Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА: РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА, ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА И АГРЕГАЦИИ БЕЛКОВ

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ПЛЕТЕНЬ АНАТОЛИЙ ПЕТРОВИЧ

Москва-2008

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии

им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета

им. М.В.Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Муронец Владимир Израилевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

Гильмиярова Фрида Насыровна

доктор биологических наук Гмошинский Иван Всеволодович

доктор биологических наук Калита Наталия Федоровна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук

Защита состоится «16» марта 2009 г. в 14 ч. на заседании Диссертационного совета Д.001.002.01 при ГУ НИИ питания РАМН (109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ питания РАМН.

Автореферат разослан «____»______________200___ г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Коденцова В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Открытия последних лет показали, что хорошо известные биомолекулы могут участвовать в происходящих в клетке и организме процессах, проявляя новые, необычные функции. Полифункциональность, казалось бы, хорошо исследованных молекул биополимеров заставляет иначе взглянуть на их роль и значение [Ishitani et al., 1998, Муронец и др., 1999, Наградова, 2003]. Ярким примером такого полифункционального белка является глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД) (NAD - зависимая фосфорилирующая D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, КФ 1.2.1.12), которая стала основным объектом данной работы.

ГАФД катализирует один из ключевых этапов гликолиза: реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-дифосфоглицерат с образованием NADH и является одним из самых изучаемых на сегодняшний день ферментов гликолиза [Наградова, 2001, Chuang et al., 2005]. Это связано не только с важностью обеспечиваемой им гликолитической функции, но еще и с обнаруженными многочисленными негликолитическими свойствами фермента в клетке [Tatton, 2000, Tisdale 2001]. Содержание ГАФД в тканях составляет 10-20% от общего количества растворимых белков, что свидетельствует об очень важной ее роли в жизни клетки. Наиболее необычным свойством ГАФД является ее способность превращаться при окислении сульфгидрильных групп в ацилфосфатазу, то есть приобретать новую ферментативную активность [Allison, Connors, 1970, Schmalhausen, Muronetz, 1997]. Функциональное значение появления такой активности ГАФД в регуляции энергетического обмена до сих пор было мало изучено. Кроме того, недавно было обнаружено, что ГАФД участвует в слиянии клеточных мембран и клеточной адгезии, экспорте тРНК, репликации и репарации ДНК. Имеются многочисленные данные о том, что ГАФД вовлечена в развитие нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера и Паркинсона и др.) и вирусных инфекций, а также показано, что она играет важную роль в индукции апоптоза клетки [Sirover, 1999, Mazzola, Sirover, 2001]. Однако конкретные механизмы, объясняющие участие ГАФД во всех этих патологических процессах, до сих пор неизвестны. Было высказано несколько гипотез об участии ГАФД в регуляции важных для клетки процессов (в том числе, связанных с патологическими изменениями) [Schmalhausen, Muronetz, 1997, Arutyunova et, al., 2003, Polyakova et al., 2005, Hara et al., 2006], которые, однако, не получили пока достаточного экспериментального подтверждения в имеющейся научной литературе по данному вопросу.

Кроме того, учитывая важность ГАФД для функционирования клетки, особое значение приобретает разработка подходов, позволяющих избирательно воздействовать на ее свойства.

Цели и задачи исследования. Целью работы является определение характеристик и установление механизмов тех внутриклеточных процессов, в которых ГАФД участвует за счет проявления своих неканонических функций, несвязанных непосредственно с гликолитическим процессом.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Проверка гипотезы, согласно которой, появление ацилфосфатазной активности у частично окисленной перекисью водорода ГАФД, может приводить к разобщению окисления и фосфорилирования в гликолизе.

2. Проверка предположения, согласно которому изменение связывания окисленной ГАФД с нуклеиновыми кислотами является одним из механизмов вовлечения фермента в индукцию апоптоза, и изучение влияния изменения внутриклеточной локализации ГАФД при индукции апоптоза в клетках HeLa.

3. Изучение взаимодействия шаперонина с ненативными и неправильно свернутыми формами фермента (на примере ГАФД), а также влияния такого взаимодействия на шаперонин-зависимое сворачивание белков.

4. Разработка методов получения антител к различным формам ГАФД для создания высокоспецифических ингибиторов ферментов, функционирующих за счет белок-белковых взаимодействий.

Научная новизна работы. В настоящей работе была экспериментально подтверждена гипотеза о существовании разобщения окисления и фосфорилирования в гликолизе на стадии, катализируемой ГАФД и 3-фосфоглицераткиназой. Было доказано, что как в смеси ферментов гликолиза, так и в тканевых экстрактах окисление ГАФД приводит к ускорению гликолиза и, одновременно, к уменьшению синтеза ATP. Был установлен механизм обнаруженного явления. Оказалось, что мягкое окисление ГАФД перекисью водорода приводит к появлению у фермента ацилфосфатазной активности при сохранении дегидрогеназной. Это ведет к разобщению гликолиза, изменяя его энергетическую эффективность и скорость. Важнейшим результатом окисления ГАФД перекисью водорода является способность эффективно образовывать лактат при недостатке ADP как в смеси гликолитических ферментов, так и в цитоплазматической фракции мышц.

Были получены прямые доказательства предположения об изменении связывания окисленной ГАФД с нуклеиновыми кислотами как одного из механизмов вовлечения фермента в индукцию апоптоза и перераспределения фермента между внутриклеточными фракциями. Так было доказано, что окисление ГАФД увеличивает ее сродство к нуклеиновым кислотам, особенно в присутствии окисленного кофактора фермента - NAD. Впервые было показано, что такой модификацией является окисление цистеиновых остатков в активных центрах фермента. Эти данные впервые показывают важную роль модификации высоко реакционноспособных сульфгидрильных групп ГАФД в регуляции сродства фермента к нуклеиновым кислотам. Было впервые обнаружено, что при апоптозе, вызванном действием перекиси водорода, происходит перераспределение ненативных форм ГАФД между ядром и цитоплазмой.

Впервые было показано, что формы белков, неспособные в принципе свернуться в нативную конформацию, необратимо блокируют шаперонин, препятствуя тем самым правильному сворачиванию других полипептидных цепей. Так, было обнаружено, что инкубация шаперонина GroEL с мутантными O-R-димерами (или с ГАФДДТНБ) в растворе приводит к образованию стабильного комплекса. При этом связывание шаперонина с этими формами ГАФД блокирует GroEL-зависимый рефолдинг термостабильной ГАФД B.st.. Кроме того, впервые было обнаружено, что присутствие окисленных форм ГАФД также блокирует шаперон-зависимую стадию ренатурации.

