Размещено на http://allbest.ru

Размещено на http://allbest.ru

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата технічних наук

Розробка технології комплексного ферментного препарату -фруктофуранозидази з біомаси дріжджів роду Saccharomyces

1.Загальна характеристика роботи

ферментний препарат дріжджовий

актуальність теми. Сьогодні у світі понад 60 млн чоловік хворі на цукровий діабет і захворювання дедалі поширюється. Одним з факторів, що стримують нарощування об'ємів виробництва відомих і нових лікувальних дієтичних продуктів на основі застосування фруктози та високофруктозних сиропів є відсутність комплексного ферментного препарату в-фруктофурано-зидази (КФП в-ФФ) вітчизняного виробництва. За браком дешевої технології цього ферменту майже весь інвертний сироп (40 000 т за рік) отримують кислотним гідролізом цукрози, який, на відміну від ферментативного, супроводжується утворенням побічних продуктів, вилучення яких значно ускладнює технологічний процес і підвищує вартість кінцевого продукту (глюкозного та фруктозного сиропів). Тому на сьогодні в Україні потреби у КФП в-ФФ з активністю 30 од/мг становлять приблизно 5 т на рік. Крім того, введення у практику сільського господарства нових культур, зокрема топінамбура, актуалізує проблему утилізації відходів його переробки (віджиму, стічних вод) при виробництві інуліну.

Отже, важливим завданням для сучасного розвитку кондитерської і консервної галузей харчової промисловості, виробництва нових лікувально-профілактичних препаратів та продуктів функціонального призначення на основі мікробіологічної промисловості є розроблення сучасної енерго- та ресурсоощадної біотехнології високоактивного КФП в-ФФ з тривалим терміном зберігання, з можливістю використання як сировини біомаси хлібопекарських дріжджів, накопиченої на відходах переробки топінамбура. Вирішенню цих важливих завдань і присвячена дисертаційна робота, виконана в Національному університеті харчових технологій.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводились відповідно до тематики науково-дослідних робіт Проблемної науково-дослідної лабораторії Національного університету харчових технологій “Розробка комплексної безвідходної технології переробки топінамбура з використанням біоконверсії та фізичних впливів з метою одержання продуктів лікувально-профілактичного призначення”, що виконувалась згідно з наказом Міністерства освіти України № 37 від 13 лютого 1997 р. (№ 0197 U 001108 державної реєстрації).

Автор особисто приймала участь в проведенні лабораторних та промислових досліджень, обробці та аналізі отриманих результатів.

Мета і задачі досліджень. Мета роботи полягає в розробленні технології КФП в-ФФ з біомаси дріжджів Saccharomyces cerevisiae, що накопичена при культивуванні на відходах переробки топінамбура, або з біомаси дріжджів промислового виробництва. Відповідно до поставленої мети були визначені наступні завдання:

· визначення та обґрунтування режимів максимального вилучення цукрів з віджиму топінамбура;

· оптимізація складу інуліновмісного водного екстракту віджиму топінамбура

· розробка способу одержання біомаси дріжджів S. cerevisiae на інуліновмісних відходах топінамбура;

· дослідження процесу вилучення в-фруктофуранозидази з дріжджових клітин при балістичній дезінтеграції суспензій;

· вивчення особливостей процесу та обґрунтування оптимального режиму осадження в-фруктофуранозидази із супернатанту дезінтеграту (безклітин-ного екстракту) за допомогою дубильної кислоти (таніну);

· проведення досліджень фізико-хімічних властивостей таніносаджених препаратів в-фруктофуранозидази;

· вивчення впливу режимів висушування сухих комплексних ферментних препаратів на їхню в-фруктофуранозидазну активність. Визначення умов та тривалості зберігання КФП;

· розробка технології сухого КФП в-ФФ та апаратурно-технологічної схеми виробництва його. Апробація технології у виробничих умовах.

Об'єкт дослідження - дріжджі S. сerevisiae; в-фруктофуранозидаза в процесах дезінтеграції клітин, осадження, висушування та тривалого зберігання; водний екстракт цукрів з віджиму топінамбура. .

Предмет дослідження - водна екстракція цукрів з віджиму топінамбура; дезінтеграція суспензій дріжджів; процес осадження в-фруктофуранозидази; висушування та зберігання КФП в-ФФ.

Методи дослідження - культивування клітин дріжджів; фізико-хімічні методи визначення вмісту сухих речовин, рН, концентрації біомаси, амінного азоту, редукувальних речовин; спектрофотометричні методи визначення активності в-ФФ, вмісту білків і нуклеїнових кислот; методи статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено можливість вирощування хлібопекарських дріжджів на водному екстракті віджиму топінамбура без додаткового внесення поживних речовин і визначено умови культивування дріжджів, що забезпечують високий рівень накопичення біомаси і споживання вуглеводів інуловмісних середовищ.

Розроблено спосіб виділення ферментного препарату в-ФФ з дріжджових клітин шляхом балістичної дезінтеграції та наступного осадження ферменту з безклітинного екстракту за допомогою таніну, який забезпечує довготривале зберігання ферментного комплексу без зниження ферментативної активності.

