Морфофізіологічні адаптації різновікових груп Cyprinus Carpio L. за несприятливої дії екологічних факторів

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені І.І. МЕЧНИКОВА

АВТОРЕФЕРАТ

Морфофізіологічні адаптації різновікових груп CYPRINUS CARPIO L. за несприятливої дії екологічних факторів

03.00.16. - екологія

Жиденко Алла Олександрівна

Одеса - 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Чернігівському державному педагогічному університеті імені Т.Г. Шевченка, МОН України

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор

Грубінко Василь Васильович,

Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира Гнатюка,

завідувач кафедри загальної біології, м. Тернопіль

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

член-кореспондент НАН України, професор Шульман Георгій Євгенович,

Інститут біології південних морів НАН України, головний науковий співробітник, м. Севастополь

доктор біологічних наук, професор

Арсан Орест Михайлович,

Інститут гідробіології НАН України,

завідувач відділу екотоксикології, м. Київ

доктор біологічних наук, професор,

Курант Володимир Зіновійович,

Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира Гнатюка,

декан хіміко-біологічного факультету,

м. Тернопіль

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Протягом життя гідробіонти постійно зазнають дії несприятливих екологічних чинників. До тих з них, що ритмічно повторюються - абіотичні (критичні межі та флуктуації температури, рН, іонний склад води тощо) та біотичні (голодування, хижацтво, конкуренція тощо) - у риб сформувалися адаптації. Результати їх вивчення опубліковані в численних роботах Г.Є. Шульмана (1972), М.Р. Лава (1976), П. Хочачки, Дж. Сомеро (1988, 2002), В.С. Сидорова (1985,1998), В.Д. Романенка (1974-1987, 2004), М.Д. Озернюка (1985, 2003), Н.М. Нємової (2004), G.E. Shulman and R.V. Love (1999) та ін. На відміну від природних чинників, антропогенні стресори, особливо хімічні, становлять для водяних організмів більшу небезпеку.

Кількість виділених з природних джерел і синтезованих токсичних речовин уже перевищило 6 млн. і продовжує збільшуватися щорічно приблизно на 5% [Романенко В.Д., 2004]. Водне середовище забруднюється промисловими стічними водами, осіданням на водну поверхню повітряних викидів промисловості, надходженням отрутохімікатів, фосфатів і нітратів з сільськогосподарських угідь з ґрунтовим стоком і через атмосферу з опадами тощо [Брагінський Л.П. та співавт., 1990]. Як наслідок високої швидкості цих процесів в організмі гідробіонтів не встигають активізуватися наявні та швидко сформуватися нові системи захисту до токсикантів у зв'язку з їх неспецифічністю і багатоваріантністю дії.

Одним з найбільш небезпечних хімічних забруднювачів сьогодення є пестициди. Їх навантаження на 1га обробленої площі становить 0,6-1,2 кг, а порушення умов зберігання та утилізації призводить до забруднення ними питної води та ґрунтів, а також водоймищ. Найбільш поширеними є гербіциди, до яких вимоги безпеки формально низькі. Актуалізують проблему також відомості про те, що забруднення гербіцидами прибережних вод [Major R.M., 2003] впливає на фотосинтез та окисні процеси у зелених водоростей, а вживання в їжу риби, забрудненої гербіцидами [Hertz-Picciotto I. et al., 2008], призводить до зниження вмісту імуноглобулінів в крові і збільшує ризики захворювань. Пестициди, як і іони важких металів, здатні накопичуватися в рибі, що може призвести до змін їх ембріонального і постембріонального розвитку, порушень біохімічних і фізіологічних процесів. Ці ефекти часто є причиною зниження рибопродуктивності внутрішніх водойм.

Вивченню впливу токсичних речовин на гідробіонтів присвячені роботи Е.А. Веселова (1957-1965), М.С. Строганова (1968-1971), В.В. Метєлєва (1971), В.І. Лук'яненка (1967-1989), К.К. Врочинського (1979-1987), О.М. Арсана (2007) та ін. Сформовано теорію про динаміку пошкодження хімічними токсикантами організму риб, згідно з якою дія отрут на організм є фазовою: за Е.А. Веселовим (1957) - це такі фази: індиферентна (байдужості), стимуляції, депресії, сублетальна та летальна; В.І. Лук'яненко (1967) виділяє такі фази реакції гідробіонтів на токсикант: бескомпенсаційна, повної компенсації, неповної компенсації, критична фази. Строганов М.С. (1971) запропонував універсальний закон дії токсичного чинника на організм, в основі якого лежить етапність реагування організму як цілого на цей чинник. Разом з тим, динаміка фізіолого-біохімічних і морфологічних особливостей організму риб в процесі інтоксикації відповідно до фаз її розвитку системно не досліджена, унаслідок чого невирішеною є проблема оцінки токсикотолерантності риб і прогнозування їх виживання та біопродуктивності за токсичного навантаження.

Окремі механізми адаптації риб до дії токсичних речовин описані в роботах А.І. Путінцева (1981), Ф.З. Меєрсона (1981), О.Ф. Філенка (1984), Б.А. Флєрова (1989), М.Д. Озернюка, (1992), В.В. Грубінка (1995), В.З. Куранта (2003) та ін. Біохімічні механізми, що визначають якісну і кількісну своєрідність метаболічних функцій організмів, висвітлені в працях П. Хочачки і Дж. Сомеро (1988, 2002), що запропонували розглядати термінові відповіді організмів і їх структур на дію стресових факторів як «компенсаторну» адаптацію, що здійснюється за рахунок наявних в момент дії фактору фізіолого-біохімічних компонентів клітин, а тривалі (довготермінову) глибокі зміни, що відбуваються за рахунок активації геному та глибокої структурно-функційної перебудови обміну речовин, які надають організмам у змінених умовах нових властивостей, як «наступальну (експлуатативну)» адаптацію, котра розширює функціональні можливості організмів порівняно з вихідним станом і завдяки цьому дає їм можливість активно використовувати чинники середовища на свою користь. Гандзюра В.П. та Грубінко В.В. (2008) запропонували каскадний механізм організації біохімічної адаптації у гідробіонтів до токсикантів, суть якого полягає в тому, що несприятлива дія в біосистемах викликає короткотривалий стимулюючий ефект, що чергується зі станом пригнічення функцій системи, а результат дії чинника та відповідь біологічної системи на нього є підсумком взаємодії процесів пошкодження (деструкції) і компенсаторно-адаптивних реакцій системи, що перебігають одночасно.

