Біологічно активні речовини роду Hypericum L. як джерело створення лікарських засобів із заданими властивостями

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВІТИ ІМЕНІ П.Л. ШУПИКА

УДК 615.322: 615.011:633.88:581.19:582.824

Біологічно активні речовини роду Hypericum L.

як джерело створення лікарських засобів

із заданими властивостями

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фармацевтичних наук

МАКОВЕЦЬКА Олена Юріївна

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі медичної ботаніки Національного ботанічного саду імені М.М. Гришка НАН України.

Науковий консультант: доктор фармацевтичних наук ДІХТЯРЬОВ СЕРГІЙ ІВАНОВИЧ Державний науковий центр лікарських засобів, заступник директора з наукової роботи

Офіційні опоненти:доктор фармацевтичних наук, професор ВЕТЮТНЕВА НАТАЛІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА Київська медична академія післядипломної освіті ім. П.Л. Шупика, професор кафедри фармацевтичної хімії та фармакогнозії;

доктор фармацевтичних наук КУЗЬМЕНКО ІВАН ЙОСИПОВИЧ Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділу технології, синтезу та аналізу лікарських засобів;

доктор фармацевтичних наук, професор ПЕТРЕНКО ВОЛОДИМИР ВАСИЛЬОВИЧ Запорізький державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри аналітичної хімії

Провідна установа:Національна фармацевтична академія України МОЗ України, кафедра медичної ботаніки, м. Харків

Захист відбудеться “26” квітня 2002 року о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.04 при Київській медичній академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика за адресою: 04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9).

Автореферат розісланий “23” березня 2002 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Л.Б. Пилипчук

Маковецька О.Ю. Біологічно активні речовини роду Hypericum L. як джерело створення лікарських засобів із заданими властивостями. - Рукопис.

Дисертація представлена на здобуття наукового ступеня доктора фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. - Київська медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика. - Київ, 2002. біологічний сполука звіробій антрахінон

Дисертацію присвячено питанням комплексного вивчення біологічно активних речовин роду звіробій Hypericum L., зокрема антрахінонів та флавоноїдів: дослідження якісного складу, кількісного вмісту в рослинах 73 видів Hypericum L.; структури, можливостей моделювання нових сполук із заданими властивостями; біологічної дії. В результаті досліджень виявлені нові джерела сировини звіробою для виробництва препаратів антидепресантної та антивірусної дії - види з секцій Adenosepalum, Hirtella, Taeniocarpium, Coridium. Вперше змодельовані та одержані нові сполуки діантронової природи, які мають задані властивості (розчинність у воді, малу токсичність та високу біологічну дію, незалежну від світлового впливу), - водорозчинні форми та глікозиди діантронів; - вивчено їх антивірусну дію. Розроблено комплексну технологію одержання і методики контролю якості першого вітчизняного антидепресивного фітопрепарату Капсули Антидепресин із субстанцією екстрактом трави звіробою сухим. Водорозчинні форми, глікозиди діантронів і екстракт трави звіробою рекомендовано для дослідів in vivo з вивчення антивірусної активності.

Ключові слова: Hypericum; біологічно активні речовини; діантрони; гіперицин; глікозиди; водорозчинні форми; флавоноїди; антидепресантна, антивірусна дія; екстракт трави звіробою сухий; капсули Антидепресин.

Маковецкая Е.Ю. Биологически активные вещества рода Hypericum L. как источники создания лекарственных средств с заданными свойствами. - Рукопись.

Диссертация представлена на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. - Киевская медицинская академия последипломного образования имени П.Л. Шупика. - Киев, 2002.

Диссертация посвящена вопросам комплексного изучения биологически активных веществ (БАВ) рода зверобой Hypericum L., в частности антрахинонов и флавоноидов: анализу их качественного состава, количественного содержания в растениях 73 видов Hypericum L., неспецифических для флоры Украины; исследованию структуры БАВ, физико-химических свойств, возможностей моделирования новых соединений с заданными свойствами; физиологического и фармакологического действия.

Впервые проведена полная химическая таксация рода Hypericum L. по составу антрахинонов и флавоноидов. На основе полученных данных предложена модификация внутриродовой классификации Hypericum L., разработанной Н. Робсоном (Англия, 1977).

В результате экспериментов выявлены новые источники сырья зверобоя для производства препаратов антидепрессантного и антивирусного действия - виды из секций Adenosepalum, Hirtella, Taeniocarpium, Coridium.

Впервые экспериментальными и расчетными методами исследована тонкая структура молекулы диантронов (на модели гиперицина) и доказано, что гиперицин существует в виде суммы как нейтральных, так и заряженных частиц, - частично восстановленных форм, катионов, анион-радикалов, дианионов и молекул известной хиноидной структуры, - образованных, главным образом, на основе трех таутомеров, находящихся в триплетном состоянии. Установлено, что достаточно легко осуществляется протонирование молекул таутомеров гиперицина за счет молекул воды путем присоединения протона к кислородному атому карбонильных групп.

На основе полученных данных впервые смоделированы и получены новые соединения диантроновой природы, имеющие заданные свойства (растворимость в воде, малую токсичность и высокое биологическое действие, независимое от светового воздействия), - комплексные соединения с поливинилпирролидоном и гликозиды диантронов; - изучена их структура, состав, физико-химические свойства, антивирусное действие.

Впервые исследовано влияние диантронов на процессы переноса электронов в реакции Хилла. Показано, что физиологическая роль агликонов полифенолов в мембранных структурах хлоропластов и митохондрий связана с ингибированием синтеза АТФ, сопряженного с переносом электронов по электронно-транспортной цепи и, параллельно, с интенсификацией дыхания. Реакция гликозилирования полифенолов играет регуляторную роль, нивелируя ингибиторное воздействие агликонов на процесс переноса энергии.

Разработаны комплексная технология получения и методики контроля качества первого отечественного антидепрессивного фитопрепарата “Капсулы Антидепрессин” с субстанцией - экстрактом травы зверобоя сухим. Технология позволяет значительно повысить рентабельность производства благодаря параллельному производству из одного и того же сырья травы зверобоя продырявленного двух фитосредств с разными свойствами - антибактериального препарата “Новоиманин” и антидепрессивного препарата “Капсулы Антидепрессин”.

