Валідація методу фрагментного аналізу STR-локусів із використанням набору реактивів AmpFlSTR Identifiler Plus для проведення реакції ампліфікації

А.С. Повх

С.М. Романчук

Державний науково-дослідний експертно-криміналістичний центр МВС України

Мета статті - висвітлити результати внутрішньолабораторної валідації методу фрагментного аналізу STR-локусів на генетичних аналізаторах АВ 3130 та 3100-Avant із використанням набору реактивів AmpFlSTR Identifiler Plus для проведення реакції ампліфікації, надати певні рекомендації. У процесі дослідження перевірено в її межах кілька параметрів (точність і достовірність методу, його чутливість, оптимальна концентрація ДНК, гетерозиготний баланс, співвідношення статера та алеля в ДНК-профілі, додаткові піки (+А, -А) та нетипові алелі (артефакти), вплив інгібіторів на реакцію ампліфікації, якість реакції ампліфікації під час дослідження деградованої ДНК, достовірність результатів дослідження відповідно до стандартів ДНК NIST, ДНК-суміші за різних співвідношень концентрації ДНК, аналітичний і стахостичний пороги). Підтверджено високоточ- ність методу фрагментного аналізу STR-локусів із використанням набору реактивів Identifiler® Plus і високий рівень достовірності результатів дослідження; його цілковиту придатність та ефективність для встановлення генетичних ознак особи (трупа), а також біологічних слідів, у тому числі й за наявності інгібіторів (винятком є дослідження деградованої ДНК). Методологічну основу дослідження становлять закони і категорії теорії пізнання, зокрема положення матеріалістичної діалектики, що сприяли усвідомленню об'єкта, предмета, мети і завдань дослідження в контексті взаємо- обумовленості здобутків і потреб практики. При цьому методи формальної логіки (аналіз, синтез, дедукція, індукція, аналогія, абстрагування) дали змогу детальніше усвідомити зміст досліджуваних питань, системно-структурним методом з'ясовано сутність досліджуваних категорій і явищ. Метод моделювання використано під час висвітлення перебігу внутрішньолабораторної валідації методу фрагментного аналізу STR-локусів на генетичних аналізаторах АВ 3130 та 3100-Avant з використанням набору реактивів AmpFlSTR® Identifiler® Plus для проведення реакції ампліфікації.

Ключові слова: валідація; дезоксирибонуклеїнова кислота; короткий тандемний повтор; полі- меразна ланцюгова реакція; фрагментний капілярний електрофорез. фрагментний аналіз реактив ампліфікація

Цель статьи - отобразить результаты внутрилабораторной валидации метода фрагментного анализа STR-локусов на генетических анализаторах АВ 3130 и 3100-Avant с использованием набора реактивов AmpFlSTR Identifiler Plus для проведения реакции амплификации, дать соответствующие рекомендации. В процессе исследования проверено в ее рамках несколько параметров (точность и достоверность метода, его чувствительность, оптимальная концентрация ДНК, гетерозиготный баланс, соотношение статера и аллеля в ДНК-профиле, дополнительные пики (+А,-А) и нетипичные аллели (артефакты), влияние ингибиторов на реакцию амплификации, качество реакции амплификации в ходе исследования деградированной ДНК, достоверность результатов исследования в соответствии со стандартами ДНК NIST, ДНК-смеси при различных соотношениях концентрации ДНК, аналитический и стахостический пороги). Подтверждена высокоточность метода фрагментного анализа STR-локусов с использованием набора реактивов Identifier® Plus и высокий уровень достоверности результатов исследования; его полную пригодность и эффективность для установления генетических признаков личности (трупа), а также биологических следов, в том числе и при наличии ингибиторов (исключением является исследование деградированной ДНК). Методологическую основу исследования составляют законы и категории теории познания, в частности положения материалистической диалектики, которые способствовали осознанию объекта, предмета, цели и задач исследования в контексте взаимообусловленности достижений и потребностей практики. При этом методы формальной логики (анализ, синтез, дедукция, индукция, аналогия, абстрагирование) позволили подробнее осознать содержание изучаемых вопросов, системно-структурным методом раскрыта сущность исследуемых категорий и явлений. Метод моделирования использован при освещении хода внутрилабораторной валидации метода фрагментного анализа STR-локусов на генетических анализаторах АВ 3130 и 3100-Avant с использованием набора реактивов AmpFlSTR® Identifiler® Plus для проведения реакции амплификации.

Ключевые слова: валидация; дезоксирибонуклеиновая кислота; короткий тандемный повтор; полимеразная цепная реакция; фрагментный капиллярный электрофорез.

