці хітозану з молекулярними масами 161 000 та 400 000.

Мембрани формували методом інверсії фаз. Модифікуючу речовину (ПГМГ-хлорид або крохмаль) вводили безпосередньо у формувальний розчин.

В роботі використовували наступні методи поверхневого модифікування ацетатцелюлозних та целюлозних промислових мембран: омилення ацетатцелюлозних мембран УАМ-300, прищеплена полімеризація на поверхні ацетатцелюлозних та целюлозних мембран поліакрилової кислоти (ПАК), полігліцидилметакрилату (ПГМА) (з їх наступною обробкою відповідно ПГМГ-хлоридом та налідиксовою кислотою) та хітозану з використанням реактиву Фентона (прищеплення ПАК) або перйодату натрію (прищеплення ГМА та хітозану).

Ацетатцелюлозні та целюлозні мембрани при висушуванні повністю втрачають свої розділювальні властивості, тому про ступінь прищеплення на поверхні мембран ми опосередковано судили за зміною об'ємного потоку води крізь мембрани порівняно з немодифікованими зразками.

Для визначення розділювальних характеристик мембран використовували стандартну циліндричну комірку непроточного типу Amicon 8200, (виробництво Millipore, США).

Для проведення якісного аналізу результатів хімічного модифікування зразків мембран використовували ІЧ-спектроскопію. Дослідження поверхневих шарів зразків мембран проводили на спектрометрі UR-20 методом багаторазового порушеного повного відбиття (МБППВ) з використанням приставки МБППВ.

Бактерицидну дію мембран досліджували відносно таких культур бактерій Української колекції мікроорганізмів (УКМ): Escherichia coli BE, Escherichia coli HB 101, Escherichia coli, Staphylococcus aureus

Третій розділ присвячений розробці методів отримання ацетатцелюлозних мембран з антибактеріальними властивостями.

Детально описано формування ацетатцелюлозних мембран з добавкою ПГМГ-хлориду методом фазової інверсії.

Показано, що зміна концентрації бактерицидного препарату в формувальному розчині суттєво впливає на характеристики мембран. Збільшення концентрації ПГМГ-хлориду від 0,5 до 3% (мас.) призводить до зменшення об'ємного потоку води з 409 до 56 л/(м²·год) та збільшення коефіцієнта затримки ацетатцелюлозними мембранами ПЕГ-35000 з 5,9 до 25% відповідно.

Це засвідчує, що наявність ПГМГ-хлориду в формувальному розчині призводить до формування мембран більш тонкопористої структури.

ПГМГ-хлорид - водорозчинний олігомер, тому для запобігання його десорбції з ацетатцелюлозної мембрани, бактерицидний препарат хімічно зшивали з ацетатом целюлози в процесі формування мембрани.

Як зшивальний агент використовували епіхлоргідрин (ЕХГ), який в лужному середовищі ковалентно зв'язує біоцидний препарат з матеріалом мембрани. Реакція відбувається за механізмом послідовного оксіалкілування гуанідинових груп, в результаті якої утворюється просторово зшитий водонерозчинний ПГМГ- хлорид.

Вивчення розділювальних характеристик отриманих мембран свідчать, що збільшення тривалості витримування мембран в коагуляційній ванні з ЕХГ призводить до зменшення об'ємного потоку води крізь мембрани та до зростання коефіцієнта затримки мембранами ПЕГ з різними молекулярними масами.

Чим більша концентрація ПГМГ-хлориду у розчині, з якого сформовані мембрани, тим більш суттєві зміни спостерігаються в характеристиках мембрани. Так, якщо для мембрани. сформованої з розчину, який містив 3% (мас.) ПГМГ-хлориду коефіцієнт затримки ПЕГ з ММ 35000 дорівнює 100%, то для мембрани. сформованої з розчину, що містив 0,5% (мас.) ПГМГ-хлориду, лише 36% (витримування в коагуляційній ванні з ЕХГ цих мембран становило 30 хв.).

Бактерицидна активність сформованих ацетатцелюлозних мембран як до грам-негативних, так і до грам-позитивних бактерій зростає зі збільшенням в них кількості ПГМГ-хлориду.

Найвищу бактерицидність має мембрана, розчин для формування якої містив 3% (мас.) ПГМГ- хлориду. Дана мембрана характеризується 100%-ою бактерицидністю до грам-негативної бактерії E. coli та 99,9%-ою бактерицидністю до грам-позитивної бактерії S. aureus. Висока бактерицидна дія даної мембрани зберігається протягом більше 70 діб.

Проведені дослідження по вивченню бактерицидних властивостей мембран з ковалентно зшитим ПГМГ-хлоридом показали, що зшивання ПГМГ-хлориду з ацетататом целюлози погіршує бактерицидну активність мембран.

