Биохимические и микробиологические основы спиртового производства

Биохимические и микробиологические основы спиртового производства

Для разложения сложных веществ сырья на сахара, которые затем сбраживаются с получением этилового спирта и диоксида углерода, используются ферменты солода и микроорганизмов. При этом происходят сложные биохимические процессы.

Рис.1. Принципиальная технологическая схема производства спирта из крахмалистого сырья

Углеводы

Углеводы -- это природные органические соединения, в основном состоящие из углерода, водорода и кислорода. Общая формула углеводов С_т--(НгО)_п.

Все углеводы можно разделить на моносахариды, олигосахариды, полисахариды.

Моносахаридами называются низкомолекулярные полиокси-карбонильные соединения с неразветвленной углерод-углеродной цепью.

Олкгосахариды, занимая промежуточное положение между моносахаридами и полисахаридами, содержат небольшие цепи, состоящие из нескольких моносахаридных звеньев.

Полисахариды представляют собой продукты поликонденсации моносахаридов, их молекулы образуют цепи, состоящие из остатков моносахаридов, связанных друг с другом через атом кислорода. Они являются типичными высокомолекулярными веществами.

Моносахариды, или монозы, в зависимости от количества углеродных атомов в цепи называются тетрозами, пентозами, гексозами. В природе из моносахаридов встречаются главным образом гексозы и пентозы. Из гексоз (С₆Н1₂0₆) наиболее важными для производства спирта являются глюкоза, фруктоза, манноза, галактоза, а из пентоз (С5Н10О5) -- арабиноза, ксилоза.

Гексозы под действием ферментов дрожжей сбраживаются с образованием этилового спирта и диоксида углерода; пентозы дрожжами не сбраживаются.

Строение моносахаридов в оксикарбонильной форме можно представить формулами:



Моносахариды, содержащие в оксикарбонильной форме альдегидную группу называют альдозами, кетонную - кетозами. В альдозах карбонильная группа находится на конце цепи молекулы, в кетозах она образована вторым углеродным атомом.

Углеродные атомы в молекулах принято нумеровать, начиная с того конца цепи, на котором находится или к которому ближе карбонильная группа.

Звездочками в формулах обозначают асимметрические атомы, обусловливающие существование пространственных изомеров (четыре валентности атома связаны с четырьмя различными атомами и радикалами).

При наличии в молекуле моносахарида четырех асимметрических атомов углерода возможно существование 16 (2⁴) стереоизомеров или восьми пар, каждая из которых называется одинаково, но имеет стереоизомеры D- и L-ряда.

Изомеры с гидроксилом, расположенным справа у наиболее удаленного из карбонильной группы (пятого у гексоз, четвертого у пентоз) асимметрического углеродного атома, относятся к D-ряду, расположенным слева -- к Х-ряду. Все моносахариды растительного происхождения принадлежат к D-ряду.

Оптические изомеры, отклоняющие плоскость поляризации вправо, называют правовращающими и обозначают знаком (+), а отклоняющие плоскость поляризации влево -- левовращающими и обозначают знаком {--). Смесь равных количеств правовращающих и левовращающих изомеров, не способную вращать плоскость поляризации, называют рацемической, ее обозначают знаком (±). Расположение гидроксильных (спиртовых) групп в молекуле относительно карбонильной группы обозначают иногда греческими буквами а, р, у, б, е.

Оксикарбонильные формы хорошо объясняют реакционную способность сахаров.

В водных растворах большинство молекул находится в циклической форме. Циклическая форма моносахарида образуется у альдоз, когда карбонильная группа взаимодействует со спиртовой группой у пятого-(б-положение) или четвертого (у-положение) углеродного атома.

Если карбонильная группа взаимодействует со спиртовой группой в б-положении, то образуется шестичленное кольцо (пиранозная форма сахара), а при взаимодействии со спиртовой группой в у-положении -- пятичленное кольцо (фуранозная форма сахара).

В растворах глюкоза существует в трехззаимопревращающихся формах:



Пиранозные формы моносахаридов более устойчивы, чем фуранозные. Поэтому все кристаллические моносахариды находятся в пиранозной форме. Фуранозы встречаются только в растворах. Водный раствор моносахаридапредставляет собой сложную систему, в которой находятся в состоянии равновесия а- и р-пиранозы, а- и р-фуранозы и карбонильная форма.

Полисахариды. Используемое в производстве спирта зерновое сырье и картофель содержат крахмал, целлюлозу, гемицеллюлозу, камеди, слизи (гумми-вещества), пектиновые вещества и др.

