Высокоэффективная жидкостная хроматография

Мультиплетность спектра. Часто в спектрах ЯМР сигнал проявляется не отдельным пиком, а их набором. Количество линий в спектре ЯМР определяется количеством химически неэквивалентных ядер данного сорта и константами спин-спинового взаимодействия этих ядер. В некоторых случаях (спектры 1Н, 13С, 19FЯМР) спектры могут содержать сотни (и даже тысячи) резонансных линий. Хотя анализ подобных спектров вызывает определенные затруднения, именно они представляют наибольший интерес в структурных исследованиях, поскольку содержат много информации[34].

Сигнал может расщепляться на два, три, четыре и большее число пиков, при этом число пиков называют мультиплетностью. Относительные интенсивности линий в мультиплете можно выразить с помощью треугольника Паскаля (таблица 3) [35].

Таблица 3 - Треугольник Паскаля

Число соседних ядер	Интенсивность линий	Название мультиплета
0 1 2 3 4 5 6	1 1 1 1 2 1 1 3 3 1 1 4 6 4 1 1 5 10 10 5 1 1 6 15 20 15 6 1	Синглет Дублет Триплет Квадруплет Квинтиплет Секстиплет

Указанные выше факторы позволяют утверждать, что наибольшее практическое значение имеют два вида спектроскопии ЯМР: спектроскопия 1Н ЯМР (или протонный магнитный резонанс, ПМР) и спектроскопия 13С ЯМР при естественном содержании изотопа 13С (или углеродный магнитный резонанс). Среди других магнитных изотопов прежде всего следует выделить ядра 19F и 34Р. Спектры ЯМР этих ядер хорошо изучены и широко используются на практике.



1.6 Общие сведения о химических сдвигах

В атомах и молекулах резонансные частоты ЯМР сдвигаются под влиянием экранирующего действия электронных оболочек. Это явление, впервые обнаруженное Проктором на примере резонанса 14N вNH4NO3, было названо химическим сдвигом.

Химический сдвиг показывает, насколько сдвинут данный резонансный сигнал в слабое поле относительно сигнала протонов эталона. Рассматриваемая величина является безразмерной и характеризует химическое окружение протона. Отнесение протонов к различным типам химического окружения представляет собой первый шаг в расшифровке спектров, а химический сдвиг является первым параметром спектров ЯМР.

Экранирование в атомах. Под влиянием внешнего магнитного поля Н0 электроны в атомах прецессируют вокруг направления поля с частотой Лармора:

(31)

Эта прецессия эквивалентна току, создающему на ядре атома дополнительное поле Н'. В атомах поле Н' направлено противоположно поляризующему полю

(32)

причем величина называется константой экранирования.

При учете распределения электрона в атоме с функцией плотности вероятности с(r) можно показать, что константа экранирования определяется выражением

(33)

Рассмотрим, в частности, атом водорода. Единственный электрон этого атома находится в 1s-состоянии, описываемом функцией вида:

(34)

где а1 - боровский радиус, равный 0,529Е. Используя численные значения фундаментальных постоянных, получим в результате интегрирования

(35)

При расчете констант экранирования в многоэлектронных атомах необходимо учитывать экранирующее действие всех электронных оболочек. Поскольку электронные состояния атомов рассчитываются методами современной квантовой химии с весьма большой точностью, то расчет о в целом не вызывает затруднений [36]. Для некоторых атомов, ядра которых представляют интерес в органической химии, соответствующие данные приведены в представленной ниже таблице 4.

Таблица 4 - Константы экранирования ядер в некоторых атомах

Атом	Электронная оболочка	Магнитный изотоп	Константа экранирования
H C N O F	1s ls22s22p2 ls22s22p3 1s22s22p4 1s22s22p5	1Н 13С 14N, 15N 17O 19F	18 261 325 395 464



Константы экранирования ядер в атомах всегда положительны. Поскольку это приводит к уменьшению эффективного поля на ядре, то такое экранирование называется диамагнитным (d).

Строго говоря, разделение константы экранирования на два вклада условно, поскольку величины этих вкладов, как это показывают точные расчеты, зависят от начала координат, и инвариантна только их сумма. Однако при одинаковом выборе начала координат (например, на рассматриваемом ядре) можно сопоставлять данные расчетов диамагнитного и парамагнитного вкладов. В таблице 4 приведены данные точных расчетов для некоторых простых молекул (Н2, 1НЯМР; СН4, 13СЯМР; F2, l9FЯМР). Из таблицы 4 следует, что с ростом заполненности2p-оболочек существенно возрастает роль парамагнитного вклада. Обратим внимание на тот факт, что в молекуле F2 ядра фтора, по существу, дезэкранированы (относительно гипотетического иона F9+), поскольку <0.

Эти расчеты явились основанием для широко распространенного мнения о том, что для экранирования тяжелых ядер определяющее значение имеет парамагнитный вклад.

Таблица 5 - Диамагнитный и парамагнитный вклады в экранирование для простых молекул, м.д.

Ядро	Молекула
1Н 13С 19F	H2 CH4 F2	32 294 480	-5 -107 -630	27 187 -150	6.4 2.7 0.7

В практической спектроскопии ЯМР используются разности констант экранирования

, (37)

где - экранирование некоторого стандартного ядра в эталонной молекуле, - константа экранирования исследуемого ядра. Нетрудно показать, что выражается через экспериментально определяемые параметры согласно формуле

(38)

где - резонансные частоты соответственно исследуемого и стандартного ядер.

1.7 Химические сдвиги ядер 1Н

Химические сдвиги протонов измеряются в м.д. относительно сигнала тетраметилсилана как внутреннего стандарта (д-шкала ТМС):

(39)

Иногда используют ф-шкалу (ТМС):

ф=10,00-д. (40)

Эмпирические данные:

1. Химические сдвиги протонов занимают диапазон 0-10 м. д. (д-шкала). Стандартная ошибка измерения сдвигов протонов равна ±0,01 м. д.

2. Химические сдвиги протонов распространенных растворителей и стандартных веществ, дающих один сигнал в спектре, приведены в таблице 6



Таблица 6 - Химические сдвиги протонов в некоторых органических соединениях

Соединения	Формула	д, м.д.
Циклопропан Этан Циклогексан Ацетон Диметилсульфоксид Ацетилен п-Диоксан Хлористый метилен Этилен Хлороформ Бензол Трифторуксусная кислота	С3Н6 СН3-СН3 С6Н12 СН3СОСН3 (СН3)2SO (CH)2 C4H8O2 CH2Cl2 CH2=CH2 CHCl3 C6H6 CF3COOH	0,22 0,88 1,44 2,17 2,50 2,88 3,56 5,30 5,84 7,27 7,27 11,34

3. Химические сдвиги протонов характеристичны.

