Біологічно активні речовини роду Hypericum L. як джерело створення лікарських засобів із заданими властивостями

Таким чином, на основі отриманих результатів доведено, що гіперицин, виділений із сировини трави звіробою звичайного, є комплексною сполукою, утвореною гіперицином і a-D-глюкозою.

Показано, що утворення такої комплексної сполуки гіперицину (гіперицин, виділений з сировини трави з. звичайного) призводить до зміни ряду його фізико-хімічних властивостей: візуальних ознак (кристалічна речовина ® смолиста речовина); розчинності у воді (практична нерозчинність ® помірна розчинність); хроматографічної рухомості при проведенні двомірної паперової хроматографії; УФ-, ІЧ- та ЯМР ¹³С спектрів.

Розрахунковими методами квантової хімії у напівемпіричному s,p-валентному наближенні досліджено енергетику таутомерних переходів п'яти таутомерів гіперицину з симетричною структурою в синглетному і триплетному мультиплетних станах, природу електронних переходів у його спектрах поглинання, природу вібраційних спектрів гіперицину, реакційну здатність окремих атомів і таутомерів. Вивчені можливості модифікації молекул таутомерів гіперицину, пов'язані з їх електронно-донорними і акцепторними та протонно-донорними і акцепторними властивостями; електронні спектри відновлених форм, аніон- та катіон-радикалів, аніонів, катіонів, діаніонів та дікатіонів, утворених на основі синглетів і триплетів таутомерів гіперицину.

За результатами розрахунків величин загальної енергії виявлено, що стабільність молекул таутомерів гіперицину більша у синглетному стані. Найбільш стабільною серед симетричних таутомерів I-V молекули гіперицину в синглетному стані є відома структура хінону I (7,14-діон-1,3,4,6,8,13-гексагідроксидіантрон; загальна енергія складає -6150.164 еВ). У триплетному стані найбільшу стабільність має таутомер IV (8,13-діон-1,3,4,6,7,14-гексагідроксидіантрон; загальна енергія -6148.046 еВ). Структури таутомерів І та IV наведені на рис. 6. В той же час 41 таутомер із асиметричною структурою характеризуються невисокою стабільністю як в синглетному, так і в триплетному стані (від -5949.917 до -6146.651 еВ).

Встановлено, що таутомери гіперицину відрізняються між собою за величинами загальної енергії, за розподілом s,p-електронної густини, що зумовлює різні електронно-донорні та акцепторні властивості кисневих атомів таутомерів, і за конформаціями. Реакційна здатність атомів у молекулах таутомерів залежить від стану молекули і підвищується зі збільшенням мультиплетності.

Розрахунковими методами доведено, що найбільшим від'ємним надлишковим зарядом і відповідною відновною здатністю характеризуються атоми кисню карбонільних груп. У триплетному стані на кисневих атомах карбонільних груп таутомера I накопичується значний від'ємний надлишковий заряд (-0.3849), що призводить до суттєвого зростання їх електронно-донорної спроможності порівняно з синглетним станом молекули (-0.3703). У триплетному і більшої мультиплетності станах молекул таутомерів II-V відбувається відтягування s,p-електронної густини до кисневих атомів гідроксильних груп та вуглецевих атомів.

Знайдено, що у зв'язку з низькою енергію спорідненості до електрону та невеликим адіабатичним потенціалом іонізації молекули таутомерів гіперицину легко піддаються модифікаціям. За розрахунковими даними величин загальної енергії модифіковані частки, утворені на основі молекул таутомерів гіперицину, в порядку зниження стабільності розташовуються таким чином: відновлені форми > катіони > аніон-радикали > діаніони > молекули > катіон-радикали > дікатіони > аніони. Всі модифіковані сполуки, отримані на основі триплетів таутомерів, мають більшу загальну енергію порівняно з відповідними синглетами на відміну від вихідних молекул таутомерів гіперицину.

Виявлено, що в ряду відповідних відновлених форм найбільшу стабільність мають форми, утворені на основі таутомерів I та IV. Найвищою стабільністю серед катіонів, аніон-радикалів, діаніонів та катіон-радикалів відзначаються відповідні частки, утворені на основі таутомерів IV і I. Серед дікатіонів найбільш стабільними є дікатіони на основі таутомерів IV і V, серед аніонів - аніони, утворені на основі таутомера I.

Згідно з квантово-хімічними розрахунками, довгохвильові смуги у спектрах поглинання, отримані для оптимізованих структур таутомерів гіперицину, істотно відрізняються від одержаних експериментальним шляхом і відповідають таким величинам: таутомер I - 388.3 нм, сила осцилятору f = 0.47; таутомер II - 375.0 нм, f = 0.49; таутомер III - 412.7 нм, f = 0.64; таутомер IV - 431.6 нм, f = 0.59 і таутомер V - 394.1 нм, f = 0.16. Отже, приймаючи існуюче уявлення, що молекула гіперицину в основному стані є синглетом, на основі результатів квантово-хімічних розрахунків енергетики електронних переходів необхідно було б очікувати для гіперицину зеленого забарвлення з довгохвильовою смугою поглинання у ділянці 440-450 нм. Проте експериментальні дані переконливо свідчать, що забарвлення гіперицину відповідає червоному з відповідними смугами поглинання в ділянці 545 і 590 нм (див. рис. 4). Це свідчить, що реальна електронна будова молекули гіперицину дещо відрізняється від відомої структури І і є модифікованою.