Отже, при вивченні забруднення водних екосистем і формування адаптації у гідробіонтів системно досліджено лише вплив антропогенних чинників на динаміку чисельності і запаси економічно корисних видів риб, запропоновано критерії ранньої діагностики відхилень від норми, окремі біохімічні механізми дії токсичних речовин на організм риб. Проте, співвідношення реакцій-відповідей риб на поведінковому, морфологічному, фізіологічному та біохімічному рівнях в комплексі за дії токсичних речовин, особливо гербіцидів, в органах риб різного віку в процесі розвитку і формуванні адаптацій вивчені недостатньо, що і стало предметом цього дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота була складовою частиною досліджень лабораторії екологічної біохімії водяних організмів Чернігівського державного педагогічного університету імені Т.Г.Шевченка і виконана в рамках тематики держбюджетних науково-дослідницьких робіт на замовлення Міністерства освіти і науки України: «Дослідження механізмів адаптації прісноводних риб до токсикантів водного середовища, розробка на їх основі методів біологічного моніторингу і модельних екосистем для очищення забруднених вод» (№ держреєстрації 0198U000339); «Оцінка комплексного впливу токсикантів і природних фізичних факторів на екосистему малої річки (на прикладі річок Чернігівського Полісся)»; «Комплексна оцінка дії гербіцидів, які застосовуються в Україні, на гідробіонтів, пошук біоіндикаторів» (№ держреєстрації 0109U001298).

Мета і завдання досліджень. На підставі дослідження закономірностей морфологічних, фізіологічних і біохімічних змін встановити адаптації в організмі Cyprinus carpio L. різного віку до дії органічних токсикантів, іонів свинцю і зимового голодування.

Реалізацію мети здійснювали через вирішення таких завдань:

· вивчити поведінкові реакції риб як етап термінової відповіді організму на дію токсикантів;

· встановити швидкість проникнення і ступінь накопичення зенкору, похідних 2,4-дихлорфеноксиоцетової кислоти, раундапу в органах риб різного віку та морфологічні зміни в них за дії гербіцидів з плином часу;

· виявити механізм формування адаптації системи крові цьоголіток і двохліток коропа за дії гербіцидів;

· дослідити взаємозв'язок хімічної будови гербіциду та метаболізму вуглеводів, ліпідів, білків і енергетичного обміну в органах коропа різного віку;

· дати комплексну оцінку стану організму двохліток коропа за токсичного навантаження;

· встановити залежність між природою токсиканту (іони свинцю, фенол, гербіциди) і показниками енергетичного обміну в органах коропа;

· з'ясувати механізми адаптаційного процесу у коропів різного віку до низьких температур і зимового голодування та порівняти особливості формування адаптивних реакцій в двохліток коропа до дії природних і антропогенних чинників;

· встановити роль катіонів кальцію в формуванні адаптивних реакцій в організмі коропа до гербіцидів, а також вплив амінокислотного складу кормів на життєздатність молоді риб в стресових умовах.

Об'єкт дослідження: реакція-відповідь Cyprinus carpio L. різного віку на дію екологічних чинників природного та антропогенного походження.

Предмет дослідження: динаміка поведінкових, морфологічних і метаболічних показників в організмі коропа за дії токсикантів різної хімічної природи, зимового голодування і формування адаптації до них.

Методи дослідження: гідрохімічні, іхтіологічні, гістологічні, гематологічні, біохімічні, морфометричний аналіз, мікроскопія, ультрацентрифугування, фотоелектроколориметрія, спектрофотометрія, хроматографія, статистично результати оброблено загальноприйнятими методами за стандартними комп'ютерними програмами.

Наукова новизна і теоретичне значення роботи. В дисертаційній роботі здійснено теоретичне узагальнення і проведено порівняння механізмів формування адаптації коропа до токсичних чинників (гербіциди, фенол, іони свинцю), а також до низьких температур та зимового голодування. Вперше здійснено комплексне дослідження впливу токсичних речовин органічної природи на Cyprinus carpio L. різного віку на фізіологічному, структурному і біохімічному рівнях.

На підставі виявлених морфологічних змін органів і тканин встановлено вікові особливості реакції риб на гербіцидне навантаження. Вперше показано взаємозв'язок між хімічною будовою гербіциду, його здатністю проникати в організм з плином часу (4 - 7 - 14 діб) та гістологічними змінами в органах коропа (зябра, кишечник, мозок, білі м'язи, печінка). Вплив гербіцидів виявляється в значних змінах структур печінки, зябер, а особливо мозку риб за дії амінної солі

2,4-дихлорфеноксиоцетової кислоти; печінки і білих м'язів - за дії раундапу і зябер - за дії зенкору. Для встановлення швидкості проникнення досліджуваних гербіцидів в організм риб запропоновано і вперше розраховано коефіцієнти ліпофільності: для раундапу Log P= -2,36±0,64, для зенкору Log P=1,3±0,21, для 2,4-дихлорфеноксиоцетової кислоти

Log P=2,60±0,35, для розчину бутилового ефіру 2,4- дихлорфеноксиоцетової кислоти Log P = 4,26±0,34.

Вперше показано взаємозв'язок між хімічною будовою гербіциду і мірою його впливу на спрямованість вуглеводного обміну в коропа.

Дано комплексну оцінку розвитку адаптивних реакцій у відповідь на дію стрес-чинників з плином часу (1 - 14 - 21 доби перебування риб в токсичних умовах) на метаболічному, клітинному, тканинному і морфологічному рівнях.

Вперше показана залежність формування адаптації певного типу від віку: компенсаторної як відповідь на дію шкідливого чинника середовища у цьоголіток і експлуатативної (наступальної) у двохліток коропа.

Практичне значення одержаних результатів. Детальне вияснення патоморфологічної і гістологічної картини інтоксикації гербіцидами двохліток коропа рекомендовано використовувати для встановлення причин і попередження загибелі риб. Результати роботи також можуть бути використані для оцінки рівня забруднення водойм і профілактики інтоксикацій у риб в природних водоймах і рибовирощувальних ставах.

На відкритих колекторно-дренажних і дренажних каналах та зрошувальних системах рекомендовано заборонити застосування гербіцидів, до складу яких як діюча речовина входить ізопропіламінна сіль гліфосату або гліфосат в формі кислоти, а також похідні 2,4-дихлорфеноксиоцетової кислоти.

На основі запропонованої концепції етапності формування адаптації у риб до досліджуваних чинників обґрунтовано формування критичного стану організму двохліток коропа на 7 добу дії стрес-чинника. Запропоновано спосіб корекції обміну речовин у коропа в умовах гербіцидного забруднення за допомогою термінового внесення розчинних солей кальцію з розрахунку 2-3 ц вапна або вапняку на 1 га водної поверхні.