Был предложен метод получения антител против неактивных форм ферментов, которые были способны вызывать инактивацию нативного фермента за счет индукции конформационных перестроек. Было доказано, что в определенных условиях инактивируются не только те субъединицы фермента, которые взаимодействуют с антителом, но и соседние (благодаря передаче белок-белковых взаимодействий между отдельными субъединицами). Этот подход открывает новые возможности создания специфических ингибиторов ферментов на основе антител, вызывающих конформационные перестройки в белках за счет неполного соответствия эпитопов и активных центров антител.

Практическое значение работы. На основании исследованных механизмов вовлечения ГАФД в регуляцию жизнедеятельности клетки в норме и патологии показано, что этот фермент является важным объектом для действия лекарственных препаратов. Прежде всего, возникает обоснованная возможность ускорять эффективность энергетического обмена путем ингибирования дегидрогеназной активности ГАФД мягкими окислителями. В этом случае окисленная ГАФД проявляет ацилфосфатазную активность, что приводит к разобщению окисления и фосфорилирования в гликолизе. В результате скорость гликолиза увеличивается, а снижение его эффективности (уменьшение образования АТР) компенсируется за счет окислительного фосфорилирования в митохондриях. Таким образом, нами предлагается новый способ воздействия на энергетический обмен клеток.

Обнаруженное нами влияние окисления ГАФД на эффективность ее связывания с нуклеиновыми кислотами и транслокацию в ядро позволяет, с одной стороны, предложить новые пути регуляции апоптоза, а с другой, разработать новые методы ранней диагностики патологических изменений в клетках и тканях на основе транслокации ГАФД из цитоплазмы в ядро.

На примере взаимодействия окисленной и модифицированной ГАФД с шаперонином показана возможная роль этого процесса в развитии нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы. Правильный подбор лекарственных препаратов и продуктов питания, предупреждение воздействия ядовитых соединений, модифицирующих сульфгидрильные группы ГАФД, регулирование процесса окислительного стресса, профилактическое введение антиоксидантов должно препятствовать появлению поврежденных белков и исключать их блокирующее воздействие на шаперонин. На основании этих наблюдений могут быть предложены новые способы профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний (прежде всего профилактическое применение антиоксидантов).

Предложен принципиально новый подход для отбора антител, способных вызывать развивающуюся во времени инактивацию нативных форм ферментов. На основе этого метода могут быть получены новые типы ингибиторов ферментов, действие которых заключается в индукции конформационных перестроек, трансформирующих нативную конформацию белка в неактивную.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместных заседаниях отделов биокинетики и биохимии животной клетки НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, а также на перечисленных ниже Всероссийских и международных конференциях: III съезд Биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2002), Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kiev, 2003), I Международная конференция “Химия, структура и функция биомолекул» (Минск, 2004), Международная юбилейная конференция, посвященная 70-летию В.П.Скулачева «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), International conference «Fundamentals and Application» dedicated to 250th anniversary of Moscow State University (St.Petersburg-Kizhiy-Valaam, 2005), International alumni seminar on “Biotechnology and Health” (Erevan, 2005, 2008), II Международная конференция “Химия, структура и функция биомолекул» (Минск, 2006), VI симпозиум «Химия протеолитических ферментов», посвященного памяти В.К.Антонова (Москва, 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология. Проблемы и перспективы» (Светлогорск, 2008).

По материалам диссертации опубликовано 35 печатных работ. Опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ - 9 публикаций, другие издания - 8 публикаций, материалы научных конференций - 18 публикаций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (429 ссылок). Объем работы составляет 375 страниц, содержит 60 рисунков и 6 таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу Bacillus stearothermophilus выделяли из штамма-суперпродуцента Escherichia coli GM-109. Данный штамм был трансформирован мультикопийной плазмидой pskBstII, содержащий ген ГАФД из B.st. Плазмида была любезно предоставлена проф. Ги Бранлантом из Университета Пуанкаре (г. Нанси, Франция). Выделение проводили согласно методике Ройтел и соавторов (Roitel O. et al., 1999). Мутантные формы ГАФД B.stearothermophilus из клеток E. coli штамма GM-109, трансформированных плазмидой psk II B. stearothermophilus, выделяли по той же методике.

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из скелетных мышц кролика выделяли по методике Хилла (Hill C.M. et al., 1975).

Нефосфорилирующую глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (ГАПН) Streptococcus mutans из штамма E.coli DH5, трансформированного мультикопийной плазмидой pskBstII, несущей ген ГАПН S. mutans, проводили по методу Кроу и Виттенбергера (Crow and Wittenberger, 1979).

Шаперонин GroEL из клеток E.coli штамма W3110, трансформированной плазмидой рОF39, содержащей ген GroEL проводили по методике Корралеса и Фершта с некоторыми модификациями (Corrales, Fersht, 1996). Плазмида, содержащая ген GroEL, была любезно предоставлена проф. В.В. Месянжиновым (ИБОХ РАН).

Моноклональные антитела клона 6С5 против ненативных форм ГАФД были получены нами ранее совместно с А. Г. Катрухой.

3-фосфоглицераткиназу, 3-фосфоглицератмутазу и енолазу выделяли из мышц кролика по методу Скоупса (Scopes, Stoter, 1982).

Ренин из почек выделяли по описанной нами методике с применением ионообменной и аффинной хроматографии на иммобилизованном пепстатине (Плетень и др., 1979).

Выделение протаминов, а также их дополнительная очистка до электрофоретически гомогенного состояния, определение аминокислотного состава и др. физико-химических свойств были проведены по описанной нами ранее методике (Исаева и др., 1989). В этой работе был использован только один из препаратов - протамин из лососевых рыб («сальмин»), представляющий собой монопротамин, содержащий в своем составе только одну основную аминокислоту - аргинин.

Концентрацию белка определяли методом Бредфорд (Bradford M., 1976) и спектрофотометрически по поглощению при длине волны 280 нм (А0,1%280 холоГАФД B.st.=0,92, апоГАФД B.st.=0,83, холоГАФДк =1,0, апоГАФДк =0,83, IgG =1,5).

Концентрацию иммобилизованных белков определяли по модифицированному методу Бредфорд (Asryants R. et al., 1985).

Определение дегидрогеназной активности ГАФД проводили спектрофотометрически по увеличению поглощения NADH.