При застосуванні квантово-хімічних розрахунків показано, що утворення відновлених форм, катіонів, аніонів, катіон-, аніон-радикалів, дікатіонів та діаніонів внаслідок реалізації протонно-донорних і акцепторних та електронно-донорних і акцепторних властивостей таутомерів гіперицину викликає суттєве зміщення довгохвильових смуг поглинання у червону ділянку їх електронних спектрів порівняно з немодифікованими молекулами таутомерів гіперицину. Визначено, що довгохвильові смуги в експериментальних електронних спектрах поглинання гіперицину зумовлені існуванням відновлених форм у триплетному стані на основі таутомерів I та IV і синглету відновленої форми на основі таутомера I; катіонів, утворених на основі триплетів таутомерів I-IV; аніон-радикалів, утворених на основі триплетів таутомерів I-IV (особливо - IV) і синглетів таутомерів IV і III; діаніонів триплетів таутомерів II-V і синглетів таутомерів I і IV, а також триплетів молекул таутомерів I, II і IV.

Таким чином, за результатами аналізу експериментальних та розрахункових УФ-, ІЧ-спектрів, і стабільності доведено, що гіперицин існує у вигляді пулу - суми як нейтральних, так і заряджених часток - відновлених форм, катіонів, аніон-радикалів, діаніонів та молекул відомої хіноїдної структури, - утворених, головним чином, на основі триплетів таутомерів IV, I і II. При цьому досить легко відбувається протонування молекул таутомерів гіперицину за рахунок молекул води шляхом приєднання протону до кисневого атому карбонільних груп.

У четвертому розділі обгрунтовано необхідність створення нових форм та похідних діантронів, проведено моделювання їх структури, наведені способи їх отримання, досліджено властивості нових сполук на основі діантронів.

З метою одержання сполук із новими властивостями або більш високою активністю були отримані нові форми і похідні діантронів (гіперицину, псевдогіперицину). Для підвищення біодоступності моделювання сполук проводили у напрямку отримання водорозчинних форм діантронів шляхом взаємодії з полівінілпіролідоном (ПВП) або глюкозою. Сполуки отримували за розробленими нами способами (з ПВП - Патент України № 24693A від 04.08.98; з глюкозою - Патент України № 24768А від 06.10.98).

Досліджено хроматографічну рухомість та спектральні властивості нових водорозчинних форм діантронів (гіперицин, псевдогіперицин), отриманих за допомогою реакції комплексоутворення з ПВП, та глікозидів діантронів порівняно з вихідними діантронами. Розрахунковими методами визначено оптимальну за геометрією конформацію ПВП, його водорозчинного комплексу з гіперицином, глюкози та 49 можливих структур глікозидів гіперицину. На основі вивчення стабільності та електронних спектрів поглинання в синглетному і триплетному станах встановлено вірогідну структуру отриманих глікозидів діантронів.

Встановлено, що вихідні діантрони гіперицин та псевдогіперицин у всіх семи застосованих системах розчинників є більш рухомими у порівнянні з утвореними на їх основі комплексними сполуками та глікозидами. Хроматографічними методами доведено, що при взаємодії гіперицину або псевдогіперицину з ПВП утворюється одна комплексна сполука, при реакції діантронів з глюкозою - три (для гіперицину) або дві (для псевдогіперицину) сполуки з різною хроматографічною рухомістю.

Виявлено, що при переведенні гіперицину і псевдогіперицину у водорозчинні форми за допомогою ПВП в їх УФ-спектрах відзначається батохромний зсув максимумів поглинання при довжинах хвиль 480 нм (до 490 нм), 524 нм (до 526 нм), 545 нм (до 554 нм) та 590 нм (до 597 нм) із паралельним падінням поглинання у новоутвореної комплексної сполуки порівняно з вихідним діантроном. В УФ-спектрах глікозидів діантронів спостерігається гіпсохромний зсув довгохвильових максимумів поглинання - відповідно до 456 нм, 512 нм, 536 нм та 568 нм - із сильним падінням поглинання.

За результатами ІЧ-спектроскопії доведено взаємодію гіперицину та псевдогіперицину з ПВП при комплексоутворенні, що проявляється в змінах смуг гідроксильного та карбонільного поглинання, і підтверджує утворення молекулярних комплексів, сформованих за рахунок водневих зв'язків між карбонілом полімеру і гідроксилом діантрону та/або протонованим карбонілом полімеру і карбонілом діантрону (рис. 7). Характеристичними частотами поглинання у вібраційних спектрах водорозчинної форми гіперицину є: 3484, 2952, 1610, 1494, 1462, 1440, 1372, 1334, 1292, 1264, 1196, 1088, 652 і 568 см^-1; псевдогіперицину: 3425, 2992, 1656, 1610, 1450, 1348, 1334, 1264, 1197, 1088 см^-1; водорозчинної форми псевдогіперицину: 3484, 2952, 1610, 1494, 1462, 1450, 1372, 1348, 1334, 1292, 1264, 1197, 1088, 652 і 568 см^-1.