Разработаны и апробированы на НПЦ “Борщаговский ХФЗ”: - проект промышленного технологического регламента на производство экстракта травы зверобоя сухого; - проект промышленного технологического регламента на производство капсул Антидепрессин; - проект фармакопейной статьи на экстракт травы зверобоя сухой; - проект фармакопейной статьи на капсулы Антидепрессин. Препарат “Капсулы Антидепрессин” успешно прошел все доклинические испытания, и по результатам исследований является более эффективным, чем препараты сравнения “Деприм” и “Флуоксетин”, и равноэффективным препарату “Амитриптилин”.

По результатам определения цитотоксичности и вирулицидной эффективности in vitro экстракт травы зверобоя сухой, полученный по новой оригинальной технологии, комплексные соединения диантронов с поливинилпирролидоном и гликозиды диантронов рекомендованы для дальнейших испытаний с целью создания антивирусных препаратов, высокоэффективных по отношению как к сложноустроенным (Рабдовирусы), так и простым (Пикорнавирусы) вирусам.

Разработана рецептура для приготовления тонизирующего и общеукрепляющего безалкогольного напитка “Бодрящий”, на основе травы зверобоя продырявленного, включенная в технические условия ТУ У 15.8-13931591-001 “Смеси растительные “Экоплант” - полуфабрикаты для приготовления безалкогольных напитков”. Производство напитка осуществляется Коммандитным Товариществом “Эко”, г. Кременчуг.

Ключевые слова: Hypericum; биологически активные вещества; диантроны; гиперицин; гликозиды; водорастворимые формы; флавоноиды; антидепрессантное, антивирусное действие; экстракт травы зверобоя сухой; капсулы Антидепрессин.

Makovetskaya Е.Yu. Biologically active substances of Hypericum L. genus as a source of creation of pharmaceuticals with given properties. - Manuscript.

Thesis for a doctor's degree in speciality 15.00.02 - Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy. - Kiev Medical Academy of Postgraduate Training named after P.L. Shupik. - Kiev, 2002.

The thesis is devoted to questions of complex study of Hypericum genus biologically active substances, in particular - dianthrones and flavonoids: a research of qualitative composition, quantitative contents in plants from 73 Hypericum species; structure, possibilities of modelling of new compounds with given properties; biological action. As a result of experiments the new sources of raw material of Hypericum for production of preparations with antidepressant and anti-virus action - species from Adenosepalum, Hirtella, Taeniocarpium, Coridium sections are revealed. For the first time the new compounds of dianthronic nature with given properties (solubility in water, small toxicity and high biological effect independent of light influence), - dianthrones water-soluble forms and glycosides are modelled and received; their anti-virus action is investigated. The complex technology of obtaining and methods of quality control of the first home anti-depressive phytopreparate Antidepressinum Capsules with dry extract of H. perforatum herb as a substance is developed. The new substances are recommended for in vivo experiments on anti-virus activity study.

Key words: Hypericum; biologically active substances; dianthrones; hypericin; glycosides; water-soluble forms; flavonoids; antidepressant, anti-virus action; dry extract of H. perforatum herb; Antidepressinum Capsules.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Створення і впровадження у медичну практику вітчизняних високоефективних лікарських препаратів, направлених на відновлення здоров'я людини в умовах погіршення екологічної обстановки - одне з головних завдань сучасної фармацевтичної науки. Важливе значення у цьому напрямку набувають лікарські засоби, створені на основі рослин та виділених із них речовин.

Серед рослин, які на протязі багатьох років широко застосовуються у медичній практиці, чільне місце займають види роду звіробій Hypericum L. Проте, незважаючи на великий інтерес у світі до роду в цілому, підвищення якого спостерігається протягом останнього десятиріччя, більшість робіт присвячено двом найбільш вивченим видам, офіцинальним в Україні, - звіробою звичайному Hypericum perforatum L. та з. плямистому H. maculatum Crantz, - біологічно активні речовини яких, за літературними даними, мають виражені протимікробні (ефірні олії, флавоноїди), противірусні, антидепресивні (діантрони), кровозупинні, капілярозміцнюючі, гепатопротекторні, гіпоазотемічні, гіпоглікемічні (флавоноїди), протизапальні, анальгезуючі (дубильні речовини, флавоноїди, ефірні олії), стимулюючі (терпеноїди, флавоноїди, дубильні речовини), в'яжучі (дубильні речовини), жовчогінні (флавоноїди, ефірні олії, дубильні речовини, смоли), антиоксидантні властивості (флавоноїди, діантрони, вітамін Є). На основі речовин, виділених із з. звичайного та з. плямистого, одержаний ряд вітчизняних та імпортних фармацевтичних препаратів - “Новоіманін” із антимікробною дією, “Гіфларин” із гіпоазотемічними властивостями, “Гіперфорат”, “Седарістон”, “Фітогран”, “Седа-Гранделат”, “Кіра”, “Геларіум Гіперикум” (Німеччина), “Деприм” (Словенія) антидепресивної дії та ін. Інші види роду Hypericum L. або вивчені недостатньо, або практично зовсім не вивчені.

Згідно з прийнятою природною внутрішньородовою класифікацією Н. Робсона (Robson, 1977), рід Hypericum L. налічує біля 400 видів, які належать до 30 секцій. До нез'ясованих питань біохімії роду Hypericum L. на нинішній момент відносяться: якісний склад біологічно активних речовин вторинного походження (у тому числі - флавоноїдів, антрахінонів), зокрема, в залежності від фази розвитку рослин, виду та секції; кількісний вміст сполук фенольної природи - в залежності від фази розвитку рослин, виду та секції. Актуальним у цьому аспекті постає і вивчення впливу речовин фенольної природи та комплексних екстрактів, одержаних із рослин роду Hypericum L., на депресивні стани різного ступеню тяжкості та на деякі групи простих і складноутворених вірусів.

Безсумнівний науковий і практичний інтерес, таким чином, має хемотаксономічне дослідження видів роду Hypericum L., і виявлення в межах роду секцій та видів, що відрізняються високим вмістом біологічно активних речовин фенольної природи, і є перспективними для одержання фармацевтичних препаратів із заданими властивостями, зокрема, антидепресантними та антивірусними, які у вітчизняній практиці невідомі.

Важливим є також вивчення тонкої структури діантронів - однієї з груп біологічно активних речовин, що є специфічною для рослин роду Hypericum L., з метою подальшої її модифікації, зважаючи на віруліцидну та антидепресантну активність природних вихідних діантронів та їх деякі недоліки (мала активність по відношенню до простих вірусів, необхідність фотоактивації для прояву вираженої біологічної дії, низька біологічна доступність у зв'язку з нерозчинністю у воді та біологічних рідинах). Безсумнівну актуальність представляє отримання речовин діантронової природи, що мають більш високу віруліцидну активність та більшу біодоступність у порівнянні з відомими сполуками з метою подальшої розробки на їх основі високоефективних противірусних препаратів.

