Патогенетические факторы развития и течения болезни крона и неспецифического язвенного колита у детей

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Патогенетические факторы развития и течения болезни крона и неспецифического язвенного колита у детей

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) до настоящего времени остаются одной из наиболее серьезных и нерешенных проблем в педиатрии и гастроэнтерологии. По тяжести течения, частоте осложнений, и летальности болезнь Крона (БК) и неспецифический язвенный колит (НЯК) занимают одно из ведущих мест в структуре болезней ЖКТ (Григорьева Г.А., Мешалкина Н.Ю., 2007).

В последние годы отмечается стремительный рост НЯК и, особенно, БК во всем мире, включая индустриально развитые страны, где тенденция роста наиболее высока. Характерной особенностью эпидемиологии ВЗК в последние десятилетия является увеличение распространенности данной патологии среди молодых людей (Dermot P.B., et al., 2005). По данным Turunen P., et al. (2006) заболеваемость БК и НЯК у детей и подростков в Финляндии за последнее десятилетие удвоилась. По данным Behrens R., et al. (1996) примерно у 1/3 пациентов первая манифестация ВЗК происходит до достижения ими 18 лет. Beattie R.M. et al. (2006) указывают, что 25% ВЗК манифестируют в детском возрасте. По данным Buller H., et al. (2002) распространённость этих заболеваний у детей в разных странах колеблется от 2,2 до 6,8 на 100000 населения. В Англии и Ирландии частота впервые выявленных ВЗК у детей составляет 5,2 на 100 тысяч (Sawczenko A., et al., 2001).

В Российской Федерации было проведено единственное эпидемиологическое исследование БК в 1997 г., согласно которому распространённость БК в Московской области равна 3,5 на 100 тысяч взрослого населения, заболеваемость БК 0,3 на 100 тысяч взрослого населения (Белоусова Е.А., 1997). Характерной особенностью эпидемиологии ВЗК в России является поздняя диагностика и преобладание тяжелых осложненных форм с высокой летальностью (в 3 раза выше, чем в большинстве стран). Эпидемиологических исследований ВЗК в детском возрасте в Российской Федерации не проводилось.

Этиология ВЗК до сих пор остается неизвестной. С современных позиций патогенез ВЗК рассматривают как взаимодействие генетической предрасположенности, нарушенной иммунной реактивности, в первую очередь на уровне слизистой оболочки кишечника, нарушенной барьерной функции кишки и повышенной чувствительности к воздействию факторов внешней среды, в том числе кишечной микрофлоре и специфическим антигенам (Kucharzik T., et al, 2006). Совокупность этих факторов приводит к патологической иммуно-воспалительной реакции в кишечнике с формированием и поддержанием хронического воспаления в пищеварительном тракте.

Генетическая предрасположенность подтверждается многими зарубежными исследованиями. Высокий, 15-кратный риск развития ВЗК отмечается у родственников первой степени родства (Bourma G., Strober W., 2003). Наиболее высокая конкордантность у монозиготных близнецов отмечается при БК и составляет 72%. Генетическую предрасположенность к ВЗК часто связывают с полиморфными вариантами генов NOD2/CARD15, DLG5, OCTN1, OCTN2, TLR4, TNFБ, IL-1RA и IL-10 (Tomer G., et al., 2003; Ferraris A., et al., 2006; Weersma RK, et al., 2008; Strober W, et al., 2008; Степанова Е.В., 2009). Однако степень влияния этих полиморфных вариантов генов у населения разных стран на развитие ВЗК и клинические проявления заболеваний имеют существенные отличия. Частота полиморфизмов генов в разных популяциях существенно различается (Hugot J.P., et al., 2001; Ogura Y., et al., 2001; Hampe J., et al., 2001).

Точные механизмы иммунопатогенеза БК и НЯК остаются до конца не известными. При обоих заболеваниях отмечается дисфункция эффекторных и регуляторных клеток, как приобретенного, так и врожденного звена иммунной системы, гиперпродукция медиаторов воспаления, что приводит «неконтролируемому воспалению» (Pallone F., et al.; Krajina T., et al. 2003). Однако связь этих процессов с активностью и клиническими проявлениями ВЗК требует уточнения.

С другой стороны, микрофлора кишечника является необходимым и, возможно, ключевым фактором в развитии ВЗК и их поддержании. Этот вывод был подтвержден результатами многочисленных экспериментальных и клинических исследований (Rath H.C., et al., 2001). У больных с ВЗК было выявлено, что кишечная микрофлора претерпевает большие изменения. Они включают в себя высокую сосредоточенность бактерий в мукозном слое, как в воспаленных, так и невоспаленных участках кишечника (Ahmad T., et al., 2002). Однако, имеющиеся данные недостаточны для понимания механизмов развития этих заболеваний и их клинических проявлений.

ВЗК характеризуются чрезвычайным разнообразием клинических проявлений, темпов прогрессирования и развития осложнений, особенно в детском возрасте. Это требует дифференцированных подходов в диагностике и подборе разной степени агрессивности проводимой терапии. Для обеспечения адекватной тактики ведения больных необходимы четкие диагностические и прогностические критерии, которые до настоящего времени отсутствуют.

Таким образом, научные исследования, изучающие патогенетические механизмы развития ВЗК, направленные на разработку информативных критериев диагностики и прогноза, крайне актуальны.

Цель исследования: Установить факторы прогноза развития и течения БК и НЯК у детей на основании комплексного изучения полиморфизма генов, показателей иммунного воспаления, пристеночной микрофлоры кишечника при разных клинических вариантах ВЗК для оптимизации диагностики, лечения и профилактики заболеваний.

