Этапы получения лизина
Роль лизина в построении критических белков организма. Схема производства аминокислот в виде высокоочищенных кристаллических препаратов. Культивирование продуцента и биосинтез лизина в промышленных ферментаторах. Технология получения препаратов лизина.
| Рубрика | Химия |
| Вид | курсовая работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 24.04.2016 |
| Размер файла | 49,3 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Оглавление
- Глава 1. Обзор литературы
- 1.1 Роль лизина в питании человека и животных
- 1.2 Пути микробного синтеза
- 1.3 Характеристика Corynebacterium glutamicum
- 1.3.1 Структура генома
- 1.3.2 Клеточная структура и метаболизм
- 1.3.3 Применение в биотехнологии
- 1.4 Технология биосинтеза лизина
- 1.4.1 Приготовление и стерилизация питательной среды, технологического оборудования и коммуникаций
- 1.4.2 Получение посевного материала в производственных инокуляторах или посевных аппаратах
- 1.4.3 Культивирование продуцента и биосинтез лизина в промышленных ферментерах
- 1.4.4 Производство кормового препарата ЖКЛ (жидкого концентрата лизина)
- 1.4.5 Производство высококонцентрированных кормовых препаратов
- Глава 2. Объект и методы исследования
- 2.1 Объект исследования
- 2.2 Методы исследования
- 2.2.1 Методика оживления и очистки культуры
- 2.2.2 Методика исследования влияния температуры
- 2.2.3 Приготовление питательной среды
- 2.2.4 Приготовление разбавлений
- 2.2.5 Подсчет и замер колоний микроорганизмов
- 2.2.6 Методы микроскопического исследования микроорганизмов
- 2.2.7 Статистическая обработка результатов
- Глава 3. Результаты исследования
- 3.1 Характеристика загрязнителей
- 3.2 Исследование морфологии клеток
- 3.3 Влияние температуры на рост культуры
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Роль лизина в питании человека и животных
Лизин (б, е-диаминокапроновая кислота) - незаменимая основная алифатическая аминокислота. Это специфичная протеиназа, которая в основном катализирует расщепление пептидных связей, образованных б-аминогруппой лизина. Эта незаменимая аминокислота жизненно важна для построения критических белков организма. Лизин входит в триаду аминокислот, особо учитываемых при определении общей полноценности питания (лизин, триптофан, метионин). Недостаток лизина в зерновых продуктах и сравнительно высокая потребность организма в нем ставят проблему лизина на одно из первых мест.
Данная аминокислота необходима для роста, восстановления тканей, производства антител, гормонов и ферментов. Экспериментально доказано, что при недостатке в рационе лизина рост молодых крыс прекращается с одновременным развитием гипопротеинемии. Отмечается нарушение гемопоэза и как результат этого уменьшение числа эритроцитов и количества гемоглобина. Введение лизина способствует резкому увеличению количества ретикулоцитов с увеличением очагов кроветворения в костном мозге. При наблюдении за людьми, не получавшими в рационах достаточного количества лизина у них отмечалось нарушение азотистого равновесия, истощение мышц и нарушение кальцификации костей, а также ряд изменений в печени и легких.
Лизин участвует в утилизации жирных кислот, необходимых для производства энергии. Помогает устранять некоторые проблемы связанные с бесплодием. Лизин катализирует процессы ферментативных превращений. В процессах ферментации е-аминогруппа радикала лизина осуществляет прикрепление субстрата, подвергающегося ферментативному превращению, к ферменту. Так, например, соединение биотина с белком осуществляется через е-аминогруппу радикала лизина белковой молекулы и карбоксильную группу боковой цепи молекулы биотина. Лизин входит в состав нуклеотидпептидов, являющихся промежуточным продуктом в синтезе белка. Реже лизин встречается в липопептидах - метаболитах в биосинтезе белков. В качестве диаминокислоты входит в состав белков рибосом и глюкагона-пептида -- гормона, синтезирующегося в б-клетках островковой части поджелудочной железы. Принимает участие в обмене белков и углеводов.
L-форма лизина снижает содержание триглицеридов в сыворотке крови. Участвует в синтезе аналогичного никотину алкалоида - анабазина. В своем распаде показывает поведение, несколько отклоняющееся от поведения остальных аминокислот. После потери б-аминогруппы следует замыкание кольца, которое после перемещения двойной связи снова разрывается с образованием б-аминоадипината, что приводит к образованию глутаровой и, впоследствии - кетоглутаровой кислоты. Способствует абсорбции кальция и поддерживает баланс азота во взрослом организме, участвует в производстве антител, гормонов и ферментов, способствует образованию коллагена и восстановлению тканей. Дефицит лизина вызывает у людей головную боль, головокружение, повышенную чувствительность к шуму, понижение аппетита, тошноту, рвоту, ферментные нарушения, анемию, лейкемию, истощение, нарушение репродуктивной функции. Он способствует улучшению сосредоточения. Недостаточность лизина может проявляться в покраснении глаз, выпадении волос, неспособности к концентрации, раздражительности, недостатке энергии, замедлении роста. Вводят в пищу детей для повышения аппетита, при лечении тяжелых отравлений. Он снижает повышенный уровень триглицеридов в сыворотке крови, усиливает иммунитет к вирусным инфекциям. Следует отметить способность лизина уменьшать вероятность и / или предупреждать герпесную инфекцию.
Высоким содержанием лизина отличаются все молочные продукты, однако наибольшую ценность по содержанию лизина представляют творог и обрат, получаемый в результате сепарирования молока. Важным источником лизина являются сычужные сыры. При свертывании молока сычужным ферментом образующийся сгусток в большей степени обогащен лизином, чем сгусток, образующийся в результате молочнокислого брожения. Особенностью содержания лизина в мясе является то, что он содержится и в соединительнотканных белках (4% от веса белка). Наиболее богат лизином белок мышечной ткани - миозин и белок крови - гемоглобин. В них лизина в 2,5 раза больше, чем в соединительно-тканном белке коллагене.
Яйца в качестве источника лизина представляют меньшую ценность по сравнению с мясом и творогом. 0ни содержат наполовину меньше лизина (0,8 г на 100 г, тогда как в мясе 1,5 г лизина на 100 г). В частях яйца лизин распределен неравномерно. В наибольшем количестве лизин представлен в яичном белке, в котором лизина в 2 раза больше, чем в белке желтка. Таким образом, с точки зрения содержания лизина белок является более ценным, чем желток.