Зважаючи на виснаження природної ресурсної бази офіцинальних видів звіробою у зв'язку з нераціональним використанням сировини трави звіробою, наявної у фармацевтичному виробництві, одним з реальних шляхів збільшення рентабельності є розробка технологічної схеми комплексного виробництва нового лікарського засобу з антидепресантною дією - препарату “Капсули Антидепресин” паралельно з виробництвом із тієї ж сировини антибактеріального препарату “Новоіманін”. Іншим шляхом підвищення природних запасів сировини офіцинальних видів звіробою в Україні є промислове культивування у спеціалізованих агропромислових підприємствах, для чого необхідною є розробка технології промислового культивування офіцинальних видів Hypericum L. в умовах України.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у відповідності до плану науково-дослідних робіт відділу медичної ботаніки Національного ботанічного саду ім. М.М. Гришка НАН України (шифр теми 317-БАР, номер державної реєстрації 0101U000922).

Мета і задачі досліджень. Метою роботи є вивчення морфобіохімічного різноманіття видів Hypericum L. світової флори, не представлених у флорі України (на модельних екземплярах інтродуцентів Національного ботанічного саду (НБС) НАН України, Київ); виявлення в межах роду Hypericum L. секцій та видів, перспективних для одержання фармацевтичних препаратів із заданими властивостями; вивчення тонкої структури молекул діантронів як найбільш вагомих біологічно активних речовин з антидепресантними та антивірусними властивостями (на моделі гіперицину), вивчення можливостей моделювання на їх основі похідних із новими властивостями та отримання з трави звіробою нових високоефективних засобів антидепресивної, противірусної та тонізуючої дії.

Для реалізації поставленої мети вирішувалися такі задачі:

- вивчити якісний склад антрахінонів і флавоноїдів у видів роду Hypericum L. світової флори, не специфічних для флори України, - в залежності від фази розвитку рослин, виду та секції - на базі модельних екземплярів 73 видів Hypericum L. з усіх 30 секцій роду, інтродукованих у НБС НАН України;

- виявити закономірності розподілу та накопичення біологічно активних речовин антрахінонової та флавоноїдної природи у рослин роду Hypericum L. у період вегетації, в зв'язку з сезонними ритмами, в залежності від секції;

- дослідити кількісний вміст похідних антрахінону та флавоноїдів у видів роду Hypericum L. світової флори - в залежності від фази розвитку рослин, виду та секції;

- виявити секції та види Hypericum L. світової флори, перспективні за вмістом антрахінонів і флавоноїдів для отримання фармацевтичних препаратів із заданими властивостями;

- вивчити тонку структуру молекул діантронів групи гіперицину (на моделі гіперицину), можливості їх модифікації за допомогою полімерів та вуглеводів та створення на їх основі форм і похідних з новими властивостями;

- створити водорозчинні форми діантронів групи гіперицину та нові похідні діантронів (глікозиди);

- вивчити структуру, склад та фізико-хімічні властивості нових похідних діантронів і форм діантронів;

- встановити біологічну роль індивідуальних речовин Hypericum L. антрахінонової та флавоноїдної природи в рослинних і тваринних організмах (на моделі переносу електронів в електронно-транспортному ланцюзі в реакції Хіла);

- встановити вплив індивідуальних речовин антрахінонової і флавоноїдної природи та комплексних екстрактів, отриманих із рослин роду Hypericum L., на прості та складноутворені віруси (Пікорнавіруси, Рабдовіруси);

- дослідити спектр антивірусної дії нових похідних діантронів і форм діантронів;

- вивчити фармакологічну дію (антидепресантну) індивідуальних речовин та комплексних екстрактів, отриманих із використанням різних методик із рослин роду Hypericum L., у дослідах in vivo;

- розробити технологічну схему комплексного виробництва та показники якості нового антидепресивного препарату з сировини трави звіробою, наявної у фармацевтичному виробництві.

Об'єкти досліджень: рослини 73 неспецифічних для флори України видів роду Hypericum L., що належать до всіх його 30 секцій (інтродуценти НБС, Київ), а також родоспецифічні біологічно активні речовини (БАР) Hypericum L. - діантрони гіперицин, псевдогіперицин, протогіперицин, протопсевдогіперицин, гіперикодегідродіантрон, їх водорозчинні комплекси з ПВП та глюкозиди, отримані нами.

Предмет дослідження: виявлення секцій та видів Hypericum L. світової флори, перспективних за вмістом діантронів і флавоноїдів для одержання фармацевтичних препаратів антидепресантної та антивірусної дії; отримання нових похідних і форм діантронів із заданими властивостями (розчинність у воді, мала токсичність, висока біологічна активність, незалежна від фотоактивації); розробка технологічної схеми комплексного виробництва і показників якості нового антидепресивного препарату з сировини трави звіробою, наявної у фармацевтичному виробництві; розробка основи створення противірусного препарату з високою біологічною доступністю.

Методи дослідження: Якісний склад БАР вивчали методами паперової (ПХ) та тонкошарової хроматографії (ТШХ). Кількісне визначення суми мономірних антрахінонів і суми діантронів проводили із застосуванням спектрофотометричних методів (Маковецкая и др., 1991); суми флавоноїдів - за методом спектрофотометрії з алюмінію хлоридом (ТФС 42-1775-87, у нашій модифікації); дубильних речовин - за методикою ДФ ХІ (1987, вип. 1, с.286-287); суми фенолкарбонових кислот - згідно з методикою (Saxena et al., 1994); суми вільних цукрів - за методикою (Takeda et al., 1998); суми кумаринів - методом (Sonar, Singh, 1992); суми тритерпенових сапонінів - за методикою (Li, Hu, 1995); загального азоту - за методикою (ДФ ХІ, 1987, вип. 1, с.180-181). Структуру діантронів досліджували методами ПХ, ТШХ, електронної (УФ), інфрачервоної (ІЧ) спектроскопії, ядерно-магнітного резонансу (ЯМР) та квантово-хімічними методами у напівемпіричному s,p-валентному наближенні (PM3 - Seeger et al., 1991; Stewart, 1989). Вплив діантронів (гіперицин, псевдогіперицин) та флавоноїдів (кверцетин, гіперозид, рутин) на реакцію Хіла проводили за методикою (Марковский и др., 1989). Цитотоксичність in vitro визначали згідно до (Методические вопросы научной разработки противовирусных средств, 1977); віруліцидну активність - методом титрування за ефектом бляшкоутворення в культурах клітин під живильним покриттям (Широбоков и др., 1986). Гостру токсичність in vivo досліджували за методом В.Б. Прозоровського із співавт. (1978); при вивченні токсичності при хронічному застосуванні візуально визначали наявність ознак інтоксикації при внутрішньошлунковому введенні речовин, що досліджувались, протягом 14 діб в ефективній дозі. Антидепресантну активність вивчали із застосуванням двох методик: плавального тесту (Русаков, Вальдман, 1978) та розробленого нами комбінованого резерпін-плавального тесту (резерпіновий тест - за Машковським із співавт., 1983).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено повну хімічну таксацію роду Hypericum L., в тому числі докладно вивчено якісний склад антрахінонів і флавоноїдів у видів роду Hypericum L. світової флори, не характерних для флори України, в залежності від фази розвитку рослин, виду та секції; виявлено закономірності розподілу та накопичення біологічно активних речовин антрахінонової та флавоноїдної природи у рослин роду Hypericum L. у період вегетації, в залежності від секції.