Задачи исследования:

1. Изучить частоту полиморфных аллелей генов NOD2/CARD15 (G908R, R702W, c. 3020insC), DLG5 (R30Q), OCTN1 (L503F), OCTN2 (-207 G/C), TLR4 (D299G), IL-1RA (VNTR-пилиморфизм), TNFБ (-308 g/a), IL-10 (-1082 g/a) у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом, их ассоциацию с заболеваниями и разными клиническими вариантами течения и относительный риск развития.

2. Определить особенности иммунного воспалительного процесса у детей при разных вариантах течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита по результатам спонтанной и стимулированной продукции цитокинов в культуре цельной крови и изолированных моноцитов, экспрессии информационной РНК цитокинов и паттерн-распознающих рецепторов (TLR4, NOD2) в клетках крови и слизистой оболочки кишечника.

3. Изучить состав пристеночной микрофлоры и оценить значение отдельных ее представителей (группа B. fragilis, группа C. leptum, группа C.coccoides, род Bifidobacterium, род Lactobacillus, род Prevotella и кластер Atopobium) при разных вариантах течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

4. Исследовать характер взаимосвязей генетических, иммунных и микробиологических показателей в особенностях развития и течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

5. Определить диагностически значимые показатели генотипа, иммунного воспаления, пристеночной микрофлоры кишечника в развитии и течении болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

6. Разработать факторы прогноза развития, течения и эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите на основании показателей генотипа, иммунного воспаления и пристеночной микрофлоры кишечника.

Научная новизна:

Впервые проведено комплексное изучение генотипа, иммунного воспаления, пристеночной микрофлоры кишечника у детей при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите.

Впервые проведено исследование частоты полиморфных вариантов G908R, R702W, c. 3020insC гена NOD2/CARD15, R30Q гена DLG5, L503F гена OCTN1, -207 G/C гена OCTN2, D299G гена TLR4, VNTR-полиморфизм гена IL-1RA, -308 g/a гена TNFБ, -1082 g/a гена IL-10 у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом в Российской Федерации, изучены ассоциации генотипов с данными болезнями и рассчитан риск развития заболеваний.

Впервые показана роль полиморфных генотипов в развитии особенностей течения и прогрессирования заболеваний, выявлены факторы прогноза развития для каждой нозологической формы.

Установлены особенности иммунного воспаления в зависимости от клинических форм, локализации процесса и течения у детей с воспалительными заболеваниями кишечника.

Показана роль пристеночной микрофлоры кишечника, особенности состава и значение отдельных ее представителей при течении разных клинических форм болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

Впервые изучены взаимосвязи генотипа, иммунной реакции и пристеночной микрофлоры кишечника при различных клинических вариантах болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей. Выявлены особенности иммуно-воспалительной реакции у детей с различными вариантами полиморфного генотипа.

Выявлены генетические маркеры прогноза эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей.

Практическая значимость:

Выявленные особенности генотипа, иммунного воспаления и пристеночной микрофлоры кишечника способствуют ранней диагностики, прогнозированию активности, течения и эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей.

Показано, что прогноз течения и исхода болезни Крона и неспецифического язвенного колита должен строиться на комплексной оценке особенностей генотипа, иммунного воспаления и пристеночной микрофлоры кишечника.

Наиболее диагностически значимыми при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей являются: исследование полиморфных вариантов G908R, R702W, c. 3020insC гена NOD2/CARD15, R30Q гена DLG5, L503F гена OCTN1, -207 G/C гена OCTN2, D299G гена TLR4, VNTR-полиморфизм гена IL-1RA, -308 g/a гена TNFБ, определение популяционного уровня Lactobacillus и Bifidobacterium в биоптатах слизистой оболочки кишечника и уровня IgG-антител к лактобациллам и бифидобактериям, так как позволяют информативно оценить активность и построить прогноз течения заболеваний и эффективности терапии.

Показано, что оценка иммунного воспаления должна базироваться на комплексном исследовании уровня цитокинов в нативной сыворотке, их спонтанной и стимулированной продукции в культуре крови и экспрессии их генов в крови и тканях, так как исследование только сывороточного уровня не отражает истинного характера иммуно-воспалительной реакции.

На основании проведенного исследования выявлены факторы прогноза развития, течения и эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей.

Внедрение результатов работы. Основные результаты исследования внедрены в клиническую практику гастроэнтерологических отделений Российской детской клинической больницы, детской городской клинической больницы №13 имени Н.Ф. Филатова г. Москвы, отделения гастроэнтерологии НЦЗД РАМН.

Основные научные положения и выводы внедрены в педагогический процесс курса гастроэнтерологии и диетологии ФУВ кафедры госпитальной педиатрии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», кафедры поликлинической педиатрии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Результаты исследования использованы при подготовке методических рекомендаций «Воспалительные заболевания кишечника у детей: болезнь Крона и неспецифический язвенный колит», утверждённые Министерством здравоохранения Республики Бурятия.

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены на совместной научно-практической конференции кафедры детских болезней №2 педиатрического факультета РГМУ, сотрудников отделов ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России, отдела гастроэнтерологии с гепатологичсекой группой НЦЗД РАМН, Российской детской клинической больницы и детской городской клинической больницы №13 им. Н.Ф. Филатова г. Москвы; «Четырнадцатой Российской Гастроэнтерологической Неделе» (Москва, 2008); VII Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2008); XV, XVI Конгрессах детских гастроэнтерологов России и стран СНГ» (Москва, 2008, 2009); Первом Объединенном научно-практическом форуме детских врачей (Орел, 2008); XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009); 11-ом Международном Славяно-балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2009» Санкт-Петербург, 2009); 2-ом международном конгрессе по пробиотикам «Санкт-Петербург - Пробиотики-2009» (Санкт-Петербург, 2009); III Всероссийской научно-практической конференции детских диетологов (Москва, 2009); 11 Международном медицинском форуме «Современные медицинские технологии на службе охраны здоровья россиян» (Нижний Новгород, 2010); VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на Дону, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ, из них 11 статей опубликовано в журналах, рецензируемых ВАК.