Встановлено оптимальні фізико-хімічні умови дії таніносаджених КФП в-фруктофуранозидази та вивчені каталітичні параметри ферменту.

Запропоновано теоретичні положення про механізм дії в-фруктозидаз на вуглеводи з в-2,1-фруктозидним зв'язком.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено спосіб одержання біомаси дріжджів S. cerevisiae на інуліновмісних відходах переробки топінамбура (Патент України № 31511 А, МПК 6С 12N 1/16), застосування якого дасть можливість зменшити загальну кількість органічних речовин у відходах переробки топінамбура.

Розроблено науково обґрунтовану технологію сухого КФП в-ФФ з використанням дезінтегратора балістичної дії ФУГ-1М для руйнування клітин, застосуванням таніну як осаджувача ферменту і наступним висушуванням КФП в-ФФ вакуумним способом (Патент України № 34403 А, МПК 7С 12N 9/26). Для вилучення ферменту запропоновано використовувати біомасу дріжджів S.cerevisiae, що накопичена на інуліновмісному водному екстракті віджиму топінамбура за розробленим у дисертаційній роботі способом, або біомасу харчових дріжджів промислового виробництва. Використання високоактивного ферментного препарату з тривалим терміном зберігання, одержаного за цією технологією, дасть змогу удосконалити технології глюкозно-фруктозного (з цукрози), високофруктозного (з інуліну) сиропів, кристалічної фруктози та створити нові продукти дієтичного, лікувально-профілактичного призначення. Таким чином, створення виробництва хлібопекарських дріжджів на інуліновмісних відходах топінамбура та впровадження технології сухого КФП в-ФФ матиме соціальний ефект.

Економічний ефект від впровадження проекту цеху виробництва КФП в-ФФ потужністю 1т за рік та ціні препарату, еквівалентній 80 дол. США за 1 кг становитиме 51,9 тис. грн. додаткового річного прибутку.

Запропонована технологія КФП в-ФФ успішно пройшла напіввиробничі випробування в умовах ВАТ “Трипільський біохімічний завод”.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто розроблено і теоретично обґрунтовано технологію КФП в-ФФ, підготовлено до публікації статті, заявки на патенти. Спільно з науковим керівником к.х.н., доц. О.М. Мірошниковим та науковим консультантом д.т.н., проф. Л.Д. Бобрівником проведено аналіз та узагальнення результатів досліджень. Дослідження процесу екстракції топінамбурного віджиму та культивування дріжджів на ЕВТ проведено спільно з к.т.н. Т.І. Романовською. Дослідження процесу балістичної дезінтеграції клітин дріжджів та виділення ферменту проведено спільно з к.б.н. І.І. Майко. Дослідження впливу режимів висушування на в-фруктофуранозидазну активність КФП, аналіз та узагальнення отриманих результатів проведено спільно з к.б.н. Н.В. Колтуковою.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на конференції “International Workshop on Inulin as Medicine & Food Ingredient. Property and Applications of Inulin” (USUFT, Kiev, Ukraine, 1997), а також на V-VII Міжнародних науково-технічних конференціях: “Розроблення та впровадження прогресивних ресурсоощадних технологій та обладнання в харчову та переробну промисловість” (Київ, 1997 р.), “Проблеми та перспективи створення і впровадження нових ресурсо- та енергоощадних технологій, обладнання в галузях харчової і переробної промисловості” (Київ, 1999 р.), “Пріоритетні напрями впровадження в харчову промисловість сучасних технологій, обладнання і нових видів продуктів оздоровчого та спеціального призначення” (Київ, 2001 р.), на наукових семінарах Проблемної науково-дослідної лабораторії НУХТ (1997 - 2000 рр.).

Публікації. По темі дисертаційної роботи опубліковано 10 друкованих праць, в тому числі 4 статті у наукових фахових виданнях, перелік яких затверджено Вищою атестаційною комісією України, 2 деклараційних патенти України на винахід та 4 тези доповідей наукових конференцій.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, 7 розділів, висновків та 6 додатків. Матеріали дисертаційної роботи викладено на 121 сторінці основного тексту, містить 29 таблиць і 24 рисунки. Список використаних джерел включає 153 найменування.

ферментний препарат дріжджовий

2.Основний зміст роботи

У вступі обґрунтовано актуальність теми дисертаційної роботи, сформульовано мету та задачі досліджень, визначено наукову новизну та практичну цінність робот.

У першому розділі “характеристика, методи виділення та перспективи застосування -Фруктофуранозидази дріжд-жів” на базі аналізу літературних джерел розглянуто проблемні питання сучасної класифікації -фруктозидаз; перелічено виявлені продуценти, описано локалізацію в клітинах, механізм дії, структуру та властивості -фруктофурано-зидази. Розглянуто як традиційні, так і сучасні способи одержання -фрукто-фуранозидази, зокрема з використанням дезінтеграторів балістичної дії для вилучення клітинних компонентів та дубильної кислоти для виділення ферментів. На основі даних огляду літератури зроблено висновок про поціль-ність розроблення технології ферментного препарату -фруктофуранозидази.