Із використанням фітохімічного критерію систематики рослин (а саме, якісного складу антраценпохідних і флавоноїдів) запропоновано модифікацію внутрішньородової класифікації Hypericum L., розробленої Н. Робсоном (Англія, 1977).

Вперше досліджено кількісний вміст антрахінонів і флавоноїдів для всіх 30 секцій роду Hypericum L., в тому числі - в залежності від фази розвитку рослин, - і встановлено вплив зазначених речовин на прості та складноутворені віруси in vitro; у дослідах in vivo вивчено антидепресивну дію індивідуальних сполук та комплексних екстрактів, отриманих із використанням різних методик із деяких видів Hypericum L. На основі одержаних даних вперше виявлено секції Hypericum L. світової флори (Adenosepalum, Hirtella, Taeniocarpium, Coridium), перспективні для отримання фармацевтичних препаратів з антидепресивними та антивірусними (проти Пікорна- та Рабдовірусів) властивостями, та рекомендовано для клінічних випробувань новий антидепресивний препарат із звіробою.

Вперше експериментальними і розрахунковими методами досліджено тонку структуру молекули діантронів (на моделі гіперицину) і доведено, що гіперицин існує у вигляді суми як нейтральних, так і заряджених часток - відновлених форм, катіонів, аніон-радикалів, діаніонів та молекул відомої хіноїдної структури, - утворених, головним чином, на основі трьох таутомерів - 8,13-діон-1,3,4,6,7,14-гексагідроксидіантрону, 7,14-діон-1,3,4,6,8,13-гексагідроксидіантрону і 3,4-діон-1,6,7,8,13,14-гексагідроксидіантрону, що знаходяться у триплетному стані. Встановлено, що досить легко здійснюється протонування молекул таутомерів гіперицину за рахунок молекул води шляхом приєднання протону до кисневого атому карбонільних груп.

На основі виділених із рослин звіробою діантронів, природних і синтетичних вуглеводів і полімерів вперше створено нові форми діантронів групи гіперицину та одержано нові похідні діантронів (глікозиди діантронів), вивчено їх структуру, склад, фізико-хімічні властивості, антивірусну дію. Водорозчинні форми діантронів та глікозиди діантронів поряд із екстрактом трави звіробою запропоновано для дослідів in vivo з вивчення антивірусної активності проти Пікорна- і Рабдовірусів із метою створення нового високоефективного препарату з противірусною активністю та високою біологічною доступністю.

Вперше досліджено вплив діантронів на процеси переносу електронів у реакції Хіла. Базуючись на отриманих даних, показано, що фізіологічна роль агліконів поліфенолів у мембранних структурах хлоропластів і мітохондрій пов'язана з інгібуванням синтезу АТФ, сполученого з переносом електронів по електронно-транспортному ланцюгу і, паралельно, з інтенсифікацією дихання, при цьому реакція глікозилювання поліфенолів відіграє регуляторну роль, нівелюючи інгібіторний вплив агліконів на процес переносу енергії.

Практичне значення одержаних результатів. У результаті вивчення морфобіохімічного різноманіття родового комплексу Hypericum L. світової флори за вмістом похідних антрацену та флавоноїдів виділені види та секції, перспективні для подальшого отримання фармацевтичних препаратів із заданими властивостями. Так, види з секцій Adenosepalum, Hirtella, Taeniocarpium і Coridium відзначаються високим вмістом діантронів групи гіперицину та флавоноїдів флавонолової групи і рекомендовані для одержання сумарних лікарських засобів з антидепресантними, антивірусними, тонізуючими властивостями. Як перспективні для отримання лікарських препаратів на основі діантронів запропоновані види з секцій Crossophyllum, Oligostema, Drosocarpium, Origanifolia і Thasia; для отримання лікарських засобів на основі флавоноїдів - види з секцій Campylosporus, Androsaemum, Spachium, Psorophytum, Ascyreia і Brathys.

Розроблено технологію промислового вирощування офіцинальних видів звіробою, яка впроваджена у Київській та Миколаївський областях України (за розробленою технологією офіцинальні види звіробою вирощуються в агропромислових господарствах с. Дідівщина Фастівського району Київської області на площі у 25 га та с. Щербані Вознесенського району Миколаївської області на площі 50 га).

Розроблено комплексну технологію одержання та методики контролю якості першого вітчизняного антидепресивного фітопрепарату “Капсули Антидепресин” із субстанцією - екстрактом трави звіробою сухим.

Розроблені: - проект промислового технологічного регламенту на виробництво екстракту трави звіробою сухого; - проект промислового технологічного регламенту на виробництво капсул Антидепресин; - проект фармакопейної статті на екстракт трави звіробою сухий; - проект фармакопейної статті на капсули Антидепресин, які апробовані НВЦ “Борщагівський ХФЗ”.

Результати in vitro визначення віруліцидної ефективності проти Пікорна- та Рабдовірусів екстракту трави звіробою сухого, отриманого за новою оригінальною технологією, водорозчинних форм діантронів і глікозидів діантронів, дозволили рекомендувати їх для подальших випробувань з метою створення антивірусних препаратів, високоефективних по відношенню як до складноутворених (Рабдовіруси), так і простих (Пікорнавіруси) вірусів.

Розроблено рецептуру для приготування тонізуючого і загальнозміцнюючого безалкогольного напою “Бадьорий”, на основі трави звіробою звичайного, включену до технічних умов ТУ У 15.8-13931591-001 “Суміші рослинні “Екоплант” - напівфабрикати для виготовлення безалкогольних напоїв”. Виробництво напою здійснюється Командитним Товариством “Еко”, м. Кременчук.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною завершеною науковою працею.