Можливо, це спричинено участю функціональних груп, що надають ПГМГ-хлориду біоцидних властивостей, у зшиванні даної речовини з матеріалом мембрани.

Дослідження впливу тривалості витримки мембрани в коагуляційній ванні із зшивальним агентом на бактерицидні властивості підтверджують це припущення (табл.1).

Таблиця 1.

Дослідження бактерицидної активності ацетатцелюлозних мембран, модифікованих ПГМГ-хлоридом у присутності зшивального агента

В третьому розділі також представлено опис формування ацетатцелюлозних мембран, наповнених крохмалем. Мембрани формували методом інверсії фаз на підкладках з нетканого поліпропілену. Як показали експериментальні дослідження збільшення концентрації крохмалю в формувальному розчині призводить до зростання продуктивності мембран та до зменшення коефіцієнту затримки мембранами ПЕГ-35000. Таким чином, введення в АЦ-мембрану дисперсного крохмалю призводить до погіршення порової структури мембран, перш за все в селективному шарі.

Для надання отриманим мембранам антибактеріальних властивостей їх було модифіковано 0,25% р-ном йоду в КJ. Дослідження стабільності комплексу крохмаль-йод в водних розчинах при значеннях рН 1,68, 3, 6,86, 9,68, 11 показало, що даний комплекс в лужному середовищі стабільний протягом 4 діб, в нейтральному - 7 діб і лише в кислому середовищі даний комплекс є стабільним протягом тривалого часу (мінімум 30 діб).

Таблиця 2.

Дослідження впливу стабільності комплексу крохмаль - йод на бактерицидні властивості крохмальвмісних ацетатцелюлозних мембран по відношенню до грам- негативної бактерії E. coli

Досліджено, що бактерицидність модифікованих йодом ацетатцелюлозних мембран, розчини для формування яких містили 1 та 2% (мас.) крохмалю, відносно грам-негативної бактерії E. coli становить 100%.

Дана бактерицидність в нейтральному середовищі зберігається сталою протягом 3 діб, потім поступово зменшується і на 7 добу мембрана повністю втрачає свої антибактеріальні властивості (табл. 2).

Результати даних аналізів підтверджуються дослідженням стабільності комплексу крохмаль - йод в нейтральному середовищі.

В четвертому розділі представлено результати досліджень щодо модифікування промислових целюлозних та ацетатцелюлозних мембран.

Розроблено та досліджено процес модифікування промислових целюлозних мембран хітозаном з молекулярними масами 161000 та 400000.

Про ефективність модифікування опосередковано судили по зниженню продуктивності модифікованих мембран відносно немодифікованих. Максимальне зниження водопроникності та 100%-ва бактерицидність спостерігається для мембрани, модифікованої 1% (мас.) оцтовокислим розчином хітозану.

Подальше збільшення концентрації хітозану в модифікуючому розчині не призводить до зменшення водопроникності, крім того, розчини хітозану з концентрацією 2% (мас.) та вище досить в'язкі, що ускладнює їх застосування. Встановлено, що транспортні властивості модифікованих мембран залежать від молекулярної маси хітозану. Так, для їх порівняння зразки целюлозних мембран С005F, С010F, C030F та C100F, що характеризуються cut-off 5000, 10 000, 30 000 і 100 000 відповідно, модифікували хітозаном з молекулярними масами 400 000 та 161 000 (табл. 3).

Продуктивність мембран, модифікованих хітозаном з ММ 400 000 менша ніж мембран модифікованих хітозаном з ММ 161 000. Коефіцієнти затримки ж мембранами хлориду натрію, модифікованими більш високомолекулярним хітозаном, вищі ніж мембранами модифікованими хітозаном з меншою ММ.

Дані залежності пояснюються тим, що макромолекули хітозану з ММ 400 000 нездатні проникати в тонкі пори мембрани і тому прищеплення головними чином відбувається на поверхні мембрани, в результаті чого вона набуває позитивного заряду.

Таблиця 3 Розділювальні властивості мембран, модифікованих хітозаном з різною молекулярною масою (робочий тиск 0,2 МПа для мембрани С005 F та C010F і 0,05 МПа для мембран C030F та C100F).

Бактерицидність мембран C005 F, модифікованих хітозаном з молекулярними масами 161000 та 400000, по відношенню до E.coli складає 100%. Дослідження антимікробних властивостей мембран C010F, модифікованих хітозаном 161000 та 400000, показало, що вони характеризуються 80,0 та 99,0% бактерицидністю відповідно. Бактерицидність більш широкопористих мембран C030F, C100F, модифікованих хітозаном з ММ 161 000, також нижча за мембрани, модифіковані хітозаном з ММ 400 000. В цілому, із збільшенням розміру пор мембрани, модифіковані як менш так і більш високомолекулярним хітозаном, втрачають свої антимікробні властивості, незважаючи навіть на те, що при модифікуванні більш широкопористих мембран кількість хімічно прищепленого хітозану значно вища, ніж для тонкопористих.