У другому розділі “Об'єкти та методи досліджень” наведено перелік та характеристики об'єктів дослідження, що були використані у дослідженнях, викладено методику проведення дослідів.

Скринінг дріжджів S. cerevisiae для біоконверсії вуглеводів топінамбура проводили серед штамів 623 (з Національної колекції дріжджів Інституту винограду і вина “Магарач”), 624-626 (із музею виробничих культур Київського дріжджового заводу). Мальтазну активність дріжджів визначали методом триразового замішування та підняття кульки тіста при 32 С.

Дезінтеграцію клітин проводили у балістичному дезінтеграторі ФУГ-1М при частоті обертання ротора () 2000 та 3000 хв-¹. Молольними тілами були кульки сополімеру стиролу з дивінілбензолом. Просіюванням крізь калібру-вальне сито була отримана робоча фракція з діаметром 350...500 мкм. Насипний об'єм мікрокульок V_МТ змінювали від 75 до 150 мл. Руйнуванню піддавали дріжджові клітини S. cerevisiae промислового виробництва ВАТ “Трипільський біохімічний завод” (м. Обухів) у вигляді водних суспензій, концентрація яких становила 12,5 та 16,5 % СР. Дезінтеграцію клітин здійснювали у проточному режимі; наведені експериментальні дані відповідають умовам стаціонарного стану процесу. Швидкість протікання 1л/хв встановлювали за водою і робили контрольний замір після закінчення процесу. Тривалість дезінтеграції суспензії дріжджів з розрахунку на 1 дм³ становила до 10 хв (до 10 циклів руйнування). Супернатант дезінтеграту (СПД) відділяли від клітинних залишків центрифугуванням при 2500 хв^-1, протягом 30...45 хв. Ефективність проведення дезінтеграції оцінювали за ступенем дезінтеграції (СД), користуючись прямими і непрямими методами. В основі перших було визначення кількості живих клітин до і після дезінтеграції прямим підрахунком у камері Горяєва. При непрямих методах СД визначали за концентрацією білка, нуклеїнових кислот і рівнем -ФФ активності СПД. Вміст білка визначали за методом Бредфорд та спектрофотометричним методом, в-ФФ активність - за методом Самнера з динітросаліціловою кислотою. З метою проведення порівняльного аналізу отриманих даних з результатами досліджень інших авторів та -ФФ активністю комерційних препаратів, за одиницю активності в-ФФ при гідролізі цукрози (тобто інвертази) приймали кількість ферменту, яка гідролізує 1 мкМ цукрози за 1 хв при температурі 30 С та рН 4,6. При цих стандартних умовах визначали в-ФФ активність у супернатантах дезінтегратів, активність же сухих КФП -ФФ визначали при 55 С, тобто при встановленій в процесі досліджень оптимальній температурі. За одиницю в-ФФ активності відносно інуліну (тобто інулінази) приймали кількість ферменту, яка гідролізує інулін з утворенням 1 мкМ фруктози за 1 хв при оптимальній температурі 50 С та рН 4,6.

Статистичну обробку результатів дезінтеграції дріжджових суспензій, осадження та висушування КФП -ФФ здійснювали на ЕОМ за алгоритмом пакета прикладних програм Coplot.

У третьому розділі “КУЛЬТИВУВАННЯ дріжджів Saccharomyces cerevisiae на інуліновмісних відходах переробки топінам-бура” наведені результати оптимізації процесу водної екстракції вуглеводів топінамбурного віджиму та вирощування відібраних штамів на отриманому екстракті. Вивчено вплив гідромодуля, температури, рН та тривалості процесу на вміст цукрів в екстракті. Фактори змінювали у таких діапазонах: гідромо-дуль від 4 до 13, температуру від 15 до 90 С, рН від 3 до 9, тривалість з 15 до 60 хв. Критеріями оптимізації параметрів екстракції вуглеводів вибрано: масову концентрацію цукрів в екстракті, визначену резорциновим колориметр-ричним методом, та вихід фруктози і фруктозидів з одиниці маси віджиму. Результати експериментів обробляли статистичними методами з використанням пакета Coplot. Вплив кожного фактора розглядали окремо на кожному рівні. Розраховували для кожного рівня кожного фактора середнє значення масової концентрації цукрів в екстракті (відгуку факторів). Залежність формалізованих значень факторів від значень їхніх середніх відгуків апроксимували рівняннями. За допомогою регресійного аналізу встановлено, що залежність масової концентрації цукрів екстракту віджиму топінамбура (ЕВТ) від гідромодуля описується рівнянням першого порядку. Методика експерименту не дала змоги встановити зв'язок між масовою концентрацією цукрів екстракту та активною кислотністю екстрагента, що може пояснюватись вмістом у топінамбурному віджимі речовин з буферними властивостями. Що стосується тривалості екстракції, то очевидно, що у такому широкому діапазоні та порівняно з іншими факторами її вплив несуттєвий.

Адитивно-нелінійне рівняння має вигляд:

y = (14,245 - 2,916x₁ - 0,4875 + 6,4485x₂ - 1,1575x₂² + 12,275 - 5,023x₃ + 0,965x₃² ) : 3,

де x₁ - гідромодуль екстракції; x₂ - температура процесу екстракції; x₃ - тривалість процесу;

y - масова концентрація цукрів ЕВТ.