Дисертанту належить вирішальна роль у визначенні мети дослідження, шляхів її реалізації, плануванні та використанні експерименту, його обробці, інтерпретації та узагальненні одержаних результатів, формуванні основних положень та висновків, що захищаються. Крім того, дисертантом особисто проведений аналіз літературних даних сучасного стану вивчення біологічно активних речовин видів роду Hypericum L., їх структури, властивостей, складу, вмісту у рослинах роду, біологічної дії та практичного застосування; вивчений якісний склад та кількісний вміст антрахінонів і флавоноїдів у 73 видів Hypericum L. світової флори, не специфічних для флори України (в залежності від фази розвитку рослин, виду та секції); виявлено закономірності розподілу та накопичення БАР антрахінонової та флавоноїдної природи у рослин роду Hypericum L. у період вегетації, в зв'язку з сезонними ритмами; на базі отриманих результатів виявлено секції та види Hypericum L. світової флори, перспективні за вмістом антрахінонів і флавоноїдів для отримання фармацевтичних препаратів із заданими властивостями. Розрахунковими методами квантової хімії, хроматографічними методами, методами кислотного гідролізу та УФ-спектроскопії дисертантом особисто вивчено тонку структуру молекул діантронів групи гіперицину (на моделі гіперицину), можливості їх модифікації за допомогою полімерів та вуглеводів; створено на їх основі нові водорозчинні форми і похідні (глікозиди діантронів) з новими, заданими, властивостями; вивчено їх структуру, склад та фізико-хімічні властивості. Дисертант брала безпосередню участь в аналізуванні ІЧ- та ЯМР ¹³С-спектрів вихідних діантронів та їх нових похідних, у розробці планів експериментів та проведенні дослідів по вивченню біологічної ролі речовин Hypericum L. антрахінонової та флавоноїдної природи в живих організмах (на моделі переносу електронів в електронно-транспортному ланцюзі в реакції Хіла), антидепресантної дії індивідуальних БАР і комплексних екстрактів, отриманих із рослин роду Hypericum L., та по встановленню впливу окремих БАР (вихідних та нових сполук) і екстрактів Hypericum L. на прості та складноутворені віруси (Пікорнавіруси, Рабдовіруси). Дисертантом особисто здійснено детальний аналіз одержаних результатів та обгрунтовано основні теоретичні положення стосовно фізіологічної ролі БАР в живому організмі та механізмів їх впливу як in vivo, так і in vitro; запропонований новий фармакологічний тест для визначення антидепресантної дії препаратів - резерпіно-плавальний тест.

Дисертантом безпосередньо розроблено технологічну схему комплексного виробництва та показники якості нового антидепресивного препарату з сировини трави звіробою, наявної у фармацевтичному виробництві; розроблено проект ФС на екстракт трави звіробою сухий і препарат “Капсули Антидепресин” та проекти промислових технологічних регламентів на виробництво екстракту трави звіробою сухого і препарату “Капсули Антидепресин”. Дисертант брала участь в апробації промислових технологічних регламентів та показників якості на НВЦ “Борщагівський ХФЗ”. Дисертантом безпосередньо розроблено рецептуру для приготування безалкогольного напою “Бадьорий”, на основі трави звіробою звичайного, включену до ТУ У 15.8-13931591-001 “Суміші рослинні “Екоплант” - напівфабрикати для виготовлення безалкогольних напоїв”.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались на Четвертій Міжнародній конференції з медичної ботаніки (Київ, 1997), на Міжнародній нараді, присвяченій пам'яті В.Г. Мінаєвої “Фізіолого-біохімічні аспекти вивчення лікарських рослин” (Новосибірськ, Росія, 1998), на 10 Міжнародній науковій конференції “Вивчення онтогенезу рослин природних та культурних флор у ботанічних закладах Євразії” (Умань, 1998), на V національному з'їзді фармацевтів України (Харків, 1999), на Міжнародній конференції “Medicinal Raw Material and Phytopreparations for Medicine and Agriculture” (Караганда, Казахстан, 1999), на 12 Міжнародній науковій конференції “Вивчення онтогенезу рослин природних та культурних флор у ботанічних закладах і дендропарках Євразії” (Полтава, 2000), на Євроконференції “Modern Analytical Methods for Food and Beverage Authentication” (Лєдніце, Чехія, 2000), на спільному засіданні відділень молекулярної біології, біохімії, експериментальної та клінічної фізіології і загальної біології НАН України та Вченої ради біологічного факультету Київського національного університету ім. Т.Г.Шевченка (2001), а також на наукових конференціях і Вченій Раді Національного ботанічного саду НАН України (1992-2001).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 36 наукових робіт, у тому числі - 23 статті у фахових наукових журналах і 3 Патенти України на винахід.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 449 сторінках машинопису (загальний обсяг - 297 сторінок машинопису), вона складається з вступу, огляду літератури, 5 розділів експериментальної частини, висновків, бібліографії та додатків. Роботу ілюстровано 61 таблицею і 71 рисунком. Список використаної літератури налічує 488 джерел, із них 323 іноземних.

ОСНОВНИЙ Зміст роботи

У вступі обґрунтовується вибір теми та її актуальність, формулюються завдання досліджень, відзначаються наукова новизна та практична значимість отриманих результатів.

У першому розділі наведено короткий огляд сучасних уявлень про ботаніко-систематичну, хімічну та фармакологічну характеристику роду Hypericum L.; про стан вивчення структури та властивостей діантронів та природних і синтетичних модуляторів низькомолекулярних сполук. Окреслюються основні методи, що використовуються для якісних та кількісних досліджень діантронів у сировині звіробою, наведено сучасні гіпотези щодо будови діантронів і механізмів їх фізіологічної та фармакологічної дії.

У розділі “Введення в експеримент” обгрунтований вибір об'єктів та методів дослідження.