Крахмал (C₆H₁₀0₅)_n как резервный материал в значительных количествах накапливается в клубнях картофеля (до 20% массы сырья) и зернах злаков (до 80 % массы сырья). Он состоит из двух полисахаридов; а-амилозы (17--25%) и амилопектина (75--83 %). Кроме этих основных компонентов в природном крахмале содержится 0,1--0,7 % минеральных веществ (в основном фосфорная кислота), около 0,6 % высших жирных кислот (пальмитиновая, стеариновая и др.), 0,1--0,8 % белка.

Амилоза состоит из длинных неразветвленных цепей, в которых все остатки глюкозы соединены глюкозидными связями между первым и четвертым углеродными атомами (а-1,4-свя-зями).

Растворы амилозы полидисперсны. Молекулярная масса амилозы -- от нескольких до пятисот тысяч. Амилоза легкорастворима в теплой воде и образует неистинные растворы невысокой вязкости, которые при добавлении йода окрашиваются в синий цвет. Раствор амилозы нестоек, и при длительном хранении в результате агрегатирования в нем образуется нерастворимый микрокристаллический осадок, не поддающийся расщеплению кислотами и ферментами.

Амилопектин в отличие от амилозы имеет сильноразветвленные цепи. Ветви содержат в среднем по 12 остатков глюкозы, и точки ветвления образуются приблизительно у каждого 12-го остатка. Глюкозные остатки в остове молекулы амилопектина соединены глюкозидными связями а-1,4-типа, а в точках, ветвления-- связями а-1,6-типа.

Таким образом, цепи амилопектина имеют следующую разветвленную структуру:

Олигосахариды, содержащие два остатка моносахаридов, называются дисахаридами, три остатка -- трисахаридами, четыре - тетрасахаридами.

Общее число глюкозных остатков в молекуле амилопектина может достигать 6000, а его молекулярная масса 1 млн.

В отличие от амилозы амилопектин образует коллоидные или мицеллярные растворы, которые при добавлении йода окрашиваются в красно-фиолетовый цвет. Он растворяется в воде при нагревании до температуры 120--130°С и дает очень вязкие и стойкие растворы (5%-ной концентрации).

Под действием минеральных кислот при высоких температурах или. в результате катализа амилолитическими ферментами при 55--60 °С в молекуле крахмала происходят ослабление и разрыв связей между макромолекулами амилопектина и амилозы, который сопровождается образованием гомогенной массы (стадия клейстеризации и разжижения крахмала). Затем в разных частях молекул амилопектина и амилозы разрываются о-1,4- и а-1,6-глюкозидные связи с присоединением по месту разрыва каждой связи молекулы воды. Таким образом, крахмал расщепляется на более короткие полисахариды различной молекулярной массы -- декстрины и олигосахариды.

Декстрины на первых стадиях гидролиза мало отличаются от крахмала по размеру молекулы и^- свойствам. По мере дальнейшего гидролиза уменьшается молекулярная масса декстринов и изменяется окраска их реакции с йодом. Крахмал с йодом окрашивается в синий, амилодекстрины, имеющие молекулярную массу 10 000--12 000, -- в сине-фиолетовый, эритродекстрины (молекулярная масса 4000--7000) -- в красно-бурый цвет. Со стадии образования ахродекстринов (молекулярная масса 2900--3700) и до конца гидролиза окраска остается такой же, как и водного раствора йода. По мере гидролиза изменяется также растворимость декстринов в спирте, уменьшается вязкость раствора.

В начале процесса в гидролизате присутствуют все перечисленные углеводы, но преобладают декстрины, с увеличением продолжительности гидролиза масса сахаров увеличивается.

При кислотном гидролизе крахмал расщепляется с образованием в конечном счете глюкозы. При ферментативном гидролизе под действием ферментов, содержащихся в проросшем зерне--солоде, крахмал расщепляется до мальтозы, а при гидролизе ферментами плесневого гриба (Asp. awamori, Asp. niger) --до глюкозы.

Дрожжами непосредственно крахмал и декстрины не сбраживаются.

Гликоген (животный крахмал) является резервным полисахаридом, общим для животных организмов, а также некоторых дрожжей и бактерий. По строению он близок к амилопектину, но имеет более разветвленную структуру: точки ветвления повторяются через каждые 10--18 остатков глюкозы. Раствором йода гликоген окрашивается в красно-бурый или буро-коричневый цвет. Под действием минеральных кислот гликоген расщепляется до глюкозы. Целлюлоза, или клетчатка (С₆Н₁₀0₅)_ге, составляет основную массу клеточных стенок растений. По строению целлюлоза сходна с амилозой крахмала, но остатки глюкозы соединены в ней р-1,4-глюкозидными связями. В среднем молекулярная масса целлюлозы 500 ООО. Целлюлоза нерастворима в горячей воде и почти не разлагается разбавленными кислотами и щелочами. Полный гидролиз целлюлозы до глюкозы достигается длительным нагреванием ее с минеральными кислотами под высоким давлением,

Гемицеллюлозы (полуклетчатки) представляют собой совокупность полисахаридов клеточной стенки растений, которые можно экстрагировать водными растворами щелочей. Гемицеллюлозы легче гидролизуются минеральными кислотами, чем целлюлоза. При их гидролизе образуются пентозы (арабиноза или ксилоза) и гексозы (майноза, галактоза и т. п.).