VALIDATION OF STR-LOCUS FRAGMENT ANALYSIS METHOD BY USING A SET OF REAGENTS AmpFISTR IDENTIFIER PLUS FOR CARRYING OUT THE AMPLIFICATION REACTION

A. Povkh

S. Romanchuk

State Scientific Research Forensic Center, MIA of Ukraine

The purpose of the article is to clarify the results of in-vitro validation method of the fragmentation analysis of the STR-locus on the AB 3130 and 3100-Avant genetic analyzers, using the AmpFlSTR® Iden- tifiler® Plus reagent kit for the amplification reaction, and to provide specific recommendations. During the study several parameters have been checked (accuracy and reliability of the method, its sensitivity, optimal DNA concentration, heterozygous balance, stator-allele ratio in the DNA profile, additional peaks (+ A, -A) and atypical alleles (artifacts) were tested within the study, the effect of the inhibitors on the amplification reaction, the quality of the amplification reaction during the degradation DNA study, the reliability of the results according to NIST DNA standards, the DNA mixture at different ratios of DNA concentration, analytical and stochastic thresholds). The accuracy of the method of fragment analysis of STR-loci using the set of Identifiler® Plus reagents and the high level of reliability of the results of the study, its complete suitability and efficacy for establishing the genetic traits of a person (corpse), as well as biological traces, were confirmed including the confirmation of the method in the presence of inhibitors (with the exception of degraded DNA studies). The methodological basis of the study includes laws and categories of the theory of cognition, particularly the provisions of materialistic dialectics, which contributed to the awareness of the object, subject, purpose and objectives of the study in the context of the interdependence of achievements and needs of practice. At the same time, formal logic methods (analysis, synthesis, deduction, induction, analogy, abstraction) made it possible to understand in more detail the content of the investigated issues, and the essence of the studied categories and phenomena was clarified by the system-structural method. The simulation method was used to outline the flow of in vitro laboratory validation of the fragment analysis of STR loci method on genetic analyzer AB 3130 and 3100-Avant using the AmpFlSTR® Identifiler® Plus reagent kit for carrying out the amplification reaction.

Keywords: validation; deoxyribonucleic acid; short tandem repetition; polymerase chain reaction; fragment capillary electrophoresis.

Застосування високотехнологічних методів аналізу ділянок дезоксирибонуклеїнової кислоти (далі - ДНК), у послідовності яких є тандемні повтори, стало проривом у криміналістичній ідентифікації особи (трупа), адже їх набір унікальний для кожного індивідуума, крім однояйцевих близнюків (Butler, 2006). Залежно від розміру повтори поділяють на мікро- та мінісателіти (Pimenov, Kultin, & Kondrashov, 2001, s. 22). Мікроса- теліти - це локуси (ділянки ДНК) із короткими тандемними повторами, які містять від двох до шести пар нуклеотидів; мінісателіти - локуси з перемінною кількістю тандемних повторів із семи і більше пар нуклеотидів.

Уперше думку про доцільність використання гіперваріабельних мінісателітів (Variable Numder Tandem Repeat, далі - VNTR-локуси) висловив видатний англійський генетик Джеффріс у 1985 р. (Jeffreys, Wilson, & Thein, 1985, vol. 314; 316). Активного розвитку в цей період набули і мікросателіти (Short Tandem Repeat, далі - STR-локуси), застосування яких забезпечувало більш точну ідентифікацію особи (трупа) (Fregeau, & Fourney, 1993; Wang et al., 1995). Саме з цього часу STR-локуси широко використовують у криміналістичному ДНК-аналізі. На їх основі створено бази даних геномної інформації людини, які сприяють вирішенню багатьох завдань кримінального судочинства.

Зазвичай експертові для дослідження надходять сліди біологічного походження, які могли піддаватися певному впливу зовнішнього середовища, як-то: різкі зміни температури, довготривале перебування у воді, ґрунті, снігу, дія хімічних і біологічних речовин тощо. Результатом такого впливу є деградація та інгібування ДНК, що ускладнює молекулярно-генетичні дослідження. У зразках біоматеріалу з деградованою ДНК більш імовірні збереження коротких фрагментів (STR-локусів) порівняно з довгими (VNTR-локусами), що дає змогу встановити генетичні ознаки біологічних слідів.

Під час молекулярно-генетичної експертизи для генотипування зразків крім сучасних наборів реактивів на практиці іноді використовують набір реактивів для проведення реакції ампіліфікації AmpFlSTR® Identifiler® Plus (далі - Identifiler® Plus) (AmpFlSTR® Identifiler® Plus, 2015; Wang, Chang, Lagaњ, Calandro, & Hennessy, 2012). Непоодинокими є завдання провести порівняльну експертизу, у якій генетичні ознаки особи (трупа) або слідів біологічного походження встановлені з використанням набору реактивів для проведення реакції ампіліфікації Identifiler® Plus.