Объём и структура диссертационной работы: диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, четырех глав материалов собственного исследования, главы обсуждения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы, содержащего ___ источников (___ отечественной и ____ зарубежной литературы). Работа проиллюстрирована ___ таблицами и ___ рисунками.

Содержание работы

иммунный крон язвенный колит

Материалы и методы исследований

Работа проводилась в период 2006-2010 годов на базе отделений гастроэнтерологии Российской детской клинической больницы, Научного центра здоровья детей РАМН, Государственного научного центра колопроктологии Росмедтехнологий, ДГКБ №13 им. Н.Ф. Филатова г. Москвы и инфекционного отделения №2 ДГКБ №9 им. Г.Н. Сперанского г. Москвы.

Молекулярно-генетическое исследование проводилось на базе лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН, иммунологические исследования - на базе отдела молекулярной гематологии, онкологии и иммунологии ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России, микробиологические - на базе кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО Российского государственного медицинского университета Росздрава и лаборатории иммунохимической диагностики ФГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Всего было обследовано 216 пациентов с ВЗК и 209 человек контрольной группы. Среди пациентов с ВЗК у 97 (44,9%) больных была диагностирована БК и у 119 (55,1%) детей - НЯК.

Диагноз ВЗК основывался на основании оценки жалоб, данных анамнеза заболевания, клинического осмотра и данных лабораторных инструментальных исследований. В обязательном порядке диагноз БК и НЯК верифицировался морфологически. В соответствии с Монреальской классификацией (2005) все пациенты с БК были определены в подгруппы с учетом возраста к моменту установления диагноза, локализации процесса, характера течения заболевания. Для оценки клинической активности при БК использовался педиатрический индекс активности, у пациентов с неспецифическим язвенным колитом был использован клинический индекс активности Rachmilewitz.

Молекулярно-генетические исследования включало исследование образцов ДНК 88 не родственных пациентов с БК и 101 - с НЯК, а также 126 человек из группы популяционного контроля. Оценивалось наличие полиморфных аллелей генов NOD2/CARD15 (G908R, R702W, c. 3020insC), DLG5 (R30Q), OCTN1 (L503F), OCTN2 (-207 G/C), TLR4 (D299G), IL-1RA (VNTR-пилиморфизм), TNFБ (-308 g/a), IL-10 (-1082 g/a) Образцы ДНК выделены из цельной крови, забор 1 мл крови проводился одновременно с забором крови для планового биохимического исследования из локтевой вены. Генетическое исследование включало следующие этапы: выделение геномной ДНК, мультиплексную лигазную реакцию, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ), анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ-анализ), электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).

Иммунологические исследования включало определение уровня TNF-б, TNF-в, IFN-г, IL-2, IL-10, IL-8, IL-6, IL-4, IL-5, IL-1b, IL-12p70 с использованием цитометрического метода в нативной сыворотке и в четырех образцах культуры цельной крови и изолированных моноцитов, прошедших стимуляцию белками бактериальных оболочек: LPS (липополисахарид), MDP (мурамилдипептид) и комбинации LPS и MDP. Исследование проведено с помощью цитометра BDFaxCantoFlowCytomix (США) и набора антител к цитокинам BMS810FF (Bender MedSistem GmbH Viena Austria). Выделение моноцитов проводилось методом иммуномагнитной сепарации (Dynabeads MyPure Monocyte Kit 2 for Untouched human cells, Invitrogen Осло, Норвегия).

Изучение уровня экспрессии мРНК IL-12p70, IL-1-b, 2,4,5,6,8,10, TNF-б, TNF-в, IFN-г, NOD2 и TLR4 проводилось в крови и в биоптатах слизистой оболочки сигмовидной кишки у детей с ВЗК и условно здоровых детей. Забор материала для исследования проводился в пластиковую микропробирку, содержащую фиксатор RNA-Later (Ambion, Texas, USA). Выделялась РНК из архивных образцов с использованием набора «Рибо-Сорб» (АмплиСенс, Россия, Москва) ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора в соответствии с методикой производителя. Постановка реакции обратной транскрипции осуществлялась в соответствии с методикой производителя. ПЦР проводили в автоматическом режиме, используя амплификатор Dyad. Постановку реакции ПЦР в режиме реального времени осуществляли с использованием праймеров синтезированых ЗАО «Синтол» (Россия). Детекция флуоресценции в пробирках в режиме реального времени производилась с использованием двух каналов. Канал Orange использовался для детекции флюоресценции внутреннего контроля (GAPDH-ген), длина волны - возбуждение 585 нм, эмиссия 610 нм. Канал Yellow-возбуждение 470 нм, эмиссия 510 нм.

Изучение представителей пристеночной микрофлоры (группа Clostridium coccoides, группа Clostridium leptum, группа Bacteroides fragilis, род Bifidobacterium, род Lactobacillus, род Prevotella, и кластер Atopobium) проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с помощью группоспецифических праймеров. Выделение ДНК из образцов проводилось по методу Boom с использованием набора ZR Genomic DNA Tissue MiniPrep (ZYMO RESEARCH) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Постановку реакции ПЦР в режиме реального времени осуществляли с использование готовых 2,5Х ПЦР-смесей («Синтол») в приборе АНК-32 («Синтол»). Флуоресценция в пробирках детектировалась в режиме реального времени на канале FAM (возбуждение 492 нм, эммиссия 520 нм). Значения пороговых циклов определялись автоматически прибором.

Антитела класса IgG к бифидобактериям и лактобациллам определяли с помощью иммуноферментного анализа. Учет результатов на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Оптическую плотность растворов в каждой ячейке измеряли с помощью многоканального автоматического горизонтального фотометра «Titertech MultiscanМС» фирмы «Flow Laboratories» (Англия).