Недостаточность лизина в хлебных злаках является основным фактором, снижающим ценность белков этих продуктов. Недостаток лизина в белках зерновых культур сказывается на общем аминокислотном балансе всего пищевого рациона. С удалением зародыша и наружных оболочек продукт (мука сортовая, манная крупа и др.) еще в большей степени обедняется лизином. Резко выделяются высоким содержанием лизина бобовые культуры - соя, горох, фасоль. Это продукты, как бы самой природой предназначенные для компенсации недостающего лизина в хлебных злаках. В соевой муке количество лизина более чем в 10 раз превышает его содержание в пшеничной муке, в гороховой муке - в 5 раз.
1.2 Пути микробного синтеза
Производство аминокислот в промышленных масштабах является третьим наиболее важным направлением в белой биотехнологии, не превосходящим по своим объемам лишь этанол и антибиотики. Двумя наиболее важными аминокислотами в производстве являются L-глутамат и L-лизин, стоимость продаж которых составляет более 1,5 миллиардов долларов в год. Обе эти аминокислоты производятся различными видами родов Corynebacterium и Brevibacterium. В дополнение к лизину продуценты рода Corynebacterium также используется в качестве платформы для производства других аминокислот, таких как L-треонин, L-метионин, L-серин, L-гистидин, L-валин, L-триптофан, L-фенилаланин и L-тирозин, L-лейцин и L-изолейцин.
Лизин является конечным продуктом семи или десяти реакций, начиная от его предшественника - оксалоацетата, и в зависимости от используемого маршрута. Первый шагом в пути синтеза лизина является превращение оксалоацетата в аспартат добавлением аминогруппы от глютамата, катализируемой с помощью аспартаттрансмутазы. Аспартат форфолирируется в L-4-аспартилфосфат с помощью аспартаткиназы, далее он превращается в L-аспартат-4-семиальдегид с помощью аспартатсемиальдегиддегидрогеназы. L-4-аспартилфосфат после преобразуется в дигидродипиколинатсинтазой в дегидродипиколинат. На следующем шаге путем катализа дигидродипиколинатредуктазой он преобразуется в L-пиперидин-2,6-дикарбоксилат.
aspB: EC: 2.6.1.1 (аспартаттрансмутаза); lysC: EC 2.7.2.4 (аспартаткиназа); asd: 1.2.1.11 (аспартатсемиальдегиддегидрогеназа); dapA: EC 4.2.1.52 (дигидродипиколинатсинтаза); dapB: EC 1.3.1.26 (дигидродипиколинатредуктаза); dapD: EC2.3.1.117 (2,3,4,5-тетрагидропиридин-2,6-дикарбоксилат-N-сукцинилтрансфераза); dapC: EC 2.6.1.17 (сукциниламинокетопимелаттрансаминаза); dapE: EC 3.5.1.18 (сукцинилдтаминопимелатдесукцинилаза); dapF: EC 5.1.1.7 (диаминопимелатэпимераза); lysA: EC 4.1.1.20 (диаминопимелатдекарбоксилаза); ddh: EC 1.4.1.16 (диаминопимелатдегидрогеназа).
На этом этапе синтеза существуют два пути для конверсии к мезо-2,6-диаминопимелату, последнему шагу перед конечным продуктом. Либо используется прямая реакция добавления второй аминогруппы в одном шаге (с использованием диаминопимелатдегидрогеназы), известная как дегидрогеназный вариант, или же четыре последовательные реакции, названные сукцинильным вариантом. Сукцинильный вариант предполагает использоване таких ферментов как тетрагидропиридин-2,6-дикарбоксилат-N-сукцинилтрансфераза, сукциниламинокетопимелаттрансаминаза, сукцинилдтаминопимелатдесукцинилаза и диаминопимелатэпимераза, так эе для него необходим дополнительный сукцинил-КоА. Последним шагом является декарбоксилирование мезо-2,6-диаминопимелат в лизин, который в конечном итоге идет на экспорт из клетки лизинпемеразой. В связи с коммерческой значимостью производства лизина С.glutamicum, синтетических путь получения лизина привлек всестороннее внимание, что привело к созданию впечатляющего списка патентов и патентных приложений.
1.3 Характеристика Corynebacterium glutamicum
Систематическое положение: домен - Bacteria; тип - Actinobacteria; класс - Actinobacteria, порядок - Actinomycetales; семейство - Corynebacteriaceae, род - Corynebacterium.
Синонимы: Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium lilium, Corynebacterium lactofermentum, Brevibacterium chang-fua, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium glutamigenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium seonmiso, Brevibacterium taipei, Micrococcus glutamicus, Brevibacterium thiogenitalis, Micrococcus maripuniceus.
Род Corynebacterium включает около 50 видов фенотипически различных групп бактерий. Некоторые из них (30), патогены животных и растений, в то время как другие являются сапрофитами (питаются мертвой органикой). Они так же могут выступать в качестве представителей нормальной микрофлоры человека, где эти бактерии способны найти подходящую среду обитания.
Вид Corynebacterium glutamicum является хорошо изученной почвенной бактерией и представляет большое значение в области биотехнологии, в частности, для ферментативного производства L-аминокислот для пищевой и кормовой промышленности. Название изначально было дано данному виду за его способность производить значительные количества (> 100 г на литр) глутаминовой кислоты (глутамат). С. glutamicum в настоящее время используется в коммерческих целях для получения глутамата и других аминокислот (L-лизин) и соединений. Первый штамм вида был выделен в 1957 г. С. Киносита и его коллегами, занимавшимися поисками эффективного глутамат-производителя.
1.3.1 Структура генома
Corynebacterium glutamicum имеет при себе круговую хромосому и несколько плазмид. Ее геном состоит из 3314179 нуклеотидов (в расчет берется геном штамма дикого типа С. glutamicum ATCC 13032). Она также стандартно имеет одну круговую плазмиду, pCGR1, в которой размещается 49120 нуклеотидов.
1.3.2 Клеточная структура и метаболизм
Клетки микроорганизма овальные, размером 1 - 1,5 х 0,6 - 0,8 мкм, неподвижные, граположительные. Спор не образуют.
Через 3-5 сутки роста при стандартной температуре на МПА образует колонии диаметром 2-4 мм, желтовато-кремовые, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный, структура однородная.
Corynebacterium glutamicum расщепляет углеводы в процессе брожения. Она способна забирать углерод из множества различных источников, даже таких, как некоторые ароматические соединения. Из-за разнообразия в наличие питательных веществ и источников углерода, C. glutamicum насчитывает 127 белков, связанных с регулирующей функцией в транскрипции, которая в свою очередь, связана с контролем метаболизма.
Из общей структуры С. glutamicum следует выделить строение ее клеточной стенки, одной из самых уникальных частей. Помимо пептидогликанового слоя, клеточная стенка состоит из короткой цепи миколовых кислот, наряду с парой других необычных липидов (мезодиаминопимельных кислот и арабино-галактановых полимеров).