Кожна лабораторія, в якій проводять дослідження, повинна мати експериментальний доказ придатності набору реактивів, використовуваних для вирішення поставлених завдань, шляхом його валідації (Zahalni vymohy do kompetentnosti, 2006), засвідчуючи тим самим актуальність вивчення цієї проблеми.

Результати валідаційних досліджень набору реактивів Identifiler® Plus опубліковані безпосередньо виробником (AmpFlSTR® Identifiler® Plus, 2015; Artifacts Identified, 2018), а також деякими науковцями, зокрема (Wang, Chang, Lagaњ, Calandro, & Hennessy, 2012; Gapinski, 2015).

Мета статті - висвітлити перебіг проведеної в Державному науково-дослідному експертно-криміналістичному центрі МВС України внутрішньолабораторної валідації методу із зазначеним набором реактивів, проаналізувати отримані результати і надати певні рекомендації.

Валідацію методу проводили на автоматичних генетичних аналізаторах (далі - ГА) Applied Biosystems 3130 (далі - АВ 3130) та ABI PRISM® 3100-Avant (далі - 3100-Avant) компанії Applied Biosystems, США, відповідно до вимог Наукової робочої групи методів ДНК-аналізу (SWGDAM) (Applied Biosystems 3130, 2010; ABI PRISM® 3100, 2010; Scientific Working Group, 2015). Під час цього дослідження тестували набір реактивів для проведення реакції ампліфікації Identifiler® Plus (AmpFlSTR® Identifiler® Plus, 2015). Об'єктами були:

геномна ДНК людини;

алельний леддер Identifiler® Plus;

стандарти ДНК NIST 2391b;

стандарти ДНК NIST 2391с.

Геномну ДНК виділено зі зразків крові людини загальноприйнятим методом із використанням іонообмінної смоли Chelex 100 (Pimenov, Kultin, & Kondrashov, 2001, s. 47). Реакційну суміш для проведення реакції ампліфікації, стандарти ДНК NIST 2391b та NIST 2391с готували згідно з відповідними протоколами (Certificate of Analysis Standard

Reference MaterialЛ 2391b; 2391c). Кількість та якість виділеної ДНК визначали за допомогою набору реактивів Quantifiler® Human (Applied Biosystems, США) для проведення по- лімеразної ланцюгової реакції (далі - ПЛР) в реальному часі (Quantifier Kits, 2012). Для об'єктів кожного блоку досліджень проводили реакції ампліфікації, розділення та де- текцію продуктів ампліфікації. Показники чутливості набору реактивів Identifiler® Plus порівнювали з показниками чутливості набору реактивів AmpFlSTR® Profiler® (далі - Profiler®) (Dayton et al., 2009).

Кількість аналітичних (дублювання реакційних лунок) і біологічних (дослідження в різні дні) повторів для кожного досліду була індивідуальною. Результати аналізували на програмному комплексі GeneMapper ID v. 3.2 із використанням програмного забезпечення Data Collection v. 2.0 (Hate Crime, 2015; GeneMapper ID, 2005), вважаючи їх статистично достовірними за похибки Р < 0,05. Статистичний аналіз проводили з використанням програмного забезпечення Microsoft Excel.

Усі реактиви та обладнання, використані в цьому методі дослідження, відповідають вимогам міжнародного стандарту системи управління якістю ДСТУ ISO/IES 17025 (Zahalni vymohy do kompetentnosti, 2006).

Розглянемо перебіг внутрішньолабораторної валідації методу фрагментного аналізу STR-локусів на генетичних аналізаторах АВ 3130 та 3100-Avant із використанням набору реактивів AmpFlSTR® Identifiler® Plus для проведення реакції ампліфікації.

Визначення точності та достовірності зазначеного методу дослідження

Молекулярну масу алелів леддера Identifiler® Plus визначали за висотами піків але- лів на електрофореграмах (далі - висота піків алелів), отриманих під час фрагментного аналізу. Аналіз проводили для кожного із чотирьох (3100-Avant) та восьми (АВ 3130) капілярів ГА, реакційні лунки дублювали п'ять разів, дослідження повторювали тричі в різні дні. Для кожного локусу розраховували відхилення молекулярних мас алелів від їх середнього значення.