Теоретичні положення і практичні результати роботи можуть бути використані при викладанні навчальних дисциплін фізіологічного, екологічного, гідробіологічного та іхтіологічного змісту. Авторкою роботи вони використані в курсах «Екотоксикологія», «Біохімічна адаптація гідробіонтів», «Антропогенне евтрофування водойм», «Основи аквакультури» у Чернігівському державному педагогічному університеті імені Т.Г. Шевченка, що засвідчено відповідними актами впровадження.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою авторки. Здобувачкою проаналізовано відповідну літературу, особисто розроблено програму і методику досліджень, проведено експериментальну роботу і статистичну обробку отриманих даних. При спільному виконанні дослідів з співробітниками лабораторії екологічної фізіології і біохімії водяних організмів Чернігівського державного педагогічного університету імені Т.Г. Шевченка співвиконавці наводяться як співавтори відповідних публікацій. Аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретація і формулювання основних положень і висновків, а також друковані праці підготовлено безпосередньо авторкою.

Авторка вдячна науковому консультанту за допомогу в обговоренні та інтерпретації висновків.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладені в дисертаційній роботі, апробовано на: 5 Всесоюзному біохімічному з'їзді (Київ, 1986); 5-9 Українських біохімічних з'їздах (Івано-Франківськ, 1986; Київ, 1992; 1997; Чернівці, 2002, Харків 2006); Першому та Другому Всесоюзних симпозіумах з екологічної біохімії риб (Ярославль, 1987; 1990); Всесоюзній нараді «Екологічна енергетика тварин» (Суздаль, 1988); 7-му з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернівці, 1989); Другій Всесоюзній конференції з рибогосподарської токсикології

(С.-Петербург, 1991); 7 і 8 Всесоюзних конференціях з екологічної фізіології і біохімії риб (Ярославль, 1989; Петрозаводськ, 1992); 6 Ростовській обласній науково-практичній школі-семінарі (Ростову-на-Дону, 1990);

2-4 з'їздах Гідроекологічного товариства України (Київ, 1997; Тернопіль, 2001; Карадаг, 2005); Міжнародній науковій конференції «Екотоксикологія і біоіндикація» (Дніпропетровськ, 1993); 17 International Congress of Biochemistry and Molecular Biology (San-Francisco, 1997), 5 International Amino Acids Congress (Chalkidiki, Greece, 1997); 1 Всеукраїнській науковій конференції «Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах» (Тернопіль, 1998); Міжнародній конференції «Біологія ХХІ: теорія, практика, викладання» (Київ, Черкаси, Канів, 2007); 2 науковій конференції за участю країн СНД «Сучасні проблеми фізіології і біохімії водних організмів» (Петрозаводськ, 2007); IV міжнародній науковій конференції «Біорізноманітність і роль тварин у екосистемах» (Дніпропетровськ, 2007); Всеукраїнській науково-практичній конференції «Сучасні проблеми водних екосистем» (Дніпропетровськ, 2007), Міжнародній науково-практичній конференції «Стратегія розвитку аквакультури в сучасних умовах» (Мінськ, 2008)., Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Біорізноманіття водних екосистем: проблеми і шляхи вирішення» (Дніпропетровськ, 2008), IV Міжнародній науковій конференції «Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології» (Київ, 2008).

Публікації: за результатами досліджень опубліковано 73 наукових праці, з них 25 статей у фахових виданнях, 42 - у матеріалах конференцій, з'їздів, 3 - рекомендації рибництву.

Структура й обсяг роботи. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури (1 розділ), методики і методів дослідження (1 розділ), експериментальної частини (5 розділів), підсумків і висновків. Робота викладена на 354 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 125 рисунками, 31 таблицями, налічує 516 літературних джерел, включно 121 латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

У розділі розглядаються основні закономірності дії несприятливих екологічних чинників водних екосистем на морфофізіологічні показники і поведінку риб. Зокрема, з точки зору стратегічних та тактичних завдань водної токсикології проаналізовані головні джерела забруднення водойм і шляхи та механізми надходження токсикантів; охарактеризовані основні фази дії токсичних речовин, включно пестицидів, на риб та особливості їх реакцій-відповідей в залежності від віку та впливу абіотичних чинників. Розглянуто можливості формування і механізми адаптації у гідробіонтів до токсичних речовин. На підставі аналізу даних літератури показано, що в порівняльному аспекті формування адаптації до абіотичних й антропогенних чинників у риб досліджено недостатньо. Не дано також комплексної оцінки дії на риб на всіх рівнях їх організації різних за хімічною будовою гербіцидів, насамперед похідних 2,4-дихлорфеноксиоцетової кислоти і гліфосату, що останнім часом широко використовуються, що може бути небезпечним для життєдіяльності водяних тварин і людей.

Матеріали і методи дослідження

Дослідження впливу антропогенних чинників здійснено на мальках, цьоголітках і двохлітках коропа Cyprinus carpio L., вирощених у ВАТ «Чернігіврибгосп» впродовж 1991-2007 років. Експерименти з вивчення впливу токсичних речовин проводили у 200-літрових акваріумах, в які рибу розміщували з розрахунку 1 екз. на 10 л води (мальки масою 7-13 г), на 20 л (цьоголітки масою 40-105 г), на 40 л води (двохлітки масою 150-300 г). Експерименти тривали 7, 14 та 21 доби. Воду змінювали щотридобово. У всіх випадках використовували контрольну групу риб і підтримували постійний гідрохімічний режим: значення рН становило 7,80±0,28; вміст кисню 5,8±0,5мг/л, температура води відповідала природній +5 - +19^оС. Як токсиканти застосовували гербіциди, що дозволені для використання в Україні і вироблені в Україні, Китаї, Угорщині, Польщі, Австрії, Швейцарії, США: 1) зенкор - метрибузин (4-аміно-6-третбутил-3(метилтіо)-1,2,4-тріазин-5 (4Н)-он); 2) раундап - гліфосат, фосулен (N-фосфонометилгліцин);

3) 2,4-дихлорфеноксиоцетова кислота (2,4-Д), амінна сіль 2,4-Д (2,4-ДА), розчин 2,4-Д бутилового естеру (2,4-ДБЕ); фенол; катіони свинцю. Концентрацію досліджуваних гербіцидів (2 ГДК) створювали внесенням розрахованих кількостей 70% порошку зенкору (0,2 мг/дм³) [Методичні вказівки з ..., 2003] похідних 2,4-дихлорфеноксиоцетової кислоти: амінної солі (0,2 мг/дм³), розчину 2,4-Д бутилового естеру (0,008 мг/дм³) [Врочинський К,К., 2006] і 36% водного розчину раундапу (0,04 мг/дм³) [Перелік пестицидів і ..., 2001]. Дію фенолу досліджували додаванням у воду 0,002 мг/дм³ кристалічного попередньо розчиненого фенолу (2 ГДК). Іони свинцю (Pb²⁺ - 0,2мг/дм³, 2 ГДК), вносили в воду у вигляді нітратної солі Pb(NO₃)₂. Така концентрація обрана з огляду на можливість простежити всі морфофункціональні та біохімічні зміни в організмі риб, не допустивши її загибелі. Застосована в експериментах кількість токсиканту 4 ГДК (для зенкору і раундапу) дозволила простежити зміни вмісту катіонів кальцію у сироватці крові і печінці двохліток коропа. Вплив кожної токсичної речовини на організм риб досліджували не менше, ніж в трьох повторах; кількість риб в кожному досліді залежала від його змісту, маси і віку риб. Так, для двохліток коропа кількість риб в контролі і в дослідах з вивчення токсичної дії становила не менше 6 особин, кількість мальків і цьоголіток в кожному досліді становила 25-30 особин. Загальна кількість досліджених риб - біля 15000 особин.