4. Протоны некоторых функциональных групп (ОН, NH, SH) обнаруживают сильную зависимость от растворителя, концентрации и температуры образца.

Для интерпретации химических сдвигов протонов привлекаются различные теоретические концепции. Несмотря на то, что эти концепции не дают строгого количественного описания экспериментальных данных, они полезны при проведении качественной интерпретации [37].

Разбиение наблюдаемого значения химического сдвига на отдельные вклады. В основе интерпретации химических сдвигов протонов лежит предположение о том, что химический сдвиг может быть представлен как сумма вкладов, которым соответствуют независимые электронные токи, индуцированные внешним магнитным полем. Согласно предположению Сайка и Сликтера, экранирование не рассматривают как сумму трех вкладов:

(41)

где величины , , соответствуют трем разным токам. Первый член в (41) отвечает диамагнитному току, обусловленному электронами данного атома, поэтому его называют локальным диамагнитным экранированием. Второй член соответствует локальному парамагнитному току. Наконец, третий член, называемый нелокальным экранированием, включает токи, обусловленные другими электронами системы. В принципе, этот член соответствует индуцированным токам, охватывающим несколько атомов в одной и той же молекуле или в различных молекулах. В последнем случае вклад в экранирование называют межмолекулярным.

Рисунок 18. Шкалы протонного экранирования: а - шкала абсолютного экранирования для Н+, Н, Н- и СН4; б - д-шкала ТМС химических сдвигов 1Н

Другие типы разбиения общего экранирования на отдельные вклады основываются на выделении специфических взаимодействий, которые можно представить себе в виде независимых эмпирических факторов.

Влияние электронной плотности (узаряд). Обоснованием для введения этого вклада служат два аргумента: 1 - зависимость диамагнитного вклада от плотности электрона на ls-орбитали атома водорода; 2 - корреляции химических сдвигов протонов с электроотрицательностью соседних групп (заместителей).

1. Как известно, диамагнитное экранирование в атоме водорода составляет ~ 18 м.д. Пренебрегая электрон-электронными взаимодействиями, можно-заключить, что экранирование в анионе Н будет равно сумме вкладов каждого из электронов, т. е. у(Н-)?36 м. д. На основе этих оценок можно ввести шкалу абсолютного экранирования (18). В этой шкале химический сдвиг протонов в молекуле Н2, рассчитанный с помощью достаточно точных методов, равен примерно 26 м. д. К сожалению, шкала абсолютного экранирования не имеет практического значения, поскольку ни Н2, ни тем более Н и Н- неприменимы в качестве стандартов химического сдвига. Переход в общепринятую шкалу химических сдвигов можно провести, если воспользоваться экспериментальным значением сдвига Н2 (или СН4) в д-шкале ТМС.

Пользуясь приведенными выше данными, можно перевести шкалу химических сдвигов в шкалу плотности электронов на 1s-орбитали:

(42)

Соотношение (42) часто выражают в форме эмпирического правила:

уменьшение электронной плотности около рассматриваемого атома водорода приводит к увеличению химического сдвига соответствующего протона.

2. Химические сдвиги протонов коррелируют с электроотрицательностью заместителей. Многочисленные данные по этому вопросу часто выражают в форме следующего правила:

для фрагмента СНХ--СН с ростом электроотрицательности заместителя X ближайший протон смещается в слабые поля (б-эффект), удаленный протон смещается в более сильные поля (в-эффект).

При этом предполагается, что электроотрицательные заместители приводят к понижению общей электронной плотности на атоме Сд и к повышению плотности на атоме Св [38].

Вклад магнитно-анизотропных групп. Основанием для введения вклада магнитно-анизотропных групп в экранирование является ряд «аномалий», необъяснимых в рамках корреляций с электронной плотностью, а именно: 1) значение химического сдвига протонов бензола; 2) химические сдвиги протонов ацетилена и циклопропана; 3) химические сдвиги протонов, расположенных вблизи от некоторых связей (С--Hal, С = О, С--С и т. д.).

В основе интерпретации этих наблюдений лежит модель магнитно-анизотропной группы, впервые предложенная Мак-Коннелом. В частном случае двухатомной молекулы А--В магнитный момент, индуцированный связью АВ при наложении поля Н0, будет различным в зависимости от того, как ориентирована связь АВ относительно поля Н0. В простейшем случае аксиальной симметрии, к которому относится молекула А--В, вводят две восприимчивости ч||(вдоль связи) и ч+ (перпендикулярно связи), так что

(43)

Индуцированный магнитный момент создает дополнительное магнитное поле на соседних (к данной связи) ядрах. Если рассматривать индуцированный момент как диполь и поместить этот диполь в центр связи АВ, то тогда поле можно рассчитать по формуле для поля диполя.

Поскольку раствор предполагается изотропным, то при расчете дополнительного поля, следует провести усреднение по ориентациям связи АВ относительно поля Н0. Свободное вращение молекулы АВ относительно направления поля Н0 равносильно усреднению по трем ориентациям вдоль осей х, у, z, так что среднее поле Н определится из выражения

Н=(Н(Мх)+Н(Му)+Н(Му)) (44)

Частным, но весьма распространенным случаем магнитно-анизотропных систем являются ароматические соединения, представляющие собой плоские кольца с сопряженными двойными связями, что приводит к обобществлению 2р-электронов. В таких системах под влиянием магнитного поля возникает прецессия электронного тока в плоскости кольца (кольцевые токи), что и приводит к экранированию соседних протонов.

Рисунок 19. Конуса экранирования для типичных магнитно-анизотропных групп и связей. Области (+) и (-) соответствуют областям экранирования (-д) и дезэкранирования (+д)

На рисунке 19 схематически изображены конусы экранирования для некоторых химических связей и молекулярных фрагментов.

Специфическое влияние растворителя. Под специфическим влиянием растворителя (среды) понимают образование комплексов или ассоциатов, в которых относительное расположение молекул растворенного вещества и растворителя обеспечивается химическими связями. Это могут быть слабые взаимодействия, например, донорно-акцепторное взаимодействие, водородная связь, стекинг (или пачечное) взаимодействие и т. д. Как правило, специфическое влияние растворителя обнаруживается по сильной зависимости химических сдвигов от температуры и концентрации раствора. Наиболее сильно оно проявляется на протонах, участвующих во внутри- и межмолекулярных водородных связях (ОН...О, NH ... N, SH ... S и т. д.). В этом случае специфический вклад среды может достигать ~ 10 м. д.