Благодаря свойствам ее метаболизма, С. glutamicum синтезирует такие продукты, как серин, глутамат и лизин.
1.3.3 Применение в биотехнологии
Некоторые характеристики Corynebacterium glutamicum делают ее чрезвычайно полезной в биотехнологии. Она не патогенна, не образует спор, быстро растет, относительно мало требует для своего развития, не склонна к внеклеточной секреции протеазы и имеет относительно стабильный геном.
Другое возможное применение для C. glutamicum, помимо вышеуказанных, можно отыскать в биоремедиации веществ, таких как мышьяк. С. glutamicum содержит два типа оперонов в его геноме: ars1 и ars2, - которые устойчивы к мышьяку. При дальнейших экспериментах, исследователи надеются, что смогут в конечном итоге использовать эту бактерию для связки мышьяка в окружающей среде.
У Corynebacterium glutamicum есть принцип согласованного ингибирования ферментативной активности, что является особенностью биосинтеза предшественника лизина. Ингибирование синтеза лизина в клетке возможно только при повышенной концентрации обоих конечных продуктов - лизина и треонина. Самостоятельно ни лизин, ни треонин не ингибируют активности ключевого фермента - аспартакиназы. Они ингибируют этот синтез только вместе. Таким образом, вызвать сверхсинтез лизина можно лишь нарушив синтез треонина или его предшественника - гомосерина. В результате большинство продуцентов лизина не способны синтезировать гомосерин или треонин, то есть являются «ауксотрофами» по этим аминокислотам.
1.4 Технология биосинтеза лизина
Производство аминокислот в виде высокоочищенных кристаллических препаратов строится по схеме, типичной для получения и выделения вторичных метаболитов. Наиболее распространенный одноступенчатый микробиологический синтез любой аминокислоты предполагает размножение в несколько стадий исходной культуры продуцента на агаризованной среде, выращивание в маточных колбах, размножение культуры в системе инокуляторов и посевных аппаратах. В дальнейшем осуществляют выращивание культуры в производственных ферментерах. После завершения ферментации проводят, как правило, после предварительной обработки культуральной жидкости с целью улучшения фильтруемости, отделение клеток продуцента. Полученный таким образом нативный раствор подвергают предварительной очистке от окрашенных примесей с использованием сорбционных методов. Целевую аминокислоту выделяют с помощью ионного обмена или методом осаждения. Элюаты, или маточные растворы, концентрируют вакуум-выпаркой, образующиеся технические кристаллы готового продукта очищают путем перекристаллизации из насыщенного раствора. Завершается процесс получения кристаллического препарата, как правило, вакуум-сушкой очищенных кристаллов и их упаковкой.
Побочными продуктами такого производства могут быть различные кормовые препараты, производимые на основе неутилизируемых маточных растворов выделяемой аминокислоты и отработанной биомассы продуцента, предварительно объединенной с обедненными стоками ионообменных колонн производства, промывными водами, идущими на очистку технологического оборудования, а затем высушенной до остаточной влажности около 10%.
При выпуске кормовых препаратов аминокислот с невысоким содержанием основного вещества (не более 10%) технология их производства предусматривает только стабилизацию раствора культуральной жидкости перед вакуум-упариванием, концентрирование сухих веществ культуральной жидкости на вакуум-выпарной установке, стандартизацию упаренного раствора путем добавки соответствующего количества наполнителя, сушку готового продукта и его упаковку.
При получении технических или кормовых препаратов с повышенным содержанием основного вещества дополнительно могут осуществлять отделение клеток продуцента и частичное концентрирование аминокислоты в нативном растворе методом ионного обмена или осаждения.
Поскольку в одноступенчатом способе производства аминокислот в качестве продуцентов используются ауксотрофные мутанты, требующие для своего роста и биосинтеза вторичных метаболитов среды, содержащие легкоусваиваемые источники углерода, азота и такие биологически активные вещества, как витамины, его организация возможна только в строго асептических условиях. При этом особое внимание обращается не только на стерилизацию используемых питательных сред и подаваемого воздуха, всего технологического оборудования и коммуникаций, но и на строжайшее соблюдение всех регламентных требований, обеспечивающих строго асептическое промышленное культивирование данного микроорганизма.
1.4.1 Приготовление и стерилизация питательной среды, технологического оборудования и коммуникаций
Процесс биосинтеза в производственных условиях начинают с получения посевного материала в инокуляторах и посевных аппаратах. Питательная среда для культивирования продуцентов лизина содержит в качестве основного источника углерода мелассу, уксусную кислоту или их смеси. Среди источников азота наиболее часто используют соли аммония и мочевину, а также пшеничный экстракт, гидролизаты кормовых, пекарских дрожжей и казеина. Последние играют, кроме того, роль ростовых факторов: содержат в себе дефицитные для ауксотрофного мутанта аминокислоты и витамины. Нормальное течение процесса биосинтеза обеспечивается добавками солей макроэлементов: калия, фосфора, магния. Добавок микроэлементов, как правило, не производят, они содержатся в достаточном количестве в кукурузном экстракте и гидролизатах дрожжей.
Меласса, являющаяся отходом переработки сахарной свеклы или тростника, включает до 50% сахарозы от сухих веществ (СВ); кукурузный экстракт - не менее 48% сахаров от СВ, оба они представляют собой нестандартное сырье, которое от партии к партии может в значительной степени различаться.
Все компоненты питательных сред имеют практически полный набор аминокислот и биотин, т. е. среды оказываются богатыми и вполне пригодными для роста не только основного штамма, но и всевозможных примесных (диких) культур. Это и заставляет вести процесс биосинтеза в условиях строжайшей асептики.
Подготовку ферментеров (инокуляторов) к работе начинают с промывки использованного оборудования горячей и холодной водой с последующей обработкой аппаратов и коммуникаций острым паром. Установлено, что наибольшая эффективность стерилизации наблюдается при применении острого пара, имеющего температуру 135-140 °С. Однако выбор режима стерилизации зависит от материала, из которого изготовлено оборудование и его отдельные узлы. Если какая-то часть его не может быть подвержена тепловому воздействию, например датчики измерительных приборов, то применяют «холодные» способы стерилизации, предполагающие обработку растворами различных бактерицидных агентов (формальдегид, некоторые производные фенола, хлорорганические соединения, p-пропиолактон). После проведения «холодной» стерилизации оборудование промывают стерильной водой до полного удаления остатков химических реагентов.