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ BIOSTAT и STATISTICA 6.0. В обработку результатов входил анализ распределения признаков и их числовые характеристики. В случае, если выборка подчинялась закону нормального распределения, для анализа использовались критерии параметрической статистики с вычислением средней и стандартного отклонения, при сравнении признаков применялся T-тест. В случаях ненормального распределения, в анализе полученных результатов использовались критерии непараметрической статистики с вычислением медианы и 25%-ой и 75%-ой перцентилей. При сравнении двух независимых признаков использовался критерий Манна-Уитни, а при сравнении зависимых признаков - парный критерий Уилкоксона. Для сравнения долей использовался критерий углового преобразования Фишера. При сравнении однородных величин различия считались достоверными при p<0,05. В целях выявления характера взаимодействия между показателями, характеризующими изменение в организме ребёнка, анализировалась линейная корреляция Пирсона (R) или ранговая корреляция Спирмена (R_s). Корреляционная связь при коэффициенте корреляции до 0,5 расценивалась как низкая, 0,5-0,7 - умеренная, 0,7-0,9 - сильная. Также проводился расчет рисков с определением соотношение шансов (OR, Odds Ratio) и относительного риска (RR, Risk Ratio). Значение этих показателей считались значимыми, если их 95% доверительный интервал не включал в себя единицу.

Характеристика исследуемых групп.

Нами было обследовано 216 пациентов с ВЗК в возрасте от 2 месяцев до 33 лет, средний возраст составил 13,2±3,97 лет. Длительность заболевания варьировала от 1 месяца до 16,3 лет и в среднем составила 3,9 ± 0,5 года. Среди больных с ВЗК пациенты мужского пола составили 55,5% (120 пациентов), женского пола - 44,4% (96 пациента). Среди больных ВЗК у 97 (44,9%) больных была диагностирована БК и у 119 (55,1%) детей - НЯК.

Группу пациентов с БК (n-97) составили дети (75,3%) в возрасте от 2 месяцев до 17 лет 2 месяцев и взрослые больные (24,7%) в возрасте от 18 до 33 лет, заболевание у которых манифестировало в детстве. Средней возраст группы составил 15,90,72 лет. Длительность БК в среднем составила 6,7±1,2 года. Распределение пациентов с БК по полу: мужского пола 59 человек (60,8%) и женского пола 38 (39,2%). Группу больных с НЯК (n-119) составили дети в возрасте от 1,5 лет до 17 лет 10 мес. Средний возраст пациентов с НЯК равен 10,8 ± 0,9. Длительность заболевания 3,2±0,7 года. Распределение больных с НЯК по полу: мужского пола 60 детей (50,4%) и женского пола 59 детей (49,6%). Распределение пациентов с ВЗК по возрасту на момент проведения исследования представлено в таблице 1.

Таблица 1. Распределение пациентов с ВЗК по возрасту

Контрольную группу составило 209 человек. Для различных исследований использовались разные контрольные группы. При генетических исследованиях в качестве группы сравнения использовался популяционный контроль, который был представлен образцами ДНК (n-126) людей из банка ДНК лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН, из них лица мужского пола составили 56,6%, женского пола - 46,4%. Средний возраст в этой группе составил 30,7±22,4 года. Для иммунологических исследований контрольную группу составили 59 соматически здоровых детей, госпитализированных для проведения планового хирургического лечения по поводу неосложненных форм крипторхизма и пупочной грыжи. Забор крови у них проводился в предоперационном периоде. Средний возраст этой группы 9,6 ±1,7 лет, 56,1% оставляли мальчики и 43,1% - девочки. Для микробиологических исследований контрольную группу составили 24 условно здоровых детей. Средний возраст этой группы 11,8 ±1,1 лет, 52,4% оставляли мальчики и 47,6% - девочки.

Манифестация ВЗК происходила во все возрастные периоды от 2 месяцев до 17 лет. Средний возраст манифестации ВЗК в исследуемой группе составил 9,31±0,8 лет, в том числе при БК 11,5±1,1 лет, при НЯК - 7,4±0,9 лет. Распределение больных БК и НЯК по возрасту манифестации представлено в таблице 2.

Таблица 2. Возраст манифестации заболевания при БК и НЯК

В группе пациентов с БК преобладали больные с илеоколитом (44%), изолированный илеит отмечался у 29%, изолированный колит - у 18%, поражение верхних отделов ЖКТ - у 9%. Среди больных с БК клиническая ремиссия отмечалась у 9%, высокая клиническая активность - у 27%, умеренная клиническая активность - у 32%, низкая - у 32%. Эндоскопическая ремиссия выявлялась у 5%, высокая активность - у 18%, умеренная - у 32%, низкая - у 45%. Самым частым вариантом течения БК у исследуемых пациентов было воспалительное (нестенозирующее непенетрирующее) - у 86,4%, стенозирующее - у 13,6%, пенетрирующее - у 9,1%, у одного ребенка отмечались и стенозы, и свищий. Перианальное проажение было выявлено у 13,6% больных. Внекишечные проявления отмечались у 54,5% пациентов с БК. Самыми частыми внекишечными проявлениями были суставной синдром (31,8%), патология печени (13,6%), поражение кожи и слизистых (9,1%). Снижение минеральной плотности костных тканей отмечено у 27% больных с БК.

В группе детей с НЯК преобладали пациенты с тотальным колитом (63%), левосторонний колит был отмечен у 5,2%, проктосигмоидит - у 21,3%, проктит - у 10,5%. Среди больных с НЯК клиническая ремиссия отмечалась у 36%, высокая клиническая активность - у 20%, умеренная клиническая активность - у 18%, низкая - у 26%. Эндоскопическая ремиссия выявлялась у 10%, высокая активность - у 18%, умеренная - у 26%, низкая - у 46%. Внекишечные проявления отмечались у 28,2% детей с НЯК. Самыми частыми внекишечными проявлениями были патология печени (12,8%), суставной синдром (10,3%), поражение кожи и слизистых (7,69%). Снижение минеральной плотности костных тканей отмечено у 19% детей с НЯК.