Неспецифическое влияние среды. Сюда относят группу сравнительно слабых эффектов, обусловленных физическими причинами. В частности, если растворитель магнитно-анизотропен, то он может вызывать дополнительные сдвиги на протонах растворенного вещества (иногда эти сдвиги называют ASIS-эффектами от английского anisotropicsolventinducedshifts).

Кроме того, к неспецифическим относят дисперсионные (или ван-дер-ваальсовы) взаимодействия. Эти взаимодействия определяют ближний порядок (агрегацию) молекул раствора (т.е. в конечном счете сам факт существования конденсированной фазы). Агрегация молекул приводит к появлению дополнительного экранирования, обусловленного влиянием электронных оболочек соседних молекул. В случае протонного магнитного резонанса роль дисперсионных взаимодействий, по-видимому, невелика, однако для других ядер важность этого вклада убедительно доказана [39].

1.8 Химические сдвиги ядер 13С

Химические сдвиги ядер 13С измеряют относительно тетраметилсилана в м. д. (д-шкала ТМС):

(45)

Эмпирические данные:

1. Химические сдвиги 13С занимают диапазон 0-220 м. д. (д-шкала). Стандартная ошибка измерения сдвигов составляет 0,05 м. д.

2. Химические сдвиги 13С распространенных растворителей и эталонных веществ приведены в таблице 7.

3. Химические сдвиги 13С характеристичны. Для наиболее распространенных функциональных групп химические сдвиги 13С приведены в таблице 8.

4. Как правило, влияние среды (растворителя, температуры) относительно невелико (менее 0,5 м. д. при диапазоне сдвигов в 200 м. д.).

Таблица 7 - Химические сдвиги ядер 13С в некоторых органических соединениях

Соединение	Формула	дС, м.д.
Циклопропан Этан Циклогексан Ацетон (метильная группа) Хлористый метилен п-Диоксан Ацетилен Хлороформ Четыреххлористый углерод Этилен Бензол Сероуглерод Ацетон (карбонильная группа)	С3Н6 СН3-СН3 С6Н12 СН3СОСН3 CH2Cl2 C4H8O2 С2Н2 CHCl3 ССl4 С2Н4 C6H6 СS2 СН3СОСН3	-2,2 5,7 27,5 30,4 54 67,4 73,3 77,2 96 123,3 128,5 192,8 204,1

Таблица 8 - Химические сдвиги 13С в некоторых типах связи

Гибриди-зация	Тип связи	Степень замещения
		СН3	СН2	СН	Счетв
sp3	С?С С?О? C?N C?Cl C?C=O	7-31 42-58 30-47 23,8) 20-30	17-53 40-70 37-60 39-53 25-48	25-56 52-82 47-65 44-60 31-50	30-40 67-85 50-70 67-80 36-46
sp2	C=C =C?C= C=C?O? =C?O? C=N =C?C= (аром.) C=O	? ? ? ? ? ? ?	102-122 75-90 80-97 ? ? ? ?	113-144 80-93 90-105 145-159 142-163 113-135 195-204	130-152 86-97 95-107 139-152 142-163 120-150 198-222
sp	?C ?C?O ?C?N =C=	? ? ? ?	? ? ? ?	64-77 ? ? ?	72-88 86-93 113-123 200-24

Интерпретация углеродных сдвигов основывается на ряде теоретических концепций. Так же, как и в случае протонных сдвигов, они не дают количественного описания экспериментальных данных, но полезны при качественной интерпретации.

Разбиение наблюдаемых значений химических сдвигов 13С на отдельные вклады. Химический сдвиг 13С представляют в виде суммы отдельных вкладов, каждый из которых соответствует некоторому специфическому взаимодействию:

д = дз+ дпр + дта+ др, (46)

где отдельные вклады соответствуют эффектам, связанным с электронной плотностью около данного атома углерода дз, пространственным влиянием непосредственно не связанных фрагментов молекулы дпр, влиянием соседних «тяжелых» атомов (CI, Br, I) дтаи влиянием растворителя (среды) др.

Электронный заряд сполноколо рассматриваемого атома углерода можно качественно интерпретировать как сумму у- и р-зарядов, соответствующих заполнению соответствующих гибридных орбиталей:

сполн= су| ср (47)

Ряд экспериментальных фактов подтверждает следующее правило:

уменьшение электронной плотности около рассматриваемого атома углерода приводит к увеличению химического сдвига этого атома углерода.

Имеются два наблюдения, лежащих в основании этого правила:

а) химические сдвиги 13С в заряженных формах ароматических соединений;

б) химические сдвиги 13С в линейных углеродных цепях, содержащих электроотрицательные заместители.

Корреляции с ср были изучены, в частности, на замещенных бензолах. В этом случае эффекты замещения (для мета- и пара-атомов углерода) описываются уравнением

?д= ?k?ср, (48)

где коэффициент пропорциональности между изменениями сдвига и р-заряда составляет величину 150ч200м. д. на электрон. Детальный анализ указанных корреляций показывает, что практическая ценность зависимости (48)невелика; это связано, по-видимому, с трудностью выделения «чистого» вклада ср.

Вторая группа наблюдений связана с проявлением индукционного влияния заместителя в линейных цепях. Согласно распространенной точке зрения влияние электроотрицательного (?I) заместителя сопровождается альтернированием дополнительного заряда:

X--СН2--СН2?СН3,

+дб ?дв +дг

причем эффект затухает вдоль цепи дб> дв> дг . Эта схема в целом не подтверждается данными по химическим сдвигам 13С; как правило, электроотрицательные заместители X вызывают следующие эффекты (знак + соответствует смещению в слабые поля, т. е. росту дС):



Х--СН2--СН2--СН3

+дб ?дв +дг

F--СН2--СН2--СН3

+68 +9 -4 (м. д.)

Таким образом, только в случае б-атома углерода введение электронакцепторных заместителей может быть интерпретировано как уменьшение заряда (в данном случае су или сполн)около данного атома углерода. Что касается в- и г-атомов, то выделить индукционное влияние заместителей затруднительно в связи с наличием других вкладов в химический сдвиг [40].

Пространственные эффекты. Исследования циклических систем и разветвленных углеводородов привели к выработке концепции пространственных эффектов. Наиболее известный факт, лежащий в основании этой концепции, состоит в наблюдении сильнопольного (~6 м.д.) сдвига г-атома углерода в аксиальном конформереметициклогексана (по отношению к сдвигу С6Н12) (рисунок 20).