Бактерицидна активність мембран по відношенню до грам-позитивних бактерій S. aureus дещо вища ніж до грам-негативних, але загалом має таку ж залежність. А саме, антимікробні властивості мембран, модифікованих хітозаном з ММ 161 000, нижчі ніж мембран, модифікованих більш високомолекулярним хітозаном, та зменшуються у ряду зростання розмірів пор мембрани.

В четвертому розділі також представлено результати досліджень модифікування промислових ацетатцелюлозних мембран прищепленням до їх поверхні ПАК з наступною іммобілізацією на модифікованих мембранах ПГМГ-хлориду.

При лужному омиленні ацетатцелюлозних мембран заміна ацетатних на ОН-групи призводить до гідрофілізації мембран і виникнення сильних міжмолекулярних водневих зв'язків, що впливає на водопроникність мембран. Як показали дослідження, об'ємний потік води крізь АЦ-мембрану, омилену протягом 20 хв, знижується до 80% відносно неомиленої мембрани. Подальше омилення АЦ-мембран призводить до значного зростання гідрофільності мембрани і кількості в ній вільної води, що є причиною порівняно невеликого (30%) зниження водопроникності омиленої мембрани відносно початкової. Зростання температури омилення від 293 до 323К не справляє суттєвого впливу на зміну продуктивності мембран.

Прищеплену полімеризацію АК проводили на АЦ-мембранах з різним ступенем омилення. Про ступінь прищеплення ПАК можна опосередковано судити по зміні об'ємного потоку води крізь мембрани після прищеплення відносно немодифікованої мембрани. Як видно з при тривалості омилення до 30 хв зменшення об'ємного потоку води крізь мембрани з прищепленою ПАК складає с середньому 30%. Зі збільшенням тривалості омилення до 60 хв спостерігається значне зниження об'ємного потоку води крізь мембрани до 60-70%. Звідси випливає, що найефективніше прищеплення відбувається на мембранах, омилених протягом 60 хв.

Встановлено, що на ступінь прищеплення ПАК до поверхні мембран впливає концентрація мономеру в реакційній суміші. Так, збільшення його концентрації від 0,1 до 1 моль/л призводить до зменшення об'ємного потоку води крізь модифіковану мембрану від 19 до 66% відносно немодифікованої АЦ-мембрани. Подальше підвищення концентрації АК в реакційній суміші не призводить до зміни продуктивності модифікованих мембран.

Тривалість прищеплення АК до поверхні омилених АЦ-мембран також суттєво впливає на зменшення продуктивності. Встановлено, що найбільш ефективною є тривалість модифікування 2 год., при якому зміна продуктивності мембран максимальна і складає близько 57% відносно немодифікованої мембрани.

З метою отримання мембран з антибактеріальними властивостями на мембрани з прищепленою ПАК іммобілізовано ПГМГ-хлорид, який за рахунок водневих зв'язків з прищепленими ланцюгами ПАК утворює полімер-полімерний комплекс.

Дослідження антибактеріальної дії модифікованих мембран по відношенню до грам-негативної бактерії E. coli та грам-позитивної бактерії S. aureus свідчить, що при адсорбції на мембрани ПГМГ-хлориду з його 0,001% водного розчину бактерицидна дія модифікованої мембрани складає лише 50% відносно E. coli. А при модифікуванні мембран 3%-ним водним розчином ПГМГ-хлориду значення бактерицидної активності мембран до цієї бактерії становить 99,9%. Подальше збільшення концентрації ПГМГ-хлориду в модифікуючих розчинах до 10% не призводить до зростання бактерицидної дії мембран. До грам-позитивної бактерії S. aureus мембрани характеризуються дещо меншим значенням бактерицидності - 99% при модифікуванні мембран 3%-ним водним розчином ПГМГ-хлориду.

Розроблено методику модифікування промислових целюлозних мембран гліцидилметакрилатом (ГМА). Про ступінь прищеплення ПГМА до мембран також опосередковано судили за зменшенням продуктивності мембрани відносно немодифікованої.