Для вивчення морфометричних характеристик проводили такі заміри риб [Правдін І.Ф., 1966; Справочник по физиологии рыб, 1986; Нікіфоров А.І., 2008]: L - вся довжина тіла, l - промислова довжина (до кінця лускового покриву), H - максимальна висота, О - обхват тіла максимальний, М - маса риби, m_п - маса печінки, m_с - маса селезінки. За отриманими результатами розраховували такі індекси: розтягнутості - 100*l/H, збитості - 100*O/L, масивності - 100*O/H, вгодованості - 100*M/lHO; коефіцієнт вгодованості - 100*M/l³, індекс печінки - 100*m_п/M, індекс селезінки - 100*m_с/M. Два останніх індекси використали як показник стресу [Справочник по физиологии рыб, 1986].

Морфологічні і структурні зміни в тканинах коропа під впливом гербіцидів досліджували гістологічно [Волкова Ю.Л., 1971, Євгеньєва Т.П., 1983]. Для цього на 4, 7, 14 добу проводили патологоанатомічний розтин риб і відбирали проби з таких органів: скелетних м'язів, печінки, зябер, головного мозку і кишечника. Фарбували гематоксилін-еозином, фіксували 96 % етанолом. Гістологічні препарати розглядали під мікроскопом ЛОМО Мікмед-2 (х 40) та фотографували Web-камерою. Патологічні зміни в тканинах описували, використовуючи «Атлас гістології і гістохімії прісноводних риб» [Клименко О.М. і співавт., 1999].

Накопичення гербіцидів визначали за [Методы определения ..., 1983]. Після гомогенізування кількох рибин відбирали середню пробу, а її очищення, тонкошарове хроматографування та визначення проводили згідно «Методичних вказівок ...» (2004) в нашій модифікації. Кількісні значення одержували порівнюючи площу зафарбування досліджуваних проб і стандартів гербіцидів.

Кров у риб відбирали з серця [Справочник по физиологии рыб, 1986; Давидов О.Н. и співавт., 2006] на 1, 4, 7, 14 доби експерименту. Початкову пробу крові без першої краплі використовували для визначення її згортання і швидкості зсідання еритроцитів [Посібник з клінічної ...,1992]. Решту крові стабілізували гепарином - 0,01мл (в 1мг препарату 130 од.) [Справочник по физиол. ..., 1986]. В крові визначали: кількість еритроцитів в камері Горяєва, концентрацію гемоглобіну за Салі гемометром, в'язкість - віскозиметром ВК-4; питому вагу крові [Васильєв А.В, 1948], резистентність еритроцитів за О.Н. Давидовим (2006). На підставі одержаних даних розраховували вміст гемоглобіну в одному еритроциті та кольоровий показник крові. В сироватці крові визначали вміст білку за Лоурі [Lowry O.H. et al., 1951], неорганічного фосфату за Лоурі і Лопес [Lowry O.H. et al., 1946]. Кількість залишкового азоту і катіонів кальцію визначали за В.С. Роніним та співавт. (1977).

Для дослідження особливостей пластичного обміну визначали відсоток сухої речовини, води, загальний вміст білків та їх фракцій в органах коропа [Філіппович Ю.Б. і співавт., 1982; Явоненко О.Ф. і співавт., 1989]. Кількість загальних ліпідів і активність ліпази визначали за О.Н. Давидовим і співав. (2006). Вміст кетонових тіл визначали в білих м'язах, печінці і в мозку спектрофотометрично [Баєва В.І. і співавт., 1973] в нашій модифікації (в безбілковий фільтрат додавали насичений розчин їдкого натру і кольоровий реактив. Стандартним розчином слугував хімічно чистий ацетон).

Вміст глюкози і глікогену визначали глюкозооксидазним методом згідно з інструкцією до лабораторного набору АО «Реагент» (Україна). Для аналізу вмісту аденілатів [Маляревська А.Я. і співавт., 1985] заморожені тканини розтирали в порошок, нуклеотиди екстрагували 8 % розчином хлорної кислоти в співвідношенні маси тканини до об'єму розчинника 1:1 при охолодженні 30 хв. Аденілати розділяли на пластинках «Силуфол»

UV-254 тонкошаровою хроматографією в системі розчинників 1,4-діоксан-ізопропанол-аміак-вода (4:2:1:4).

Активність ферментів в органах визначали в їх гомогенатах на 0,25 ммоль сахарозі у співвідношенні 1:10. Ядра, мітохондрії і мікросоми осаджували згідно загальноприйнятих методик [Schachman H.K., 1959] з урахуванням деяких особливостей фракціонування гомогенатів тканин риб [Casey C.A. et al., 1982]. Мітохондрії виділяли за Зініч В.Н. (1986) та додатково очищували центрифугуванням в градієнті щільності сахарози 0,32-1,25 ммоль [Арутюнян А.В. і співавт., 1978] в горизонтальному роторі при 75000g впродовж 60 хв. при +4^оС.

Інкубаційна суміш для визначення в-оксибутиратдегідрогеназної активності (КФ 1.1.1.30) містила: 50 ммоль трис-HCl; pН 8,1; 0,5 ммоль ЕДТА; 0,3 ммоль дітіотреітола; 0,4 мг БСА на 1 мл; 1,4 % етанолу; 0,5 ммоль NAD⁺; загальний обсяг 3 мл. [Булах Е.И. і співавт., 1974; Brady L.J. et al., 1986]. Впродовж 7 хв. при температурі 30⁰ С інкубували суміш, що містила 100 мкг білка везикул, 0,3 мл 0,2%-ного тритону Х-100, 15 мкл

актиміцину А, доданого для запобігання повторного окиснення NАDH'Н⁺ у ланцюзі транспорту електронів. Реакцію розпочинали внесенням 20 мкмоль в-D, L-оксибутирату. Активність в-оксибутиратдегідрогенази реєстрували спектрофотометрично за відновленням NAD⁺.