Ацилфосфатазную активность окисленной ГАФД определяли спектрофотометрически по накоплению NADH в сопряженной системе с восстановленной ГАФД по методике Шмальгаузен и др. (Schmalhausen E.V., 1999).

Иммобилизацию белков проводили по методике, разработанной ранее в нашей лаборатории (Cherednikova T. et al., 1980). Степень активации носителя составляла 5-10 мг BrCN/г влажной сефарозы для иммобилизации ГАФД за одну субъединицу, 30 мг BrCN/г сефарозы для иммобилизации ГАФД за две субъединицы или для иммобилизации GroEL.

Получение иммобилизованных форм ГАФД различной нативности и степени олигомерности проводили в соответствии с описанными ранее подходами (Муронец и др., 1980, Cherednikova T. et al., 1980). Иммобилизованные на Cефарозе активные димеры ГАФД из мышц кролика и B. Stearothermophilus получали после диссоциации иммобилизованного активного тетрамера на свободный и связанный с матрицей димеры. Неактивный тетрамер получали обработкой иммобилизованного тетрамера глутаровым альдегидом. Для получения иммобилизованной денатурированной ГАФД тетрамеры, связанные с матрицей через одну субъединицу, денатурировали до полной инактивации фермента в 8 М мочевине или в буфере c рН 2,3.

Иммунизацию кроликов проводили согласно стандартной процедуре (Green J. and Manson M., 1998), используя для иммунизации 2 мл эмульсии, содержащей 1т мл полного адъюванта Фрейнда, 0,5-0,8 мг ГАФД B. stearothermophilus и 0,8 мг GroEL. Это позволило выделить из сыворотки крови одного животного антитела против двух антигенов.

Выделение антител на иммобилизованных антигенах. Фракцию иммуноглобулинов G, полученную из поликлональной сыворотки, наносили на сорбенты с различными иммобилизованными антигенами и инкубировали в течение 30-40 минут. Не связавшиеся с иммуносорбентом антитела собирали, а сефарозу промывали буферным раствором. Низкоспецифичные антитела элюировали буферным раствором с рН 4,3. Высокоаффинные антитела элюировали буферным раствором с рН 2,3. Полученные антитела немедленно нейтрализовали двукратным объемом фосфатного буферного раствора (рН 7,7), замораживали и хранили при температуре -20С.

Титр антител на ГАФД и GroEL в сыворотке определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа ELISA по классической процедуре непрямого иммуноферментного анализа (Barh G.M. et al., 1980). Степень перекрестной реакции между антителами определяли с помощью метода иммунопреципитации с Protein G. ГАФД инкубировали с эквимолярным количеством антител в течение 20 мин, а затем добавляли иммобилизованный Protein G. После 40 мин инкубации сефарозу промывали и состав проб анализировали ДСН-электрофорезом. Анализ интенсивности белковых полос проводили с помощью компьютерной программы PCBAS 2.08.

Электрофорез в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле в присутствии ДСН, а также нативный электрофорез и иммуноблоттинг проводили с соответствии со стандартными процедурами.

Введение [32P]dATP в ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. ДНК метили с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I с добавлением случайных гексануклеотидов и [32P]dAТФ согласно стандартной методике (Маниатис Т. и др., 1984).

Связывание ГАФД с мечеными ДНК и РНК. Апоформу ГАФД кролика получали с помощью аффинной хроматографии на колонке с Affi-blue сефарозой. АпоГАФД подвергали окислению Н2О2. Окисленный и восстановленный апоферменты затем инкубировали с ДНК или РНК в присутствии кофакторов (NAD или NADH) или без них. Затем проводили фильтрацию смеси через нитроцеллюлозные фильтры (0,45 m, Millipore HA), промывку фильтров и измерение радиоактивности во всех пробах (Wong I. and Lohman T.M., 1993)

Изучение субклеточной локализации ГАФД в клетках HeLa в процессе апоптоза. Клетки HeLa и HeLa-Bcl-2 выращивали на среде Eagle (Rovensky Y.A. et al., 1999). В апоптоз клетки вводили одновременным добавлением TNF- и ингибитора синтеза белка (эметина) в количестве 1 мкг/мл среды. Перекисный апоптоз индуцировали добавлением в культуральную среду раствора перекиси водорода до конечной концентрации 10 мкМ. Культуру клеток HeLa и HeLa-Bcl-2 выращивали в течение двух дней и фиксировали 4% раствором формальдегида. Актиновые микрофиламенты окрашивали флуоресцентным красителем родамин-фаллоидином. ГАФД окрашивали с помощью моноклональных антител клона 6С5. Клетки исследовали и фотографировали с помощью микроскопа Axiophot (Carl Zeiss, Germany) и объективов (Apochromat, Germany) с 40 - и 60 - кратным увеличением, а также конфокального лазерного микроскопа LSM-510 (Carl Zeiss, Germany) со 100 - кратным увеличением.

Анализ методом дифференциальной сканирующей калориметрии(ДСК) проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре "ДАСМ-4" ("Биоприбор", Россия). Измерения проводили при скорости нагрева 1,0оС/мин в диапазоне температур от 20 до 100оС при избыточном давлении 2 атм.

Регистрацию спектров кругового дихроизма проводили на дихрографе MARK V “Jobin Ivon” (Франция), управляемом компьютером IBM-PS 1-6, в кювете с длиной оптического пути 1 см. Данные обрабатывали с использованием программы RDA.

Определение коэффициента седиментации. Седиментационный анализ проводили на аналитической ультрацентрифуге Beckman E с использованием фотоэлектрической сканирующей приставки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. РАЗОБЩЕНИЕ ГЛИКОЛИЗА ПРИ ИНДУКЦИИ АЦИЛФОСФАТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

гликолиз глицеральдегид нуклеиновый фермент

Одной из основных целей работы являлась проверка гипотезы, согласно которой, появление ацилфосфатазной активности у частично окисленной перекисью водорода глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД), может приводить к разобщению окисления и фосфорилирования в гликолизе (Schmalhausen, Muronetz, 1997). Для проверки этого предположения мы изучили влияние Н2О2 на гликолиз, используя смесь очищенных ферментов гликолиза или цитоплазматическую фракцию из мышц крысы. Было показано, что окисление ГАФД Н2О2 действительно приводит к ускорению гликолиза на участке 3-ФГА - лактат как в смеси ферментов (рис. 1), так и в цитоплазматической фракции мышц.



Рис. 1. Зависимость накопления лактата от концентрации H2O2 при инкубации смеси ферментов в присутствии 3-ФГА и ADP. Концентрация 3-ФГА в среде 3мМ, концентрация ADP 1мМ. Накопление лактата в пробах, содержащих МЭ, принимали за 100% активности.

