Этапы получения лизина

Метод раздавленной капли. Данный метод был нами использован для определения подвижности бактерий. На середину чистого предметного стекла мы наносили каплю дистиллированной воды, затем стерильной петлей добавляли небольшое количество бактерий, хорошо размешивая. Сверху каплю накрывали покровным стеклом, предварительно подкрасив ее метиленовым синим. Рассматривали препарат под микроскопом при увеличении 400х. При этом в поле зрения можно было наблюдать подвижные формы микроорганизмов.

Фиксированный препарат. Данный метод мы использовали для определения формы бактериальных клеток. Работу начинали с приготовления мазка, который высушивали над пламенем спиртовки. При этом важно было не допустить перегрева мазка, так как при этом может произойти свертывание белков протоплазмы бактериальной клетки. Затем мы производили фиксирование препарата путем быстрого проведения покровного стекла над пламенем горелки, что обеспечивает лучшее прикрепление мазка к стеклу. После этого - окрашивали препарат раствором карболового фуксина, промывали водопроводной водой, высушивали и рассматривали увеличении 400х.

После фотографии фиксированных препаратов колоний, выращенных при каждой конкретной температуре, подвергались анализу программой ScopeTek, где случайно выбиралось и измерялось по 100 клеток.

Метод окраски по Граму. Данный метод основан на способности клеток микроорганизмов удерживать красители трифенилметанового ряда.

Готовили фиксированный мазок на чистом предметном стекле, сверху помещали полоску фильтровальной бумаги и наносили краситель. Через 1-2 минуты снимали бумагу и, не промывая, наносили на мазок каплю йода. Через 1 мин обесцвечивали мазок спиртом и окрашивали красителем (карболовым фуксином). Затем смывали остатки красителя водой, высушивали над пламенем спиртовки и рассматривали под микроскопом при увеличении 400х. При этом грамположительные бактерии окрашивались в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в розовый.

Метод окраски спор по Цилю-Нильсону в модификации Мюллера. Данный метод был использован для определения возможности некоторых видов загрязнителей к спороношению.

Готовили фиксированный мазок на чистом предметном стекле, затем наносили 5% раствор серной кислоты для протравы. Препарат подогревали пять минут (до появления паров), затем сливали кислоту. После мазок промывали водой, покрывали фильтровальной бумагой и наносили на нее карболовый фуксин Циля. Красили препарат в течение семи минут, периодически добавляя раствор красителя и подогревая его до появления пара или же доводя до кипения. По мере испарения растворителя добавляли краситель, не давая ему подсохнуть во время подогревания. Затем снимали фильтровальную бумагу, препарат промывали и обесцвечивали (в течение 15 сек.) 1% раствором серной кислоты, после чего промывали водой. Потом окрашивали препарат метиленовым синим в течение 1 мин. Затем препарат тщательной промывали водой, высушивали над пламенем спиртовки и рассматривали под микроскопом при увеличении 400х.

Споры при этом приобретали характерный красный цвет, а вегетативные клетки - синий.

2.2.7 Статистическая обработка результатов

- вычисление среднего арифметического значения по всем повторностям (x_ср);

- вычисление разности (d) между данными по повторностям;

- определение среднего арифметического разности (d_ср);

- расчет отклонения между каждой разностью и средним значением (d-d_ср);

- возведение данного отклонения в квадрат и его суммирование (?(d-d_ср)²);

- вычисление ошибок разностей (S_d) по следующим формулам:

S_{d (1 - 2)} =; S_{d (1 - 3)} =.

- Вычисление критерия Стьюдента фактического:

t _(1-2) = (x_2ср - x_1ср)/ S_d(1-2); t _(1-3) = (x_3ср - x_1ср)/ S_d(1-3);

Фактический критерий мы сравнивали с теоретическим и делали выводы, пользуясь следующим правилом: если фактический критерий Стьюдента равен теоретическому значению или больше него, то разность между вариантами существенна.

Теоретические значения критерия t мы брали из таблицы для различных уровней вероятности, которое вычисляли по формуле:

v = (n₁-1) + (n₂-1)

Глава 3. Результаты исследования

Как указывалось ранее, агаризованная среда LB, на которой рекомендовано поддерживать активность культуры Corynebacterium glutamicum, является приемлемой для многих сторонних диких штаммов. Поэтому при пересевах требуется поддерживать жесткие стерильные условия, что в нашей лаборатории является весьма сложной задачей.