Пектиновые вещества являются высокомолекулярными соединениями углеводной природы. Они содержатся в клубнях картофеля, сахарной свекле, ягодах, фруктах и других растениях. В клеточных стенках они вместе с гемицеллюлозами являются цементирующим материалом. Нерастворимые в воде, пектиновые вещества в виде протопектина составляют большую часть межклеточного вещества растений.

Протопектин при нагревании под действием кислот или фермента протопектиназы расщепляется с образованием нерастворимой фракции и растворимой--гидратопектина. Гидратопектин представляет собой смесь, состоящую на 70--75% из пектина и на 20--25 % из арабана и галактана.

Пектин является полисахаридом, имеющим, цепную структуру, состоящую из остатков галактуроновой кислоты, которая присутствует примерно' на 75 % в виде метилового эфира. В процессе переработки из метилового эфира образуется метиловый спирт, являющийся вредной примесью. Поэтому метиловый эфир частично удаляют на стадии разваривания и осахаривания, используя приемы перепада давлений. Основное количество метанола удаляется на стадии ректификации.

Камеди и слизи, или гумми-вещества, -- полисахариды, содержащиеся в растениях. Камеди выделяются при повреждении коры многих растений в виде вязких растворов, застывающих в стеклообразную массу. Камеди являются гетерополисахаридами, так как состоят из нескольких моносахаридов, а также могут включать одну или несколько уроновых кислот.

В эндосперме пшеницы и других злаков находится около 2 % нерастворимых в воде, но набухающих в ней некрахмальных полисахаридов, образующих при отмывании крахмала слизистый слой, в котором содержатся в основном пентозаны и остатки гексоз. При полном кислотном гидролизе они дают преимущественно пентозы (ксилозу, арабинозу) и гексозы (глюкозу, маннозу, галактозу). Сравнительно много слизей в зернах ржи (около 2,5 % сухого вещества зерна), что обусловливает повышенную вязкость ржаного сусла.

Белки

Растительные белки являются основным материалом для построения протоплазмы и ядра растительных клеток; продукты гидролиза белков -- пептиды и аминокислоты -- необходимы для жизнедеятельности микроорганизмов, используемых в спиртовом производстве.

В среднем в белках содержится 52 % углерода, 7 % водорода, 23 % кислорода, 17 % азота, 1 % серы. Некоторые белки содержат также фосфор.

Молекулы белка состоят из остатков аминокислот, соединенных пептидными (--СО--NH--) связями, длинные цепи которых с помощью водородных, дисульфидных и ионных связей образуют своеобразные «клубки». При нагревании выше 60 ° эти связи разрываются и «клубок» распадается, происходит денатурация белка, которая сопровождается изменением его первоначальных свойств. Денатурация может протекать также под действием кислот, щелочей, органических растворителей.

Белки как высокомолекулярные органические соединения образуют коллоидные растворы, многие из которых получены в кристаллическом виде.

Все белки разделяются на две большие группы: протеины, которые дают при гидролитическом расщеплении только ами- нокислоты, и сложные белки, или протеида, в которых белок связан с веществом небелковой природы -- простетическоЙ груп- пой.

Протеины по их растворимости в воде, солевых и спиртовых растворах разделяют на альбумины, глобулины, проламины, глютелины.

К альбуминам относятся растворимые в воде белки; к глобулинам-- белки, нерастворимые в воде, но растворимые в водных растворах различных солей, например хлорида натрия. Глобулинами являются белки картофеля и сахарной свеклы.

Проламины -- это белки, нерастворимые ни. в воде, ни в солевых растворах, но хорошо растворяющиеся в спиртовых растворах 60--80 %-ной концентрации, в семенах зерновых злаков найдены следующие проламины, глиадин--в пшенице и ржи, гордеин -- в ячмене, зеин -- в кукурузе, авеин-- в овсе.

К глютелинам относятся белки, растворимые только в щелочах: глютенин из семян пшеницы, глютелин кукурузы, оризенин риса, К глютелинам относятся фосфопротеины, протеиноиды, протамины, гистоны.

Протеиды классифицируют и зависимости от химической природы простетической группы. Липопротеиды содержат в качестве простетической группы липоиды, хромопротеиды -- азотистые соединения, гликопротеиды -- различные углеводы, нуклеопротеиды -- нуклеиновые кислоты.