У глікозильованих форм діантронів методом ІЧ-спектроскопії встановлено наявність ковалентних глікозидних -О- зв'язків на місці карбонільних груп вихідних діантронів, що виражається у зникненні смуг карбонільного поглинання (при 1656 та 1610 см^-1) і значному підсиленні поглинання у ділянці -О- зв'язку (при 1020 см^-1) (рис. 8). Таким чином, доведено, що глікозильовані форми діантронів є глікозидами діантронів, утвореними за допомогою ковалентних зв'язків по карбонільних групах діантронів і гідроксильних групах глюкози. Характеристичними частотами поглинання у вібраційних спектрах глікозидів гіперицину є: 3396, 2972, 2936, 1476, 1452, 1440, 1372, 1334, 1254, 1144, 1096, 1050, 1020, 916, 854, 772, 716, 552 і 530 см^-1; глікозидів псевдогіперицину - 3425, 2980, 2952, 1486, 1472, 1382, 1348, 1264, 1220, 1172, 1121, 1050, 1020, 916, 854, 772, 716, 552, 530 см^-.

Напівемпіричними розрахунковими квантово-хімічними методами (РМ3 - Stewart, 1989) доведено, що в утворенні водорозчинної комплексної сполуки діантрону з ПВП беруть участь 5 молекул діантрону на 2 молекули ПВП. Встановлено, що таке співвідношення призводить до найменших енергетичних витрат у процесах перетворення молекул та, відповідно, до формування найбільш стабільних комплексів ПВП - діантрон. Зазначені комплексні сполуки мають вигляд ПВП - діантрон - ПВП, де дві молекули полімеру “обгортають” з одного боку п'ять молекул діантрону, які, в свою чергу “зшивають” піролідонові або піролідолові цикли молекул ПВП за допомогою водневих зв'язків між карбонільною групою полімеру та однією з гідроксильних груп діантрону, чи карбонільною групою діантрону та протонованим за рахунок молекули води карбонілом (гідроксильною групою) ПВП. При переведенні у водорозчинну форму значно збільшується дипольний момент молекул діантронів (таутомер І - від 3.428 Дб до 5.142 Дб; таутомер IV - від 2.196 Дб до 3.294 Дб), що вказує на стабілізацію комплексу ПВП - діантрон у розчині за рахунок сольватації молекулами води і робить такий перехід практично незворотнім.

Розрахунковими квантово-хімічними методами доведено також, що в результаті взаємодії гіперицину та глюкози в молярних співвідношеннях 1:16-1:25 проходить реакція глікозилювання відновлених форм, катіонів чи молекул гіперицину з утворенням моно- (в положеннях біля С₁₄ або С₇), ди- (в положеннях біля С₁, С₁₄ або С₁, С₇) та гептаглюкозидів (в положеннях біля С₁, С₃, С₄, С₆, С₇, С₈, С₁₄ або С₁, С₃, С₆, С₇, С₈, С₁₃, С₁₄, або С₁, С₄, С₆, С₇, С₈, С₁₃, С₁₄), що представлені у речовині у вигляді асоціатів з молекулами глюкози, де асоційовані молекули глюкози, розташовуючись навколо молекули глікозиду гіперицину, відіграють роль у підтриманні її конформації.

Доведено, що реакція утворення глікозидів на основі молекул гіперицину проходить у два етапи: перший етап - внутрішньомолекулярна конденсація з відповідним протонуванням карбонільних груп (перехід до таутомера V); другий етап - глікозилювання гідроксильних груп, утворених по карбонілах, із відповідним утворенням глікозидів та води. Для відновлених форм, утворених на основі гіперицину, перший етап реакції відсутній, але приєднання глюкози до однієї з протонованих карбонільних груп у положенні С₇ або С₁₄, очевидно, викликає міграцію протону від відповідного вуглецевого атому, по якому утворюється О-глікозидний зв'язок, до вуглецевого атому, біля якого знаходиться вільна карбонільна група (С₇ ® С₁₄ або С₁₄ ® С₇), із подальшим її протонуванням і утворенням гідроксилу. При утворенні моно- або диглікозидів цей гідроксил залишається вільним, при утворенні гептаглікозидів проходить його глікозилювання. У випадку катіонів реакція утворення моно- або диглікозидів проходить по одній з протонованих карбонільних груп гіперицину без подальших перетворень молекули; утворення гептаглікозидів потребує внутрішньомолекулярної конденсації з переходом протону від однієї з метильних груп гіперицину до вільної карбонільної групи з її протонуванням.