Концентрация перекиси водорода, вызывающая максимальный прирост лактата (на 100-150 %), в смеси ферментов и в мышечном экстракте составляет 5-10 и 100 мкМ, соответственно. Дальнейшее увеличение концентрации перекиси водорода приводит к снижению концентрации лактата в пробах, что объясняется ингибированием как дегидрогеназной, так и ацилфосфатазной активностей вследствие окисления Cys-149 до более высокой степени окисления, чем сульфеновая кислота.

Известно, что в аэробных условиях, при интенсивном функционировании митохондрий, протекание гликолиза должно затормозиться из-за недостатка ADP.

Мы предположили, что может произойти не замедление, а блокирование гликолиза из-за особенности сопряженной реакции, катализируемой ГАФД и 3-ФГкиназой. Так, после образования 1,3-ДФГ он может или связываться с 3-ФГкиназой или ацилировать ГАФД. В обоих случаях промежуточный комплекс является стабильным, причем превращения 1,3-ДФГ в 3-ФГ без добавления ADP не происходит. Окисление ГАФД может вызывать увеличение скорости гликолиза, за счет расщепления 1,3-дифосфоглицерата до 3-фосфоглицерата даже при очень низких концентрациях цитоплазматической ADP. При этом стадия, на которой происходит синтез АТP, исключается (и, следовательно, нет необходимости в использовании ADP), а реакция образования NADH становится независимой от киназной реакции и присутствия ADP.

Было показано, что в присутствии окисленной ГАФД гликолиз эффективно протекает даже при низких концентрациях ADP (Рис.2). Наибольшая разница в накоплении лактата между опытными пробами, содержащими 10 мкМ H2O2 и контрольными, содержащими 2 мм МЭ, наблюдается при низких концентрациях ADP (менее 0,5 мМ), когда скорость 3-ФГкиназной реакции падает из-за недостатка ADP. В этом случае наличие дополнительного ADP- независимого пути расщепления 1,3-ДФГ приводит к ускорению гликолиза. Сходные результаты были получены в эксперименте с цитоплазматической фракцией мышц.



Рис. 2. Зависимость накопления лактата от концентрации ADP при инкубации смеси ферментов в присутствии 3-ФГА. Концентрация H2O2 в опыте 10 мкМ, концентрация 3-ФГА 3 мМ, концентрации ADP указаны на рисунке, светлые столбики - пробы, содержащие H2O2; темные столбики - пробы, содержащие МЭ.

За протеканием гликолиза мы следили не только по накоплению лактата, но и по изменению концентрации АТP в среде.

В таблице 1 представлено соотношение образования лактата и ATP в мышечном экстракте в зависимости от наличия окислителя или восстановителя в среде.

Таблица 1.

Накопление АТP в цитоплазматической фракции мышц в присутствии 3 мМ 3-ФГА и 1мМ АDP.

	Лактат, мM	ATP, мМ	ATP/ 3-ФГА наблюдаемое	ATP/ 3-ФГА теоретическое
В присутствии 100 мкM Н2О2	0,62 0,038	0,65 0,01	1,04 0,08	1 полное разобщение
В присутствии 1 мМ MЭ	0,186 0,022	0,31 0,032	1,61 0,14	2 полное сопряжение

Из таблицы 1 видно, что хотя в присутствии H2O2 количество образовавшегося АТP выше в 2 раза, а лактата - в 3 раза, чем в присутствии МЭ, однако эффективность гликолиза существенно возрастает в присутствии меркаптоэтанола, о чем свидетельствует отношение АТP/3-ФГА. Если в пробе с МЭ на каждую молекулу 3-ФГА образуется около 2 молекул АТP, что соответствует состоянию полного сопряжения в гликолизе, то в пробе, предварительно окисленной Н2О2 , соотношение АТP/ФГА составляет 1,04, то есть только 1 молекула АТP синтезируется на моль 3-ФГА. Это позволяет предположить, что в последнем случае АТP синтезируется только в ходе пируваткиназной реакции. Это свидетельствует о разобщении окисления и фосфорилирования в гликолизе на стадии, катализируемой ГАФД-3-ФГ-киназой. Таким образом, окисление ГАФД приводит к ускорению гликолиза, но к уменьшению синтеза АТP.

Эти наблюдения подтверждают наше предположение, что окисленная ГАФД, необратимо расщепляя 1,3-ДФГ, направляет гликолиз в обход 3-ФГкиназной реакции, обеспечивая тем самым накопление NADH и пирувата независимо от наличия ADP.

Накопление лактата в пробах, содержащих окисленную ГАФД, возможно и при наличии в среде одной лишь АТР. Как следует из таблицы 2, эффективное накопление лактата в присутствии 1мМ АТP наблюдалось только в пробах, окисленных перекисью водорода. В присутствии МЭ прирост лактата был крайне низким - в 10-12 раз ниже, чем в окисленных Н2О2 пробах. Сходные эффекты наблюдались как в смеси гликолитических ферментов, так и в цитоплазматической фракции мышц.

Таблица 2.

Накопление лактата в присутствии 3мМ 3-ФГА и 1 мМ ATP.

	Концентрация лактата, мM
	в присутствии МЭ	в присутствии H2O2
смесь ферментов	0,024 0,006	0,27 0,008
цитоплазматическая фракция мышц	0,015 0,005	0,18 0,006

Окисление проводили в присутствии H2O2 в концентрации: 10 мкМ (смесь гликолитических ферментов );100мкМ (цитоплазматическая фракция).

Рис. 3. Схема “футильного цикла гликолиза”.

По всей видимости, в опытах с использованием АТР мы видим явное доказательство работы “футильного цикла” с участием 3-ФГкиназы и окисленной ГАФД (схема на рис.3).

В ходе такого цикла ATP и 3-ФГ, образующиеся в системе, превращаются в ADP и 1,3-ДФГ при участии 3-ФГкиназы, а окисленная форма ГАФД вновь гидролизует 1,3-ДФГ до 3-ФГ, который снова поступает в цикл.

Таким образом, комбинация окисленной ГАФД и 3-ФГкиназы в присутствии 3-ФГА, приводит к гидролизу АТP с образованием АDP, который используется в пируваткиназной реакции. Благодаря такому «футильному циклу» гликолиз может функционировать даже в тех условиях, когда его протекание по обычному пути заблокировано из-за отсутствия АDP.