Результаты исследования и их обсуждение

В нашем исследовании с целью изучения частоты встречаемости полиморфных вариантов (ПВ) генов NOD2/CARD15 (G908R, R702W, c. 3020insC), DLG5 (R30Q), OCTN1 (L503F), OCTN2 (-207 G/C), TLR4 (D299G), IL-1RA (VNTR-полиморфизм), TNFБ (-308 g/a), IL-10 (-1082 g/a) у детей с БК и НЯК мы обследовали 196 пациентов с ВЗК, из них 88 пациентов с БК и 108 детей с НЯК. Среди обследованных больных у 180 человек (92,3%) выявлен тот или иной ПВ исследуемых генов. Только у 15 пациентов (7,7%) не были выявлены полиморфные варианты генотипов. Среди пациентов с диким вариантом генотипа у 4 человек был установлен диагноз БК (4,54% от всех больных с БК), а у 11 человек - НЯК (10,2% от всех больных с НЯК).

Полиморфный вариант G908R гена NOD2/CARD15 (табл. 3) обнаружен только у 5 (5,68%) больных с БК и у 6 (5,55%) больных с НЯК. Данный полиморфизм выявлялся только в гетерозиготном состоянии, как у больных с ВЗК, так и в популяционном контроле. Аллельная частота G908R гена NOD2/CARD15 при БК составила 2,84%, а при НЯК - 2,78%. В контрольной группе аллельная частота равна 1,98%. Частоты аллелей G908R при БК и НЯК в исследуемых и контрольной выборках не имеют статистически значимые отличия (р>0,05), что не подтверждает ассоциация наличия полиморфных аллелей G908R гена NOD2 с БК и НЯК.

Таблица 3. Частота полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 у детей с ВЗК

Полиморфный вариант R702W гена NOD2/CARD15 обнаружен у 13 (14,8%) больных с БК, у 11 больных (12,5%) в гетерозиготном, а у 2 (2,27%) - гомозиготном состоянии. При НЯК ПВ R702W гена NOD2/CARD15 был обнаружен у 8 больных (7,41%) и только в гетерозиготном состоянии. Аллельная частота R702W у пациентов с БК составила 8,52%, при НЯК - 3,7%. В контрольной выборке аллельная частота равна 3,17%. Статистически значимые отличия в частоте полиморфизма R702W с популяционным контролем были выявлены только у пациентов с БК (p<0,05), что свидетельствует об ассоциации полиморфизма R702W с БК. У больных с НЯК статистически значимых отличий частоты полиморфной аллели R702W выявлено не было и ассоциации не выявлено.

При исследовании относительного риска развития БК в зависимости от наличия полиморфного генотипа NOD2/CARD15 было установлено, что наличие у пациента полиморфного варианта аллели R702W достоверно (p<0,05) повышает риск БК в 2,84 раза.

Полиморфный вариант c. 3020insC гена NOD2/CARD15 выявлен у 22 пациентов с болезнью Крона (25%), в том числе в гомозиготном состоянии у 4 (4,54%) больных, в гетерозиготном состоянии у 18 (20,4%) больных. При НЯК данный полиморфизм был у 6 больных (5,55%), их них у 4 (3,7%) в гетерозиготном, а у 2 (1,85%) - в гомозиготном состоянии. Аллельная частота c. 3020insC гена NOD2/CARD15 среди больных БК составила 14,8%, при НЯК - 3,7%. Гомозиготы по c. 3020insC выявлены только среди больных и отсутствуют в контрольной группе. Аллельная частота в группе популяционного контроля составила 5,95%. Нами выявлены статистически значимые отличия (p<0,01) в частоте встречаемости полиморфизма c. 3020insC между контрольной и исследуемыми выборками только при БК, что свидетельствует об ассоциации полиморфизма c. 3020insC с БК. Ассоциации аллели c. 3020 insC с НЯК не выявлено. Относительного риска развития БК при наличии аллели c. 3020insC гена NOD2/CARD15 достоверно (p<0,05) повышается в 2,74 раза.

Оценка значения гомозиготного полиморфного генотипа NOD2/CARD15 в исследуемых группах не представляется возможной из-за отсутствия такого генотипа в контрольной выборке.

Полиморфный вариант R30Q гена DLG5 (табл. 4) выявлен в гетерозиготном состоянии у 16 (19,7%) пациентов с БК и у 14 (13%) больных с НЯК. Аллельная частота R30Q гена DLG5 у пациентов с БК составила 9,88%, при НЯК - 6,48%. Аллельная частота R30Q в популяционном контроле составила 8,33%. Частоты встречаемости R30Q между исследуемой и контрольной группой не имеют статистически значимых отличий (p>0,05), и ассоциация полиморфного варианта 30Q гена DLG5 не подтверждена ни с БК, ни с НЯК.

Таблица 4. Частота полиморфных вариантов генов DLG5, OCTN1, OCTN2 у детей с ВЗК

Полиморфный вариант L503F гена OCTN1 выявлен у 48 пациентов с болезнью Крона (59,3%), в том числе в гомозиготном состоянии у 11 (13,6%) больных, в гетерозиготном состоянии у 37 (45,7%) больных. При НЯК данный полиморфизм был у 68 больных (63%), их них у 20 (18,5%) - в гомозиготном состоянии. Аллельная частота L503F гена OCTN1 при БК составила 36,4%, при НЯК - 40,7%. В контрольной выборке полиморфный вариант L503F выявлен у 55 из 126 человек (43,6%), из них у 12 человек (9,5%) в гомозиготном состоянии, и аллельная частота 503F составила 25,6%. Статистически значимые отличия (p<0,05) в частоте данного ПВ выявлены между больными с БК и контрольной выборкой, а также между больными с НЯК и контролем (p<0,01). Это свидетельствует об ассоциации полиморфизма L503F гена OCTN1, как с БК, так и НЯК. Относительного риска БК при наличии полиморфизма L503F гена OCTN1 достоверно (p<0,05) повышается в 1,58 раза, а риск развития НЯК возрастает в 1,9 раза (p<0,05).