Липопротеиды входят в состав растительной клетки, хромопротеиды-- в состав пигментов, гликопротеиды играют важную роль в построении протоплазмы. Нуклеопротеиды входят в состав протоплазмы живой клетки.

Нуклеиновые кислоты представляют собой высокомолекулярные органические кислоты, растворяющиеся в щелочных растворах н осаждающиеся при подкислении. При гидролизе нуклеиновые кислоты распадаются на пуриновые и пиримидиновые основания, сахара (рибозу и дезоксирибозу) и фосфорную кислоту.

Различают дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), которая содержит p-D-2-дезоксирибозу и пиримидиновое основание тимин, и рибонуклеиновую кислоту (РНК), в составе которой P-D-рибоза и пиримидиновое основание урацил.

ДНК содержится в ядрах клеток, хлоропластах и митохондриях, РНК-- в цитоплазме и ядре.

Важнейшие структурные элементы ядра клетки -- хромосомы, состоят из белка и ДНК и являются носителями наследственной информации. В хромосомах имеются определенные участки молекулы ДНК, называемые генами -- единицами наследственности, в которых закодирован тот или иной специфический признак организма.

Таким образом, дезоксирибонуклеиновую кислоту можно рассматривать как биохимическую систему, способную концентрировать наследственную информацию, передавать ее потомству, а также управлять биосинтезом ферментов и других белков в клетках на всех этапах ее развития соединения, в которых рибоза соединена с пуриновым (или дезоксирибоза с пиримидиновым) основанием, называют нуклеозидами. Нуклеозиды, соединяясь с молекулой фосфорной кислоты, образуют нуклеотиды.

Нуклеозид аденозин (соединение пуринового основания аденина с рибозой), соединяясь с одной молекулой фосфорной кислоты, образует аденцзинмонофосфат (АМФ) или адениловую кислоту. Адениловая кислота может присоединить к своему фосфатному радикалу еще один или два остатка фосфорной кислоты, образовывая аденрзиндифосфат (АДФ) или аденозинтрифосфат (АТФ).

АМФ, АДФ и АТФ играют важную роль в обмене веществ: процессах, дыхания и брожения.

Под действием ферментов, кислот и щелочей цепи молекул белка разрываются с образованием промежуточных продуктов гидролиза -- пептонов, полипептидов и дипептидов, которые расщепляются до конечных продуктов-- аминокислот.

Таким образом, основной структурной единицей белка являются аминокислоты.

Большая часть аминокислот представляет собой производные жирных кислот, в которых у а-углеродного атома один атом водорода замещен аминной группой --NH₂. Общая формула а-аминокислот

Аминокислоты принадлежат к группе моноамино-монокарбоновых кислот и содержат как кислотную карбоксильную группу, так и щелочную аминную. В водных растворах от карбоксильной группы отщепляется ион водорода, и аминокислота функционирует как кислота.

Одновременно в водном растворе основные группы аминокислот являются источником гидроксильных ионов.

Аминокислоты являются одновременно кислотами и основаниями, относятся к группе амфотерных электролитов и в качестве буферных веществ поддерживают в организме определенную концентрацию водородных ионов.

Белки, состоящие из а-аминокислот, содержат определенное количество свободных аминных и карбоксильных групп и подобно аминокислотам являются амфотерными электролитами. В настоящее время известно более 150 аминокислот, однако составными частями белков являются только 22 аминокислоту.

В производстве спирта аминокислоты являются одной из основных составных частей питательной среды для дрожжей и микроорганизмов --продуцентов ферментов. Содержатся они в клеточном соке картофеля, в зернах злаков, в проросших зернах (солоде), в барде.

Ферменты

Ферменты представляют собой специфические биологические катализаторы белковой природы.

Как всякие катализаторы, ферменты снижают энергию активации, необходимую для осуществления той или иной химической реакции,, направляя ее через промежуточные реакции, которые требуют значительно меньше энергии. Например, для гидролиза 1 моль сахарозы до глюкозы и фруктозы без участия катализатора требуется 32 000 кал (7637,2 Дж). Если же гидролиз катализируется ферментом р-фруктофуранозидазой, то энергия активации составляет 9400 кал (2243,4 Дж). Оказывая влияние на скорость, ферменты не расходуются и не входят в состав конечных продуктов реакции.

Важными особенностями ферментов являются высокая специфичность действия, легкая изменяемость свойств в зависимости от условий среды (рН, температура, присутствие активаторов или ингибиторов и др.). Это позволяет катализировать реакции в очень мягких условиях -- при пониженной температуре, атмосферном давлении, невысоком рН среды и т. д.

Ферменты разделяют на одно- и двухкомпонентные. Однокомпонентные ферменты (простые белки, протеины) состоят исключительно из белка. Каталитические свойства в них проявляют чаще всего остатки аминокислот: серина, гистидина, триптофана, аргинина, тирозина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, которые называют активными центрами ферментов.