Рисунок 20. К модели пространственных эффектов для химических сдвигов 13С

Распространенная интерпретация этого наблюдения, впервые предложенная Чини и Грантом, состоит в том, что при определенных пространственных условиях (рисунок 20) связь Cг --Н поляризуется таким образом, что заряд на атоме С возрастает, что и приводит к увеличению экранирования атома Сг. Величина г-гошэффекта, согласно Чини и Гранту, определяется формулой

дС= 1680 cosиexp (?2,67 r) (49)

где r - длина радиуса-вектора Н ... Н, Е; и - угол, образованный связями С?С и С--Н (метильной группы). В случае метилциклогексана и>90° и, следовательно, д<0 (сильнопольное смещение).

Влияние «тяжелого атома». Исследования хлор-, бром- и иод-замещенных углеводородов показали, что химический сдвиг 13С замещённых атомов (Сб) в этих соединениях наряду с индуктивным влиянием галогенов (--I-эффект), содержит компенсирующий, т.е. сильнопольный, вклад, названный эффектом «тяжелого атома». Природа этого эффекта сводится к тому, что протяженные электронные оболочки тяжелых атомов экранируют не только свои ядра (35/37С1, 81Вr и т. д.); но и диамагнитно экранируют соседние ядра углерода Сб.

Влияние растворителя (среды). Исходя из концепции разделения эффектов среды на специфические и неспецифические можно полагать, что наибольшие изменения химических сдвигов 13С (более 1ч2 м. д.) будут обусловлены химическими причинами (влиянием водородной связи, донорно-акцепторных взаимодействий и др.), приводящими к образованию комплексов и ассоциатов [41].

1.9 Общие сведения о константах спин-спинового взаимодействия

Сравнивая спектр бензилацетата и спектр этилформиата, приведенные на рисунке 21, можно заметить не только различие в положении резонансных сигналов. Сигналы отличаются также мультиплетностью. В одном случае как метильные, так и метиленовые протоны проявляются в спектре как синглеты. В другом - протоны таких же групп дают триплет и квартет соответственно с вполне определенным распределением интенсивностей внутри этих мультиплетов. Причина появления этой тонкой структуры - спин-спиновое взаимодействие. Оно возникает за счет магнитного взаимодействия между отдельными протонами, которое передается через электроны химических связей, косвенно соединяющих эти протоны, а не непосредственно через пространства. На рисунке 22 это схематически показано для молекулы фтороводорода и протонов метиленовой группы. Магнитный момент ядра А вызывает слабую магнитную поляризацию связывающих электронов, которая передается через перекрывающиеся орбитали на ядро Х. Как следствие этого, внешнее поле на ядре Х будет в зависимости от спинового ядра А либо возрастать, лидо уменьшаться. Таким образом, локальное магнитное поле, определяющее резонансную частоту ядра Х, изменяется и сигнал ЯМР расщепляется в дублет. То же справедливо и для ядра А. два спиновых состояния ядра А почти равновероятны, поэтому линии в дублете имеют равную интенсивность [42].

Рисунок 21. Спектры ЯМР бензилацетата и этилформиата.

Впервые спиновые мультиплеты наблюдали в спектрах ЯМР Гутовский и Мак-Колл.



Рисунок 22. Схема ядерного спин-спинового взаимодействия через посредство связывающих электронов:а- в молекуле НF; б - в группе СН2.

Контактное взаимодействие.Энергию спин-спинового взаимодействия ядер определяют как часть общей энергии системы, содержащую скалярное произведение вектор-спинов:

Е= hJABIAIB (50)

Величина JAB, называемая константой спин-спинового взаимодействия, отражает «химическую специфику» связи спинов IAи IB (или IХ в случае примера на рисунке 22).

Иногда с тем, чтобы выделить собственно электронное участие в ядерном спин-спиновом взаимодействии, используют приведенные константы

(51)

Для того чтобы вычислить константу спин-спинового взаимодействия JАВ, необходимо рассмотреть взаимодействия ядерных магнитных моментов с орбитальным и спиновым моментами электронов. Квантовомеханический анализ показывает, что наиболее важен особый случай «близкодействия» электронного спина S и ядерного спина I, который называют контактным (или Ферми-взаимодействием).

Константы JАВ в методе молекулярных орбиталей. Если использовать для описания молекулярных систем метод ЛКАО МО (молекулярные орбитали как линейные комбинацииатомныхорбиталей), то очевидно, что наиболее важное значение для спиновой связи ядер будут иметь атомные s-орбитали, поскольку более высокие (р-, d- и т. д.) орбитали имеют «узлы» на ядре. т. е. |ш(0) |2 = 0.

Развивая подход, основанный на теории возмущений, Попл и Сантрн получили в рамках теории ЛКАО МО более общую формулу для приведенной константы спин-спинового взаимодействия:

КАВ = (52)

где -- атом-атомная поляризуемостьs-орбиталей и , принадлежащих атомам (и ядрам) А и В.

Величина определяется выражением:

, (53)

где суммирование проводится по всем переходам из занятых орбиталей шi на возбужденные (или незанятые) шj-орбитали.

В случае двухатомной молекулы с s-орбиталями и , центрированными на ядрах А и В, можно показать, что атом-атомная поляризуемость имеет вид:

, (54)

где I - ионность связи А--В; -- энергии антисвязывающей и связывающей молекулярных орбиталей. Таким образом, с ростом ионности связи величина уменьшается, причем для чисто ионных связей атом-атомная поляризуемость равна нулю. Отсюда видно, что спин-спиновое взаимодействие является важным свойством ковалентных структур. Кроме того, из соотношения (54) следует, что при наличии низколежащих возбужденных состояний константа возрастает [43].

Классификация типов констант спин-спинового взаимодействия. Константы классифицируют, исходя из типов взаимодействующих магнитных изотопов А и В, т. е. различают константы (или (J(1Н--1Н)), JСН (или J(13С--Н)), JСР (или J(13C-19F)), JHF(или J(1Н--19F)) и т.д. Для практических целей наибольший интерес представляют константы и константы JСН.

Константе обычно приписывают индекс, указывающий число у-связей, разделяющих взаимодействующие ядра. Так, выделяют прямые константы 1J(между непосредственно связанными ядрами), геминальные2J, вицинальные3J. Константы между ядрами, разделенными более чем тремя у-связями, часто называют дальними константами. Как правило, величины констант быстро падают по абсолютной величине с увеличением числа у-связей.