Стерилизацию питательных сред осуществляют традиционным способом, так же как и подготовку технологического воздуха. Растворяемые компоненты среды нагревают до определенной температуры, затем выдерживают при этой температуре с последующим охлаждением до температуры ферментации. Термолабильные компоненты среды, например мелассу, стерилизуют отдельно, предварительно нагревая при перемешивании до 80°С с периодическим добавлением к раствору определенного количества воды. Собственно стерилизацию осуществляют путем быстрого разогрева полученного раствора глухим паром до 120-122 °С и выдерживают минимально необходимое время. Охлажденный раствор сжатым стерильным воздухом передают в предварительно подготовленный ферментер. Все остальные компоненты среды перед подачей в ферментер стерилизуются последовательно в том же аппарате или параллельно в отдельном реакторе с мешалкой, нагреванием до необходимой температуры и выдерживанием в течение 1 часа.
Пеногаситель (как правило, синтетического происхождения), используемый на стадиях культивирования продуцента в посевном аппарате и основном ферментере, стерилизуется отдельно в более жестком режиме (температура и длительность), чем это принято для стерилизации любых питательных сред.
1.4.2 Получение посевного материала в производственных инокуляторах или посевных аппаратах
Эта важная технологическая операция, состоящая в обеспечении основного производства достаточным количеством высококачественной биомассы клеток продуцента для засева промышленных ферментеров.
Начало процесса ферментации в посевных аппаратах, как и в основных ферментерах, начинается с засева их производственным штаммом, выращенным в необходимом количестве на предыдущих стадиях культивирования. В зависимости от продуцента количество посевного материала, передаваемого в посевной аппарат, может варьировать в широких пределах от 1 до 20% (обычно 3-5%) по объему. Коэффициент заполнения посевного аппарата в зависимости от конструкции его отдельных узлов (способ перемешивания, наличие эффективных механических пеногасителей и др.) составляет 0,5-0,7. Перемешивание среды достигается либо в результате барботажа стерильного воздуха, либо турбинной мешалкой со скоростью вращения 300 об/мин.
При выращивании культуры продуцента состав питательных сред может несколько меняться в зависимости от употребляемого штамма и основного источника углерода (см. таблицу 1.4.2.1.).
Таблица 1.4.2.1. Питательная среда для культивирования продуцента лизина в посевном аппарате (в %)
|
Меласса (по содержанию сахара) |
7,5 |
|
|
Кукурузный экстракт (содержание СВ 50%) |
2 |
|
|
Сульфат аммония |
2 |
|
|
Калия фосфат: однозамещенный |
0,05 |
|
|
двухзамещенный |
0,05 |
|
|
Мел |
1 |
|
|
Пеногаситель синтетический |
0,1 |
|
|
Вода |
остальное |
|
|
pH среды |
6,9-7,0 |
Посевную культуру выращивают при температуре 28-32°С в течение 18-24 ч и расходе воздуха 1 объем на 1 объем жидкости в 1 мин. В течение всего процесса культирования pH среды поддерживают на уровне 7,0-7,2. Об окончании процесса судят по оптической плотности культуральной жидкости и морфологическим признакам выросших клеток.
Культивирование продуцентов лизина на ацетатной среде характеризуется рядом особенностей. Поскольку присутствующий в среде ацетат угнетает биосинтез ферментов цикла трикарбоновых кислот, предельно допустимое содержание субстрата не должно превышать 2%. Поэтому при культивировании осуществляют его дробную подачу. Установлено, что наилучших результатов в производстве биомассы удается достичь при использовании в качестве источника углерода смеси уксусной кислоты с ацетатом аммония, взятых в определенном соотношении, устанавливаемом для каждого штамма экспериментально. При этом в пересчете на уксусную кислоту общая концентрация ацетат-ионов не должна превышать 1,5-2,0%.
Наиболее перспективным не только для роста клеток, но и для биосинтеза лизина оказалось применение в качестве субстрата смеси ацетата с легкоусвояемым углеводом -- сахарозой или глюкозой. Источником последних обычно служит та же меласса или гидрол, в исходной питательной среде их количество должно быть сравнимо с ацетатом.
По завершении процесса ферментации в посевных аппаратах готовая культура не должна содержать фагов, посторонней микрофлоры и иметь титр около 109 клеток на 1 мл. После проведения микробиологического контроля выращенный продуцент передают на стадию производственной ферментации.
1.4.3 Культивирование продуцента и биосинтез лизина в промышленных ферментерах
Проводят в стандартных биореакторах объемом 50, 63 и 100 м3. Такие аппараты должны обеспечить нормальный рост и развитие промышленного продуцента в асептических условиях; они снабжены необходимыми коммуникациями, теплообменниками, перемешивающими устройствами, штуцерами для подачи питательной среды и соответствующим оборудованием для ввода в нее стерильного воздуха, дополнительных питательных ингредиентов, растворов кислот и щелочей для поддержания pH среды на необходимом уровне, системами ввода стерильного пеногасителя и передачи культуральной жидкости на дальнейшую переработку. Перед началом культивирования ферментеры промывают и стерилизуют паром в течение 1 ч при 0,1 МПа.
Стерильная питательная среда в момент введения в биореактор имеет температуру, близкую к среде выращивания продуцента (32-35 °С), или около 80°С. В последнем случае для достижения температуры проведения процесса культивирования жидкую фазу охлаждают подачей холодной воды в рубашку аппарата или в теплообменники, расположенные внутри самого ферментера.
Состав питательной среды для различных штаммов-продуцентов может также различаться, как и при выращивании культуры в посевных аппаратах. Некоторые отличия могут наблюдаться в составах мелассных сред на стадиях получения продуцента в посевных аппаратах и основных ферментерах. Например, ранее указанному составу среды для посевного аппарата будет соответствовать соответствующее содержание основных компонентов питания для промышленных ферментеров (см. таблицу 1.4.3.1.).
Таблица 1.4.3.1. Среда для культивирования продуцента лизина в промышленном ферментере (в %)
|
Меласса (по содержанию сахара) |
7-12 |
|
|
Кукурузный экстракт (по содержанию СВ) |
1,2-1,5 |
|
|
Сульфат аммония |
2 |
|
|
Калия фосфат: однозамещенный |
0,05 |
|
|
двухзамещенный |
0,05 |
|
|
Мел |
1 |
|
|
Пеногаситель синтетический |
0,1 |
|
|
Вода |
остальное |
|
|
pH среды |
7,0-7,2 |
Посевной материал в количестве 5-10% от объема питательной среды поступает в ферментер. Коэффициент заполнения последнего в зависимости от интенсивности пенообразования составляет 0,6-0,75. Процесс ферментации продолжается от 55 до 72 ч при интенсивном перемешивании и аэрации (0,8-1,0 объема воздуха на объем питательной среды в 1 минуту), повышенном давлении 0,02-0,03 МПа, постоянной температуре 28-32°С и контролируемом значении pH, которое в течение культивирования поддерживается на уровне 7,0-7,5; периодически производится подача стерильного пеногасителя.