Встановлено, що найбільший вплив на процес екстракції цукрів справляють температура і гідромодуль. Тривалість процесу на цьому етапі впливає значно менше.

Перша похідна функції виходу цукрів з віджиму топінамбура: y = - 0,4968 - 0,7717x₂ + 0,6433x₃ дає можливість визначити оптимальні параметри екстрагування вуглеводів віджиму топінамбура. Графічне зображення першої похідної у тривимірному просторі дає можли-вість встановити лінію перетину площини пер-шої похідної з площиною нульових її значень. Лінія перетину містить сукупність оптималь-них значень незалежних змінних, для яких залежна змінна має найбільші значення (рис.1).

З'ясовано оптимальну температуру прове-дення процесу екстракції. Встановлено, що при 42 С через 15 хв в екстракт переходить біль-шість цукрів віджиму. Розраховано, що найбіль-ший вихід цукрів з одиниці маси віджиму буде в разі використання гідромодуля 10.

Для виявлення оптимального значення рН екстракції, проведено однофакторний експеримент при оптимальних значеннях інших факторів. Встановлено, що оптимальні значення рН для екстракції вуглеводів не відрізняються від нативного рН топінамбурного соку.

Вивчення кінетики накопичення біомаси та утилізації вуглеводів рідких інуліновмісних середовищ досліджуваними штамами дріжджів S.cerevisiae дало змогу встановити, що найповніше утилізував цукри поживного середовища та знижував вміст видимих сухих речовин штам 626, який накопичував 42,5 г /дм³ біомаси вологістю 75 % (табл. 1). Таке ж накопичення біомаси спостерігалось і при культивуванні 623-го штаму, але кількість спожитих ним вуглеводів була меншою

Дано порівняльну характеристику мальтазної активності досліджуваних штамів. Результати досліджень (див. табл. 1) свідчать про те, що найвищий рівень синтезу мальтази на фоні найменшого накопичення кількості біомаси показав 625-й штам. Задовільну мальтазну активність мали штами 623 та 626. Найгіршу активність виявив 624-й штам.

Розроблено спосіб отримання біомаси хлібопекарських дріжджів на водному екстракті віджиму топінамбура, при якому без додаткового внесення поживних речовин в 1 дм³ культуральної рідини накопичується 45...50 г біомаси дріжджів (W = 75 %), що придатна для використання у хлібопекарській та біотехнологічній (як сировина для одержання КФП -ФФ) галузях.

Таблиця 1 Показники поживного середовища та культуральної рідини штамів дріжджів S. cerevisiae після культивування на водному екстракті віджиму топінамбура

У четвертому розділі “Розробка технологіїї комплексного ферментного препарату -фруктофуранозидази. Фізико-хімічні властивості таніносаджених препаратів -фрукто-фуранозидази” наведені результати досліджень процесів вилучення, осадження та висушування КФП -ФФ. Метою проведення досліджень процесу руйнування дріжджових клітин у балістичному дезінтеграторі (БД) ФУГ-1М було визначення сфокусованого режиму дезінтеграції, при якому можливе максимальне вилучення цільового клітинного компонента - -ФФ - за мінімальну кількість циклів руйнування клітин. Вивчення впливу частоти обертання ротора БД родини ФУГ на СД та вихід клітинних ферментів дало змогу попереднім дослідникам дійти висновку про ефективність застосування максимально можливої частоти - =3000 хв-¹. Але використання такої частоти обертання ротора накладає обмеженість як на діапазон використання молольних тіл, так і на концентрацію дріжджових суспензій. Вказується, що дезінтеграція при 3000 хв-¹ та насипному об'ємі мікрокульок, що перевищує 100 мл, супроводжується закупорюванням щілин сепаратора, зниженням швидкості протікання суспензії та її нагріванням. Подібним чином впливають на перебіг процесу і високі концентрації суспензій (понад 12,5 % СР). Перелічені недоліки суттєво обмежують використання вказаних апаратів на промисловому рівні. З метою пошуку ефективного режиму дезінтеграції автором було вирішено провести дослідження процесу дезінтеграції при більш низькій частоті обертання ротора (2000 хв-¹) у робочому діапазоні об'єму абразивного матеріалу, збільшеному до 150 мл, та концентрації дріжджових суспензій 12,5...16,5 % СР. Вибір такого діапазону робочих концентрацій дріжджових суспензій зумовлено, по-перше, тим, що запропонованою в цій роботі технологією передбачається стадія промивання дріжджової пасти та її повернення після центрифугування на повторну дезінтеграцію, по-друге, крім біомаси свіжих та нереалізованих пресованих дріжджів, передбачалось використання також промислових сепараторних суспензій дріжджів, концентрація яких становить 500...700 г/дм³.