Знак константы спин-спинового взаимодействия.В рассмотренной выше упрощенной модели приведенная константа К оказывается положительной. Это обусловлено тем, что (или), а также тем, что коэффициенты в связывающей орбитали имеют одинаковые знаки, а в антисвязывающей - разные знаки. Эксперименты показывают, что в большинстве случаев прямые константы положительны.

Однако для некоторых прямых констант (например,1JCF) и ряда других констант (например, 2Jнн) наблюдаются отрицательные значения. В ЛКАО МО теории cпин-спинового взаимодействия эти факты находят объяснение в том, что наряду с основным переходом (шсв>шантисв) заметный вклад в константу дают переходы между другими занятыми и возбужденными состояниями, и суммирование в (54) включает три (для 2JCF), четыре (для 2Jнн) и большее число членов.

Знаки констант спин-спинового взаимодействия JАВ зависят также от знаков гиромагнитных постоянных, поэтому целесообразней использовать приведенные константы JАВ. Следует отметить, что экспериментальные знаки констант JАв определяются не во всех случаях [44].

1.10 Экспериментальные аспекты спектроскопии ЯМР

Важнейший принцип, лежащий в основе классификации спектрометров ЯМР, состоит в способе генерирования высокой частоты. В связи с этим различают спектрометры стационарного (или непрерывного) типа с непрерывной генерацией высокой частоты и импульсные спектрометры с импульсной генерацией высокой частоты. В импульсных спектрометрах используется Фурье-преобразование, поэтому спектрометры указанного типа называют импульсными Фурье-спектрометрами [45].

Блок-схема спектрометра ЯМР непрерывного типа приводилась ранее (рисунок 9) и в целом она не претерпела принципиальных изменений. В современных спектрометрах используются высокостабильные генераторы частоты и синтезаторы частоты, позволяющие получить любые стабильные частоты в некотором диапазоне частот (рисунок 23).

При регистрации спектра частота v0 изменяется в резонансной области SW, ограниченной некоторыми начальным и конечным значениями и . Развертка частоты проводится либо с помощью непосредственного изменения несущей частоты ВЧ-поля , либо путем изменения частоты модуляции.

Приемник ЯМР сигналов представляет собой устройство, предназначенное для усиления, детектирования и фильтрации сигналов ЯМР. Приемник обычно включает приемную катушку, усилители высокочастотного напряжения, фазовый детектор. Приемная катушка вместе с измерительной ампулой размещается непосредственно в магнитном поле. Возникающая в приемной катушке э.д.с. ядерной намагниченности представляет собой колебания с частотой и амплитудой порядка нескольких микровольт, которые усиливаются до уровня нескольких вольт. Детектор по высокой частоте позволяет выделить фазовые компоненты сигнала ЯМР.

Часто используемый метод приема сигналов ЯМР основывается на модуляционной технике. В одном из вариантов этого метода высокая частота , подаваемая на приемную катушку, модулируется по амплитуде низкой частоты (рисунок 23) [46].

Можно показать, что облучение спиновой системы таким амплитудно-модулированным полем эквивалентно облучению сразу тремя частотами: -, и + (считая, что глубина модуляции мала). Следовательно, при изменении магнитного толя Н условия для резонанса будут выполняться три раза. Частоты

--

+

Резонансные поля

Здесь ?H - дополнительное поле. Сигнал при H=H0 называют центральной полосой, а сигнал при H0+?H и H0-?H называют высокопольной и низкопольной боковыми полосами соответственно (рисунок 24). Модуляционный метод используется в системах развертки. Кроме того, этот метод позволяет решить проблему нулевой базисной линии, что весьма важно для интегрирования сигналов ЯМР.



Рисунок 23. Система N генераторов и N приемников, позволяющая осуществить одновременную генерацию и прием сигналов ЯМР во всем диапазоне частот

Рисунок 24. Боковые полосы в спектре с полевой разверткой

Частота модуляции подбирается так, чтобы три спектра не перекрывались между собой.

Магниты для ЯМР спектрометров высокого разрешения должны удовлетворять следующим требованиям:

1) Обеспечивать достаточно высокую напряженность магнитного поля Н0. Как правило, напряженности поля Н0 спектрометров ЯМР лежат в диапазоне 1-7 Т, что соответствует резонансной частоте протонов в диапазоне 40-300 МГц.

2) Магнит должен иметь зазор, достаточный для размещения там образца - ампулы с веществом. Стандартная ампула представляет собой цилиндр диаметром 5-20 мм; необходимость размещения в том же зазоре датчика заставляет использовать магниты с зазором 20-40 мм.

3) Магнитное поле должно быть достаточно однородным в той части ампулы, которая находится в резонансной катушке (фактически эта область представляет собой цилиндр высотой 10 мм и диаметром 5 мм).

4) Магнитное поле должно быть достаточно стабильным во времени. Запись спектра ЯМР длится достаточно долго (до нескольких часов в режиме накопления), поэтому важно, чтобы магнитное тюле в образце заметно не изменилось в течение этого времени [47].

Все эти требования чрезвычайно осложняют конструирование магнитов для ЯМР спектрометров. Неудивительно, что «львиную долю» стоимости современного спектрометра (до 70%) составляет стоимость магнита и относящихся к нему систем (питание, стабилизация и т. д.).

В спектроскопии ЯМР нашли применение магниты трех типов:

- постоянные магниты,

- электромагниты,

- сверхпроводящие соленоиды.

Однородность магнитного поля. Имеется несколько специальных приемов, позволяющих улучшить однородность магнитного июля для каждого из трех указанных типов магнитов. В частности, чтобы избежать краевых эффектов, используют относительно большие диаметры полюсных наконечников (для обычных магнитов) и достаточно длинные соленоиды (для сверхпроводящих магнитов). Важное значение имеет также терморегуляция: постоянство температуры магнита (для обычных магнитов), сложная система дьюаров (для сверхпроводящих соленоидов).

Практически важными оказались два способа увеличения однородности:

1) вращение образца вокруг продольной оси,

2) исправление пространственной функции поля H (x,у,z)с помощью специальных дополнительных магнитных полей, создаваемых электрическими катушками. Эти катушки получили название шиммирующих катушек или просто шимм (от англ. shims - «прокладки», поскольку эти катушки, как правило, накладываются в виде топкого слоя на полюсные наконечники или на боковые поверхности датчика) [48].

Спектры ЯМР прежде всего определяются агрегатным состоянием исследуемого вещества.