Дополнительное подтверждение предложенной нами гипотезы о разобщении окисления и фосфорилирования в ходе гликолиза было получено в опытах с нефосфорилирующей глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой. Этот фермент, отсутствующий в тканях животных, катализирует NADP-зависимое превращение 3-фосфоглицеринового альдегида сразу в 3-фосфоглицерат без образования макроэргических соединений. Мышечный экстракт инкубировали в присутствии ADP, ФГА, NADP (кофактор ГАПН) и NADH (кофактор ЛДГ) и различных концентраций ГАПН. Было показано, что в присутствии 1 и 3,5 мкМ ГАПН накопление лактата возрастает в 5 и 8 раз, соответственно, по сравнению с пробами без добавления этого фермента. ГАПН способна эффективно заменять собой окисленную ГАФД и при добавлении в мышечный экстракт АТP вместо ADP. Таким образом, показана возможность существования футильного цикла, благодаря наличию в системе фермента-разобщителя. Таким образом, введение независимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназной системы с гидро-, а не с фосфоролитическим расщеплением ацил-фермента дает те же эффекты, что и наличие ацил-фосфатазной системы, расщепляющей 1,3-дифосфоглицерат. Обсуждаемые процессы могут иметь особое значение в условиях дефицита ADP в цитоплазме клетки, особенно при интенсивном дыхании, происходящем в митохондриях. Такие реакции позволяют поставлять субстраты в митохондрии (NADH и пируват) независимо от уровня ADP в цитоплазме, что может быть важным при работе митохондрий в режиме разобщения, а также обеспечивать приток субстратов для реакций биосинтеза.

2. Влияние H2O2 НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГАФД С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ

Существует обширная информация об участии ГАФД в индукции апоптоза и в развитии ряда патологических состояний, которое опосредовано осуществляется через взаимодействие фермента с нуклеиновыми кислотами. Однако конкретные механизмы этих процессов не изучены. По этим причинам мы исследовали влияние окисления перекисью водорода на особенности связывания ГАФД с нуклеиновыми кислотами, предполагая, что такое окисление может быть одним из механизмов вовлечения фермента в индукцию апоптоза.

Мы предположили, что в зависимости от степени окисления ГАФД и наличия кофактора в ее активном центре, фермент должен по-разному связываться с нуклеиновыми кислотами. Прежде всего, окисление SH- групп Cys-149 ГАФД должно понижать прочность связывания NAD в активном центре фермента, вследствие невозможности образования комплекса с переносом заряда между модифицированным Cys-149 фермента и кофактором. Способность такого окисленного фермента связываться с нуклеиновыми кислотами может изменяться как за счет изменения эффективности конкуренции кофактора и нуклеиновых кислот за активный центр ГАФД, так и благодаря изменению его сродства к НК.

Для проверки данной гипотезы мы определили параметры связывания полностью окисленной (100 мкм перекисью водорода) и полностью восстановленной (2 мМ МЭ) ГАФД с кофакторами NAD и NADH. Параметры связывания NAD или NADH с ГАФД определяли по тушению белковой флуоресценции по мере увеличения концентрации кофакторов. Было показано, что у восстановленной формы фермента присутствуют 4 центра связывания NAD на тетрамер ГАФД: два участка прочного (стехиометрического) связывания (КД менее 100 нМ), а также и 3 и 4 участки с КД 0,9 мкМ и 12 мкМ, соответственно. После окисления ГАФД до полного исчезновения всех видов активности фермента, сродство ГАФД к коферменту NAD значительно снижается - исчезают участки прочного стехиометрического связывания, а для участков непрочного связывания Кд снижается до 64 мкМ. Это происходит из-за невозможности образования комплекса с переносом заряда между модифицированным остатком Cys-149 и NAD. Так как NADH не способен образовывать комплекс с переносом заряда с Cys-149, то окисление фермента должно в меньшей степени влиять на его сродство к NADH. Действительно, окисленная форма фермента обладает двумя участками прочного стехиометрического связывания NADH и двумя участками связывания с КД 0,03 и 7мкМ. Таким образом, полученный результат подтверждает наше предположение о более высоком сродстве окисленного фермента к NADH, чем к NAD.

Для изучения взаимодействия нуклеиновых кислот с окисленной ГАФД был использован метод связывания белков с нуклеиновыми кислотами на нитроцеллюлозных фильтрах. В работе использовалась [32P] меченная суммарная тРНК, [32P] меченная тотальная ДНК и апофермент. Фермент окисляли 70 мкМ раствором перекиси водорода, а в восстановленном состоянии поддерживали 2 мМ МЭ. Результаты связывания ГАФД с [32P] меченной суммарной тРНК представлены на рис. 4. тРНК связывается и с окисленной апоГАФД и с восстановленной апоГАФД (кривые 7 и 5).



Рис. 4. Взаимодействие [32P] меченной тРНК с окисленной и восстановленной ГАФД. Апофермент ГАФД в 10мМ Трис-HCl, рН 7,6, содержащем 7мМ MgCl2 и 10мМ KCl, окисляли 70 мкM раствором перекиси водорода или инкубировали в присутствии 2мМ раствора МЭ, а затем инкубировали с [32P] меченной суммарной тРНК в различных молярных соотношениях в течение 30 минут при 37оС. Кофакторы NAD и NADH в концентрации 100мкM добавляли за 10 минут до внесения в пробы тРНК. Комплексы адсорбировали на нитроцеллюлозных фильтрах, счет осуществляли по Черенкову. 1 - связывание тРНК с БСА в качестве контроля; 2 - окисленная ГАФД в присутствии NADH; 3 - восстановленная ГАФД в присутствии NADH; 4 - восстановленная ГАФД в присутствии NAD; 5 - восстановленная ГАФД без кофакторов; 6 - окисленная ГАФД в присутствии NAD; 7 - окисленная ГАФД в отсутствие кофакторов. Молярную концентрацию ГАФД определяли из расчета на мономер фермента.

Однако, связывание с окисленной формой происходит гораздо лучше, чем с восстановленной, т.е. окисление само по себе повышает сродство ГАФД к тРНК. Присутствие же кофактора практически предотвращает связывание тРНК с восстановленной формой фермента (кривая 4) и незначительно уменьшает связывание ее с окисленной (кривая 6). NADH обладает более выраженной способностью предотвращать связывание ГАФД с РНК, чем NAD (кривые 2 и 3).

Из-за более высокой прочности связывания кофактора NADH в активном центре окисленной ГАФД, концентрация NADH, способная воспрепятствовать связыванию тРНК с окисленным ферментом, ниже, чем соответствующая концентрация NAD.