При анализе роли гомозиготного полиморфного генотипа L503F гена OCTN1 статистически значимая ассоциация (p<0,05) выявлена только у больных НЯК. Риск развития НЯК при таком генотипе возрастает до 2,16 раза (OR=2,16, 95%-ДИ 1,10-4,65, p<0,05).

Полиморфизм -207 G/C гена OCTN2 он был выявлен у 52 пациентов с болезнью Крона (64,2%), в том числе в гомозиготном состоянии у 16 (19,6%) больных. При НЯК данный ПВ был у 63 больных (58,3%), из них у 46 (42,6%) в гетерозиготном, а у 17 (15,7%) - в гомозиготном состоянии. Аллельная частота -207 G/C гена OCTN2 при БК составила 42%, при НЯК - 37%. Аллельная частота 207С в группе популяционного контроля составила 31%. Статистически значимые отличия (p<0,05) в частоте встречаемости полиморфизма -207 G/C гена OCTN2 были выявлены только между больными с БК и контрольной выборкой. При НЯК ассоциация с аллелью -207 G/C гена OCTN2 не выявлено. При анализе гомозиготного полиморфного генотипа -207 G/C гена OCTN2 статистически значимой ассоциации не было выявлено ни при БК, ни при НЯК.

При оценке относительного риска развития исследуемых заболеваний в зависимости от наличия полиморфизма -207 G/C гена OCTN2 было установлено, что наличие у пациента полиморфной аллели достоверно (p<0,05) повышает риск БК в 1,61 раза.

Полиморфный вариант D299G гена TLR4 (табл. 5) выявлен у 13 (16%) пациентов с БК, в том числе в гомозиготном состоянии у трех (3,7%) больных, в гетерозиготном состоянии у 10 (12,4%) больных. При НЯК данная полиморфная аллель выявлена у 15 (13,9%) больных, из них у 2 (1,85%) в гомозиготном и у 13 (12%) - в гетерозигоном состоянии. Аллельная частота D299G гена TLR4 среди больных с БК составила 9,88%, при НЯК - 7,87%. В контрольной выборке полиморфные аллели D299G выявлены у 30 человек (23,8%), в трех случаях (2,38%) выявлен в гомозиготном состоянии. Аллельная частота D299G в группе популяционного контроля составила 13,1%. По данным нашего исследования аллельная частота D299G при БК и при НЯК ниже, чем в контрольной выборке, и различия в аллельной частоте между исследуемыми и контрольной выборкой статистически незначимы (р>0,05), ассоциация полиморфного варианта D299G гена TLR4 с БК и НЯК не доказана. При анализе гомозиготного полиморфного генотипа также не выявлена статистически значимая ассоциация ни при БК, ни при НЯК

Таблица 5. Частота полиморфных вариантов генов TLR4, TNFБ, IL-10 у детей с ВЗК

Полиморфный вариант -308 g/a гена TNFБ выявлен у 16 (19,7%) пациентов с БК, из них у 14 (17,3%) пациентов в гетерозиготном, а у 2 (2,47%) - в гомозиготном состоянии. При НЯК данный полиморфизм был выявлен у 20 (18,5%) больных, и только в гетерозиготном состоянии. Аллельная частота -308a гена TNFБ при БК составила 11,1%, при НЯК - 9,26%, а в популяционном контроле - 8,33%. Частоты встречаемости -308 g/a гена TNFБ между исследуемыми и контрольной выборками не имеют статистически значимых отличий (p>0,05), и ассоциация полиморфного варианта -308 g/a гена TNFБ не подтверждена ни с БК, ни с НЯК.

Полиморфный вариант -1082 g/a гена IL-10 выявлен у 2 (2,47%) пациентов с БК и у 2 (1,85%) больных с НЯК, и только в гетерозиготном состоянии. Аллельная частота -1082 g/a гена IL-10 при БК составила 1,23%, при НЯК - 0,9%. В контрольной группе полиморфный вариант -1082 g/a гена IL-10 обнаружен только у 1 из 126 человек, и его аллельная частота составила 0,4%. Статистически значимых отличий и ассоциация не выявлено ни при БК, ни при НЯК.

Таблица 6. Частота полиморфизма VNTR-полиморфизм гена IL-1RA у детей с ВЗК

При исследовании тандемных вариабельных повторов (variable number of tandem repeats, VNTR) в интронной зоне 2 гена IL-1RA у детей исследуемых групп было выявлено несколько вариантов полиморфных аллелей: с длиной фрагмента 230, с длиной фрагмента 488 и с длиной фрагмента 574, частота которых в исследуемых выборках представлена в таблице 6. При БК VNTR-полиморфизм гена IL-1RA были выявлены у 45 пациентов (56,2%), в том числе в гомозиготном состоянии у 9 (11,2%) больных. При НЯК данный вид полиморфизма был у 48 больных (44,4%), из них у 8 (7,41%) - в гомозиготном состоянии. Наиболее частыми были полиморфные аллели с длиной фрагмента 230 и с длиной фрагмента 488, они встречались во всех исследуемых выборках. Полиморфная аллель с длиной фрагмента 574 выявлена только у больных с БК. Аллельная частота VNTR гена IL-1RA с длиной фрагмента 230 при БК составила 28,1%, при НЯК - 24,5%, что было ниже чем в контрольной выборке, где частота этой полиморфной аллели составила 29,8%. Статистически значимых отличий в частоте встречаемости VNTR-полиморфизма гена IL-1RA между исследуемыми и контрольной выборками, а, следовательно, и его ассоциации с БК или НЯК не выявлено. Полиморфный вариант гена IL-1RA с длиной фрагмента 488 также встречался во всех выборках. Его аллельная частота при БК составила 3,74%, при НЯК - 1,39%, а в контрольной выборке - 0,8%. Статистически значимые отличия (p<0,05) в частоте встречаемости данного полиморфизма гена IL-1RA были выявлены только между больными с БК и контрольной выборками. Следовательно, и ассоциация VNTR-полиморфизма гена IL-1RA с длиной фрагмента 488 выявлена только с развитием БК. Однако исследование относительного риска развития БК в зависимости от данной аллели гена IL-1RA не дало статистически значимых результатов.