Об'єктами досліджень при аналізі БАР були рослини 73 неспецифічних для флори України видів роду Hypericum L., що належать до всіх його 30 секцій, - інтродуценти НБС, Київ. При приготуванні нового лікарського засобу сировиною служила трава офіцинального виду звіробою звичайного Hypericum perforatum L., зібрана в Криму (фаза масового цвітіння); у Львівській області (фаза масового цвітіння); а також трава культивованого в НБС з. звичайного (різні фази онтогенетичного розвитку). При вивченні індивідуальних діючих речовин Hypericum L. об'єктами досліджень були: діантрони гіперицин (фірма Roth, арт. № 5593, ФРН), псевдогіперицин (фірма Koch-Light, Швейцарія), протогіперицин (С₃₀Н₁₈О₈; т.пл. 316^оС; Brockmann et al., 1975), протопсевдогіперицин (С₃₀Н₂₂О₁₀; т.пл. 354^оС; Brockmann et al., 1975), гіперикодегідродіантрон (С₃₀Н₂₀О₈; т.пл. 330^оС; Brockmann et al., 1975), їх водорозчинні комплекси з ПВП та глюкозиди, отримані нами.

Якісний склад БАР вивчали методами ПХ та ТШХ у різних системах розчинників. Кількісне визначення суми мономірних антрахінонів у перерахунку на франгулаемодин і суми діантронів у перерахунку на гіперицин проводили за методиками, запропонованими нами раніше (Маковецкая и др., 1991), основою яких є використання питомих показників поглинання. При кількісному визначенні суми флавоноїдів застосовували метод спектрофотометрії з алюмінію хлоридом, згідно з методикою (ТФС 42-1775-87), у нашій модифікації (застосована на стадії отримання спиртового екстракту і полягає у попередньому знежиренні сировини звіробою органічним розчинником). Кількісне визначення дубильних речовин проводили за методикою ДФ ХІ (1987, вип. 1, с.286-287); суми фенолкарбонових кислот - згідно з методикою (Saxena et al., 1994); суми вільних цукрів - за методикою (Takeda et al., 1998); суми кумаринів - методом (Sonar, Singh, 1992); суми тритерпенових сапонінів - за методикою (Li, Hu, 1995); загального азоту - за методикою (ДФ ХІ, 1987, вип. 1, с.180-181).

Цитотоксичність in vitro визначали у перещепних культурах клітин HeLa та L₄₁ за наявністю та інтенсивністю дегенеративних змін в культурі клітин у темряві та за умов попередньої фотоактивації (Методические вопросы научной разработки противовирусных средств, 1977). Віруліцидну активність вивчали на прототипних штамах вірусів поліомієліту типу 2, Sebin (P-712, Ch, 2ab), Коксакі В1 (Conn-5), В4 (JVS), B6 (Schmitt), родина Picornaviridae, рід Enterovirus; і вірусу везикулярного стоматиту (Індіана), родина Rhabdoviridae, рід Vesiculovirus, що культивуються у перещепних культурах клітин Нер-2 і L₄₁ із використанням середовища Ігла з антибіотиками як підтримуючого. Інфекційну активність вірусів (БТО/мл) визначали методом їх титрування за ефектом бляшкоутворення в культурах клітин під живильним покриттям (Широбоков и др., 1986); віруліцидну активність оцінювали за показником зниження титру вірусу на log₁₀.

Токсичність in vivo вивчали в гострих і хронічних дослідах на білих нелінійних мишах-самцях. Гостру токсичність досліджували за методом В.Б. Прозоровського із співавт. (1978). При дослідженні токсичності при хронічному застосуванні візуально визначали наявність ознак інтоксикації (загибель, судоми, втрата ваги, зміни покровів шкіри та м'яких тканин голови, тіла, кінцівок) при внутрішньошлунковому введенні речовин, що досліджувались, протягом 14 діб в ефективній дозі. Як препарати порівняння використовували: Деприм (LEK, Словенія) з субстанцією - екстрактом трави звіробою сухим (0.5% суми діантронів); антидепресанти з групи інгібіторів нейронального захвату амітриптилін (Spofa, Чехія) і флуоксетін (Прозак, EGIS, Угорщина). Антидепресантну активність вивчали із застосуванням двох методик: плавального тесту (Русаков, Вальдман, 1978) та розробленого нами комбінованого резерпін-плавального тесту, згідно з яким антидепресантна активність визначалась за двома експериментальними підходами: за власне антирезерпіновою дією, тобто усуненням поведінкових та вегетативних ефектів, викликаних резерпіном (резерпіновий тест - за Машковським із співавт., 1983) та за впливом на поведінку “відчаю” у плавальному тесті, підсилену депресивною дією резерпіну.

Вплив діантронів (гіперицин, псевдогіперицин) та флавоноїдів (кверцетин, гіперозид. рутин) на реакцію Хіла проводили згідно з методикою (Марковский и др., 1989) на хлоропластах проростків гороху сорту “Уладовський 10”, одержаних за методикою (Rawyler et al., 1995), вирощеного при освітленні лампами денного світла.

Структуру діантронів досліджували методами ПХ, ТШХ, електронної (УФ), інфрачервоної (ІЧ) спектроскопії, ядерно-магнітного резонансу (ЯМР) і квантово-хімічними методами у напівемпіричному s,p-валентному наближенні (PM3 - Seeger et al., 1991; Stewart, 1989).

У другому розділі наведені результати дослідження біологічно активних речовин рослин роду Hypericum L. в онтогенезі.

На модельних екземплярах інтродуцентів НБС вивчений якісний склад і кількісний вміст похідних антрацену (мономірних антрахінонів та діантронів групи гіперицину) і флавоноїдів в онтогенезі рослин, що належать до 73 видів роду Hypericum L., з усіх 30 секцій роду (згідно до Robson, 1977), неспецифічних для флори України.

В результаті порівняльних фітохімічних досліджень якісного складу БАР встановлено, що склад антраценпохідних і флавоноїдів у вивчених 73 видів звіробою близький і залежить від секції. В межах кожної секції він практично ідентичний.

Виявлено, що діантрони (гіперицин, псевдогіперицин, протогіперицин, протопсевдогіперицин) є специфічними для роду Hypericum L. сполуками та характерні для видів з 16 еволюційно розвинених секцій - Bupleuroides, Hypericum, Olympia, Campylopus, Origanifolia, Drosocarpium, Oligostema, Thasia, Crossophyllum, Hirtella, Taeniocarpium, Coridium, Triadenioides, Humifusoidaeum, Adenosepalum і Elodes. Більш примітивні в еволюційному відношенні секції Campylosporus, Psorophytum, Ascyreia, Takasagoya, Androsaemum, Inodora, Roscyna, Myriandra, Webbia, Arthrophyllum, Heterophylla, Adenotrias, Brathys і Spachium характеризуються наявністю мономірних антрахінонів франгулаемодину, франгуліну, емодинантрону та емодинантранолу.