Таким образом, можно прийти к заключению, что комплекс с РНК может образовываться только в тех случаях, когда кофактор NAD в активном центре ГАФД либо отсутствует, либо связан непрочно, из-за неспособности образовывать комплекс с переносом заряда.

Далее мы исследовали взаимодействие ГАФД с тотальной [32P] меченой ДНК. Как видно из приведенных на рисунке 5 данных - наилучшее связывание ДНК наблюдается с окисленной апоГАФД (кривая 1). Присутствие кофактора NAD ослабляет взаимодействие ДНК с окисленным ферментом (кривые 2, 3) и практически предотвращает его взаимодействие с восстановленным (кривые 5 и 6). Эти результаты аналогичны данным, полученным при изучении взаимодействия ГАФД с тРНК.



Рис. 5 Взаимодействие [32P]меченной тотальной ДНК с окисленной и восстановленной ГАФД.

Апофермент ГАФД в 10мМ Трис-HCl, рН 7,6, содержащем 7мМ MgCl2 и 10мМ KCl, окисляли 70 мкM раствором перекиси водорода или инкубировали в присутствии 2мМ раствора МЭ, а затем инкубировали с [32P] меченной тотальной ДНК в различных молярных соотношениях в течение 30 минут при 37оС. Кофактор NAD в концентрации 100мкM или 3мМ добавляли за 10 минут до внесения в пробы ДНК. Комплексы адсорбировали на нитроцеллюлозных фильтрах, счет осуществляли по Черенкову. 1 - окисленная апоГАФД в отсутствии кофактора; 2 - окисленная ГАФД в присутствии 100мкM NAD; 3 - окисленная ГАФД в присутствии 3мМ NAD; 4 - восстановленная апоГАФД без кофактора; 5 - восстановленная ГАФД в присутствии 100мкM NAD; 6 - восстановленная ГАФД в присутствии 3мМ NAD. Смесь [32P] меченной ДНК с БСА использовали в качестве контроля (7). Молярные концентрации ГАФД определяли на мономер белка.

Было показано, что окисление ГАФД увеличивает ее сродство к нуклеиновым кислотам. Эти данные подтверждают важную роль модификации ГАФД в ее способности взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами.

Мы впервые показали, что такой модификацией может быть окисление цистеиновых остатков в активных центрах фермента, причем даже присутствие кофактора NAD не могло воспрепятствовать этому взаимодействию.

Как было показано выше, окисление фермента может ослаблять связывание с ним кофактора NAD. В то же время известно, что четвертичная структура апофермента гораздо менее стабильна, чем холофермента (Lakatos S. and Zavodsky P., 1976), и, таким образом, окисление ГАФД может приводить к диссоциации апофермента на димеры и мономеры. Таким образом, окисление вызывает появление в клетке ненативных форм ГАФД, способных перемещаться из цитоплазмы в ядро. Следовательно, с помощью антител к ненативным формам ГАФД можно попытаться визуализовать такие формы in vivo методом иммунного окрашивания, показав, таким образом, их субклеточную локализацию. Этим исследованиям был посвящен следующий раздел нашей работы.

3. ИЗМЕНЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗ ПРИ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА

На основании собственных и литературных данных мы предположили, что именно ненативные формы ГАФД, которые неспособны участвовать в катализе гликолитической реакции, могут быть вовлечены в патологические процессы. В связи с этим было решено изучить внутриклеточную локализацию нететрамерных, то есть ненативных форм ГАФД. Для иммунной окраски ненативной ГАФД в клетке были использованы моноклональные антитела клона 6С5, которые с высокой аффинностью связывались с димерной, мономерной и денатурированной формами ГАФД, но не с нативными тетрамерами. (Grigorieva J. et al., 1999). На рисунке 6, А представлены результаты такого окрашивания. Видно ярко светящееся ядро, цитоплазма же остается практически темной. Лишь по краям заметно окрашивание, напоминающее стресс фибриллы. Видно, что окрашивание ГАФД по краям цитоплазмы полностью совпадает с окраской актина, то есть можно говорить о взаимодействии в клетке ненативной формы ГАФД и актина. Для подтверждения выявленной нами колокализации ГАФД и актина, мы использовали конфокальную микроскопию.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.

6. Внутриклеточная локализация ненативной ГАФД (А) и актина (В) в клетках HeLa

На рисунке 7 представлены результаты одновременного окрашивания клеток на ГАФД и актин.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.7 Одновременное окрашивание клеток HeLa на ненативную форму ГАФД и актин. Клетки HeLa выращивали и окрашивали так же, как и в предыдущем эксперименте mAbs 6C5 и фаллоидином. Зеленое свечение - окраска ненативной формы ГАФД в клетках; красное - окраска актина. А - локализация актина в клетках HeLa; B - локализация ГАФД в клетках HeLa; C - колокализация ГАФД и актина в клетках HeLa

Видно, что окраска на ненативную ГАФД полностью совпадает с окраской на актин, что подтверждает оранжевое свечение комплекса (С) (окраска на ГАФД - зеленое свечение (В), на актин - красное (А)).

Таким образом, нами была продемонстрирована колокализация ненативной ГАФД и актина в нормальных клетках HeLa.

Для клетки известны состояния, когда в процессе апоптоза цитоплазматическая ГАФД транслоцируется в ядро. Для того чтобы оценить, что происходит при этом с ненативной формой фермента, мы изучили его субклеточную локализацию в процессе апоптоза. Апоптоз в клетках HeLa вызывали их инкубацией с TNF. На рисунке 8 показано окрашивание клеток HeLa mAbs 6C5 после 4 часов инкубации с TNF. На рисунке мы можем выделить 3 типа клеток, отличающихся по окраске. 1 - большие клетки, в которых четкая окраска ядра исчезла, вся клетка окрашена равномерно неярко, хотя осталось более четкое окрашивание краев клетки. По своей морфологии клетки еще близки к контрольным; 2 - клетки, окраска которых напоминает "солнечное затмение". Морфологически клетки уже заметно округлены; 3 - клетки, в которых яркая окраска наблюдается во всей клетке. Морфологически клетки также округлены. Второй тип клеток здесь составляет большинство популяции. После 6 часов инкубации с TNF. большую часть популяции составляет уже третий тип клеток, где ярко окрашена вся цитоплазма, а сами клетки круглые, заметно отличающиеся от морфологически нормальных. Мы полагаем, что эти три типа окрашивания ненативной ГАФД в процессе апоптоза представляют собой различные стадии, которые проходит данная форма фермента при апоптозе.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 8. Локализация ненативных форм ГАФД в клетках HeLa в процессе апоптоза после 4 часов инкубации с TNF.