Твердые тела. Как указывалось выше, сильные прямые диполь-дипольные взаимодействия в твердом теле приводят к существенному уширению линий спектра. В результате этого уширения измерение тонкой структуры спектров, связанной с химическими сдвигами и константами спин-спинового взаимодействия, становится невозможным.

Газы. Единственным серьезным ограничением для изучения спектров газов является сравнительно низкая чувствительность метода ЯМР. Для простых или высокосимметричных молекул такие исследования в принципе возможны при умеренных давлениях газа в образце (до 10 - 20 атм.). Для сложных органических систем исследования спектров в газовой фазе особого практического значения не имеют.

Жидкости. Подавляющее число измерений спектров ЯМР органических объектов проводится в жидкой фазе. Жидкость обеспечивает достаточную концентрацию вещества и узкие линии в спектрах ЯМР в результате быстрых процессов молекулярной реориентации. Несмотря на то, что последовательная теория жидкого состояния отсутствует, можно в первом приближении выделить следующие факторы среды: а) тип растворителя (для растворов), б) концентрация растворенного вещества, в) дополнительные компоненты раствора, г) температура раствора.

Растворитель. При подборе растворителя руководствуются растворимостью вещества, требуемым температурным интервалом, вязкостью. Растворители, используемые при регистрации спектров ЯМР, обычно разделяют на два класса: стандартные и специальные. К числу стандартных растворителей относят четыреххлористый углерод СС14, хлороформ (или дейтерохлороформ (CDC13), ацетон (или дейтероацетон (CD3)2CO), бензол (или С6Н6), диметилсульфоксид (или (CD3)2SO) и др. Наиболее важные свойства этих растворителей будут приведены далее.

Концентрация раствора. Возможные концентрации вещества в растворе ограничены снизу и сверху. Ограничения снизу обусловлены допустимым уровней сигнал/шум для данного метода регистрации, ограничения сверху обычно связаны с растворимостью вещества. Для чистых жидкостей при наличии очень сильного сигнала ЯМР могут возникнуть специфические явления (так называемое радиационное затухание), приводящие к уширению сигнала ЯМР.

Дополнительные добавки. В сравнительно малых количествах к исследуемым растворам могут быть добавлены различные специальные компоненты; к ним, в частности, относятся следующие:

а. Эталоны химического сдвига: тетраметилсилан, гексаметилдисилоксан, циклогексан и др.

б. Шифт-реагенты: Eu(dpm)3, Eu(fod)3, Pr(dpm)3 и др. При добавлении в незначительных количествах (~0,01 м/л) шифт-реагенты сильно изменяют химические сдвиги протонов и ядер 13С, не вызывая сильного уширения линий.

в. Релаксационные реагенты: Сr(асас)3 и др. Добавки этих веществ приводят к ускорению cпин-решеточной релаксации, что позволяет избежать насыщения сигналов ЯМР.

г. Различные химические добавки, катализирующие процессы протонирования, этимеризации, таутомерии и т. д.

Температура. Этот фактор можно рассматривать с точки зрения влияния на растворимость вещества и вязкость раствора. Кроме того, температура может оказать существенное влияние на форму спектра ЯМР в результате изменения скорости обменных процессов, в которых принимает участие исследуемое вещество [49].



1.11 Регистрация стандартных спектров ЯМР

Использование спектроскопии ЯМР обычно происходит в две стадии. На первой, предварительной, стадии обычно ограничиваются измерением стандартных спектров, поэтому данную стадию называют стандартной процедурой. В результате физик получает так называемые обзорные спектры, на основании которых он выдвигает требования к регистрации детализированных специальных спектров. Разработка этих требований и регистрация специальных спектров (т. е. вторая стадия работы) обычно тесно связаны с решением той физической проблемы, которую физик формулирует в самом начале исследования.

Рутинная регистрация стандартных спектров ПМР и 13СЯМР, как правило, складывается из следующих этапов:

а) подготовка образца;

б) регистрация спектра;

в) оценка качества спектра.

Остановимся более подробно на каждом из них.

а) Подготовка образца включает следующие этапы:

выбор растворителя, а также концентрации раствора;

выбор стандарта для измерения химического сдвига, а так-же эталонного вещества для системы внутренней стабилизации;

выбор ампулы для съемки спектра.

Выбор растворителя. Прежде всего, вещество должно растворяться в выбранном растворителе. Но растворимость не обязательно должна быть очень высокой, особенно если необходимо регистрировать протонный спектр. В этом случае 1 мг вещества в 0,4 мл растворителя вполне достаточно для получения хорошего спектра на приборе со средним и сильным полем. Растворитель может повлиять на получаемые результаты еще несколькими путями. При наблюдении протонов и углерода сигналы растворителя могут закрывать некоторые области спектра. Вязкость растворителя влияет на разрешение в спектре, особенно при работе с протонами. Некоторые растворители, например вода и метанол, содержат способные к обмену атомы водорода, что не позволяет наблюдать сигналы обменивающихся протонов в изучаемом веществе. Если планируются температурные эксперименты, то необходимо учесть температуры кипения и замерзания растворителей, равно как и возможные температурные изменения растворимости исследуемого вещества. Растворители ароматической природы, такие, как бензол и пиридин, могут вызывать большие изменения химических сдвигов в спектре растворенного вещества по сравнению со спектрами, полученными при использовании неароматических растворителей. Интенсивность и ширина сигнала дейтерия от растворителя могут оказывать влияние на результаты некоторых экспериментов, таких, как, например, разностная спектроскопия. И наконец, цены на дейтерированные растворители различаются очень сильно, что может оказаться важным фактором при выборе методик для ежедневного приготовления и измерения спектров большого числа образцов. От тщательного учета всех перечисленных факторов может во многом зависеть успех всего эксперимента.

В Приложении 1 [50] приведены некоторые физические свойства наиболее широко используемых в ЯМР растворителей. Самые дешевые из них вода и хлороформ, причем свойства хлороформа значительно больше подходят для использования в ЯМР. Стоимость других растворителей растет пропорционально трудности получения их в дейтерированной форме. Так, стоимость наиболее распространенных в органических синтезах растворителей, таких, как бензол, толуол, диметилсульфоксид (ДМСО), ацетон, ацетонитрил, метанол, хлористый метилен, диметилформамид (ДМФ) и пиридин, оказалась приблизительно одинаковой. В то же время тетрагидрофуран (ТГФ) и циклогексан стоят значительно дороже.