Двухкомпонентные ферменты; (сложные белки, протеиды) наряду с белком, называемым апоферментом, содержат небелковую часть -- простетическую группу, ответственную за каталитическую активность. Апофермент называется также белковым носителем, фероном, а простетическая группа -- агоном, коферментом, активной группой.

Белковая часть, являясь носителем активной группы, одновременно резко повышает ее каталитическую активность. В свою очередь простетическая группа стабилизирует белковую часть и делает ее менее уязвимой к денатурирующим компонентам.

Кроме активного центра различают еще два центра: субстратный и аллостерический. Под первым понимают часть молекулы фермента, к которой присоединяется субстрат, подвергающийся ферментативному воздействию, под вторым -- участок молекулы фермента, после присоединения к которому низкомолекулярного вещества изменяются третичная структура белковой молекулы и, как следствие, конфигурация активного центра, что повышает или снижает каталитическую активность. Классификация ферментов. В основе классификации лежат типы реакций, которые катализируют ферменты: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы.

Оксидоредуктазы -- окислительно-восстановительные ферменты. Большое значение имеют дегидрогеназы, катализирующие реакции дегидрирования -- отнятия и присоединения водорода в различных органических соединениях.

Аэробные дегидрогеназы, для которых единственным акцептором водорода служит молекулярный кислород, называются оксидазами. Отнимая водород от окисляемого субстрата и передавая его кислороду воздуха, оксидазы могут образовывать воду или пероксид водорода. Из оксидаз важную роль игранет по-лифенолоксидаза и глюкозооксидаза, окисляющие соответственно полифенольные соединения и глюкозу до глюконовой кислоты.

К оксидоредуктазам относятся также перокеидаза и каталаза. Первая катализирует окисление органических соединений пероксидом водорода или органическими пероксидами, вторая -- разложение перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. Оксидоредуктазы катализируют окислительно-восстановительные реакции, происходящие при процессах дыхания и брожения.

Трансферазы (ферменты переноса) катализируют перенос отдельных радикалов, целых атомных группировок (например, остатков моносахаридов, аминокислот, фосфорной кислоты, аминных, метальных групп) от одних соединений к другим. Они участвуют в многочисленных реакциях обмена веществ.

Гидролазы катализируют гидролитическое расщепление различных соединений, являются однокомдонентными ферментами. К гидролазам относятся эстеразы, карбогидразы, целлюлазы, пектиназы, протеазы и др.

Эстеразы -- ферменты, катализирующие реакции расщепления и синтеза сложных эфиров, например фосфорной кислоты (фосфатазы), жиров (липазы), нуклеотидов (нуклеотидазы) и др.

Карбогидразы -- ферменты, катализирующие гидролиз и, синтез гликозидов и сахаридов, расщепляют связь --С--О--С--. Карбогидразы разделяют на олигазы и полиазы. К олигазам относятся а- и р-глюкозидазы, а- и р-галактозидазы, р-фрукто-фуранозидаза. Эти ферменты катализируют разрыв соответственно а- и р-глюкозидных связей в гликозидах, ди- и тетрасахаридах.

Из полиаз наибольшее значение в биохимических процессах имеют амилазы--ферменты, катализирующие гидролиз крахмала, гликогена, родственных полисахаридов, олигосахаридов.

Целлюлоза и гемицеллюлоза катализируют гидролиз соответственно целлюлозы и гемицеллюлоз до декстринов и олигосахаридов.

Пектиназа катализирует гидролиз пектиновых веществ. Этим термином названа группа ферментов, основными из них являются: пектинэстераза, разрывающая сложные эфирные связи в пектине, полигалактуроназа, разрывающая глюкозидные связи между остатками галактозы, и пектинлиаза, катализирующая разрыв галактуронидных связей путем транслиминирования.

Протеазы (пептидгидролазы) катализируют гидролиз белков и полипёптидов, т. е. разрыв связи--СО--NH. Обычно протеазы разделяют на протеиназы и пептидазы. Первые катализируют расщепление белков, вторые -- расщепление полипептидов и дипептидов. Это деление протеаз условно, так как известны протеиназы, например папаин, способные гидролизовать пептидные связи не только в белках, но и различных пептидах.

Лиазы являются катализаторами реакций негидролитического расщепления субстратов. Одни из них катализируют отщепление воды, другие -- углекислоты или аммиака.

И з о м е р а з ы . способствуют превращению органических соединений в их изомеры и играют важную роль в обмене веществ.

Л и г а з ы (синтетазы) катализируют синтез молекул, который сопровождается расщеплением связи в сложных органических веществах -- нуклеозидтрифосфатах, играющих важную роль при обмене веществ живой клетки.