Розрахунковими методами встановлено, що вірогідна структура утворених в результаті реакції гіперицину з глюкозою глікозидів гіперицину відповідає формулам: моноглікозиди: 10,11-диметилен-1,3,4,6,7,8,13-гептагідроксидіантро-14-O-3-a-D-глюкозид · 15-24 a-D-глюкоза; 7-он-10,11-диметил-1,3,4,6,8,13-гексагідроксидіантро-14-O-3-a-D-глюкозид · 15-24 a-D-глюкоза; 10,11-диметил-1,3,4,6,7,8,13-гептагідроксидіантро-14-O-3-a-D-глюкозид · 15-24 a-D-глюкоза і 10,11-диметилен-1,3,4,6,8,13,14-гептагідроксидіантро-7-O-3-a-D-глюкозид · 15-24 a-D-глюкоза; 14-он-10,11-диметил-1,3,4,6,8,13-гексагідроксидіантро-7-O-3-a-D-глюкозид · 15-24 a-D-глюкоза; 10,11-диметил-1,3,4,6,8,13,14-гептагідроксидіантро-7-O-3-a-D-глюкозид · 15-24 a-D-глюкоза; диглікозиди: 10,11-диметилен-3,4,6,7,8,13-гексагідроксидіантро-1,14-O-3-a-D-диглюкозид · 14-22 a-D-глюкоза; 7-он-10,11-диметил-3,4,6,8,13-пентагідроксидіантро-1,14-O-3-a-D-диглюкозид · 14-22 a-D-глюкоза; 10,11-диметил-3,4,6,7,8,13-гексагідроксидіантро-1,14-O-3-a-D-диглюкозид · 14-22 a-D-глюкоза і 10,11-диметилен-3,4,6,8,13,14-гексагідроксидіантро-1,7-О-3-a-D-диглюкозид · 14-22 a-D-глюкоза; 14-он-10,11-диметил-3,4,6,8,13-пентагідроксидіантро-1,7-О-3-a-D-диглюкозид · 14-22 a-D-глюкоза; 10,11-диметил-3,4,6,8,13,14-гексагідроксидіантро-1,7-О-3-a-D-диглюкозид · 14-22 a-D-глюкоза; гептаглікозиди: 10,11-диметилен-13-гідроксидіантро-1,3,4,6,7,8,14-O-3-a-D-гептаглюкозид · 9-18 a-D-глюкоза; 10,11-диметил-13-гідроксидіантро-1,3,4,6,7,8,14-O-3-a-D-гептаглюкозид · 9-18 a-D-глюкоза; 10,11-диметилен-4-гідроксидіантро-1,3,6,7,8,13,14-O-3-a-D-гептаглюкозид · 9-18 a-D-глюкоза; 10,11-диметил-4-гідроксидіантро-1,3,6,7,8,13,14-O-3-a-D-гептаглюкозид · 9-18 a-D-глюкоза і 10,11-диметилен-3-гідроксидіантро-1,4,6,7,8,13,14-O-3-a-D-гептаглюкозид · 9-18 a-D-глюкоза; 10,11-диметил-3-гідроксидіантро-1,4,6,7,8,13,14-O-3-a-D-гептаглюкозид · 9-18 a-D-глюкоза.

Згідно з квантово-хімічними розрахунками, доведено, що молекули глюкозидів діантронів мають більшу стабільність у триплетному стані і, таким чином, є триплетами. Вони мають високий дипольний момент, який характеризує їх значну розчинність у воді (моноглікозиди - біля 9.6 Дб, диглікозиди - біля 7.9 Дб, гептаглікозиди - біля 9.2 Дб).

У п'ятому розділі представлені дані по дослідженню біологічною дії екстрактів, речовин звіробою та нових сполук на основі діантронів.

На ізольованих хлоропластах досліджений вплив діантронів гіперицину і псевдогіперицину, флавоноїдів кверцетину, гіперозиду і рутину на процес переносу електрону в електронно-транспортному ланцюзі (реакцію Хіла). В дослідах in vitro та in vivo досліджено токсичність чотирьох сухих екстрактів трави звіробою звичайного, отриманих із застосуванням різних методик, гіперицину, кверцетину та гіперозиду. In vivo вивчено антидепресантну активність речовин, що досліджувались, in vitro - їх віруліцидну активність.

На моделі реакції Хіла досліджено дію діантронів гіперицину і псевдогіперицину, флавоноїдів кверцетину, гіперозиду і рутину на процес переносу електрону в електронно-транспортному ланцюзі (ЕТЛ). При цьому встановлено, що діантрони гіперицин та псевдогіперицин істотно інгібують реакцію Хіла. Найбільшу інгібуючу дію справляє гіперицин, який повністю пригнічує виділення кисню хлоропластами в реакції Хіла одразу після його введення у реакційну суміш.

Показано, що інгібуюча активність флавоноїдів залежить від наявності або відсутності цукрового компоненту в молекулі. Флавоноїдний аглікон кверцетин має значний інгібуючий вплив на виділення кисню в реакції Хіла, і повністю пригнічує його через 1.5 хв. після додання у реакційну суміш, тоді як глікозиди гіперозид і рутин практично не впливають на хід реакції.