В первые сутки культивирования продуценты ассимилируют около 25% углеводов и общего азота среды, в том числе почти все аминокислоты, в этот период образуется практически вся биомасса. Вторая стадия роста культуры сопровождается резким снижением скорости накопления биомассы и самыми высокими скоростями биосинтеза лизина -- 0,8-1,0 г/(л·ч). Питательная среда сильно истощается, возможно, значительное изменение pH раствора. На данном этапе осуществляют подтитровывание среды 25%-ным раствором аммиака. Последняя стадия культивирования может сопровождаться некоторой убылью биомассы за счет небольшого автолиза клеток и резким снижением скорости образования лизина.
Контроль за ходом процесса биосинтеза осуществляют на разных этапах его проведения по оптической плотности раствора культуральной жидкости (по содержанию клеток продуцента), по содержанию субстрата в смеси или по сигналам датчиков pH и растворенного кислорода в ферментационной среде. К концу процесса биосинтеза содержание лизина в культуральной жидкости достигает не менее 40 г/л, концентрация оставшегося субстрата не более 0,5-1,0%.
Количество накапливаемого лизина удается повысить, если по мере исчерпания источников углерода и азота в среду по ходу процесса дополнительно вводить небольшие количества этих питательных веществ. Организация дробной «подпитки», общий объем которой не превышает 10% объема исходной жидкой фазы, приводит к активизации биосинтетической деятельности микроорганизмов. На мелассной среде осуществление дробной «подпитки» позволяет увеличить концентрацию образующегося в культуральной жидкости лизина до 50 г/л. Экономический коэффициент по потреблению сахара в пересчете на лизин составляет 35%.
На ацетатной среде из-за токсичности субстрата биосинтез лизина возможен только при применении дробной подачи уксусной кислоты. Как и при получении посевного материала, содержание уксусной кислоты в жидкой фазе не должно превышать 2%. Введение в среду небольшого количества сахара, например глюкозы в количестве до 1,5%, способствует повышению выхода лизина на 30-50%. Экономический коэффициент по потреблению ацетата в пересчете на лизин достигает 27%. Использование такой среды позволяет снизить потребность продуцента в биотине до 1 мкг на 1 л среды, однако при этом предполагается соблюдение определенного соотношения дефицитных аминокислот (см. таблицу 1.4.3.2.).
Таблица 1.4.3.2. Среда для культивирования штамма Corynebacterium sp.
|
Ацетат аммония |
1,5 |
|
|
Глюкоза |
1,0 |
|
|
Калия фосфат однозамещенный |
0,02 |
|
|
Сульфат магния |
0,04 |
|
|
Сульфат аммония |
3,0 |
|
|
Гидролизат соевой муки (по СВ) |
1,5 |
|
|
Вода |
остальное |
Соотношение треонина к метионину должно быть равно 3:1, содержание тиаминхлорида -- 0,04 мг/л, а биотина -- 0,05 мг/л. Уксусная кислота подавалась непрерывно в виде смеси 1 моль/л уксусной кислоты и 0,25 моль/л ацетата аммония с такой скоростью, чтобы концентрация ацетат-иона не превышала 1,5%.
К концу 72-го часа культивирования концентрация лизина составляет 34 г/л. Однако использование более высокопродуктивных штаммов-продуцентов и выбор оптимальных условий проведения процесса биосинтеза в реальном производстве позволяют за то же время культивирования достичь концентрации лизина 50 г/л.
Технология получения лизина, как и других аминокислот, одноступенчатым микробиологическим синтезом в зависимости от источника углерода предполагает использование специально подобранных штаммов-продуцентов. Количество субстрата, технология внесения его в среду, степень утилизации определяются физиологическими особенностями выбранного продуцента и адаптацией его к взятому источнику углерода.
Поскольку большинство промышленных продуцентов лизина обладает уреазной активностью, помимо традиционных источников азота в виде солей аммония возможно использование мочевины. Однако для каждого штамма выбор соли осуществляют экспериментально по наибольшему образованию лизина. На течение процесса биосинтеза оказывает влияние соотношение концентраций углерода и азота в среде, для каждого штамма существует свой оптимум. Например, для продуцента C. glutamicum 95 соотношение C:N=11:1, при его увеличении падает выход лизина, при уменьшении -- вместо лизина накапливается аланин. Недостаточная аэрация в ходе ферментации приводит к образованию молочной кислоты.
Для нормального роста и развития продуцента необходимо присутствие в среде фосфора. Его включают в состав питательных сред в виде калиевых солей фосфорной кислоты. Однако количество фосфора в среде регламентировано в пределах 8-20 мг %. Увеличение данной концентрации на один порядок для продуцента C. glutamicum почти наполовину снижает выход лизина.
Все продуценты лизина в той или иной степени испытывают потребность в ряде макро- и микроэлементов: магнии, железе, меди, марганце. Эти металлы вводят в среду в виде солей серной кислоты; сульфат магния задают на уровне 0,03--0,05%, остальных солей берут меньше -- от 0,0008 до 0,001%. Железо, медь и марганец специально в среды не вносят, если они присутствуют в достаточном количестве в пшеничном экстракте, мелассе и других компонентах среды.
Выход лизина тесно связан с основными параметрами процесса ферментации: температурой, концентрацией растворенного кислорода, длительностью культивирования, дозой и возрастом посевного материала.
Для продуцентов лизина температурный оптимум роста, развития и биосинтеза аминокислоты 28 - 30°С. Повышение температуры культивирования на 5°С приводит к быстрому автолизу клеток, и в среде накапливается значительно меньше лизина. Снижение температуры на 5° от оптимальной, хотя и не снижает выхода лизина, однако отрицательно сказывается на экономике процесса биосинтеза, поскольку время культивирования удлиняется в среднем на 12 - 20 часов. pH среды культивирования бактериальных штаммов-продуцентов 6 - 8,5. Для промышленных штаммов, используемых в настоящее время, оптимум значения pH 7,0 - 7,5.