Если нужно записать протонные спектры образцов, содержащих менее нескольких миллиграммов исследуемого вещества, то при выборе растворителя необходимо учитывать положение в спектре сигналов остаточных протонов растворителя. Существуют три источника дополнительных сигналов в спектре: протоны дейтерированного растворителя, растворенная вода и другие растворенные примеси. Обычно в спецификациях растворителей указывается содержание только остаточных протонов, но не меньшие осложнения могут вызвать и два других источника (особенно вода).

При идеальном подборе растворителя сигналы его остаточных протонов не должны перекрываться с сигналами растворенных веществ. Конечно, на практике это недостижимо, и приходится идти на компромисс. Сигналы из некоторой области, расположенной вблизи сигналов растворителя (их положение заранее известно), приходится считать недостоверными. Эта область может быть достаточно большой, поскольку в общем случае сигналы остаточных протонов представляют собой мультиплеты за счет спин-спинового взаимодействия с дейтерием. Исключения из этого правила составляют хлороформ и вода. Остаточные сигналы таких растворителей, как ацетон или диметнилсульфоксид, представляют собой квинтеты и могут легко закрывать участки спектра шириной до нескольких десятых миллионных долей. При концентрации изучаемого вещества порядка 2 мг на 0,4 мл (для веществ средней молекулярной массы) интенсивность остаточных сигналов растворителей «нормальной» чистоты (т.е. 99,5-99,9%) превышает интенсивность сигналов.

Вода часто еще больше, чем сигналы остаточных протонов, мешает наблюдению спектров. Почти все ЯМР-растворители содержат воду, а большинство из них весьма гигроскопично. Например, сигнал воды в обычном хлороформе, как правило, интенсивнее сигнала остаточных протонов. Кроме того, этот широкий сигнал находится в неудобной области спектра (около 1,6м. д.). С некоторыми растворителями, например с ДМСО, следует работать в инертной атмосфере с помощью шприцевой техники. Только в этом случае они останутся достаточно сухими для приготовления сильно разбавленных растворов. Дейтерированная вода тоже гигроскопична, и ее следует хранить в эксикаторе. Содержание воды в растворителе можно значительно уменьшить фильтрованием раствора через осушающие агенты, если, конечно, образец это позволяет. Обезвоживание можно совместить с фильтрованием образца с целью удаления твердых частиц при переносе его прямо в ампулу для ЯМР. Это позволяет избежать дополнительных процедур. Для обезвоживания можно использовать большинство обычных осушителей. Во многих случаях подходит активированный оксид алюминия.

Стандарты для измерения химического сдвига. Стандартная процедура измерения химического сдвига протонов состоит в следующем: в раствор исследуемого соединения в СС14 или CDCl3 вводят 1-2 капли тетраметилсилана (ТМС) и измеряют химические сдвиги относительно сигнала протонов ТМС. Такой способ стандартизации называют внутренним. При этом предполагают, что ТМС инертен и не образует каких-либо ассоциатов с растворителями и растворенным веществом.

Краткая характеристика основных эталонов химических сдвигов 1Н ЯМР и 13С ЯМР приведена в таблицах 10 и 11 [51].

Таблица 10 - Эталонные вещества для измерения протонных химических сдвигов

Соединение	Формула	Химический сдвиг, м.д.	Примечания
Тетраметилсилан (ТМС) Гексаметилдисилоксан 2,2-Диметил-2-силапентан-5-сульфокислота (ДСС, соль Тьера) Циклогексан	(СН3)4 [(СН3)3Si]2O (СН3)3Si(CH2)3SO3Na С6Н12	0,00 0,04 0,015 1,44	tкип= 28°С, нерастворим в воде tкип= 100,5°С, нерастворим в воде растворим в воде уширяется при низких температурах



Таблица 11 - Эталоны химических сдвигов 13С

Соединение	Химический сдвиг, м.д
	Протонный аналог	Полностью дейтерированный аналог
ТМС CS2 Хлороформ CCl4 Ацетон (метильная группа) ДМСО Циклогексан	0,00 192,8 77,2 96,0 30,4 40,5 27,5	- - 76,9 - 29,2 39,6 26,1

Ампула для регистрации спектров ЯМР. Стандартная, наиболее распространенная ампула для измерения спектров 1НЯМР представляет собой калиброванный стеклянный цилиндр длиной 15-20 см (не менее 12 см) с внешним диаметром 5 мм (рисунок 27, а). Использование вращения ампулы накладывает жесткие требования на качество ампулы: в отношении формы «донышка», калиброванности диаметра, центровки с нагрузкой, общей массы и даже формы крышки. Для получения спектра, характеризующегося максимальным разрешением, желательно использовать стандартные фирменные ампулы. Перед регистрацией спектра ампула заполняется до уровня 50 мм подготовленным исследуемым раствором и закрывается плотной тефлоновой крышкой. Для проведения исследований с газами под давлением (также с конденсированными газами) используются толстостенные ампулы (рисунок 27, б). При тщательном запаивании такая ампула может выдержать давление до 3050 атмосфер.



Рисунок 27. Ампулы для ЯМР: а - стандартная 5 мм ампула, в мм указаны важнейшие размеры; б - толстостенная ампула; в - ампула с внутренним вкладышем, фиксированным крышкой; г - микроампула со сферической резонансной полостью.

Для проведения измерения в стандартных условиях необходимо располагать примерно 0,5 мл исследуемого раствора. Довольно часто вследствие ограниченной доступности исследуемого соединения физик не располагает таким количеством раствора. В этих условиях полезно использовать микроампулы (рисунок 27,г), в которых рабочий объем катушки датчика используется наиболее эффективно. Следует помнить, что в приемную катушку попадает не вся исследуемая жидкость, а только объем, показанный на рисунке 27, а. Этот объем составляет ~ 0,1 мл: именно эта часть микроампулы делается в форме сферы. Использование микроампул позволяет уменьшить необходимое количество раствора примерно в 5 раз, что позволяет получить стандартный спектр от 1 до 3 мг органического соединения. Безусловно, широкое использование микроампул осложняется их высокой стоимостью и трудностью очистки [23].

б) Регистрация спектра

Фактическая запись спектра ЯМР проводится при определенных параметрах спектрометра. Во многих случаях, эти показатели непредставляют особого интереса для физика. Однако, для контроля качества серии спектров, если эти серии регистрируется в разное время, полезно фиксировать и выдерживать эти параметры. К числу наиболее важных параметров относятся:

ширина спектра (SW от англ. spectrumwidth) в Гц;

время прохождения (ST от англ.sweeptime) в с;

постоянная времени фильтра (Foт англ. filter) в с;

амплитуда спектра (SAот англ. spectrumamplitude);

усиление ВЧ-тракта;

уровень ВЧ-поля Н1;

амплитуда интеграла.