3 и м а з н ы й комплекс ферментов дрожжей вызывает анаэробный распад углеводов при брожении. В комплекс входят ряд оксидоредуктаз, фосфотрансфераз, лиаз (декарбоксилаз) и других ферментов, которые играют большую роль при сбраживании гексоз.

Условия действия ферментов. Действие ферментов зависит прежде всего от температуры, активной реакции среды (рН).

Оптимальная температура, при которой активность ферментов наиболее высока, составляет 40--50 °С. При более высоких температурах активность ферментов значительно понижается, и многие из них при 70--80 °С необратимо разрушаются, происходит денатурация входящего в состав фермента белка. При температурах ниже оптимальной Скорость ферментативной реакции также понижается.

Большое влияние на скорость ферментативной реакции оказывает концентрация субстрата и фермента. При низких концентрациях субстрата скорость реакции растет пропорционально концентрации субстрата, при высоких -- не зависит от нее. Скорость большей части ферментативных реакций на начальных стадиях прямо пропорциональна концентрации фермента.

Действие ферментов зависит также от присутствия специфических активаторов и неспецифических или специфических ингибиторов. К активаторам ферментов относятся ионы таких металлов, как Na+, К⁺, Mg²⁺, Са²+, Zn²⁺, Cu²⁺, Мп²⁺, Fe²⁺. Например, активность фермента амилазы повышается в присутствии ионов йода, брома, хлоридов; протеолитические ферменты становятся более активными при наличии в среде HGN, H₂S и веществ, содержащих сульфгидрильные (--SH) группы.

К неспецифическим ферментативным ингибиторам относятся соли тяжелых металлов: свинца, серебра, ртути, вольфрама, а также трихлоруксусной кислоты.

Биохимия спиртового брожения

Спиртовое брожение -- это процесс анаэробного превращения углеводов сусла в этиловый спирт и диоксид углерода под действием дрожжей.

Спиртовое брожение суммарно выражается уравнением Гей- Люссака

C₆Hi₂0₆--*-2С₂Н₅ОН + 2С0₂ +118 кДж,

которое отражает начальные и конечные продукты брожения, но не дает представления о химических превращениях сахаров и не позволяет судить о химизме образования побочных продуктов и новых дрожжевых клеток. Процесс спиртового брожения протекает через ряд промежуточных стадий с участием адениловых кислот и большого числа ферментов дрожжей.

Весь процесс спиртового брожения или ферментативной диссимиляции углеводов в анаэробных условиях можно условно изобразить поэтапно.

1-й этап. Образование фосфорных эфиров, сахаров под действием фермента гексокиназы и адениловых кислот, являющихся донорами и акцепторами фосфорной кислоты. Глюкоза превращается в глкжозо-6-фосфат. Адениловые кислоты в дрожжах содержатся в виде аденозинмонофосфата(АМФ), аденозиндифосфата (АДФ) и аденозиитрифосфата (АТФ). Гексокиназа катализирует перевес одной фосфорной группы, с АТФ на глюкозу. При этом АТФ превращается в АДФ, а остаток фосфорной кислоты присоединяется по месту шестого углеродного атома.

2-й этап. Глюкозофосфат под действием фермента глюкозофосфатизо-меразы превращается-вфруктозо-б-фосфат.

3-й этап. Фруктозо-о-фосфат под действием фермента фосфофруктоки-назы присоединяет по месту первого углеродного атома второй остаток фосфорной кислоты за счет АТФ и превращается во/фруктозо-1,6-дифосфат.

4-й этап. Под действием фермента альдоазы фруктозо-1,6-дифосфат распадается на 3-фосфоглицериновый альдегид фосфодиоксиацетон. Эта реакция обратима.

5-й этап. З-Фосфоглицериновый альдегид и фосфодиоксиацетон вступает в реакцию изомеризации под действием фермента триозофосфатизомеразы. Равновесие устанавливается при содержании 3-фосфоглицеринового альдегида 95 % я фосфодиоксиацетона 5 %.

Последовательность начальных стадий превращения глюкозы по 1--5-му этапам может быть наглядно представлена формулами:

6-й этап. В индукционный период, пока в качестве промежуточного продукта не образовался уксусный альдегид (этап 12), между двумя молекулами 3-фосфоглицеринового альдегида под действием фермента альдегидмутазы при участии молекулы воды происходит реакция дисмутации с образованием фосфоглицерина и 3-фосфоглицериновой кислоты. Фосфоглицерин в дальнейших реакциях не участвует и после отщепления фосфорной кислоты является побочным продуктом спиртового брожения.

При установившемся процессе вначале 3-фосфоглицериновый альдегид присоединяет остаток неорганической фосфорной кислоты, превращается в 1,3-дифосфоглицериновый альдегид, затем под действием фермента триозо-фосфатдегидрогеназы в присутствии НАД(никотинамидадениндннуклеогада) окисляется, в 1,3-дифвсфоглицериновую кислоту.