Что же происходит на начальном этапе после индукции апоптоза, когда исчезает ярко окрашенное ядро и окрашивание равномерно распределяется по всей клетке? Мы предположили, что возможны два пути развития событий - ненативная ГАФД просто выходит из ядра после индукции апоптоза, или она замещается транслоцирующейся в ядро нативной ГАФД, которую антитела 6С5 не окрашивают, поэтому мы больше не видим яркой окраски. Проведение аналогичных экспериментов на клетках с экспрессированным белком Bcl-2, препятствующим развитию апоптоза и транслокация ГАФД в ядро показало, что Bcl-2 не предотвращает перераспределение ненативной ГАФД. Вероятно, перераспределение ненативной ГАФД и транслокация цитоплазматического фермента в ядро при апоптозе - процессы независимые друг от друга и первый процесс нельзя объяснить простым вытеснением ненативной ГАФД из ядра пришедшим из цитоплазмы ферментом. Мы полагаем, что выход ненативной ГАФД из ядра может быть маркером самых ранних этапов развития апоптоза, предшествующим процессу ядерной транслокации цитоплазматической ГАФД.

Мы также изучали распределение в клетке ненативной ГАФД при апоптозе, вызванном действием другого агента - перекиси водорода. Было показано, что через 1 час и 15 минут ядро все еще видно, но оно становится менее четким. А через 3 часа окраска равномерно распределяется по всей цитоплазме. Четких границ ядра больше не видно. Через 20 часов мы наблюдали картину, аналогичную последним стадиям развития апоптоза при индукции TNF. Таким образом, существенных отличий в поведении в клетке ненативной формы ГАФД при перекисном апоптозе от TNF-индуцированного не наблюдается. Кроме того, мы исследовали поведение ГАФД, связанной с актином при перекисном апоптозе с помощью конфокальной микроскопии. После 15 минут и 1 часа 15 минут существенных изменений по сравнению с контрольными клетками обнаружено не было - ГАФД была колокализована с актином. Однако после 3 часов инкубации ненативная ГАФД диссоциировала из комплекса с актином. Это можно было проследить по изменению цвета комплекса - при колокализации фермента с актином он окрашивается в оранжевый цвет, а при диссоциации наблюдается отдельно свечение ГАФД, а отдельно - актина.

Наши исследования показали, что, при нормальных условиях с актином колокализована ненативная ГАФД, это может быть модифицированный фермент, а также димерная или мономерная форма. При апоптозе первое время колокализация ненативной ГАФД с актином сохраняется, однако при дальнейшем развитии процесса, происходит диссоциация комплекса ненативная ГАФД - актин. Можно предположить, что, возможно, в норме в клетке с актином образует комплекс ненативная форма фермента, при апоптозе же происходит вытеснение этой формы нативным ферментом.

4. БЛОКИРОВАНИЕ ШАПЕРОНИНА GroEL С НЕНАТИВНЫМИ ФОРМАМИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗ

Для проверки гипотезы о возможности необратимого ингибирования шаперонинов модифицированными или мутантными полипептидными цепями, в принципе неспособными сворачиваться в нативную конформацию, мы использовали бактериальный шаперонин GroEL и различные ненативные формы ГАФД. На первом этапе нашей работы мы исследовали взаимодействие шаперонина с модифицированной дитионитробензоатом ГАФД из мышц кролика (ГАФДДТНБ). Мы предположили, что ковалентная химическая модификация белка может инициировать конформационные изменения, результатом которых будет образование формы белка, способной взаимодействовать с шаперонином. Так же мы предположили, что из-за необратимости ковалентной модификации, подобная форма белка будет неспособна в принципе сформировать нативную структуру. Было показано, что после модификации 16 сульфгидрильных групп происходит диссоциация фермента на субъединицы, а также изменение его термодинамических параметров. Однако, судя по данным кругового дихроизма вторичная структура ГАФД не нарушается. Параметры связывания GroEL с модифицированной ДТНБ ГАФД определяли, используя иммобилизованные на сефарозе модифицированные мономеры фермента. Было показано, что GroEL эффективно связывается только с иммобилизованной модифицированной ГАФД (рис. 9, 3), но практически не взаимодействует с иммобилизованной тетрамерной ГАФД (дор. 2) и контрольной Сефарозой (дор. 1).



Рис.9. Связывание растворимого GroEL c иммобилизованной ГАФДДТНБ.

Растворимый GroEL инкубировали с контрольной сефарозой (1), иммобилизованными тетрамерами ГАФД (2) или с иммобилизованной ГАФДДТНБ(3), затем отмывали сефарозу от несвязавшегося белка и анализировали пробы с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. 4 - белки-маркеры.

Следует отметить, что при инкубации комплекса GroEL-ГАФДДТНБ в присутствии Mg-ATP не наблюдалось его диссоциации, которая характерна для комплексов шаперонина с полипептидными цепями, способными сворачиваться в нативную конформацию. При титровании иммобилизованного модифицированного фермента растворимым шаперонином были определены параметры связывания этих белков. Кд комплекса GroEL-ГАФДДТНБ составила 0,4 мкМ при стехиометрии 0,83 молекулы GroEL на мономер ГАФД.

Таким же образом было исследовано взаимодействие GroEL с мутантрыми димерами термостабильной ГАФД B.st.. Мы трансформировали клетки Е. coli плазмидами, содержащими гены ГАФД с мутациями в области междимерных контактов (по Р- и R-оси). Были выделены О-Р-димеры (Y46G/S48G и Y46G/R52G) и O-R-димеры (Y283V и Y283V/W84F). При изучении взаимодействия шаперонина с мутантными димерами Y283V и Y283V/W84F использовали иммобилизованный за две субъединицы GroEL. Kд комплекса GroEL/O-R-димеры составила 0,9-0,8 мкМ при стехиометрии 1 димер на молекулу шаперонина. Связывание GroEL с O-R-димерами было подтверждено также анализом препаратов сефарозы методом эдектрофореза в денатурирующих условиях. Как и в случае с модифицированной ГАФД образовавшийся комплекс не распадался после инкубации с Mg-ATP. Взаимодействие GroEL и O-R-димеров наблюдалось и в системе, когда ковалентно связанным с носителем был мутантный димер ГАФД (рис. 10). Таким образом, образование комплекса между GroEL и O-R-димерами мы наблюдаем при иммобилизации любого из партнеров реакции. В аналогичных экспериментах с O-P-димерами не было обнаружено их связывания с шаперонином.