Обрана частота обертання ротора (2000 хв-¹) дала можливість збільшити робочий діапазон об'єму абразивного матеріалу і запобігти вищезгаданим негативним явищам. Так, характер кривих, показаних на рис. 2, демонструє вплив насипного об'єму молольних тіл на ступінь дезінтеграції дріжджових суспензій: чим більший об'єм абразивного матеріалу, тим швидше дезінтеграція клітин досягає визначеного ступеня. Тому можна вважати доцільним збільшення насипного об'єму до 150 мл. Подібним чином зміна насипного об'єму абразиву впливає і на вихід -ФФ у СПД (рис. 3).

Рис. 2. Залежність СД від тривалості оброблення та насипного об'єму мікрокульок при руйнуванні суспензії дріжджів з концентрацією: а - 12,5 %СР, б - 16,5 % СР; 1,2,3,4 - насипний об'єм мікрокульок відповідно 75, 100, 125, 150 мл

Досліджено розподіл між цілими клітинами, протопластами і повністю зруйнованими клітинами у дезінтегратах дріжджових суспензій з концентраціями 12,5 та 16,5 % СР при насипному об'ємі молольних тіл 150 мл (рис. 4). Незалежно від концентрації дріжджової суспензії, кількість повністю зруйнованих клітин досягає 40 % вже після чотирьох (рис.4а) та п'яти (рис.4б) циклів обробки і залишається незмінною протягом наступних циклів дезінтеграції. Тобто, зменшення кількості цілих клітин у дезінтеграті (отже, збільшення СД) відбувається завдяки збільшенню кількості протопластів.

Для уточнення параметрів сфокусованого процесу дезінтеграції, було проведено серію порівняльних дослідів при постійному об'ємі адгезиву V_МТ=125 мл (що відповідає максимально можливому коефіцієнту заповнення камери молольними тілами k =0,6 при =3000 хв-¹) та частоті обертання ротора 2000 і 3000 хв-¹. Метою було визначення режимів дезінтеграції при 2000 хв-¹, при яких ефективність процесу за показниками -ФФ активності СПД та кількості дезінтегрованих клітин була б наближена до максимально можливих для ФУГ-1М. Порівняльний аналіз результатів експериментів (табл. 2) дав змогу визначити сфокусований режим дезінтеграції клітин хлібопекарських дріжджів у БД ФУГ-1М: концентрація суспензії 16,5 % СР, щ=2000 хв-¹, V_МТ=150 мл, тривалість 2...3 хв при швидкості протікання суспензії 1 л/хв.

Таблиця 2. Порівняльна характеристика режимів дезінтеграції у БД ФУГ-1М

за показниками ефективності

Режим дає змогу дезинтегрувати 48...51% клітин і досягти -ФФ активності у супернатанті дезінтеграту 150...180 од/мл. Подовження терміну обробки суспензії спричинює вихід значної кількості баластних білків, що негативно впливає на наступний процес виділення -ФФ, перешкоджає одержанню препарату з високою питомою активністю і тому є недоцільним.

Дослідження процесу виділення -ФФ із супернатанту дезінтеграту за допомогою таніну проводили у діапазоні концентрацій від 0,2 до 2 % за сухим таніном (концентрацію створювали 10...20 % водним розчином таніну). Спочатку вирішували задачу максимального вилучення ферменту з СПД (за визначенням -ФФ активності СПД до та після преципітації таніном), потім проводили серію осаджень у вибраному діапазоні концентрацій і після висушування визначали -ФФ активність сухих КФП. Оптимальним режимом виділення -ФФ із СПД, що забезпечує вилучення ферменту з високою питомою активністю слід вважати преципітацію ферменту за допомогою 0,6 % таніну (з розрахунку на 60 од/мл -ФФ активності). При умовах максимального вилучення -ФФ із СПД відбувається утворення зв'язків таніну не тільки з манановим каркасом ферменту, а й з амінокислотами апоферменту, в тому числі активного центру, що призводить до втрат ферментативної активності. Потребує уваги той факт, що низькоконцентровані таніносаджені ферментні препарати під зберігання протягом декількох місяців не втрачали -ФФ активності. Цей важливий для використання у промислових масштабах факт пояснюється антимікробною дією танінової кислоти, яка утворює нерозчинні комплекси з білками мікробних клітинних стінок.

Результати досліджень впливу сублімаційного та вакуумного методів висушування на -ФФ активність таніносаджених КФП показали доцільність застосування останнього (табл.3). Вакуумно висушені при 20...25 ^оС КФП -ФФ мали активність до 35,6 од/мг_КФП.

Таблиця 3. Вплив режиму висушування на -ФФ активність КФП

Дослідження впливу температури на активність -ФФ показали, що фер-мент проявляв максимальну активність при 55 С, рН 4,5…4,6 і був стабільним у межах рН від 3,5 до 5,0. Ферментативна активність при 30 С становила 34,5 % від максимальної; майже така ж активність спостерігалась при 70 С (30,4 %). Дослідження фізико-хімічних властивостей сухих КФП в-ФФ показали, що максимальна активність ферменту спостерігалась у 5,0...10-відсоткових розчинах цукрози (рис. 5). Дані вивчення термостабільності при прогріванні розчину таніносаджених препаратів -ФФ в ацетатному буфері молярною концентрацією 0,2 моль/л (рН 4,6) наведено на рис. 6. Встановлено, що у температурному діапазоні 30...55 С активність ферменту повністю зберігалась протягом 2 год, але вже через 5 хв інактивувалась при 70 С. Отже, на відміну від препаратів -ФФ грибного походження, дріжджовим ферментам притаманна нижча термостабільність.