Продуктивність мембрани максимально зменшується на 24%, порівняно з немодифікованою мембраною, при вмісті в реакційному середовищі 10 ммоль/л NaJO₄. Дана максимальна зміна продуктивності мембран після прищеплення ПГМА спостерігається при тривалості модифікування 20 год. і при подальшому зростанні часу витримки мембрани в реакційній суміші не змінюється. Зміна температури несуттєво впливає на перебіг реакції. Коефіцієнт затримки целюлозною мембраною ПЕГ-6000 зростає зі збільшенням вмісту в реакційній суміші NaJO₄.

На модифіковані ПГМА целюлозні мембрани С010F було іммобілізовано налідиксову кислоту. Іммобілізацію проводили з водного розчину натрієвої солі НК протягом 20 год. при температурах 303 і 323К. Концентрація розчину натрієвої солі налідиксової кислоти становила 0,01; 0,1; 0,15; 0,5%. Приєднання відбувалося при взаємодії карбоксильних груп НК з епоксидними групами прищепленого ПГМА. Дослідження бактерицидної дії мембран, модифікованих ПГМА з іммобілізованою налідиксовою кислотою, по відношенню до грам-негативної бактерії Е. соli показало, що найменший ріст колоній досліджуваних бактерій спостерігався на мембранах, на яких іммобілізація налідиксової кислоти відбувалася при температурі 323К. Очевидно, що при підвищеній температурі іммобілізація відбувається ефективніше і до епоксидних груп ПГМА приєднується більша кількість налідиксової кислоти, що і зумовлює вищий показник бактерицидності. 100%-вою бактерицидною активністю характеризуються мембрани з прищепленим ПГМА, іммобілізація на яких проходила з 0,5% водного розчину натрієвої солі налідиксової кислоти при 323К.

П'ятий розділ присвячений прикладним аспектам використання отриманих нами мембран з антибактеріальними властивостями. В результаті розроблених та відпрацьованих методик формування та модифікування мембран були отримані мембрани з високою антибактеріальною активністю, яка зберігається сталою протягом тривалого часу використання (більше 56 діб). Так, зокрема, целюлозні мембрани, модифіковані хітозаном використані в технологічній схемі очищення та фракціонування цільових пептидів, що входять до складу екстракту препарату простатилену. Застосування таких модифікованих мембран дозволило збільшити в реальних умовах термін їх експлуатації в порівнянні з немодифікованими целюлозними мембранами в 3,5-4 рази.

Висновки

1. Вперше розроблено метод формування ацетатцелюлозних мембран з бактерицидними властивостями шляхом безпосереднього введення ПГМГ-хлориду в формувальний розчин як в присутності зшивального агенту. так і без нього. Вивчено вплив введення цієї біоцидної добавки на розділювальні та бактерицидні властивості мембран. Встановлено, що зшивання ПГМГ-хлориду з матеріалом мембрани призводить до суттєвого падіння бактерицидної активності мембран. Показано, що мембрани, сформовані з додаванням 3% ПГМГ-хлориду без зшивального агенту, проявляють 100% бактерицидність.

2. Вперше розроблена методика отримання ацетатцелюлозних мембран наповнених комплексом крохмаль-йод. Сформовані мембрани характеризуються 100%-ою бактерицидністю.

3. Розроблено метод отримання бактерицидних мембран шляхом прищеплення до поверхні промислових ацетатцелюлозних мембран ПАК з наступною іммобілізацією на неї ПГМГ-хлориду, який утворює з ПАК інтерполімерний комплекс. Показано, що оптимальними параметрами проведення прищепленої полімеризації ПАК до поверхні омилених АЦ-мембран є концентрація АК 1моль/л та модифікування мембрани з прищепленою ПАК 3% розчином ПГМГ-хлориду.

4. Досліджено метод модифікування промислових целюлозних мембран прищепленням до їх поверхні ПГМА з наступною іммобілізацією налідиксової кислоти при різних температурах. Встановлено, що найвищою антибактеріальною активністю характеризуються мембрани з прищепленим ПГМА, модифіковані іммобілізацією натрієвої солі налідиксової кислоти з її 0,5% водного розчину при температурі 323К.

5. Розроблена методика модифікування целюлозних мембран хітозаном. Встановлено, що оптимальними параметрами модифікування є концентрація розчину 1% (мас) та тривалість 20 год.

Досліджено вплив молекулярної маси хітозану та розмірів пор мембрани на їх бактерицидну активність. Показано, що антимікробні властивості мембран, модифікованих низькомолекулярним хітозаном, нижчі ніж мембран, модифікованих високомолекулярним хітозаном, та зменшуються зі зростанням розмірів пор мембрани.

6. Целюлозні мембрани, модифіковані хітозаном, використані в технологічній схемі баромембранного очищення та фракціонування цільових пептидів, які входять до складу субстанцій простатилену та рекомендовані до впровадження на підприємствах фармацевтичної промисловості.