При исследовании влияния сочетания различных генотипов на риск развитие БК и НЯК у детей было установлено, что сочетание трех полиморфизмов гена NOD2/CARD15 в одном генотипе не было выявлено ни у одного человека, ни в одной из исследуемых выборок. Сочетание двух полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 было выявлено у 8 пациентов (9,1%) с БК и у одного (0,9%) больного с НЯК (табл. 7). Это вариант генотипа статистически значимо (p<0,01) ассоциирован с БК и повышает риск ее развития в 12,5 раза (p<0,05). Ассоциации этого генотипа с НЯК не выявлено.

Сочетание в одном генотипе полиморфных вариантов генов OCTN1 и OCTN2 значительно повышают риск развитие ВЗК. Такое сочетание выявлено у 48,1% больных БК и у 49,1% пациентов с НЯК, и статистически значимо (p<0,01) ассоциировано с развитием, как БК, так и НЯК. Риск развития БК при сочетании в одном генотипе полиморфных вариантов L503F гена OCTN1 и -207 G/C гена OCTN2 повышается в 2,23 раза (p<0,05), а НЯК - в 2,32 раза (p<0,05).

С генотипом, включающим в себя один из полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 и L503F гена OCTN1, выявлена статистически значимая (p<0,01) ассоциация только БК, и риск развития заболевания при таком генотипе составляет 2,23 (p<0,05). Подобная картина отмечается и при сочетании в одном генотипе полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 и -207 G/C гена OCTN2. С ним так же статистически значимо (p<0,01) ассоциировано развитие БК, и риск развития составляет 2,66 (p<0,05).

В случае сочетания в одном генотипе трех полиморфных вариантом (ПВ гена NOD2/CARD15, L503F гена OCTN1 и -207 G/C гена OCTN2) выявлена значимая ассоциация, как с развитием БК (p<0,01), так и развитием НЯК (p<0,05) у детей. Риск развития БК при таком генотипе увеличивается в 5,5 раза (p<0,05). Значение риска развития НЯК в этом случае статистически не значим (p>0,05), так как включает 1,00 в свой доверительный интервал.

Таблица 7. Относительный риск развития болезни Крона и НЯК при сочетании полиморфных генотипов

При сочетании в одном генотипе полиморфного варианта гена NOD2/CARD15 и R30Q гена DLG5 была выявлена статистически значимая (p<0,05) ассоциация только с развитием БК у детей. Однако значения риска не были статистически значимыми (p>0,05).

При сочетании в одном генотипе полиморфных вариантов L503F гена OCTN1 и R30Q гена DLG5 также была выявлена достоверная (p<0,05) ассоциация с БК у детей, однако риск развития не был статистически значимым (p>0,05). В случае сочетания в одном генотипе полиморфных вариантов L503F гена OCTN1, -207 G/C гена OCTN2 и R30Q гена DLG5 помимо ассоциации с развитием БК (p<0,05), также отмечалось повышение риска развития БК у детей в 3,14 раза (p<0,05).

При сочетании в одном генотипе VNTR-полиморфизма гена IL-1RA и L503F гена OCTN1 было выявлено наличие достоверных ассоциаций данного генотипа с развитием БК (p<0,01) и НЯК (p<0,05). Риск развития БК у детей с таким генотипом возрастал в 2,69 раза (p<0,05), а НЯК - в 1,97 раза (p<0,05). В случае сочетания в одном генотипе VNTR-полиморфизма гена IL-1RA и L503F гена OCTN1 и -207 G/C гена OCTN2 также была выявлена статистически значимая ассоциация с БК (p<0,05) и НЯК (p<0,05), однако достоверное (p<0,05) повышение риска развития заболевания было выявлено только у пациентов с БК. Риск развития БК при таком варианте полиморфного генотипа повышается в 2,14 раза (p<0,05).

При сочетании в одном генотипе других полиморфных вариантов исследуемых генов не было выявлено статистически значимых ассоциаций с БК и НЯК и повышение риска развития данных заболеваний у детей.

При анализе влияния полиморфного генотипа на манифестацию и клиническое течение болезни Крона у детей было установлено, что полиморфный вариант R702W гена NOD2/CARD15 ассоциирован с манифестацией БК в пубертатном периоде, в возрасте старше 11 лет (p<0,05), относительный риск заболевания в этом возрасте при наличии данного генотипа составляет 2,84 (95% ДИ 0,67-12,2; p>0,05), однако он не является статистически значимым. С манифестацией БК в возрасте 4 - 6 лет ассоциирован полиморфный вариант R30Q гена DLG5 (p<0,05), и относительный риск манифестации заболевания в этот возрастной период составляет 2,85 (95% ДИ 1,11-7,29; p<0,05). С возрастом манифестации БК на 1 году жизни ассоциирован полиморфный вариант L503F гена OCTN1 (p<0,05), при наличии данной полиморфной аллели риск развития заболеваний уменьшается в 0,29 раза, однако относительный риск статистически не значим (95% ДИ 0,05-1,67; p>0,05).