Активність глюкозо-6-фосфатази (КФ.3.1.3.9, Г-6-Фаза) визначали в надосадковій фракції гомогенатів вищезазначених органів [Львова С.П., 1985]. Інкубаційна суміш містила: 0,3 мл 0,087 моль цитратного буферу, рН=6,5; 0,1 мл 0,1 моль глюкозо-6-фосфату, після 3 хв. преінкубації додавали 0,2 мл досліджуваного ферментного розчину та інкубували 30 хв. Реакцію зупиняли додаванням 1мл 10% ТХОК і охолоджували на льоду. Через 5 хвилин отриману суміш розводили дистильованою водою до 2,5мл і осад білків відокремлювали центрифугуванням. В отриманому центрифугаті визначали вміст неорганічного фосфату [Lowry O.H., Lopez S.A., 1946; Скулачев В.П., 1962]. Ферментну активність виражали в мкмоль неорганічного фосфату (Р_i) за 1 хв на 1 мг білка.

Активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (КФ 1.1.1.49, Г-6-ФДГ) визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 340нм [Biochemica information, Bd.1, 1975]. Інкубаційна суміш містила: 0,1 моль К⁺-фосфатного буферу, рН 7,6; 35 ммоль розчину глюкозо-6-фосфату, 11 ммоль NADР⁺. Активність виражали в мкмоль NADP⁺/мг білка за 1 хв. Активність ізоцитратдегідрогенази (КФ 1.1.1.41) визначали в мітохондрійній фракції. Інкубаційна суміш містила: 50 мкмоль трис-HCl буфера, рН 7,4; 2,0 мкмоль хлориду магнію; 1 мкмоль ізоцитрату; 0,025 мкмоль NАDР⁺. Ферментну активність виражали в мкмоль NАDР⁺ у розрахунку на 1 мг білка за

1 хвилину [Biochemica information, Bd.2, 1975].

Лактатдегідрогеназну (КФ 1.1.1.27, ЛДГ), малатдегідрогеназну

(КФ 1.1.1.37, МДГ) активності визначали спектрофотометрично за зміною оптичної щільності окиснення NADH при 340 нм [Biochemica information, Bd.2, 1975]. Інкубаційна суміш (3мл) для ЛДГ містила: 100 ммоль

К⁺-фосфатного буферу, рН 7,0; 23 ммоль пірувату; 12 ммоль NADH; 0,02мл суспензії досліджуваного ферментного препарату. Інкубаційна суміш (3мл) для МДГ містила: 100 ммоль К⁺-фосфатного буферу, рН 7,5; 15 ммоль оксалоацетату; 12 ммоль NADH; 0,02 мл суспензії досліджуваного ферментного препарату. Активність ферменту виражали в мкмоль окисненого NАDН на мг білка за 1 хв.

Вивчення залежності між характером живлення риб і хімічною структурою їх тіла, а також впливу якісного та кількісного складу спожитих кормів на біомасу (біопродукцію на організмовому рівні) проведено на цьоголітках, які були розділені за характером живлення на 3 групи. Відмінності співвідношення природних і штучних кормів у живленні риб забезпечували утриманням цьоголіток коропа при різних щільностях посадки (10; 20; 60 тис. екз./га) і низкою інтенсифікаційних заходів (внесення у воду ставків мінеральних і органічних добрив, рибного борошна і комбікормів). Перша група - живлення молоді риб тільки природним кормом; для другої групи риб - співвідношення природних і штучних кормів становило 1:1; третя група риб живилася комбікормом згідно з нормативами [Сборник нор.-тех. …, 1986].

Кількість вільних амінокислот визначали методом висхідної паперової хроматографії (марка паперу FN - 1 і Ленінградська середня) [Пасхіна Т.С., 1964; Ali S.N., 1983]. Гліцин і серин розділяли низхідною хроматографією в системі розчинників [Починок Х.П., 1976]. Кількість вільних амінокислот у пробах контролювали на амінокислотному аналізаторі ААА 881 (Чехія) за методикою, що описана в додатку до приладу.

Усі результати були оброблені статистично. Кореляційний і однофакторний дисперсійний аналіз здійснювали згідно методичних рекомендацій [Лакін Г.Ф., 1990]. Визначення швидкості проникнення досліджених гербіцидів в організм риб розраховували на основі таблиці інкрементів груп атомів для органічних сполук ? коефіцієнтів ліпофільності [Lipinski C.A. at al., Rishton G.M. 1997]. Статистично результати оброблено загальноприйнятими методами за стандартними комп'ютерними програмами, а вірогідне розходження між середніми арифметичними величинами визначали за допомогою t-критерію Стьюдента. Розходження між порівнюваними групами вважали вірогідними при * - Р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

В експерименті використані мальки, цьоголітки і двохлітки коропа. Через 2-5 хвилин після їх переміщення у воду, що містила похідні 2,4-Д, у риб спостерігається значний хаотичний рух і вистрибуванням з глибини. Через 3-4 години коропи заспокоювалися, але рухалися повільніше порівняно з контрольними особинами. Зміни поведінки риб за цих умов, як вважають [Касумян А.О., 2001], відбуваються внаслідок ураження органів чуття риб, рецепторні елементи яких безпосередньо взаємодіють з токсикантами. Під дією зенкору впродовж всього експерименту (для двохліток - 14 діб, для цьоголіток і мальків - 21 доба) риби ставали рухливішими (здійснювали стрімкі рухи з товщі води) і агресивнішими. У цьоголіток і двохліток відмічено пошкодження рила і хвостових плавців, що більш виражено у двохліток. Токсичний вплив раундапу виявлявся в загальній слабкості риб, уповільненні реакцій на зовнішні подразники (світло, заміна води). На 14 добу коропи були малорухливими, але знаходилися в вертикальному, а не боковому положенні. Найбільш виражені поведінкові реакції на дію токсикантів спостерігали у двохліток.

Фенолвмісні стічні води впливають на смакові якості риби вже в концентрації 0,01 мг/л [Метелев В.В., 1971]. Нами була використана концентрація фенолу 0,002 мг/л (2 ГДК), тому ці ознаки не виявлено. За його дії спостерігалося занепокоєння, хаотичне плавання коропа, періодичне розкриття ним рота і зябрових кришок, незначна втрата координації рухів.

Важкі метали, що діють на нервову систему, наприклад, свинець, руйнує периферичні нерви і головний мозок, а це, як наслідок, призводить до порушення поведінки. Тому за концентрації Pb²⁺ 0,1-0,4 мг/л спостерігаються симптоми отруєння риб [Метелев В.В., 1971]. У нашому експерименті вміст катіонів свинцю у воді був 0,2 мг/л (2 ГДК), внаслідок чого реакції риб характеризувалися неспокійною поведінкою, підвищенням дихального ритму та збільшенням його глибини. Летальних випадків, втрати рівноваги, зниження частоти дихання не виявлено.