7-й этап. 1,3-Дифосфоглицериновая кислота под действием фермента фосфотрансферазы передает остаток фосфорной кислоты молекуле АДФ с образованием АТФ и 3-фосфоглицериновой кислоты.

8-й этап. З-Фосфоглицериновая кислота под действием фермента фос-фоглицеромутазы изомеризуется в 2-фосфоглицериновую кислоту.

9-й этап. 2-Фосфоглицериновая кислота под действием фермента энолазы, активируемого ионами Mg+, Mn+, Zn²+, превращается в фосфоэнолпи-ровиноградную кислоту. Оптимум действия энолазы рН 5,2--5,5.

10-- 11-й этапФосфоэйолпировиноградная кислота под действием фер-М#нта фосфотранофтоааы в присутствии ионов К+ передает остаток фосфорной кислоты на АДФ, причем образуются АТФ и энолпировиноградная кислота, превращаемая затем в пировиноградную кислоту.

12-й этап. Под действием фермента карбоксилазы от пировиноградной кислоты отщепляется диоксид углерода и образуется уксусный альдегид.

13-й этап. Фермент алкогольдегидрогеназа переносит водород с восстановленного НАД-Н₂ на уксусный альдегид, в результате чего образуется этиловый спирт и регенерируется НАД (никотина мядадениндинуклеотид).



Последовательность превращений 3-фосфоглицериновой кислоты в пи-ровиноградную кислоту, уксусный альдегид и этиловый спирт (7--13-й этапы).

Таким образом, при спиртовом брожении наряду с этиловым спиртом и диоксидом углерода всегда образуется некоторое количество побочных продуктов, в частности глицерина./ При связывании уксусного альдегида сульфитом' брожение направляется в сторону образования глицерина:

В щелочной среде молекула уксусного альдегида вступает в реакцию со второй молекулой уксусного альдегида, образуя этиловый спирт и уксусную кислоту, параллельно образуется также глицерин. Эти реакции суммарно выражаются уравнением



Микроорганизмы в спиртовом производстве

Культивируемые микроорганизмы. В спиртовом производстве для получения амилолитических ферментов помимо солода все в большем количестве используются микроскопические грибы, реже -- дрожжеподобные организмы и споровые бактерии.

Для промышленного производства ферментных препаратов применяют как природные штаммы микроорганизмов, выделенные из естественных сред, так и мутантные, полученные путем физико-химических воздействий на природные штаммы.

Микроорганизмы синтезируют одновременно комплекс ферментов, Но некоторые из них продуцируют в значительных количествах лишь один фермент.

Микроскопические грибы. Для получения амилаз используют микроскопические грибы рода Aspergillus видов niger, oryzae, usamii, awamori, butatae.

В питательную среду для аспергиллов вводят углеводы, азотистые и минеральные вещества. Для накопления амилазы в ней должны присутствовать крахмал, декстрины, или мальтоза, источниками азота могут быть белки, их гидролизаты, аммониевые соли и нитраты. Среда должна содержать серу, фосфор, калий, магний и микроэлементы.

Микроскопические грибы под микроскопом выглядят как тела нитевидного строения со специфическим строением плодоносящих органов.

В спиртовом производстве для получения амилолитических ферментов нашли применение также дрожжеподобные грибы рода Endomycopsis, выращиваемые глубинным способом и продуцирующие главным образом активную глюкоамилазу, а-амилазная активность гриба Endomycopsis проявляется незначительно, поэтому его применение возможно только вместе с другими источниками ос-амилазы, например с ячменным солодом или бактериальной а-амилазой.

Бактерии. Активные амилазы синтезируют такие бактерии, как Вас. subtilis, Вас. mesentericus, Вас. diastaticus и др. Бактерии обычно представляют собой палочки длиной 1,2-- 1,3 мкм и диаметром 0,6--0,8 мкм, которые образуют цепочки, состоящие из двух, трех и более звеньев. Цикл развития бактерий в глубинных условиях составляет у Вас. diastaticus 10-- 12 ч при температуре 60 °С, у Вас. mesentericus 24--36 ч при 40°С.

Отличительной особенностью бактерий является накопление высокоактивной термофильной а-амилазы, используемой на стадии проваривания концентрированных замесов для предварительного разжижения и декстринизации клейстеризованного крахмала сырья перед тепловой обработкой.

Дрожжи. Для сбраживания Сахаров, содержащихся в сусле, в спиртовом производстве применяют дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae.

Используется несколько разновидностей этого вида рас, отличающихся друг от друга по некоторым признакам.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются одноклеточными микроорганизмами, относящимися к классу аскомицетов (сумчатых грибов). Дрожжевые клетки имеют яйцевидную элипсоидальную, овальную или вытянутую форму и достигают величины 6--11 мкм, размножаются почкованием и очень редко спорообразованием.