При оценке влияния полиморфного генотипа на преимущественную локализацию патологического процесса при БК у детей было выявлено, что с носительством полиморфной аллели c. 3020insC гена NOD2/CARD15 ассоциировано развитие изолированного илеита (p<0,01). Риск развития илеита при данном варианте полиморфного генотипа у детей с БК возрастает в 2,2 раза (95% ДИ 1,18-4,08; p<0,05). Изолированный колит у детей с БК ассоциирован с ПВ R702W гена NOD2/CARD15 (p<0,01), а относительный риск возрастает в 5,81 раза (95% ДИ 2,15-15,7; p<0,05). Также с изолированным поражением толстой кишки у детей с БК были выявлены ассоциации c. 3020 insC гена NOD2/CARD15 (p<0,05) и VNTR-полиморфизма гена IL-1RA (p<0,05), при наличии данных генотипов риск развития изолированных колитов снижался в 0,32 и 0,58 раза соответственно, однако данные показатели относительного риска не были статистически значимыми (RR=0,32 95% ДИ 0,08-1,24 и RR=0,58 95% ДИ 0,29-1,18 соответственно; p>0,05). С поражением верхних отделов ЖКТ выявлена ассоциация с ПВ c. 3020insC гена NOD2/CARD15 (p<0,05) и D299G гена TLR4 (p<0,05). У носителей полиморфной аллели c. 3020insC гена NOD2/CARD15 риск поражения верхних отделов ЖКТ снижался в 0,32 раза, однако данный показатель статистически не значимым (95% ДИ 0,08-1,24; p>0,05). При наличии ПВ D299G гена TLR4 риск развития поражения верхних отделов ЖКТ повышался в 2,33 раза, но относительный риск также не был статистически значимым (95% ДИ 0,98-5,51; p>0,05).

С прианальным поражением у детей с БК были выявлены ассоциации с ПВ R702W гена NOD2/CARD15 (p<0,01), L503F гена OCTN1 (p<0,01) и -308 g/a гена TNFБ (p<0,05). При наличии в генотипе детей с БК полиморфной аллели R702W гена NOD2/CARD15 риск перианального поражения возрастает в 7,14 раза (95% ДИ 2,13-23,9; p<0,05). Полиморфная аллель L503F гена OCTN1 снижает риск перианального поражения при БК в 0,66 раза (95% ДИ 0,44-0,98; p<0,05). При ассоциации течения БК у детей с аллелью -308 g/a гена TNFБ риск перианального поражения также снижается в 0,43 раза, однако показатель статистически не значим (95% ДИ 0,14-1,36; p>0,05).

При анализе влияния генотипа на характер течения БК у детей было установлено, что стенозирующее течение ассоциировано с полиморфной аллелью c. 3020insC гена NOD2/CARD15 (p<0,01), и риск стенозов составляет в 7,14 раза (95% ДИ 2,13-23,9; p<0,05). Пенетрирующее течение БК ассоциировано с 3 полиморфными аллелями: R702W гена NOD2/CARD15 (p<0,05), L503F гена OCTN1 (p<0,05) и D299G гена TLR4 (p<0,05). Риск развития кишечных свищей у детей с БК при ПВ R702W гена NOD2/CARD15 повышался в 2,81 раза (95% ДИ 1,14-6,96; p<0,05). Полиморфные генотипы с аллелями L503F гена OCTN1 и D299G гена TLR4 снижали риск развития свищей у детей с БК в 0,74 (95% ДИ 0,51-1,08) и 0,21 (95% ДИ 0,03-1,49) раза соответственно, но показатели относительного риска не были статистически значимыми (p<0,05).

При оценке взаимосвязи полиморфизма изучаемых генов с наличием внекишечных проявлений у детей с БК нами не было выявлено ассоциаций генотипа, как с общим наличием внекишечных проявлений, так и отдельными их формами.

При анализе влияния генотипа на манифестацию и клиническое течение болезни НЯК у детей не было установлено ассоциаций полиморфных вариантов изучаемых генов с манифестацией НЯК у детей в определенном возрастном периоде.

При оценке влияния полиморфного генотипа на преимущественную локализацию патологического процесса при НЯК у детей было выявлено, что развитие тотального колита ассоциировано с носительством ПВ L503F гена OCTN1 (p<0,05) и D299G гена TLR4 (p<0,05). Риск развития тотального колита при НЯК при носительстве аллели L503F гена OCTN1 снижался в 0,79 раза (95% ДИ 0,63-0,92; p<0,05), а при носительстве аллели D299G гена TLR4 - риск снижался в 0,43 раза, однако данный показатель не был статистически значимым (95% ДИ 0,18-1,48; p>0,05). С проктосигмоидитом у детей с НЯК ассоциирован ПВ L503F гена OCTN1 (p<0,05), риск в данном случае возрастал в 1,31 (95% ДИ 1,03-1,67) раза (p<0,05). Также ассоциация с проктосигмоидитом была вывалена у носителей полиморфной аллели D299G гена TLR4 (p<0,05), риск развития в этом случае возрастал в 3,11 раза (95% ДИ 1,30-7,41; p<0,05).

Перианальное поражение при НЯК было ассоциировано с ПВ G908R (p<0,05) и R702W (p<0,05) гена NOD2/CARD15, а также -308 g/a гена TNFБ (p<0,05). При носительстве аллели G908R риск развития перианального поражения возрастает в 8,5 (95% ДИ 1,93-37,5; p<0,05), при носительстве R702W гена NOD2/CARD15 - в 4,9 раза (95% ДИ 0,44-0,98; p<0,05), а при носительстве -308 g/a гена TNFБ - в 3,0 раза (95% ДИ 1,21-7,45; p<0,05).