Отже, вираженість порушень поведінкової активності риб за дії токсичних речовин (2 ГДК) зростає в такій послідовності: іони свинцю, фенол, похідні 2,4-дихлорфеноксиоцетової кислоти, раундап, зенкор.

У забруднених водоймах першими зазнають дії токсикантів зябра, зовнішні покрови та кишечник риб. Хімічна структура токсиканта впливає на швидкість проникнення його в організм риб, зміни в органах і формування відповідної адаптивної реакції в них. Зенкор унаслідок складності будови і відносної легкості проникнення (Log P=1,3±0,21) у внутрішні органи, на відміну від інших досліджуваних гербіцидів, спричиняє найбільший вплив на зябра двохліток коропа.

Під впливом зенкору змінюються форми респіраторних ламел у зв'язку з їх вираженим колоподібним набуханням (а) і гіпертрофією дистальних ділянок філаментів (б) (рис. 1Б), що призводить до зменшення надходження токсичної речовини в організм риб. Відомо, що інтенсивність газообміну прямо залежить від площі поверхні зябер і кількості клітинних шарів, що формують їх епітеліальну тканину (у коропових - до 8). Підвищення висоти епітелію збільшує дистанцію «кров - середовище» і знижує інтенсивність газообміну, що перешкоджає надходженню токсичних речовин, обмежуючи поглинання кисню. Добова дія зенкору сприяє терміновій адаптації, що виражається в найбільшій мобілізації фізіологічних ресурсів організму, максимальному збільшенні кількості еритроцитів та вмісту гемоглобіну, білків плазми. зенкор токсикант дихлорфеноксиоцетовий гербіцид

Це пов'язано зі зміною форми респіраторних ламел, прогресуючим збільшенням їх об'єму (рис. 1Б). Відповідною реакцією є збільшення кількості еритроцитів у двохліток коропа (рис. 2А). Після 7 доби перебування риб в токсичному середовищі значення показників крові змінюється. Так, під впливом зенкору за значного зниження вмісту гемоглобіну в крові (рис. 2Б) спостерігається стабілізація кількості еритроцитів (рис. 2А), однак величина кольорового показника, що вказує на ступінь насичення еритроцитів гемоглобіном, найменша (0,39) порівняно з контролем (0,97) (рис. 3Б). Крім того, для дії зенкору є характерною зміна форми еритроцитів, зростає кількість молодих клітин, які мають округлу форму з найменшим співвідношенням діаметрів, що призводить до мікроцитозу (зменшення об'єму еритроцитів) і зменшення вмісту гемоглобіну. У зв'язку з цим показник ВГЕ є найменшим - 39,36 пн.

Формування довготермінової адаптації під дією зенкору за змінами величини показників крові у двохліток і цьоголіток не відбувається (на

14 добу експерименту розбіжності в показниках крові цьоголіток коропа під дією зенкору порівняно з контролем досягають 50%). Поясненням цього може слугувати руйнування структур зябер двохліток коропа (міжклітинний набряк епітелію з вираженою деструкцією в респіраторних ламелах) (рис. 1В).

Крім того, активні поведінкові реакції цьоголіток і двохліток коропа під дією зенкору призводять до відповідних змін кількості макроергічних сполук в органах і вмісту фосфору (рис. 4А,Б) в сироватці крові (активне плавання - збільшення енерговитрат - зростання кількості неорганічного фосфату в сироватці крові у 3,6 рази). Збільшення кількості АМP на 26 % і АDP на 13 % у мозку двохліток коропа порівняно з мозком контрольних риб не призводять до підвищення швидкості переносу електронів і посилення ресинтезу АТP з АDP. Тому адаптивні можливості на рівні енергетичного метаболізму у мозку коропа повністю не задіяні. Навпаки, відбувається зниження рівня АТP на 37%, АЕЗ на 23 %, співвідношення діючих мас аденілаткіназної реакції на 38% (рис. 4Б.) Збалансованість шляхів використання АТР в органах, клітинах та підтримка її на визначеному рівні досягається функціонуванням складних механізмів регуляції за принципом зворотного зв'язку [Newsholme E.A. et al. 1973]. Якщо цей процес відсутній, то це є сигналом порушення гомеостазу в організмі, що, можливо, пов'язано з зменшенням активності ферментів катаболізму, за винятком вірогідного зростання активності глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (пентозофосфатний шлях) з метою збільшення пулу пентоз і відновлених форм коферментів (табл. 1).

Таблиця 1

Зміна активності окремих ферментів вуглеводного обміну у мозку двохліток коропа за дії гербіцидів, M±m, n=6

Примітка: * - різниця вірогідна у порівняні з контролем

Останні, як наслідок, забезпечують підтримання структури тканин білих м'язів і мозку за дії зенкору. Отже, адаптація до дії зенкору здійснюється на структурному рівні завдяки активації пентозофосфатного шляху.

Найлегше в організм риб проникає раундап (Log P = - 2,36±0,64), наслідком чого є морфологічні порушення: утворення на зовнішніх покривах та плавцях двохліток коропа виразок, крапкових крововиливів, набряків тощо. Цей вплив, можливо, пояснюється хімічною будовою гербіциду, його кращою розчинністю у воді порівняно з зенкором і похідними 2,4-дихлорфеноксиоцетової кислоти. Крізь зябра, які при цьому не ушкоджуються, гліфосат з кровотоком надходить до усіх органів, тканин і клітин, що призводить до їх структурних змін.

Після 14 доби дії токсиканту виявлено порушення структури м'язових волокон, їх неупорядковане розташування, а в деяких ділянках виявлено відсутність поперечної смугастості (лізис телофрагми та мезофрагми). Отримані нами дані співвідносяться з результатами дослідження патології осетрових, в яких спостерігали розшаруванням м'язових волокон, в процесі чого мішенню гідролаз разом з колагеном можуть бути протеоглікани [Руоколайнен Т.Р., 1985]. Зменшення вмісту нерозчинних білків у м'язах і збільшення частки вологи свідчать про перебіг аналогічних процесів та про активацію катаболізму.

У гістопрепаратах печінки коропа після 14 діб інтоксикації спостерігаються лімфоцитарні скупчення у портальних трактах. У результаті поширення процесу вакуольно-краплинної дистрофії відбувається тотальний некроз гепатоцитів (рис. 7Б), що призводить до функціональної недостатності органу. У неушкоджених ділянках тканини, що залишилися, простежується збільшення ізоцитратдегідрогеназної активності в 2 рази, лактатдегідрогеназної - на 4,5 %.

Морфофункціональні зміни в тканинах кишкового тракту виникали лише під впливом раундапу. На 14 добу відмічається виражений набряк слизової оболонки кишечника і в його просвіті знаходимо жовчні конкременти (рис. 9). Під час патологоанатомічного розтину риб візуально відмічали наявність жовчних каменів блакитно-зеленого кольору (а) та скупчення карбонату кальцію білого кольору (б).