З'ясування чутливості методу. Геномну ДНК, виділену зі зразка крові людини, титрували з бідистильованою деіо- нізованою водою у співвідношеннях 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 та аналізували з використанням системи 7500 PCR Real Time / Quantifiler Human (Dombrovskyi, Povkh, Petrychuk, & Romanchuk, 2017). Потім проводили реакції ампліфікації з концентраціями ДНК 0.74; 0.65; 0.58; 0.32; 0.17; 0.05; 0.04 та 0.03 нг/мкл. Фрагментний аналіз здійснювали при п'яти- та десятисекундних ін'єкціях. Аналітичний поріг інтенсивності становив 50 відносних одиниць флуоресценції (relative fluorescence units, далі - RFU).

Кількість аналітичних і біологічних повторів була кратною трьом. Найменшу концентрацію ДНК, яку слід використати в реакції ампліфікації для отримання якісного результату, визначали, оцінюючи такі критерії, як повнота ДНК-профілів, гетерозиготний баланс, висота піків алелів, поява побічних піків.

Визначення оптимальної концентрації ДНК. Геномну ДНК виділили з п'яти зразків крові людини, кожен зразок нормалізували до концентрацій 0,075; 0,1 та 0,2 нг/мкл. З кожним із розведень проводили реакції ампліфікації та фрагментний аналіз, тричі повторюючи ці дослідження. Оптимальну концентрацію ДНК, яку потрібно додати до проби для отримання якісного результату реакції ампліфікації, визначали за показниками гетерозиготного балансу та за висотами піків алелів, які обраховували в RFU.

Дослідження гетерозиготного балансу в ДНК-профілях. Кожен зразок виділеної з 20 зразків крові людини геномної ДНК нормалізували до концентрації 0,1 нг/мкл, після чого проводили реакції ампліфікації та фрагментний аналіз. Аналітичні дослідження повторювали тричі, біологічні - двічі. Співвідношення між гетерозиготними алелями в кожному локусі обраховували за отриманими показниками висоти піків. Основним критерієм оцінки гетерозиготного балансу була різниця висот піків гетерозиготних алелів.

Дослідження співвідношення висоти хибного алеля (статера) та істинного алеля в ДНК-профілі

Дослідження додаткових піків (+А, -А), а також нетипових алелів (артефактів) у ДНК-профілі

Концентрацію геномної ДНК визначали полімеразною ланцюговою реакцією в реальному часі, нормалізуючи її до 0,2 нг/мкл (Dombrovskyi, Povkh, Petrychuk, & Roman- chuk, 2017). Після цього проводили реакції ампліфікації з тривалістю останньої стадії 10, 20, 30 і 40 хв, а також фрагментний аналіз. Аналітичні дослідження повторювали тричі в різні дні. Визначали величину позаматричного нуклеотидного додатка ±А.

Дослідження показників інгібування реакції ампліфікації. Змоделювали процес інгібування реакції ампліфікації (Dombrovskyi, Povkh, Petrychuk, & Romanchuk, 2017). Аналітичні та біологічні дослідження повторювали тричі. Аналізуючи отримані результати, оцінювали повноту ДНК-профілів, висоту піків але- лів, гетерозиготний баланс алелів.

Дослідження деградованої ДНК. Підготували зразки деградованої ДНК (Dombrovskyi, Povkh, Petrychuk, & Romanchuk, 2017), провели з кожним із них реакції ампліфікації та фрагментний аналіз. Для оцінки ступеня деградації ДНК у кожній часовій точці оцінювали повноту ДНК-профілів при п'яти- та десятисекундних ін'єкціях. Аналітичні та біологічні дослідження повторювали тричі.

Визначення достовірності результатів дослідження з використанням стандартів ДНК NIST. Для аналізу використовували вісім компонентів стандартів ДНК NIST 2391b (№ 1, 2, 3, 4, 5, 7, GM09947A, GM09948) та чотири компоненти стандартів ДНК NIST 2391с (A, B, C, D). Кожний стандарт нормалізували до концентрації 0,1 нг/мкл. З кожним компонентом стандартів проводили реакції ампліфікації та фрагментний аналіз, тричі повторюючи ці дослідження. Достовірність отриманих результатів визначали, порівнюючи отримані дані зі значеннями у свідоцтвах проведення аналізу стандартів ДНК NIST 2391b та NIST 2391с (Certificate of Analysis Standard Reference Material® 2391b; 2391c).

Дослідження ДНК-сумішей за різних співвідношень концентрації ДНК із використанням стандартів ДНК NIST 2391с

Компоненти А, В, С стандартів ДНК NIST 2391с нормалізували до концентрації 0,1 нг/мкл, потім змішували, дотримуючись певного співвідношення (табл. 1).

Таблиця 1

Співвідношення компонентів стандартів ДНК NIST 2391с у сумішах