У п'ятому розділі “Розрахунок просторової будови молекул фруктанів - субстрату -фруктозидаз” наведені результати квантово-хімічного в параметризації РМ3 та молекулярно-механіч-ного аналізів досліджуваних фруктанів - субстратів -фруктозидаз, проведених з метою встановлення впливу просторової будови фруктанів на активність та специфічність інулолітичних ферментів. На основі квантово-хімічних розрахунків у напівемпіричному ,-електронному наближенні методом РМ3 з повною оптимізацією просторової будови розраховано модель молекули ністози, яка відповідає мінімуму вільної енергії (рис. 7). Вибір молекули ністози був зумовлений тим, що вона має такий самий спектр взаємозв'язків, як і молекула інуліну, і може слугувати моделлю дії як екзо-, так і ендо--фрукто-зидаз (на відміну від молекули трисахариду кестози). Встановлено торсійні кути, електронну густину, дипольний момент та повну енергію молекули ністози. Аналіз торсійних кутів дав змогу зробити цікаве припущення щодо впливу просторової будови фруктанів з -2,1-фруктозидним зв'язком на будову активного центра інулолітичних ферментів. Так, було встановлено, що кут (зв'язок між фруктозними залишками) становить 179,5. Це означає, що залишки фруктози, задіяні у процесі гідролізу, перебувають в одній площині. На наш погляд, це свідчить на користь структури “щілина” відносно активного центра ендоінулінази.

Методом молекулярної механіки розраховано і побудовано модель молекули олігофруктану (зі ступіненем полімеризації 10) інулінового типу з 2,1-фруктозидним зв'язком (рис. 8).

Вибір такої довжини ланцюга для розрахунків зумовлений тим, що -ФФ активність КФП, отриманих із дріжджів S. сerevisiae, спостерігалась лише відносно олігофруктанів. Аналіз моделі фруктанового декамеру дав змогу визначити одну з причин високої сумарної активності в-фруктозидаз (екзо- та ендоінуліназ) мітоспорових грибів відносно активності єдиної дріжджової -ФФ екзо-типу і зробити висновок про можливу некоректність порівняння абсолютних показників інулолітичної активності цих ферментів.

Уточнено механізм дії екзо- та ендо-в-фруктозидаз на вуглеводи з в-2,1-фруктозидним зв'язком.

У шостому розділі “Розробка апаратурно-технологічної схеми виробництва КФП в-фруктофуранозидази” наведені результати напіввиробничих випробувань розробленої технології сухого КФП в-ФФ. Розроблено апаратурно-технологічну схему (рис. 9) одержання сухого КФП в-ФФ з біомаси дріжджів роду Saccharomyces. Виробництво ферменту включає такі основні стадії: приготування дріжджової суспензії у реакторі Р-3; обробка дріжджової суспензії у балістичному дезінтеграторі D-5; відділен-ня центрифугуванням (Ц-8) супернатанту дезінтеграту від осаду зруйнованих дріжджів; осадження в-ФФ розчином таніну у реакторі осадження Р-16; відділення вологого ферменту центрифугуванням (Ц-18); вакуумне висушу-вання ферменту в апараті СШ-19 з подальшим подрібненням в апараті П-20 та пакуванням в апараті ПМ-21. Для додаткового вилучення ферменту осад зруйнованих дріжджів піддається промиванню водою у реакторі Р-12. Кінцевий продукт (W=5 %) має в-ФФ активність 28...30 од/мг сухого препарату. Технологією передбачається використання відходів даного виробництва: з дріжджової пасти пропонується проведення екстрагування нуклеїнових кислот та вилучення білків, а з надосадової рідини, яка утворюється після видалення осадженого вологого ферменту - екстрагування вітамінів та ліпідів.

Технологія сухого КФП в-ФФ з біомаси дріжджів роду Saccharomyces успішно пройшла напіввиробничі випробування в умовах ВАТ “Трипільський біохімічний завод”. В результаті випробувань було отримано 360 л дезінтеграту зі ступенем дезінтеграції 48,3 %. Після видалення клітинних залишків в-ФФ активність супернатанту дезінтеграту становила 136 од/мл. Осадження ферменту здійснювали додаванням 20-відсоткового водного розчину таніну у супернатант дезінтеграту до створення 1,36-відсоткової концентрації за сухим таніном (з розрахунку 0,6 % таніну на 60 од/мл в-ФФ активності) при інтенсивному перемішуванні. Осад висушували вакуумним способом при температурі 20…25С. Загальний вихід сухого ферментного препарату становив 1,96 кг з в-фруктофуранозидазною активністю 29,3 од/мг.

У сьомому розділі “Техніко-економічне обґрунтування впровадження технології КФП в-фруктофуранозидази” наводяться результати порівняльного аналізу за основними показниками економічної ефективності запропонованої технології, яка передбачає виділення ферменту за допомогою таніну з класичними методами осадження ферменту етиловим спиртом та висолюванням сульфатом амонію.