в) Оценка качества спектра

Прежде чем перейти к обработке спектра, физик должен оценить его качество. При визуальном осмотре спектра следует обращать внимание на следующие особенности.

Интенсивность сигналов. Спектры могут быть измерены с малым уровнем ВЧ-поля Н1, или с ослаблением усиления по низкой частоте. Желательно располагать спектром, сигналы которого имеют интенсивность (в мм у-оси),достаточно удобную для работы с линейкой или измерителем.

Фаза сигнала. Как правило, регистрируют сигнал поглощения, поэтому стандартный спектр не должен содержать фазовых искажений.

Разрешение в спектре. В спектре отыскивают «синглетную» линию (или, точнее, предположительный «синглет»), оценивают его ширину , пользуясь известным масштабом, и сравнивают эту величину с паспортным разрешением спектрометра ()0. Если существенно больше ()0, то разрешение считается плохим. При анализе причин плохого разрешения следует проверить раствор на наличие парамагнитных примесей, а также твердых нерастворимых примесей.

Боковые сигналы от вращения. При осмотре спектра можно иногда обнаружить боковые сигналы от вращения. Идентификация этих сигналов приводится следующим образом: наиболее интенсивные сигналы спектра исследуют на симметрию; если по обе стороны центрального сигнала обнаруживаются эквидистантно расположенные сигналы меньшей интенсивности, то эти сигналы могут оказаться боковыми от вращения. Для окончательной проверки этого предположения рассматривают весь спектр.

Наличие калибровки спектра. Спектр должен содержать сигнал стандарта при использовании внешней стабилизации или иметь метку частоты относительно стандарта сдвига при использовании внутренней стабилизации [52, 53].

1.12 Современный ЯМР спектрометр JNM-ECA-400 корпорации «Jeol»

ЯМР спектрометр серии JNM-ECA-400 обеспечивает съемку спектров высокого разрешения как для жидких, так и для твердых образцов. Имеет цифровое генерирование частот, цифровую регистрацию сигналов и цифровое управление, высокую степень автоматизации; автоматические процедуры тестирования. Прибор соответствует техническим характеристикам, необходимым для съемки одно- и многомерных спектров, построения многоядерных корреляций, исследования кинетики химических реакций, выполнения съемки спектров твердых тел.

Прибор и система обработки и накопления данных функционируют независимо друг от друга. Высокоскоростное соединение между ними позволяет эффективно выполнять операции по измерению и обработке данных.

Спектрометр. Многочисленные импульсные генераторы, встроенные в спектрометр, позволяют генерировать сложные последовательности импульсов. Кроме того, можно управлять точно и с высокой скоростью частотами, фазами, интенсивностью и временем выхода радиочастот в каналах наблюдения и излучения.

Компьютер для управления спектрометром предназначен для системы обработки данных и независимого управления спектрометром.

Высокопроизводительный предварительный усилитель. Сверхмалошумная арсенид-галлиевая микросхема позволяет добиваться высокой чувствительности при измерениях.

Автоматические принадлежности-приставки позволяют эффективно и просто выполнять автоматическое измерение и обработку данных.

Система обработки и накопления данных. Рабочая станция системы обработки и накопления данных использует надежную операционную систему UNIX и обеспечивает выполнение высокоскоростных операций с применением современного высокопроизводительного и высококачественного графического дисплея.

Сетевая система. Система обработки и накопления данных и спектрометр соединены в одну сеть.

Усовершенствование с целью обеспечения простоты управления. Использование множества окон позволяет разделить всю работу на малые задачи, упрощая понимание операций.

Удобный для просмотра экран. Высокопроизводительный графический дисплей позволяет выполнять операции на высокой скорости и с высоким качеством. Кроме того, применение ЖК-дисплея значительно снижает воздействие магнитного поля в месте установки прибора.

Прикладное программное обеспечение Delta позволяет выполнять ряд задач: измерение 1D, 2D, 3D и 4DЯМР; управление и мониторинг спектрометра; автоматическая обработка данных; отображение и построение графиков данных; автоматический анализ данных; настройки импульсных последовательностей, условий наблюдения измерения.

Фурье-ЯМР система серии JNM-ECA-400представлена на рисунке 28 и состоит из следующих блоков:

ЯМР-зонд (1);

сверхпроводящий магнит (SCM) (2);

шасси предварительного усилителя (3);

консоль спектрометра (4);

система обработки и накопления данных (5):системный блок, цветной жидкокристаллический дисплей, мышь, клавиатура, блок ZIP, лазерный принтер.

Рисунок 28. Фурье-ЯМР система серии JNM-ECA-400

1.13 Хроматографические методы анализа. История возникновения и развития метода

Хроматография (от греч. chroma, chromatos - цвет, краска), физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную. Хроматографический анализ является критерием однородности вещества: если каким-либо хроматографическим способом анализируемое вещество не разделилось, то его считают однородным (без примесей).

Принципиальным отличием хроматографических методов от других физико-химических методов анализа является возможность разделения близких по свойствам веществ. После разделения компоненты анализируемой смеси можно идентифицировать (установить природу) и количественно определять (массу, концентрацию) любыми химическими, физическими и физико-химическими методами.

История метода.

Хроматографический метод анализа был впервые применён русским учёным-ботаником Михаилом Семеновичем Цветом в 1900 году. Он использовал колонку, заполненную карбонатом кальция для разделения пигментов растительного происхождения. Первое сообщение о разработке метода хроматографии было сделано Цветом 30 декабря 1901 года на XI Съезде естествоиспытателей и врачей в С.-Петербурге. Первая печатная работа по хроматографии была опубликована в 1903 году, в журнале Труды Варшавского общества естествоиспытателей. Впервые термин хроматография появился в двух печатных работах Цвета в 1906 году, опубликованных в немецком журнале Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft. В 1907 году Цвет демонстрирует Немецкому Ботаническому обществу образец хроматографа -- прибора для осуществления процесса хроматографии. В 1910-1930 годы метод был незаслуженно забыт и практически не развивался. В 1952 году Дж. Мартину и Р. Синджу была присуждена Нобелевская премия по химии за создание метода распределительной хроматографии. С середины 20 века и до наших дней хроматография интенсивно развивалась и стала одним из наиболее широко применяемых методов анализа.