Различные продуценты лизина испытывают неодинаковую потребность в кислороде, но поскольку процесс биосинтеза предполагает высокую активность дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот и ферментов глиоксалатного цикла, производственное культивирование должно проводиться при интенсивной аэрации. Количество растворенного в жидкой фазе кислорода необходимо поддерживать на оптимальном уровне. Недостаточная аэрация приводит к образованию аланина и молочной кислоты за счет снижения выхода лизина. Слишком интенсивная аэрация способствует усиленному росту биомассы, выход лизина при этом также начинает снижаться. В процессе культивирования концентрацию растворенного кислорода контролируют по его парциальному давлению (рО2). В момент наибольшей скорости образования биомассы и начала активного биосинтеза лизина (в период от 16 до 20 ч роста культуры) величина (рО2) резко снижается, что может отрицательно сказаться на биосинтезе аминокислоты. Показано, что в момент критического снижения парциального давления в ферментер требуется подать такое количество воздуха, чтобы концентрация растворенного кислорода не оказалась ниже 20-30% значения, соответствующего насыщению культуральной жидкости в данных условиях.
Количество подаваемого на производственную ферментацию посевного материала обычно колеблется в пределах 1-5%, с повышением дозы посевного материала выше экономический коэффициент, короче лаг-фаза и меньше время получения производственной культуры. Поскольку скорость роста клеток и максимум скорости биосинтеза лизина между собой не совпадают, практически вся биомасса образуется в первые 12-18 ч, а лизин начинает синтезироваться в заметных количествах лишь тогда, когда рост биомассы замедляется. С началом образования лизина связано уменьшение в размере клеток продуцента. Наиболее характерным признаком начала биосинтеза лизина является почти полное потребление из среды дефицитных для ауксотрофного мутанта аминокислот, например треонина. Эти факторы могут учитываться при организации микробиологического и биохимического контроля процесса ферментации.
Готовая культуральная жидкость помимо лизина и других продуктов метаболизма содержит биомассу продуцента и остатки непотребленных питательных веществ среды. В зависимости от конкретных целей производства на основе культуральной жидкости можно получить технические препараты в виде жидкого концентрата лизина (ЖКЛ) и сухого кормового концентрата лизина (ККЛ), а также высококонцентрированные кормовые и высокоочищенные кристаллические препараты для пищевой и медицинской промышленности. Производство каждого из этих препаратов осуществляется по своей технологии.
Поскольку практически весь L-лизин, производимый в мире микробиологическим синтезом, расходуется на обогащение кормов сельскохозяйственных животных и птицы, основное внимание далее будет уделено рассмотрению технологических особенностей получения кормовых препаратов.
Ранее в СССР широкое распространение имели кормовые препараты лизина в виде ЖКЛ и ККЛ. Технико-экономические показатели производства таковы, что существующая технология позволяет получать ценные кормовые добавки по приемлемой для сельского хозяйства стоимости. Его отличительной особенностью является получение технических препаратов лизина на основе всей суммы веществ, присутствующих в культуральной жидкости, включая биомассу продуцента и твердые нерастворимые частицы исходной среды. Помимо лизина товарные формы ЖКЛ и ПКЛ содержат большое количество других соединений, повышающих ценность кормовой добавки, например витамины Bi, В2, В3, В4, РР и др.
1.4.4 Производство кормового препарата ЖКЛ (жидкого концентрата лизина)
Технология производства ЖКЛ основана на упаривании готовой культуральной жидкости до содержания 40% АСВ. Для этого предварительно нагретую до температуры 95-100°С культуральную жидкость направляют на многокорпусную вакуум-выпарную установку и упаривают в 3,5-4 раза. При длительном нагревании возможны потери лизина, связанные, в основном, с процессами окисления и конденсации е-аминогрупп лизина с редуцирующими веществами, сопровождающимися появлением окрашенных продуктов (пигментов), ухудшающих качество готового продукта. Поэтому исходную культуральную жидкость предварительно стабилизируют 25%-ным раствором гидросульфита натрия в количестве 0,4% от объема жидкой фазы, а затем подкисляют концентрированной соляной кислотой до pH 4,5-5,0. Образующийся при этом монохлоргидрат лизина более устойчив к термическому воздействию. Проведение операций стабилизации и подкисления позволяет снизить потери лизина до 5-15%.
Полученный по такой технологии препарат ЖКЛ имеет вязкость 0,65-10-3 кг/(м·с), температуру замерзания около -- 18°С, удельную массу 1,15-1,30, pH 4,5-5,0, сохраняет свои свойства без изменения в течение 3 мес. Считают, что он обладает большей биологической ценностью, чем сухой ККЛ. Готовый продукт передают в железнодорожные цистерны и направляют потребителю.
Производство препарата ККЛ (кормового концентрата лизина). Препарат ККЛ производят на основе ЖКЛ. Для этого жидкий концентрат высушивают на распылительной сушилке горячим воздухом при температуре не выше 90°С до остаточной влажности 4-8% и фасуют по 20 кг в крафт-мешки с полиэтиленовым вкладышем. Такой концентрат содержит (в %) до 15-20 монохлоргидрата лизина, до 14 других аминокислот, 15-17 белка, 10-13 бетаина и 20-25 зольных веществ. По своему составу он практически не отличается от ЖКЛ.
Однако производимый по данной технологии ККЛ очень гигроскопичен, при хранении слеживается крупными комками, что затрудняет приготовление из него комбикормов. Устранение данного недостатка достигается введением в упаренную культуральную жидкость наполнителей в виде костной муки, негашеной извести, бентонита, пшеничных отрубей. Применение последних имеет наибольшее распространение. Для этого к сконцентрированной до 35-40% АСВ культуральной жидкости добавляют отруби из такого расчета, чтобы влажность смеси была около 70% и образовалась масса, способная к формированию в гранулы. Полученная таким образом паста высушивается конвективным способом на вальцово-ленточной сушилке до гранул необходимого размера. Произведенный с этими наполнителями ККЛ содержит до 7-10% лизина, он сыпуч и негигроскопичен.
лизин аминокислота биосинтез ферментатор
1.4.5 Производство высококонцентрированных кормовых препаратов
При получении высококонцентрированных кормовых препаратов лизина готовую культуральную жидкость предварительно подкисляют серной кислотой до pH 1,6-2,0. При этом молекула лизина переходит в форму двухвалентного катиона, что способствует в дальнейшем более эффективной его сорбции на ионите. Подкисленный раствор направляют на батарею ионообменных колонн, заполненных сульфокатионитом КУ-2-8 в аммонийной форме. После проведения стадии адсорбции сорбат промывают водой. Технологические стоки, содержащие клетки продуцента и другие неадсорбировавшиеся компоненты культуральной жидкости, поступают на утилизацию. С ионообменных колонн лизин элюируют (80-90% от адсорбированного количества) 0,5-5,0%-ным раствором аммиака, элюат упаривают под вакуумом при температуре 60 °С до 30-50% содержания СВ и подкисляют концентрированной соляной кислотой до pH 4,9. Образовавшийся монохлоргидрат лизина поступает на сушку, конечный продукт производства -- кормовой препарат монохлоргидрата лизина -- содержит не менее 70% основного вещества.