Для оцінки економічної ефективності проекту організації виробництва сухого КФП в-ФФ застосована сучасна методика, яка ґрунтується на зведенні грошових потоків до нинішньої вартості з урахуванням фактору часу. Розраховано, що загальний обсяг інвестицій, необхідних для організації виробництва сухого КФП в-ФФ при потужності 1 т за рік та ціні препарату еквівалентній 80 дол. США за 1 кг (ціну встановлювали з урахуванням забезпечення конкурентноздатності КФП в-ФФ та прибутковості запропонованого виробництва) дорівнює 638,61 тис. грн. Додатковий річний прибуток від реалізації заходу становить 51,9 тис. грн. Розрахунково доведено, що запропонована технологія забезпечує значно нижчий рівень витрат на придбання сировинних ресурсів порівняно з існуючими аналогами. Так, матеріальні витрати за основними статтями в разі осадження етанолом в 3,47, а в разі використання сульфату амонію - в 1,59 рази вищі, ніж при застосуванні таніну. Як показують розрахунки, класичні технології не забезпечують прибутковості виробництва при встановленій ціні КФП. Крім того, суттєвими недоліками цих способів є, у разі осадження органічними розчинниками, збільшення об'єму суміші, що подається на відділення ферменту, а в разі висолювання ферменту - довготривалість процесу, необхідність охолодження та подальшого проведення діалізу. Це зумовлює значно нижчу економічну ефективність цих технологій у порівнянні з запропонованою у роботі.

Одержані результати оцінки ефективності запропонованого проекту організації виробництва сухого КФП в-ФФ (з активністю 30 000 од/г) свідчать про наявність значного запасу його фінансової та антиризикової стійкості. Реалізація проекту є обґрунтованою і економічно доцільною.

Висновки

1. Встановлено оптимальні параметри проведення водної екстракції вуглеводів віджиму топінамбура: гідромодуль 10, тривалість 15 хв при 42 С та інтенсивному перемішуванні. Виявлено, що змінення активної кислотності екстрагента суттєво не впливає на вміст цукрів в екстракті віджиму топінамбура.

2. Екстракт віджиму топінамбура, отриманий при оптимальних параметрах, містить достатню кількість азоту та фосфору для вирощування дріжджів S. cerevisiae.

3. Експериментально встановлено, що штам 626 “Київський” при культи-вуванні на рідких інуліновмісних середовищах накопичує найбільшу кількість біомаси, найповніше утилізує цукри поживного середовища та має задовільну мальтазну активність, тому може бути рекомендованим для впровадження у виробництво хлібопекарських дріжджів на відходах переробки топінамбур.

4. Розроблено спосіб одержання біомаси дріжджів S. cerevisiae при культивуванні на екстракті з віджиму топінамбура, котрий дозволяє накопичу-вати в 1 дм³ культуральної рідини 45...50 г біомаси дріжджів (W=75%) без додаткового внесення поживних речовин.

5. Встановлено сфокусований режим дезінтеграції клітин хлібопекарських дріжджів у балістичному дезінтеграторі ФУГ-1М: щ=2000 хв-¹, V_МТ=150 мл, протягом 2...3 хв при швидкості протікання 1 л/хв суспензії дріжджів з концентрацією 16,5 % СР. Режим дозволяє дезинтегрувати 48...51 % клітин та досягти -ФФ активності у супернатанті дезінтеграту 150...180 од/мл.

6. Досліджено вплив на -ФФ активність сухих КФП умов виділення та висушування їх. Встановлено оптимальний режим осадження КФП -ФФ із супернатанту дезінтеграту: додаванням 10...20-відсоткового водного розчину таніну до досягнення 0,6-відсоткової концентрації за сухим таніном (з розрахунку на 60 од/мл -ФФ активності СПД) при температурі 20...25 ^оС протягом 10...20 хв при інтенсивному перемішуванні. в-Фруктофуранозидазна активність КФП, одержаного за розробленою технологією та висушеного вакуумним способом при 20...25 ^оС становить 30±2 тисяч од/г.

7. Сухі таніносаджені КФП -ФФ зберігають 85 % вихідної активності при температурі +4 ^оС протягом 12 місяців.

8. Дослідження фізико-хімічних властивостей сухих таніносаджених КФП -ФФ дріжджів S. сerevisiae показали, що -ФФ проявляє максимальну активність у 5...10-відсоткових розчинах цукрози при температурі 55 С та рН 4,5...4,6. Фермент є стабільним у діапазоні рН 3,5...5,0. При інкубуванні таніносаджених КФП -ФФ протягом 2 год при температурі 30...55 С активність препаратів повністю зберігається, що дозволяє рекомендувати їх для промислового виробництва та застосування.

9. На основі квантово-хімічних розрахунків у наближенні РМ3 побудо-вано модель молекули ністози, яка відповідає мінімуму вільної енергії. Визначено торсійні кути, електронну густину, дипольний момент та повну енергію молекули ністози. Методом молекулярної механіки розраховано і побудовано модель молекули олігофруктану (СП 10) інулінового типу з 2,1-фруктозидним зв'язком. Уточнено механізм дії екзо- та ендо-в-фруктозидаз на вуглеводи з в-2,1-фруктозидним зв'язком.