Показано, що флавоноїдні сполуки мають безсумнівне таксономічне значення для внутрішньородової хемосистематики Hypericum L. Оскільки флавоноїди вважаються консервативними ознаками вищих рослин (Тахтаджян, 1987), то значне різноманіття хімічних структур у певній секції свідчить про її порівняльну молодість і прогресуюче видоутворення, та значні потенційні можливості її видів для подальшої хімічної еволюції. Базуючись на цьому положенні, поява в ряді секцій роду Hypericum L. флавонолового аглікону мірицетину і флавонового аглікону лютеоліну, флавонолових глікозидів кверцитрину, ізокверцитрину і мірицитрину може вважатись за критерій розвиненості секції. В той же час наявність флавонолового аглікону кемпферолу, більш простого за своєю хімічною структурою, очевидно, свідчить про досить давнє походження секції, та може розглядатись як критерій примітивності.

Відзначено, що всі досліджені види Hypericum L. містять флавоноловий аглікон кверцетин і його глікозид гіперозид; більшість видів характеризується вмістом аглікону кемпферолу (за винятком чотирьох більш спеціалізованих порівняно з іншими видів секції Hypericum; двох спеціалізованих видів з секції Myriandra; а також видів із еволюційно розвинених секцій Origanifolia, Oligostema, Thasia, Crossophyllum і Hirtella) та глікозиду рутину (окрім H. lanceolatum, Campylosporus; двох видів із секції Drosocarpium; видів із секцій Coridium, Webbia, Arthrophyllum і Brathys), що пов'язане, очевидно, з еволюційно виробленими пристосуваннями видів до екологічних умов місцезростання.

Порівняльними хроматографічними дослідженнями зі свідками в траві 63 видів з 26 секцій роду Hypericum L. ідентифікований кверцитрин, у 50 видів з 20 секцій - ізокверцитрин, у 18 видів із спеціалізованих і еволюційно розвинених секцій Olympia, Campylopus, Origanifolia, Drosocarpium, Oligostema, Thasia, Crossophyllum, Hirtella, Taeniocarpium і Coridium - мірицетин, у 14 видів з 7 останніх секцій - його глікозид мірицитрин. В двох найбільш високоспеціалізованих і розвинених секціях Hypericum L. - Taeniocarpium і Coridium - виявлений також флавоновий аглікон лютеолін.

Виходячи з результатів порівняльних фітохімічних досліджень (а саме, вмісту діантронів та флавоноїдних агліконів мірицетину і лютеоліну та глікозиду мірицитрину), запропоновано модифікацію офіційно прийнятої внутрішньородової класифікації Hypericum L., розробленої Н. Робсоном (Англія, 1977). Так, за Н. Робсоном, вершиною еволюційного розвитку роду є гілки Drosocarpium ® Thasia ® Crossophyllum, Drosocarpium ® Oligostema ® Crossophyllum і Campylopus ® Origanifolia. В той же час, урахування фітохімічного критерію призводить до висновку, що найбільш еволюційно розвиненими секціями слід вважати Taeniocarpium і Coridium. Близькі до них за ступенем розвиненості секції Drosocarpium, Oligostema, Thasia, Crossophyllum і Hirtella (за Н. Робсоном гілці Hirtella ® Taeniocarpium ® Coridium відведено місце рангом нижче від Drosocarpium ® Thasia ® Crossophyllum, Drosocarpium ® Oligostema ® Crossophyllum і Campylopus ® Origanifolia). Внутрішньородова класифікація Н. Робсона, частково модифікована нами з урахуванням, поряд із фітохімічним, також інших систематичних критеріїв (а саме, комплексу морфологічних ознак, який свідчить про примітивність - розвиненість виду, відповідно до А.Л. Тахтаджяна, 1987), наведена на рис. 1.

За результатами кількісного аналізу виявлено, що динаміка вмісту суми антраценпохідних (як мономірних антрахінонів, так і діантронів) у всіх досліджених видів Hypericum L. має вигляд одноверхівкової кривої (парабола) з максимумом у фазу масового цвітіння (табл. 1); динаміка вмісту суми флавоноїдів - вигляд одноверхівкової кривої з максимумом-плато у фази бутонізації - масового цвітіння або вигляд параболи з нечітким максимумом у фазу масового цвітіння (табл. 2).

Відзначено деякі закономірності накопичення окремих антрахінонів та флавоноїдів по фазах онтогенезу, спільні для всіх досліджених видів Hypericum L. Так, вміст франгулаемодину за вегетаційний період має два максимуми накопичення - у фази бутонізації та наприкінці вегетації; вміст його глікозиду франгуліну є максимальним у фазу масового цвітіння, і надалі знижується до кінця вегетації. Накопичення емодинантрону поступово зростає протягом вегетаційного періоду, набуваючи максимальних значень у фазу зрілих плодів та наприкінці вегетації; накопичення емодинантранолу має два максимуми - у фази зрілих плодів - наприкінці вегетації та у фазу масового цвітіння.

Встановлено, що для всіх видів звіробою, що містять діантрони, динаміка накопичення гіперицину має вигляд параболи з чітким максимумом у фазу бутонізації, після чого накопичення гіперицину різко знижується, сягаючи найнижчої величини наприкінці вегетації. Динаміка накопичення псевдогіперицину подібна до такої гіперицину, проте максимум накопичення відзначений у фазу масового цвітіння. Вміст протогіперицину та гіперикодегідродіантрону поступово зростає протягом вегетаційного періоду та сягає максимуму наприкінці вегетації; вміст протопсевдогіперицину має два максимуми - у фазу масового цвітіння та наприкінці вегетації.

Виявлено, що у всіх вивчених видів Hypericum L. кількісний вміст флавоноїдних агліконів наприкінці вегетації знижується, а вміст глікозидів - зростає. Вміст агліконів (кемпферол, кверцетин, мірицетин, лютеолін) в онтогенезі видів Hypericum L. має чіткий максимум у фазу масового цвітіння. Найбільший кількісний вміст флавоноїдних глікозидів (кверцитрин, ізокверцитрин, мірицитрин, гіперозид, рутин) в онтогенезі рослин Hypericum L. спостерігається наприкінці вегетації, а найменший - на початку вегетаційного періоду.