Технологические стоки и промывные воды, включающие клетки продуцента, аминокислоты и другие компоненты культуральной жидкости, а также следовые количества лизина, объединяют, упаривают и сушат с наполнителем до остаточной влажности 10%. Получают препарат, который используют как кормовой продукт, он содержит до 40% белковых веществ.
Производство кристаллических высокоочищенных препаратов лизина. Такие препараты, как и другие аминокислоты, получают на основе осветленных нативных растворов, т. е. тех же культуральных жидкостей, но, как правило, свободных от клеток продуцента и окрашенных соединений. Культуральная жидкость после биосинтеза без дополнительной стабилизации поступает на фильтрационную установку, где отделяются биомасса продуцентра и присутствующие в среде карбонаты и фосфаты кальция. Влажный осадок направляют в отдельный сборник, а оттуда на сушку. Сухой биошрот используют как обогатительную добавку в корма сельскохозяйственных животных.
Тщательно очищенный от взвеси фильтрат освобождают от присутствующих пигментов путем адсорбции на активированном угле или на анионитах. Полученный раствор с pH 7,0 поступает на ионообменное выделение. В дальнейшем основные стадии производства кристаллического лизина совпадают с рассмотренной технологией получения высококонцентрированных препаратов лизина, различие наблюдается лишь на стадии получения монохлоргидрата лизина. Раствор монохлоргидрата лизина после дополнительного вакуум-упаривания при 60 °С охлаждают до 12-14 °С, образовавшиеся кристаллы лизингидрохлорида отфильтровывают под давлением азота на нутч-фильтре, маточный раствор возвращают на стадию вакуум-упаривания. Если, выпавшие кристаллы окрашены пигментами, то их с нутч-фильтра направляют в кристаллизатор, где при 70 °С растворяют в 3-4 объемах деионизованной воды, охлаждают, подвергают очистке на сорбенте от пигментных примесей и возвращают на стадию вакуум-упаривания. К очищенному концентрату лизина добавляют 3-4-кратное количество этанола и осуществляют кристаллизацию из водно-спиртового раствора. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и промывают чистым этанолом. Водно-спиртовые маточники направляют на регенерацию. Кристаллический продукт высушивают под вакуумом при 60 °С.
Выход лизина на стадии выделения составляет 75%. Готовый продукт представляет собой L-лизин монохлоргидрат с содержанием основного вещества 97-98%, имеет влажность 0,5%, зольность 0,3%, температуру плавления 210 °С.
Завершают процесс производства фасовка, упаковка и складирование готового продукта. Фасуют препарат в полиэтиленовые мешки, которые герметизируют и упаковывают в картонные коробки.
Глава 2. Объект и методы исследования
2.1 Объект исследования
Штамм Corynebacterium glutamicum B-11167 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) и имеет регистрационный номер ВКПМ В-11167. И, согласно паспорту, обладает следующими культурально-морфологическими признаками:
- клетки овальные, размером 1,0-1,5x0,6-0,8 мкм, неподвижные, грамположительные, полиморфны, спор не образуют;
- через 3-5 суток роста при 30 °С на МПА образует колонии диаметром 2-4 мм, желтовато- кремовые, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный, структура однородная тестообразная. При посеве штрихом через 2 суток рост умеренный, край гладкий, поверхность матовая;
- через 3-5 суток роста при 30 °С на глюкозоминеральной среде Гловера, содержащей лейцин, биотин и тиамин, колонии 1 - 2 мм, край ровный, структура однородная, консистенция тестообразная, поверхность гладкая, цвет колоний светло-кремовый. Рост штриха на этой среде через 2 суток умеренный.
Указанный штамм обладает следующими физиолого-биохимическими признаками:
- аэроб;
- желатину не разжижает;
- хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, фруктозе, маннозе, этаноле, уксусной кислоте. Не растет на ксилозе, арабинозе, лактозе, раффинозе;
- усваивает азот в форме солей аммония и мочевины. Не усваивает нитратный азот;
- растет при температуре 24-40 °С. Оптимальная температура 30-32 °С;
- растет на средах с рН от 6 до 8,5. Оптимальное значение рН 6,8-7,2;
- при росте в минимальной среде нуждается в биотине, тиамине и L-лейцине;
- устойчив к аналогу лизина S-(2-аминоэтил)-L-цистеину (АЭЦ);
- устойчив к стрептомицину.
Штамм обладает следующими генетическими характеристиками:
В составе ключевых генов, влияющих на уровень продукции лизина - генов аспартакиназы (lys С), гомосерин дегидрогеназы (hom), пируват карбоксилазы (рус) выявлены следующие мутации:
- в гене lysC - точечная замена в позиции нуклеотидов G835A и двойная замена в триплете ТСС на GCT в позициях T949G и С951Т, что ведет к замене аминокислот А279Т и S317A, соответственно.
- в гене hom - точечная замена в позиции нуклеотидов G443C, что ведет к замене аминокислоты G148A.
- в гене рус - точечная замена в позиции нуклеотидов C1364G, что ведет к замене аминокислоты A455G.
- штамм несет мутацию устойчивости к аналогу лизина S-(2-аминоэтил)-L-цистеину (АЭЦ) и мутацию устойчивости к антибиотику стрептомицину.
Предположительно данный штамм был получен методом классического или случайного мутагенеза, который включает в себя повторное мутации, выбор желаемого мутанта и последующей возгонки продуктивности с помощью постоянных пересевов.
Продуктивность штамма составляет не менее 130 г лизина с 1 л рабочего объема реактора при росте на среде, содержащей в качестве источников углерода глюкозный сироп и гидролизат глютена, что в принципе не является наибольшей величиной среди штаммов-продуцентов этого типа.
2.2 Методы исследования
В основу эксперимента положена методика культивирования бактерии продуцента лизина штамма B-11167 Corynebacterium glutamicum на основе сред, предложенных ФГУП «ГосНИИгенетика».
2.2.1 Методика оживления и очистки культуры
Методика оживления и очистки культуры предусматривает следующие этапы:
- оживление исходной криокультуры B-11167 Corynebacterium glutamicum: размораживание при комнатной температуре при встряхивании в течение 30 минут;
- приготовление, подготовка и стерилизация питательных сред в автоклаве при температуре 116 °С в течение 40 минут. Аналогичная подготовка необходимой посуды и инструментов при температуре не более 121 °С;
- рассев в ламинарном шкафу бактериологической петлей в чашках Петри и на агаризованную среду LB с глюкозой и биотином. Термостатирование культуры при 30 °С минимум 48 часов;
- контроль морфологических свойств культуры визуально (колонии) в чашках Петри и пробирках и микроскопированием фиксированного препарата по морфологическим признакам. Контроль чистоты культуры в силу того, что среда не является селективной и легко загрязняется дикими штаммами других родов микроорганизмов извне.