Л.А. Бугаєв і співавт. (2006) пропонують використовувати показники крові як індикатор еколого-фізіологічного стану риб за антропогенного впливу на водойми. За гербіцидного навантаження нами виявлено неоднозначність динаміки гематологічних показників у цьоголіток і двохліток коропа. Відповідна реакція організму на дію раундапу (4 доба) виявляється в збільшенні кількості еритроцитів та вмісту гемоглобіну в крові коропа (рис. 2А,Б). Критичним етапом для двохліток коропа, коли термінова адаптація є неможливою (в організмі вичерпуються фізіологічні резерви), а формування довготермінової адаптації ще не відбулося, є 7 доба. Для цього терміну дії характерні найнижчі величини у риб гематологічних показників, що вказує на зниження інтенсивності функціонування організму риб в цілому. У цьоголіток істотні зміни основних показників крові мають виявляються на 14 добу експерименту. До 21 доби відбувається певна стабілізація стану риб за дії раундапу, про що свідчать позитивні зміни величин гематологічних показників порівняно з контролем. Про формування довготермінової адаптації в організмі двохліток коропа (стабільні гематологічні показники) на 14 добу можна стверджувати тільки за дії раундапу (рис. 2, 3). Пов'язуємо це з хімічною будовою гербіциду: як водорозчинний гліфосат, що є похідним амінокислоти гліцину, він, ймовірно, залучається до обміну речовин. Функціонування окремих клітин, що забезпечують терміновий етап адаптації, зростає, активізується мобілізація енергетичних і структурних ресурсів організму, їх перерозподіл у бік переважного забезпечення систем, що відповідають за адаптацію до цього чинника. На біохімічному рівні це призводить до збільшення активності ферментів в органах (наприклад, лактатдегідрогенази у 10 разів в печінці цьоголіток коропа під дією гліфосату). Ті структури, що меншою мірою відповідають за формування довготермінової адаптації, піддаються активному руйнуванню з використанням їх в енергетичному обміні. Доказом цієї тези є зміни загального вмісту білків та їх фракційного складу в органах двохліток коропа під впливом гліфосату (біохімічний рівень): зменшення кількості нерозчинних білків і збільшення вмісту водорозчинних білків у білих м'язах і печінці, що співвідноситься з патологічними змінами в цьому органі.

Підтримання стабільності гематологічних показників у коропа під впливом раундапу можливо за рахунок катіонів кальцію, що суттєво можуть змінювати проникність клітинних мембран, підвищувати токсикорезистентність організму водяних тварин за рахунок впливу на внутрішньоклітинні біоенергетичні процеси [Романенко В.Д., 1982]. На 7 добу експерименту концентрація Са²⁺ у сироватці крові двохліток коропа за дії зенкору зменшилася на 7,3 %, а за дії раундапу збільшилася на 82,0 % порівняно з контролем.

Рис. 10. Загальний вміст азотистих сполук в крові цьоголіток і двохліток коропа (А), вміст Са²⁺ у сироватці крові (А) двохліток, за гербіцидного навантаження (14 доба), M±m, n=6.

Відомо, що у прісноводних риб вода і іони неорганічних сполук, включно Са²⁺, абсорбуючись апаратом зябер, відразу надходять у загальний кровообіг на відміну від морських риб і наземних хребетних, в артеріальній крові яких вони з'являються тільки після проходження крізь печінку. У риб, що мають лускатий покрив, через шкіру вбирається 12 %, а через зябра ? 88% іонів неорганічних сполук [Богоявленська М.П., 1955].

Як видно з даних, що на рис. 2Б, на 4 добу перебування риб під впливом зенкору змінюється форма респіраторних ламел зябер. Тому надходження іонів кальцію з води в організм риб знижується. Під дією раундапу структурні зміни в зябрах виявляються лише на 14 добу досліду і вони не настільки значні, тому вміст катіонів кальцію в крові коропа, що перебував у воді з раундапом, в 2 рази більший, ніж за дії зенкору. Оскільки використана в дослідженнях вода є твердою (12 мгекв/л або 240 мг % солей кальцію і магнію), такий шлях надходження катіонів кальцію в організм риб є можливим. Крім того, функціонує інший механізм збільшення вмісту Са²⁺ у крові коропа. Виявлено, що за дії раундапу на скелет коропа відбувається просвітління черепа і збільшення м'якості та гнучкості кісток риб. Відомо, що вміст кальцію в кістках коропа істотно не відрізняється від такого в кістках ссавців [Русанов В.В., 1974], тому резорбція кальцію з кісток черепа риб призводить до тих самих наслідків, що і у ссавців (збільшення вмісту іонів кальцію в крові). Завдяки інтенсивному іонному обміну кісткова тканина є не тільки депо мінеральних речовин, але і своєрідним буферним органом, що бере участь в регуляції іонного гомеостазу. На 14 добу експерименту кількість іонів кальцію в сироватці крові під дією зенкору зменшується на 80,7 %, а під дією раундапу ? на 51,5 % порівняно з контролем. Поясненням цього може бути прогресуюча гіпертрофія дистальних ділянок філаментів, міжклітинний набряк з вираженою деструкцією в респіраторних ламелах (зенкор) і формування в просвіті кишечника каменів карбонату кальцію (раундап) (рис. 9Б). Тому можлива корекція обміну речовин у двохліток коропа, що знаходилися в умовах гербіцидного навантаження, за рахунок термінового внесення сполук кальцію у воду і зміни концентрації іонів кальцію в крові й органах риб.

Таблиця 2

Показники вираженості гістологічних змін в органах двохліток коропа

Примітка: “-- “особливих змін не виявлено; + зміни виражені слабко;

+ + зміни виражені середньо; + + + зміни виражені значно.

Політоксичним гербіцидом є амінна сіль 2,4-дихлорфеноксиоцетової кислоти, тому що її вплив на організм коропа пов'язаний з деструктивними змінами в зябрах та скелетних м'язах, дистрофічними змінами в печінці та некробіотичними процесами в тканинах головного мозку.