Відзначено, що наявність у молекулі хіноїдної групи, як і системи сполучених бензольних кілець, робить цю молекулу інгібітором переносу електрону в фотосистемі 2. Введення у молекулу цукрового компоненту нівелює цей вплив.

На підставі отриманих даних зроблено висновок, що фізіологічна роль агліконів поліфенолів у мембранних структурах хлоропластів і мітохондрій, очевидно, пов'язана з інгібуванням синтезу АТФ, сполученого з переносом електрону по ЕТЛ хлоропластів і мітохондрій, і, паралельно, з інтенсифікацією дихання зазначених органел. Реакція глікозилювання поліфенолів відіграє регуляторну роль, нівелюючи інгібуючий вплив агліконів на процес переносу енергії.

В гострих і хронічних дослідах на мишах встановлено, що найбільшу гостру і хронічну токсичність серед досліджених діючих речовин трави звіробою (діантрон гіперицин, флавоноїди кверцетин і гіперозид) і сухих екстрактів трави звіробою, отриманих із застосуванням різних технологій, має діантрон гіперицин (в гострих дослідах LD₅₀ = 100 мг/кг; в хронічних дослідах при щоденному внутрішньошлунковому введенні ефективної дози 10 мг/кг на 10-й день у 10% тварин з'явились ознаки токсичної дії у вигляді пухлин м'яких тканин кінцівок). Показано, що флавоноїди та два сухі екстракти трави звіробою з вмістом суми діантронів у перерахунку на гіперицин 2.0% (екстракти 3 і 4) є нетоксичними як при гострому, так і при хронічному застосуванні (їх LD₅₀ точно встановити не вдалось у зв'язку з відсутністю загибелі мишей навіть при внутрішньошлунковому введенні їм дози 2000 мг/кг). Інші два сухих екстракти (екстракт 1 з вмістом суми діантронів 0.2% і екстракт 2 з вмістом діантронів 0.5%) мають малу токсичність в гострих дослідах, але виявляють кумулятивну дію при хронічному введенні.

Із застосуванням плавального тесту як експериментальної моделі психічної депресії виявлено, що діантрон гіперицин і екстракти трави звіробою сухі з вмістом суми діантронів 2.0% (екстракти 3 та 4) виявляють виражену антидепресантну дію. Про це свідчить той факт, що гіперицин і сухі екстракти достовірно зменшують тривалість періодів імобілізації та їх кількість і збільшують тривалість латентного періоду - проявів, що розглядаються як експериментальна модель симптомів, еквівалентних депресії (“поведінка відчаю”). Показано, що антидепресантна активність флавоноїдів є значно меншою.

При комбінованому застосуванні резерпінового і плавального тестів як другої моделі психічної депресії доведено, що плавальний тест поведінки “відчаю” є більш чутливим та більш пролонгованим до депресивної дії резерпіну, ніж його поведінкові та сомато-вегетативні ефекти. На основі цього використання резерпін-плавального тесту рекомендоване для більш визначеної та чіткої оцінки потенційних антидепресивних препаратів.

Знайдено, що за всіма параметрами резерпін-плавального тесту найбільш активною речовиною є гіперицин, який достовірно підвищує тривалість латентного періоду першої імобілізації, знижує загальну кількість імобілізацій та їх сумарну тривалість як по відношенню до резерпіну, так і по відношенню до контролю (тривалість періоду першої імобілізації: контроль - 38.7+2.8, резерпін - 17.4+0.9, резерпін + гіперицин - 47.8+2.6; загальна кількість імобілізацій - відповідно: 11.2+0.6, 14.9+0.9, 9.1+0.7; загальна тривалість імобілізацій: 189.3+15.4, 270.4+15.2, 103.7+15.0). За двома параметрами антидепресантної дії один сухий екстракт трави звіробою (сухий екстракт 4) рівноцінний гіперицину.

Встановлено, що всі досліджені речовини та сухі екстракти послаблюють або усувають поведінкові та сомато-вегетативні ефекти резерпіну. Проте за часом розвитку антирезерпінової дії гіперицин переважає всі інші речовини, субстанції та препарати. Флавоноїди за антирезерпіновою дією значно поступаються гіперицину, всім дослідженим сухим екстрактам і синтетичним препаратам порівняння.

Таким чином, на двох експериментальних моделях психічної депресії встановлено, що діантрон гіперицин є основною діючою речовиною сухих екстрактів трави звіробою, і відповідає за прояв антидепресантної активності. Реалізація механізму антидепресивної дії гіперицину, згідно з результатами його впливу на ефекти резерпіну, здійснюється, очевидно, двома способами: шляхом оборотного впливу на моноаміноксидазу та впливом на зворотній захват медіаторних моноамінів (серотоніну, дофаміну, норадреналіну).

Встановлено, що антидепресантна активність екстрактів трави звіробою має пряму залежність від технології їх отримання. Найменшу токсичність в гострих і хронічних дослідах та найбільшу антидепресантну дію мають сухі екстракти трави звіробою, одержані при використанні попереднього знежирення сировини органічним розчинником.