Взаимодействие GroEL с O-R-димерами в растворе было доказано методом нативного электрофореза с последующим иммуноблоттингом. Присутствие обоих белков в комплексе шаперонина с димерами было установлено с помощью специфических антител к субъединицам GroEL и ГАФД.

Дополнительные доказательства образования комплекса GroEL/O-R- димер в растворе были получены при помощи метода иммунопреципитации.



Рис. 10. Связывание растворимого GroEL с иммобилизованным димером Y283V.

1 - белки-маркеры; 2 - инкубация GroEL с контрольной сефарозой; 3 - инкубация с иммобилизованным димером Y283V.

Таким образом, мы доказали образование стабильных комплексов GroEL-ГАФДДТНБ и GroEL-O-R-димеры. Наиболее интересным является наблюдение об отсутствии диссоциации данных комплексов в присутствии Mg-ATP Этот факт указывает на возможность необратимого блокирования шаперонов полипептидными цепями, неспособными свернуться в нативную конформацию.

Влияние модифицированной ГАФДДТНБ и мутантных O-R-димеров на GroEL-зависимый рефолдинг денатурированной термостабильной ГАФД B.st.

Известно, что ни один цикл связывания и освобождения полипептида из комплекса с GroEL не может произойти в отсутствие Mg-ATP. Поэтому стабильность полученных комплексов (GroEL-O-R-димер, GroEL-ГАФДДТНБ) при их инкубации с Mg-ATP свидетельствовала о том, что нашей экспериментальной системе GroEL оказался “заблокирован” белком - субстратом. В связи с этим, было изучено влияние указанных форм ГАФД на GroEL-зависимый рефолдинг предварительно денатурированной термостабильной ГАФД B.st.. Как видно на рис.11, восстановление ферментативной активности при разведении денатурированной ГАФД достигает 20-25% и увеличивается до 50-55% в присутствии GroEL. Мутантные O-R-димеры не влияют на спонтанную реактивацию, но полностью блокируют GroEL-зависимую реактивацию фермента. Очевидно, что низкий для шаперонин-зависимой реактивации выход активного фермента можно объяснить ингибированием функционирования GroEL за счет образования прочного, недиссоциирующего в присутствии Mg-ATP комплекса шаперонина с O-R-димером. Аналогичный результат был получен в экспериментах по изучению влияния модифицированной ГАФДДТНБ на процесс спонтанной и шаперонин-зависимой реактивации денатурированной ГАФД B.st. Мы также не обнаружили эффекта модифицированной ГАФДДТНБ на спонтанный рефолдинг термостабильной ГАФД B.st., но в тоже время наблюдали ингибирование GroEL-зависимой ренатурации, как и в случае мутантных O-R-димеров.

Дополнительные подтверждения того, что ингибирование функционирования GroEL-зависимой ренатурации ГАФДB.st. является следствием связывания шаперонина с неспособным свернуться белком, были получены в следующих экспериментах. Мы использовали моноклональные антитела клона 6G7, полученные к ГАФД из мышц кролика и специфически взаимодействующие с ее ненативными формами и не взаимодействующие ни с одной из форм термостабильной ГАФД. Результаты представлены на рис 12. Преинкубация шаперонина с модифицированной ГАФД из мышц кролика приводит к ингибированию GroEL-зависимой ренатурации денатурированной ГАФД B.st..

Однако если до внесения в среду реактивации шаперонина ГАФДДТНБ преинкубировать с антителами клона 6G7, то мы будем наблюдать восстановление активности денатурированной ГАФД B.st. до уровня, характерного для GroEL-зависимой реактивации. Т. е. антитела связывали модифицированную ГАФД, тем самым, предотвращая ее взаимодействие с GroEL и, следовательно, ингибирование шаперонина.

Таким образом, мы получили убедительные доказательства того, что связывание шаперонина с модифицированной ГАФД блокирует GroEL-зависимый рефолдинг термостабильной ГАФД B.st..

Рис.11. Влияние OR-димеров ГАФДB.st. Y283V/W84F на реактивацию ГАФДB.st.

Денатурированную в 8М мочевине ГАФД разводили буфером для реактивации и инкубировали без добавок, в присутствии GroEL, в присутствии димеров, а также при одновременном добавлении димеров и GroEL. В опытах использовали димеры Y283V/W84F.



Рис. 12. Влияние ГАФДДТНБ и антител 6G7 на реактивацию ГАФДB.st.

Денатурированную в 8М мочевине ГАФД разводили буфером для реактивации и инкубировали без добавок (синие столбики) или в присутствии GroEL (красные столбики). К пробам добавляли ГАФДДТНБ и/или и антитела.

Исходя из полученных данных, можно предположить, что появление в клетке вследствие мутаций, действия ядов, лекарственных препаратов или в процессе окислительного стресса, поврежденных белков, способных связываться с шаперонином, может приводить к образованию прочных недиссоциирующих комплексов. Результатом этого будет уменьшение количества свободных шаперонов, способных облегчать фолдинг своих нормальных клеточных субстратов и, как следствие, увеличение содержания неправильно свернутых и денатурированных белков.

Следует отметить, что в клетке рефолдинг и предотвращение агрегации денатурированных белков осуществляют шапероны различной степени сложности. Так, наряду с крупными мультисубъединичными шаперонинами (сходными с GroEL) важную роль играют малые белки теплового шока. Для имитирования их деятельности ранее в нашей лаборатории были использованы полиэлектролиты разного размера, заряда и гидрофобности (полианионы и поликатионы различной природы). В этой работе мы проверили действие природных положительно заряженных белков (протаминов, выделенных из лососевых рыб) на предотвращение агрегации олигомерного фермента -глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и мономерного белка, идентичного по размерам субъединице ГАФД, - ренина (37 кДа). На рис.13 представлено влияние протамина и, для сравнения, синтетического алкилированного поли-N-алкил-4-винилпиридиниевого катиона со степенью полимеризации 1600. Из приведенных данных следует, что протамины оказывают сходное с синтетическими поликатионами антиагрегационное действие на олигомерный фермент ГАФД. Более эффективно действие протаминов на предотвращение агрегации ренина (рис.13). Вероятно, это связано не только с мономерным строением ренина, но и с более низкой изоэлектрической точкой этого белка (рI для ГАФД и ренина равны соответственно 8,5 и 5,6), что облегчает его взаимодействие с положительно заряженными белками.