2.2.2 Методика исследования влияния температуры
Методика исследования влияния температуры на штамм B-11167 Corynebacterium glutamicum включает в себя следующие этапы:
- подготовка разведений на основе смывов чистой культуры с косого агара;
- рассев на чашки Петри 3 последних разведений (10-6-10-8) по 3 повторности в спектре температур 25-35 °С с использованием агаризованый среды LB. Термостатирование культуры при каждой из соответствующих температур минимум 48 часов;
- визуальный контроль морфологических свойств культуры, подсчет количества и измерение размеров колоний. Микроскопирование фиксированных препаратов с целью учета длин бактерий при различных температурах.
- циклический пересев культуры на косой агар для поддержания ее в активном состоянии и повторение эксперимента.
2.2.3 Приготовление питательной среды
Нами использовалась агаризованная среда LB с глюкозой и биотином, рекомендованная ФГУП «ГосНИИгенетика». Для ее приготовления при учете на 1 литр требовались следующие компоненты: 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl, 1 мл d-биотина, 10 мл 50% раствора глюкозы, 17 агар-агара. Все вышеуказанное переносилось в колбу, рассчитанную на необходимый объем, доливалось дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивалось. Затем среду ставили на автоклавирование при температуре 116 °C в течение 20 минут. Либо, если рассев производился на косой агар, то по 10 мл среды заранее заливается в биологические пробирки.
Приготовленную и простерилизованную питательную среду переносили в заранее подготовленные чашки Петри, которые также были простерилизованы в сушильном шкафу при температуре 170 °C в течение 2 часов. Слегка покачивая чашки, распределяли среду равномерно по их дну и оставляли стоять на ровной поверхности. Или же чашки автоклавировались вместе со средой для повышения ее влажности и уменьшения вероятности попадания загрязнителей.
2.2.4 Приготовление разбавлений
Для микробиологического анализа микрофлоры сыра мы использовали три разбавления - 1:106, 1:107 и 1:108.
Стерильную дистиллированную воду разливали по 9 мл в 8 стерильных сухих пробирок и в одну - 10 мл.
Затем в ламинарном шкафу в биологическую пробирку с культурой, посеянной на косой агар, заливали 10 мл стерильной дистиллированной воды, бактериологической петлей производили смыв. Пробирку с полученной суспензией перемешивали на вортексе до получения равномерного раствора.
Для приготовления разбавлений мы использовали стерильные механические дозаторы. Из исходной пробирки забирали по 1 мл суспензии и перемещали последовательно в пробирки с дистиллированной водой, 1 минуту перемешивали на вортексе и переходили к следующей.
Рассев проводился из трех последних разбавлений. Из каждого отбирали по 0,2 мл суспензии и высевали на чашки Петри поверхностным способом (по три повторности). Пассаж проводился механическим дозатором. Распределение жидкости шпателем не производилось, чтобы не спровоцировать занесение в чашку загрязнителя.
На боковой стенке чашек Петри мы отмечали ее порядковый номер для удобства в контроле. Все чашки Петри помещали в термостат на 48 часов при температуре от 25 до 35 °С с разницей в градус, крышками вниз (во избежание появления конденсата).
2.2.5 Подсчет и замер колоний микроорганизмов
Подсчет колоний микроорганизмов производился с помощью счетчика колоний Flash&Go. Изначально с помощью сопутствующей программы производилась калибровка, а затем анализ каждой чашки с ручной корректировкой.
Замер колоний производился вручную с помощью обыкновенной линейку с ценой деления в 1 мм. Из каждой чашки случайным образом выбиралось 5 колоний, которые затем замерялись с точностью до 0,5 мм.
2.2.6 Методы микроскопического исследования микроорганизмов
Подобные документы
Характеристика необходимых алифатических и ароматических аминокислот, которые не могут быть синтезированы в организме человека. Пищевые источники валина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, трионина, триптофана и аргинина. Их роль в организме.
презентация [789,3 K], добавлен 10.10.2016Исследования свойств белков для изучения их химического состава и строения. Аминокислота - основная структурная единица белка. Белковые резервы. Этапы синтеза белка. Регуляция биосинтеза аминокислот. Переваривание белков. Патология белкового обмена.
реферат [21,7 K], добавлен 17.01.2009Роль аминокислот в жизнедеятельности организма человека. Сорта и химический состав яблок. Технология производства яблочного сока. Построение градуировочного графика. Методика определения аминокислот. Оптимизация условий проведения нингидриновой реакции.
дипломная работа [1,3 M], добавлен 18.07.2014Адаптация облигатных метилотрофных бактерий. Исследование степеней включения дейтерия в молекулу L-фенилаланина В. methylicum, полученного со сред с тяжёлой водой. Исследование степеней включения изотопа углерода.
автореферат [719,9 K], добавлен 23.10.2006Характеристика белков как высокомолекулярных соединений, их структура и образование, физико–химические свойства. Ферменты переваривания белков в пищеварительном тракте. Всасывание продуктов распада белков и использование аминокислот в тканях организма.
реферат [66,2 K], добавлен 22.06.2010Применение нанотехнологий в медицине. Воздействие наночастиц на организм человека. Медицинские применения сканирующих зондовых микроскопов. Получение монокристаллов в двухслойной ванне. Устройства для получения препаратов с нитевидными кристаллами.
дипломная работа [977,4 K], добавлен 04.06.2015Белки – высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот. Наследственная информация сосредоточена в молекуле ДНК. С помощью белков реализуется генетическая информация. Классификация аминокислот.
реферат [21,6 K], добавлен 17.01.2009Общие пути обмена аминокислот. Значение и функции белков в организме. Нормы белка и его биологическая ценность. Источники и пути использования аминокислот. Азотистый баланс. Панкреатический сок. Переваривание сложных белков. Понятие трансаминирования.
презентация [6,6 M], добавлен 05.10.2011Сырье, общая технологическая схема производства алюминия. Процесс получения глинозема, описание электролитической технологии получения алюминия. Его очистка и рафинирование. Определение технической топологии ТХС, специфика определения ее параметров.
лекция [308,5 K], добавлен 14.10.2009Физико-химические свойства аминокислот. Получение аминокислот в ходе гидролиза белков или как результат химических реакций. Ряд веществ, способных выполнять некоторые биологические функции аминокислот. Способность аминокислоты к поликонденсации.
презентация [454,9 K], добавлен 22.05.2012