Екстракт трави звіробою сухий 4 із вмістом діантронів 2.0%, отриманий екстракцією попередньо знежиреної сировини звіробою водою дистильованою, за результатами використання на моделі плавального тесту та резерпін-плавального тесту має високу антидепресивну активність, вищу за фітопрепарат “Деприм” з субстанцією - екстрактом трави звіробою з вмістом суми гіперицинів 0.5% - і синтетичні антидепресанти амітриптилін та флуоксетін. На основі екстракту трави звіробою сухий 4 було розроблено лікарський засіб з антидепресантною дією.

У дослідах in vitro в перещепних культурах клітин вивчено цитотоксичність і віруліцидну дію гіперицину, псевдогіперицину, водорозчинних форм гіперицину і псевдогіперицину, глюкозидів гіперицину і псевдогіперицину, кверцетину та чотирьох сухих екстрактів трави звіробою по відношенню до складноутворених вірусів (Rhabdoviridae, вірус везикулярного стоматиту) та простих вірусів (Picornaviridae, вірус поліомієліту типу 2, віруси Коксакі В1, В4, В6).

У дослідах з діючими речовинами і сухими екстрактами трави звіробою звичайного встановлено, що найбільшу цитотоксичну дію в умовах темряви мають два сухі екстракти трави звіробою - екстракт 1 з вмістом суми діантронів 0.2% і екстракт 2 з вмістом діантронів 0.5% (порогова концентрація, що не викликає загибелі клітин, складає 20 мкг/мл). Цитотоксичність гіперицину за умов темряви (порогова концентрація, яка не викликає загибелі клітин, становить 50 мкг/мл) у 2.5 рази нижча від токсичності сухих екстрактів 1 і 2 та у 2 рази вища від токсичності сухих екстрактів 3 і 4 з вмістом суми діантронів 2.0% (відповідна порогова концентрація складає 100 мкг/мл). Відзначено зміни цитотоксичної дії гіперицину та сухих екстрактів 2-4 в залежності від впливу світла видимого діапазону інтенсивністю 16000 Лк у бік зростання. Кверцетин в обох серіях дослідів (і при відсутності, і при наявності попередньої фотоактивації) виявляє слабкий токсичний вплив на культури клітин за досліджених концентрацій.

У дослідах із модифікованими та немодифікованими діантронами виявлено, що вихідні діантрони гіперицин і псевдогіперицин є найбільш токсичними сполуками in vitro. Під впливом фотоактивації цитотоксичний вплив вихідних діантронів зростає в 10 разів. Модифіковані діантрони - комплексні сполуки гіперицину чи псевдогіперицину з ПВП і глікозиди гіперицину та псевдогіперицину - відзначаються малою цитотоксичністю, незалежною від впливу світла (їх токсичність у темряві у 2 рази менша від вихідних діантронів, за умов фотоактивації - у 20 разів). Доведено, що цитотоксичність похідних гіперицину в 2 рази вища від похідних псевдогіперицину.

Знайдено, що найбільш ефективною концентрацією для прояву віруліцидної активності вихідних діантронів, їх водорозчинних форм і глюкозидів є доза 5 мкг/мл середовища. В цій концентрації всі діантрони мають виражену віруліцидність проти складноутвореного вірусу везикулярного стоматиту (Rhabdoviridae) як при наявності, так і при відсутності попередньої фотоактивації (зниження інфекційного титру вірусу - 4.3-5.2 log₁₀; результати визначення віруліцидної дії діантронів гіперицину, псевдогіперицину, їх форм і похідних по відношенню до вірусу везикулярного стоматиту наведено на рис. 9). В концентрації 5 мкг/мл середовища модифіковані діантрони - незалежно від умов досліду, а вихідні діантрони - за умов фотоактивації - проявляють віруліцидність проти вірусів поліомієліту типу 2 і Коксакі В4 (Picornaviridae) (зниження титру вірусу - 3.5-5.6 log₁₀). Подальше збільшення концентрації не призводить до зростання віруліцидної дії (див. рис. 9). Вплив вихідних діантронів на віруси на відміну від їх розчинних у воді форм і глікозидів має пряму залежність від експозиції у видимому світлі.

Виявлено, що віруліцидна активність водорозчинних форм діантронів є приблизно рівною відповідній активності глікозидів діантронів і за кількісними показниками є більш високою по відношенню до всіх досліджених вірусів у порівнянні з вихідними діантронами як при дослідженні в темряві, так і при використанні попереднього світлового опромінення. Водорозчинний гіперицин і глюкозид гіперицину є найбільш активними сполуками серед усіх досліджених модифікованих діантронів, як і їх прототип - серед вихідних діантронів. Максимальну віруліцидну дію водорозчинних діантронів та глікозидів діантронів встановлено по відношенню до вірусів везикулярного стоматиту, поліомієліту та Коксакі В4.