Таким чином, згідно з результатами досліджень вмісту окремих антрахінонів і флавоноїдів в онтогенезі видів Hypericum L., зроблено припущення, що біологічні функції антрахінонів у рослинах пов'язані з участю у репродуктивних процесах (гіперицин, франгулін, псевдогіперицин та, частково, протопсевдогіперицин можуть брати участь у процесах підготовки до цвітіння, запилювання та запліднення шляхом регуляції переносу електронів та протонів в окислювально-відновних реакціях і дії на ферментні системи) та захисних процесах при підготовці до зими (шляхом відновлення мономірних антрахінонів з утворенням емодинантрону та емодинантранолу). Біологічна роль флавоноїдних агліконів пов'язується з процесами цвітіння (а саме, з залученням комах, із дією на ферментні системи та гормони та зі стимулюванням дихання мітохондрій); функція глікозидів - із захистом рослин від охолодження (під час підготовки до зими).

Відзначено, що найкращими джерелами гіперицину і псевдогіперицину для отримання лікарських засобів на їх основі є види секцій Hypericum (особливо H. erectum, H. kamtschaticum, H. pseudomaculatum і H. punctatum), Adenosepalum (особливо H. annulatum, H. athoum і H. tomentosum L.), H. barbatum з секції Drosocarpium, H. nummularioides з секції Taeniocarpium, H. coris з секції Coridium, види секцій Olympia, Oligostema, Crossophyllum і Hirtella.

Зазначено, що види всіх секцій звіробою (окрім секції Triadenioides) можна використовувати як джерела гіперозиду. Джерелами рутину можуть слугувати види секції Ascyreia (особливо H. monogynum, H. x moserianum і H. patulum), а також види секцій Campylopus і Myriandra. Для отримання кверцетину можна використовувати види: H. acmosepalum з секції Ascyreia, H. ascyron з секції Roscyna, H. scabrum з секції Hirtella, види з секцій Androsaemum (особливо H. hircinum і H. androsaemum), Hypericum (особливо H. mitchellianum, H. punctatum і H. undulatum), Myriandra, Webbia, Triadenioides, Humifusoidaeum, Adenosepalum і Elodes.

Встановлено, що за сумарним кількісним вмістом діантронів і флавоноїдів перспективними для отримання лікарських засобів на їх основі, з потенційними антидепресантними, антивірусними та тонізуючими властивостями, є види секцій Adenosepalum, Hirtella, Taeniocarpium та Coridium (рис. 2-3). Як перспективні для отримання лікарських препаратів на основі діантронів можна розглядати види з секцій Crossophyllum, Oligostema, Drosocarpium, Origanifolia і Thasia (рис. 2); для отримання лікарських засобів на основі флавоноїдів - види з секцій Campylosporus, Androsaemum, Spachium, Psorophytum, Ascyreia і Brathys (рис. 3).

У третьому розділі наводяться дані по вивченню структури молекули гіперицину.

Експериментальними методами вивчено структуру діантрону гіперицину С₃₀Н₁₆О₈ - 1,3,4,6,8,13-гексагідрокси-10,11-діметилфенантро[1,10,9,8-опкра]перилен-7,14-діону або (у дещо скороченому варіанті, більш зручному для використання) 7,14-діон-1,3,4,6,8,13-гексагідроксидіантрону - синтетичного і природного (виділеного з сировини трави звіробою звичайного).

Показано, що синтетичний гіперицин є речовиною, практично нерозчинною у воді, тоді як гіперицин, виділений з трави звіробою звичайного, є помірно розчинною речовиною.

Хроматографією в тонкому шарі не виявлено різниці у хроматографічній рухомості синтетичного гіперицину та гіперицину, виділеного із сировини трави з. звичайного, на відміну від двомірної паперової хроматографії, застосування якої показало відмінності в хроматографічній рухомості двох форм гіперицину після проходження розчинником другого напрямку. В результаті цього показано, що гіперицин, виділений із сировини трави з. звичайного, є дещо менш рухомою речовиною у порівнянні з синтетичним гіперицином (достовірна різниця, DRf = 0.07).

Після кислотного гідролізу природного гіперицину водним розчином кислоти сірчаної 2% протягом 40 хв. при 50^оС з подальшим застосуванням хроматографічного розділення в системі н-бутанол - кислота оцтова - вода (4:1:2.2) в гідролізаті ідентифіковані: гіперицин (за яскраво-червоною флуоресценцією, що зникає після висихання хроматограм, та при порівнянні з достовірним зразком) і D-глюкоза (за реакцією з реактивом Фелінга та при порівнянні з еталонними цукрами).

Відзначено, що в електронних спектрах природного і синтетичного гіперицину в спирті етиловому 96% (рис. 4) характерними смугами поглинання є смуги, максимуми яких відповідають довжинам хвиль 250, 333, 524, 545 і 590 нм. УФ-спектри природного гіперицину характеризуються також наявністю нової смуги поглинання з максимумом при 293 нм, зумовленою комплексоутворенням гіперицин - глюкоза за допомогою системи водневих зв'язків по карбонільних групах гіперицину з гідроксильними групами вуглеводу.

Встановлено істотні відмінності ІЧ-спектрів синтетичного гіперицину і гіперицину, виділеного з сировини трави з. звичайного (рис. 5), пов'язані з комплексоутворенням природний гіперицин - глюкоза шляхом системи водневих зв'язків. Показано, що характеристичними частотами смуг поглинання для синтетичного гіперицину є: 3400, 1656, 1610, 1452, 1334, 1264, 1196, 1088 см^-1, для природного гіперицину: 3388, 1610, 1452, 1328, 1256, 1144, 1096, 1056, 1020, 854, 772 та 716 см^-1.

Відзначено, що в ЯМР ¹³С спектрах природного і синтетичного гіперицину сигнали в інтервалах хімічних зсувів ¹³С метильних груп (0.028-39.500 м.д.) та ¹³С бензольних кілець (115.210-164.132 м.д.) практично повністю співпадають, тоді як у ділянці хімічних зсувів ¹³С карбонільних вуглецевих атомів (170-180 м.д.) та зоні 60-96 м.д., що відповідає хімічним зсувам ¹³С вуглецевих атомів глюкози, спостерігаються значні відмінності, за результатами аналізу яких гіперицин, виділений з трави звіробою звичайного, на відміну від синтетичного гіперицину, є переважно комплексною сполукою з вуглеводами, а саме, з a-D-глюкозою. Виявлено також, що синтетичний гіперицин є сумою принаймні трьох таутомерів (наявність двох таутомерів хіноїдної структури підтверджується сигналами 173.792 м.д. та 177.225 м.д.), один з яких має метиленові групи (хімічний зсув 63.068 м.д.), а гіперицин, виділений з трави звіробою звичайного, містить невеликий відсоток незв'язаних молекул двох таутомерів хіноїдної структури (175.787 м.д. і 177.434 м.д.) та як мінімум одного таутомеру, що має метиленові групи (63.071 м.д.).