На спиртовых заводах, перерабатывающих зерно-картофельное сырье, применяют дрожжи, которые хорошо сбраживают мальтозу, сахарозу, фруктозу, но не сбраживают конечные декстрины (расы XII, II, М, XV и др.).

На спиртовых заводах, перерабатывающих мелассу, применяют дрожжи, которые сбраживают сахарозу, глюкозу, фруктозу и частично раффинозу .

Инфицирующие микроорганизмы. При проведении процессов охлаждения, осахаривания и сбраживания необходимо предохранять полупродукты спиртового производства (сусло, сбраживаемую среду) От внесения в них посторонних микроорганизмов и диких дрожжей, бактерий, содержащихся в сырье, полупродуктах, пыли, воде и воздухе.

Так, сусло, задерживаясь в труднодоступных для мойки и дезинфекции местах (в трубах теплообменников, на змеевиках дрожжевых, бродильных аппаратов, в трубопроводах, насосах и т. д.), является благоприятней средой для развития диких дрожжей, которые могут полностью вытеснить производственную культуру дрожжей.

Интенсивно размножаясь, дикие дрожжи ухудшают качества культурных видов хлебопекарных дрожжей.

Производственные культуры дрожжей, выделенные из инфицированной мелассно-спиртовой бражки, имеют низкую ферментативную активность и стойкость.

Дикие дрожжи, потребляя сахар, образуют мало спирта, кроме того, они превращают сахара в органические кислоты, инактивирующие амилолитические ферменты, что приводит к уменьшению степени высаживания сусла и большим потерям сбраживаемых веществ.

Источниками инфекции, ухудшающей нормальный ход процесса сбраживания, могут быть бактерии молочнокислые, уксуснокислые, маслянокислые, гнилостные.

Молочнокислые бактерии имеют цилиндрическую палочковидную, сферическую или шаровидную форму. В процессе жизнедеятельности наряду с молочной кислотой они образуют летучие кислоты, спирт, диоксид углерода водород. Оптимальная температура их роста 20--30 °С (термофильные виды хорошо развиваются при 49--51 °С), как и другие бесспоровые молочнокислые бактерии, погибают при 70--75 °С. Некоторые виды молочнокислых бактерий, например Leueonostoc mesenteroides, более устойчивы к высокой температуре и кислотам в жидких средах, они полностью погибают только при температуре 112--120 °С после выдержки в течение 20 мин, в 0,5%-ном растворе серной кислоты проявляют жизнедеятельность в течение 1 ч.

Уксуснокислые бактерии -- палочковидные бесспоровые микроорганизмы -- развиваются в тех же условиях, что и дрожжи. Они способны окислять этиловый спирт в уксусную, пропиловый --в пропионовую, бутиловый-- В масляную кислоты. Некоторые виды бактерий способны окислять также глюкозу в глюконовую кислоту, ксилозу и арабинозу-- соответственно в нейлоновую и арабоновую кислоты.

При накоплении в сбраживаемой среде 0,01 % уксусной кислоты жизнедеятельностью дрожжей задерживается, а при 0,2 % -- полностью подавляется.

Маслянокислые бактерии -- анаэробы, имеют вид палочек длиной до 10 мкм. Наряду с масляной кислотой они могут образовывать уксусную, молочную, капроновую, каприловую и другие кислоты, а также этиловый и бутиловый спирты. Маслянокислые бактерии развиваются в трубопроводах, насосах и других местах, имеющих застойные зоны. Оптимальная температура роста этих анаэробов 30--40 °С, при рН 4,9 и ниже они не развиваются. Маслянокислые бактерии опасны для спиртового производства, так как накапливаемая в результате их жизнедеятельности масляная кислота даже в незначительной концентрации (0,0005 %) угнетает развитие дрожжей.

Гнилостные бактерии интенсивно разлагают белковые вещества. В анаэробных условиях белок распадается до диоксида углерода, аммиака, сероводорода, воды и минеральных солей; в анаэробных -- накапливаются различные ядовитые и дурнопахнущие вещества. К аэробам относятся Вас. subtilis (сенная палочка), Вас. mesentericus (картофельная палочка). Температурный оптимум этих бактерий составляет 36--50 X, они характеризуются повышенной термоустойчивостью.

Бактерии Вас. subtilis, Вас. mesentericus также переводят нитраты в нитриты, последние даже в незначительной концентрации подавляют развитие дрожжей.

К анаэробам относятся Escherichia coli (кишечная палочка), Proteus vulgaris и др. Большой вред гнилостные бактерии наносят хлебопекарным дрожжам, разжижая их и сокращая срок их хранения.