Показано, що противірусна дія кверцетину зростає при збільшенні його концентрації в культуральному середовищі, незалежно від наявності або відсутності фотоактивації, та досягає максимуму при 100 мкг/мл (порогова нетоксична концентрація флавоноїду). Віруліцидну дію кверцетину доведено лише проти вірусу везикулярного стоматиту (максимальне зниження титру вірусу - 3.3-3.4 log₁₀).

Відзначено, що найбільшу віруліцидну активність серед досліджених сухих екстрактів трави звіробою звичайного мають екстракти 3 (особливо) і 4 з вмістом суми діантронів 2.0%. Вплив цих екстрактів на віруси подібний до відповідного впливу гіперицину (трохи нижчий за кількісними показниками для більшості вірусів, окрім вірусів Коксакі В4). Найбільш ефективними дозами сухих екстрактів 3 і 4 в культуральному середовищі є концентрації 5 мкг/мл. Найвищу віруліцидну дію як при наявності, так і за відсутності фотоактивації, виявлено проти вірусів везикулярного стоматиту, поліомієліту та Коксакі В4 (зниження титру вірусів поліомієліту - 3.5-3.9 log₁₀; Коксакі В4 - 3.5-3.7 log₁₀; везикулярного стоматиту - 4.9-5.1 log₁₀).

За результатами вивчення цитотоксичності та віруліцидної дії водорозчинні форми діантронів, глікозиди діантронів і два сухі екстракти трави звіробою з вмістом суми діантронів 2.0% рекомендовані для досліджень in vivo як субстанції потенційних лікарських засобів, ефективних як проти складноутворених, так і простих вірусів.

У шостому розділі обгрунтовано розробку способу отримання та вибір методів контролю якості нового лікарського засобу з антидепресантною дією, з трави звіробою.

Враховуючи відсутність вітчизняних антидепресивних фітопрепаратів поряд із зростанням актуальності вирішення проблеми ефективної терапії психічної депресії, а також отримані нами результати, що свідчать про високу антидепресантну активність та малу токсичність одного з сухих екстрактів трави звіробою звичайного, було розроблено технологію комплексної переробки наявної у фармацевтичному виробництві сировини трави звіробою звичайного. Розроблена технологія полягає в одержанні екстракту трави звіробою сухого, який містить суму БАР, виділених із трави звіробою звичайного, паралельно з отриманням із тієї ж сировини антибактеріального препарату новоіманін (ФС 42-1752-81). На основі екстракту трави звіробою сухого запропонований препарат антидепресантної дії у формі капсул Антидепресин. Технологічна схема виробництва наведена на рис. 10. Складені проекти тимчасових технологічних регламентів на виробництво екстракту трави звіробою сухого та капсул Антидепресин. Апробацію регламентів здійснено на НВЦ “Борщагівський ХФЗ”.

Досліджений вплив різних факторів на вихід суми діантронів із сировини трави звіробою звичайного. Встановлено, що виділення суми діантронів має проходити у два етапи і включати стадію попереднього знежирення сировини органічним розчинником та стадію екстракції діантронів. Підібрано оптимальні умови знежирення та екстракції: подрібнення сировини - 3 мм; знежирюючий реагент - ацетон, співвідношення сировини та знежирюючого реагенту - 1:8, температура знежирення - (20+4)^оС, кратність знежирення - 3 рази, тривалість знежирення - 72 години; екстрагент - вода дистильована, співвідношення сировини та екстрагенту - 1:30, температура екстракції - 100^оС, кратність екстракції - 1 раз, тривалість екстракції - 30 хв. із подальшим настоюванням протягом 60 хв.

Якісними реакціями в екстракті трави звіробою сухому та антидепресині встановлено наявність БАР, що належать до антрахінонів, флавоноїдів, ксантонів, кумаринів, тритерпенових сапонінів, дубильних речовин, вільних цукрів, фенолкарбонових кислот, алкалоїдів, білків.

Хроматографічними дослідженнями в екстракті трави звіробою сухому та антидепресині ідентифіковані: антраценпохідні (франгулаемодин, франгулін, емодинантрон, емодинантранол, гіперицин, псевдогіперицин, протогіперицин, протопсевдогіперицин), флавоноїди (кемпферол, кверцетин, гіперозид, кверцитрин, ізокверцитрин, рутин, (+)-катехін, (-)-епікатехін), дубильні речовини, фенолкарбонові кислоти (галова, кофейна, хлорогенова), тритерпенові сапоніни, цукри (сахароза, галактоза, глюкоза, арабіноза, ксилоза, рамноза, манноза), ксантони (мангіферин), кумарини (умбеліферон). Антидепресин у відповідності до технології його отримання містить також цукор молочний Д-(+)лактозу.