10. Розроблено технологічну та апаратурно-технологічну схеми одержання сухого КФП -ФФ з біомаси дріжджів роду Saccharomyces. Запропонована технологія КФП -ФФ успішно пройшла напіввиробничі випробування в умовах ВАТ “Трипільський біохімічний завод”.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Романовська Т.І., Бобрівник Л.Д., Малінова Н.Я. Визначення вуглеводів у топінамбурі // Харч. і перероб. пром-сть. - 1997.- № 7. - С. 23 - 24.

Особистий внесок: участь у підборі і теоретичному аналізі літературних джерел, проведенні експериментальних досліджень, узагальненні результатів.

2. Майко І.І., Бобрівник Л.Д., Малінова Н.Я. Ферментативний синтез і гідроліз фруктанів // Укр. біохім. журн. - 2000. - т. 72, № 2. - С. 14 -18.

Особистий внесок: огляд і узагальнення літературних даних, підготовка матеріалів до публікації.

3. Балістична дезінтеграція дріжджів / Н.Я. Малінова, Л.Д. Бобрівник, О.М. Мірошников, І.І. Майко // Харчова промисловість. - 2000. - № 45. - С. 92-97.

Особистий внесок: постановка експериментів, оброблення отриманих результатів та підготовка матеріалів до публікації.

4. Оптимізація екстракції вуглеводів віджиму топінамбура / Л.Д.Бобрівник, Т.І. Романовська, О.М. Мірошников, Н.Я. Малінова, І.Я. Романовський, Н.І. Левчук // Наук. пр. УДУХТ. - 2000. - № 6. - С. 79 - 80.

Особистий внесок: участь у плануванні та проведенні експериментальних досліджень, узагальненні результатів, підготовці матеріалів до друку.

5. Пат. України № 31511 А, МПК 6С 12N 1/16. Спосіб отримання харчових дріжджів роду Saccharomyces на середовищі з відходів переробки топінамбура / Л.Д. Бобрівник, І.С. Гулий, Т.І. Романовська, Н.Я. Малінова, І.Я. Романовський, О.М. Мірошников. - Заявл. 18.09.1998; Опубл. 15.12.2000, Бюл. № 7 - II.

Особистий внесок: участь в експериментальних дослідженнях, узагальнення результатів, підготовка матеріалів до публікації.

6. Пат. України № 34403 А, МПК 7С 12N 9/26. Спосіб одержання дріжджового ферментного препарату бета-фруктофуранозидази / Н.Я.Малінова, А.І. Українець, Н.В. Колтукова, І.С, Гулий, О.М. Мірошников, І.І. Майко. - Заявл. 18.05.2000; Опубл. 15.02.2001, Бюл. № 1.

Особистий внесок: проведення патентного пошуку, планування та участь у проведенні експериментів, оцінка і узагальнення результатів дослідів, підготовка матеріалів та написання заявки на патент України.

7. The Biotechnological Procession of the Waste Products of Inulin Production / T. Romanovska, L. Bobrovnik, I. Gulyi, N. Malinova // International Workshop on Inulin as Medicine & Food Ingredient. Property and Applications of Inulin. - Kiev: USUFT. - 1997.

Особистий внесок: участь в експериментальних дослідженнях, узагальненні результатів, підготовці доповіді до конференції.

8. Мікробіологічне перероблення цукровмісних топінамбурних відходів / Т.І.Романовська, Л.Д. Бобрівник, І.С. Гулий, О.М. Мірошников, Н.Я.Малінова // Тези доповідей Міжнар. наук.-техн. конф. “Розроблення та впровадження прогресивних ресурсоощадних технологій та обладнання в харчову та переробну промисловість”. - К.:УДУХТ. - 1997. - С. 46-47.

Особистий внесок: участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальненні отриманих результатів і написанні тез доповіді.

9. Виділення препарату в-фруктофуранозидази з біомаси дріжджів Saccharomyces cerevisiae / Л.Д. Бобрівник, О.М. Мірошников, І.І. Майко, Н.Я. Малінова // Тези доповідей 6-ї Міжнар. наук.-техн. конф. “Проблеми та перспективи створення і впровадження нових ресурсо- та енергоощадних технологій, обладнання в галузях харчової і переробної промисловості”. - К.:УДУХТ. - 1999. - С. 87.

Особистий внесок: планування та проведення досліджень, узагальнення отриманих результатів, оформлення тез доповіді та виступ на конференції.

10. Малінова Н.Я., Мірошников О.М., Штангеєва Н.І. Нова технологія сухого ферментного препарату в-фруктофуранозидази // Наук. пр. УДУХТ. - 2001. - № 10. - С. 62. (За матеріалами VII Міжнар. наук.-техн. конф. “Пріоритетні напрями впровадження в харчову промисловість сучасних технологій, обладнання і нових видів продуктів оздоровчого та спеціального призначення”, Київ, 2001р.)

Особистий внесок: постановка та проведення експериментів, оброблення та аналіз отриманих результатів, підготовка доповіді та виступ на конференції.

Размещено на Allbest.ru