Причиною появи периваскулярного і перицелюлярного набряків, запальних інфільтратів в м'якій мозковій оболонці, поодиноких ділянок з дистрофічними змінами нейронів у головному мозку під дією 2,4-ДА, на відміну від дії інших гербіцидів, можливо, є хімічна будова цієї солі, яка добре розчиняється в органічних розчинниках. Похідні хлорфеноксиоцетової кислоти (2,4 Д-амінна сіль), викликаючи в мозку запалення, на біохімічному рівні не чинить на нервову тканину відчутного впливу. Ці гербіциди, насамперед, підвищують активність Г-6-Фази для підтримання гомеостатичного рівня глюкози (рис. 12,13). Адаптаційні механізми за дії похідних 2,4-Д спрямовані на активацію ферментів енергетичного обміну і подальшу стабілізацію енергетичних ресурсів мозку коропа. Можливо, це пов'язано з складністю їх будови і труднощами проникнення у внутрішні ргани 2,4-дихлорфеноксиоцетової кислоти (Log P=2,60±0,35), розчину

2,4-Д бутилового естеру (Log P = 4,26±0,34). Відповідна реакція на їх дію виявляється в підтриманні достатньої кількості макроергічних сполук у мозку та в тому, що розраховані коефіцієнти енергетичного стану нервових клітин знаходяться у межах норми. Підвищення активності ферментів гліколізу та циклу Кребса за дії гербіцидів є адаптивним механізмом, завдяки якому зростає рівень АТР у мозку коропа на 10%, співвідношення АТР/АDР на 52 %, АЕЗ на 33 %.

Інші токсиканти на енергетичний статус мозку риб, так само як і гербіциди, діють різнопланово. Наприклад, адаптація мозку коропа до дії фенолу виявляється у зниженні величини всіх показників енергетичного обміну та їх стабілізації на більш низькому рівні за рахунок окиснення глюкози, синтезованої завдяки активації глюконеогенезу. Найбільший негативний вплив на енергетичні показники в мозку коропа чинять катіони свинцю.

Вміст АТР у мозку риб за дії свинцю зменшується у 2 рази, АТР/ADP - в 2,2 рази, співвідношення діючих мас АТP системи - у 3,2 рази, унаслідок неможливості фосфорилювання системи АDP-АТP, у зв'язку з інгібуванням синтезу глюкози (головного живильного субстрату для нервової тканини).

Вищезазначені закономірності характеризують обмін речовин та адаптивні можливості у риб в цілому. Однак, в процесі досліджень нами виявлено суттєві модифікаційні відмінності описаних ефектів у риб залежно від їх віку.

Найбільший негативний вплив на морфологічному рівні гербіциди чинять на двохліток коропа, що виражається в пошкодженні зовнішніх покривів тіла і зменшенні вмісту сухої речовини у м'язах (переважання катаболічних процесів) (рис. 14). Це призводить до зміни вмісту сполук нітрогену в крові коропа: під дією раундапу в крові двохліток кількість азотистих сполук зменшилася у 35 разів, що свідчить про негативний азотистий баланс, екскрецію сполук нітрогену з організму та несприятливий прогноз для життєдіяльності риб.

У мальків та цьоголіток після перебування в токсичних умовах були прозорий слиз, цільна, блискуча з перламутровим відтінком луска, що міцно утримувалася на тілі. Тіло було щільним та еластичним, без почервонінь покривів, гіперемічних ділянок, виразок, тобто не відрізнялось від такого у контрольних риб.

Крім того, мальки швидше реагували на дію гербіцидів (на 7 добу), доказом чого є значення індексів селезінки і печінки (рис. 15Б). Можливо, це сприяє включенню досліджених органічних сполук у пластичний обмін. Отримані результати свідчать про збільшення індексу селезінки у контрольних риб з віком (від мальків до двохліток). Під дією гербіцидів (додатковий стресор) ці відмінності нівелюються і їх значення близькі. У мальків індекс селезінки на 14 добу дії зенкору більший на 55 % (р<0,01), раундапу ? на 41% (р<0,01), що свідчить про перевагу анаболічних реакцій над катаболізмом у організмі молоді риб. У двохліток, навпаки, індекс селезінки зменшився на 30 % (зенкор) і на 23 % (раундап) (р<0,05), що вказує на переважання катаболічних процесів.

У роботі [Екологічна біохімія, 2005] обговорюється можливість включення ксенобіотиків в обмін речовин. Тварини мають систему біохімічного захисту для детоксикації або ослаблення дії різних за структурою хімічних речовин. У біотрансформації ксенобіотиків беруть участь різні органи і тканини: печінка, нирки, кишечник, селезінка, шкіра, клітини імунної системи тощо. Залучення гербіцидів до метаболізму практично не вливає на показники екстер'єру молоді коропа, що мало відрізняється у риб контрольної та експериментальної груп. Разом з тим, висока активність ферментів в органах цьоголіток, пов'язана з метаболізуванням гербіцидів, є позитивною з точки зору їх детоксикаці, а з іншого - відіграє негативну роль, оскільки має місце неекономна витрата енергетични субстратів, що витрачаються на підтримання цього метаболізму.

Підвищення активності визначених ферментів під дією гербіцидів можна віднести до адаптивних перебудов метаболічних шляхів для забезпечення гомеостазу та енантіостазу в організмі риб. Отже, на морфофункційному рівні адаптація легше здійснюється у мальків та цьоголіток, у зв'язку з анаболічним спрямуванням обміну речовин у них. На біохімічному рівні економність функціонування характерніша для двохліток коропа, бо цьому сприяє формування наступального виду адаптації.

Крім того, токсичні речовини здатні накопичуватися в тканинах риб, впливаючи на їх обмін речовин і життєдіяльність, а також на харчові якості риби. Так, встановлено [Мехед О.Б., 2006], що після 14 діб перебування риб у токсичних умовах, максимальна кількість 2,4 Д бутилового естеру накопичується в печінці та мозку мальків порівняно з цьоголітками та двохлітками коропа. Накопичення зенкору в органах коропа не було зафіксовано. Тому, можливе нагромадження гербіцидів у тілі риб нами перевірялося також на мальках: для раундапу воно становило 9,73±1,03 мг/кг маси тіла; для зенкору воно було мінімальним і становить 3,98±0,79 мг/кг маси тіла; для бутилового естеру 2,4-дихлорфеноксиоцетової кислоти - 12,26±0,22 мг/кг маси тіла.

Риби, ослаблені отруєнням, легше піддаються інфекційним і паразитарним захворюванням внаслідок зниження загальної опірності організму. На підставі цього актуалізується проблема використання профілактичних заходів, що попереджують отруєння риб, однією з способів якого, як зазначалося, є постачання до організму достатньої кількості іонів кальцію. Тому при надходженні гербіцидів у внутрішні водойми необхідно негайно здійснювати вапнування ставів. У літню пору рекомендується вносити вапно у воду з розрахунку 2-3 ц/га. Завдяки збільшенню іонів кальцію в організмі риб (вони відразу з зябер надходять у кров) можливе зростання активності процесів окисного фосфорилювання, посилення синтезу макроергічних сполук і успішне формування адаптації. Крім того, підвищення активності кальпаїнової системи призводить до швидкого лізису пошкоджених тканин, що підтверджується гістологічними дослідженнями.