В ходе процесса очистки культуры нам удалось выделить 2 наиболее распространенных загрязнителя, от которых сложнее всего избавиться.

Первым из них оказался представитель рода Bacillus. Он представляет собой белую колонию, характеризующуюся неограниченным ростом и широкими температурными пределами. Вырастает на первый день, подавляет все остальные встречающиеся виды. При севе штрихом занимает всю поверхность среды равномерным слоем. Экспоненциальный рост приходится на первые 2 дня.

Клетки представляют собой длинные палочки в пределах 1-7х1-1,2 мкм, неподвижны, грамположительны. К четвертому дню роста переходят к споруляции.

Вторым является представитель рода Micrococcus. Образует ярко-желтые округлые колония, характеризующиеся более умеренным ростом (вырастает до 1,5 см). Предпочитает температуры 31-35 °С. Вырастает на 2-3 день. При севе штрихом вырастает на первый день.

Клетки шаровидные, одиночные, грамотрицательные, спор не образуют. Средний диаметр - 1 мкм. Легко удаляются при облучении ультрафиолетом.

3.2 Исследование морфологии клеток

В каждый исследованной температуре мы замерили по 100 особей на каждый вариант. Измерения при температурах 34 и 35°С выпали из общей статистики из-за того, что при подобных условиях культура не росла. Мы разделили совокупность особей на 3 класса, где в первый входили микроорганизмы с 1,0 - 2,5 мкм, наиболее молодые и активные. Второй класс представлял собой приблизительные средние размеры особей - 2,5 - 3,5 мкм. И последний, третий класс включал в себя все остальные формы, вплоть до инволюционных, то есть 3,5 - 7,5 мкм.

Как можно заключить из таблицы 3.2.1., где мы сравнивали выделенные классы между собой, уровень достоверности полученных данных крайне высок, так как t (табл) меньше значения t(факт).

Таблица 3.2.1. Статобработка цифровых данных влияния температур на морфологию Corynebacterium glutamicum B-11167

Прим.: в указанной таблице сравнивались между собой I и II классы, а так же II и III.

Доминирование клеток первого класса при температуре 28 °С свидетельствует о быстром темпе роста культуры и приближении этой температуры к оптимальному значению. В качестве примечания необходимо отметить, что в паспорте указано оптимальное значение 30 °С. За пределами в 31°С рост резко угнетался и кратно возрастала доля крупных клеток и инволюционных форм. Однако показатели длин клеток внутри классов не ощутимо варьировали.

3.3 Влияние температуры на рост культуры

В первой части эксперимента для обработки данных мы использовали результаты разведения 1:10⁶. За контроль мы взяли указанный в паспорте оптимум температуры - 30°С, с которым и сравнивали все остальные повторности. Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента. Показатель концентрации клеток в культуре (ОМЧ) вычисляли следующим образом: среднее значение микроорганизмов из последнего разведения каждой температуры делили на разведение и умножали на 1 мл.

Как можно заключить из таблицы 3.3.1., концентрация клеток существенно не изменяется за исключением достоверного понижения при температуре в 31 °С. Все данные являются недостоверными в силу небольшого числа повторностей.

Таблица 3.3.1. Влияние температуры на концентрацию клеток в культуре Corynebacterium glutamicum B-11167 (КОЕ/мл)

Можно наблюдать наибольшую концентрацию микроорганизмов при температуре в 28°С и почти равномерное ее понижение вплоть до температурного предела роста.

Следующая часть эксперимента включала в себя анализ данных по размеру колоний. За контроль мы взяли указанный в паспорте оптимум температуры - 30°С, с которым и сравнивали все остальные повторности. Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента.

Как можно заключить из таблицы 3.3.2., размер колоний существенно не меняется и находится в пределах 2 мм. Однако можно пронаблюдать аналогичную тенденцию к увеличению средней величины колоний (или же интенсивности роста) к температуре 28 °С и последующее ее снижение. Все данные являются недостоверными в силу невысокой точности измерительного инструмента и небольшого числа повторностей.

Таблица 3.3.2. Влияние температуры на размер колоний Corynebacterium glutamicum B-11167 (мм)

Размещено на Allbest.ru