Кількісним аналізом БАР встановлено, що екстракт трави звіробою сухий є комплексом біологічно активних сполук: похідних антрацену - 2.6-3.1%, у тому числі - діантронів групи гіперицину - 2.2-2.6%; флавоноїдів - флавонолів та їх глікозидів, катехінів - 35.2-37.6%; фенолкарбонових кислот - 8.0-9.2%; дубильних речовин - 6.9-7.4%; тритерпенових сапонінів - 1.3-1.5%; кумаринів - 0.2-0.3% - і супутніх речовин: білків - 16.3-18.1%; вільних цукрів - 25.2-27.7%, - виділених із трави звіробою звичайного H. perforatum L. Антидепресин, згідно з технологією його отримання, як основний компонент містить вільні цукри, а саме - цукор молочний Д-(+)лактозу (сумарний вміст цукрів 81.1-82.2%). До складу БАР антидепресину також входять флавоноїди (8.7-9.5%), білки (4.0-4.6%), фенолкарбонові кислоти (2.0-2.4%), дубильні речовини (1.6-1.9%), антрахінони (0.6-0.8%, у тому числі - діантрони групи гіперицину - 0.5-0.7%), тритерпенові сапоніни (0.3-0.4%) і кумарини (0.05-0.06%).

Розроблено показники якості на екстракт трави звіробою сухий, включені до проекту Фармакопейної статті на екстракт трави звіробою сухий: опис зовнішнього вигляду, розчинність, тотожність, визначення залишкових кількостей органічних розчинників (ацетону), втрата в масі при висушуванні, кількісне визначення вмісту суми діантронів у перерахунку на гіперицин.

Розроблено показники якості на препарат “Капсули Антидепресин”, включені до проекту Фармакопейної статті на “Капсули Антидепресин”: опис зовнішнього вигляду, тотожність, середня маса вмісту капсули та розпадання, розчинення, однорідність дозування, втрата в масі при висушуванні, кількісне визначення вмісту суми діантронів у перерахунку на гіперицин.

Встановлено терміни придатності екстракту трави звіробою сухого та капсул Антидепресин, протягом яких при зберіганні у звичайних умовах показники якості, регламентовані проектом ФС, не змінюються. Терміни придатності екстракту трави звіробою сухого та капсул Антидепресин складають три роки.

На нинішній момент також розроблено рецептуру для приготування тонізуючого і загальноукріплюючого безалкогольного напою “Бадьорий”, на основі трави звіробою звичайного. Її включено до технічних умов ТУ У 15.8-13931591-001 “Суміші рослинні “Екоплант” - напівфабрикати для виготовлення безалкогольних напоїв”. Виробництво напою здійснюється Командитним Товариством “Еко”, м. Кременчук.

Результати роботи впроваджені у навчальний процес Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця, м. Київ (кафедра фармації), Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика (кафедра вірусології) та Національної фармацевтичної академії, м. Харків (кафедра фармакогнозії, кафедра медичної ботаніки).

висновки

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової проблеми створення високоефективних лікарських засобів на основі природних і модифікованих біологічно активних речовин, що виявляється в повній хімічній таксації роду Hypericum L. за вмістом антраценпохідних і флавоноїдів в онтогенезі (на модельних екземплярах рослин 73 видів Hypericum L., що не зустрічаються у дикорослому стані у флорі України та належать до всіх 30 секцій роду); виявленні в межах роду секцій та видів, перспективних для створення лікарських засобів із заданими властивостями; дослідженнях тонкої структури молекули діантронів, отриманні нових похідних із заданими властивостями на основі діантронів та розробці комплексної технології отримання і показників якості першого вітчизняного антидепресивного препарату на основі трави звіробою.

Виявлено, що діантрони (гіперицин, псевдогіперицин, протогіперицин, протопсевдогіперицин) є специфічними для роду Hypericum L. та характерні для видів з 16 секцій - Bupleuroides, Hypericum, Olympia, Campylopus, Origanifolia, Drosocarpium, Oligostema, Thasia, Crossophyllum, Hirtella, Taeniocarpium, Coridium, Triadenioides, Humifusoidaeum, Adenosepalum і Elodes. Секції Campylosporus, Psorophytum, Ascyreia, Takasagoya, Androsaemum, Inodora, Roscyna, Myriandra, Webbia, Arthrophyllum, Heterophylla, Adenotrias, Brathys і Spachium характеризуються наявністю мономірних антрахінонів (франгулаемодин, франгулін, емодинантрон, емодинантранол). Встановлено, що всі досліджені види містять флавоноїди кверцетин і гіперозид. Рутин ідентифікований у 64 видів із 26 секцій роду Hypericum L.; кверцитрин - у 63 видів із 26 секцій; кемпферол - у 59 видів із 26 секцій; ізокверцитрин - у 50 видів із 20 секцій; мірицетин - у 18 видів із 10 секцій; мірицитрин - у 14 видів із 7 секцій; лютеолін - у 5 видів із 2 секцій.

Показане таксономічне значення флавоноїдних сполук для внутрішньородової систематики Hypericum L. З використанням фітохімічного критерію систематики (а саме, якісного складу антраценпохідних і флавоноїдів) запропоновано модифікацію внутрішньородової класифікації Hypericum L., розробленої Н. Робсоном (Англія, 1977).

Виявлено, що динаміка вмісту суми антраценпохідних (як мономірних антрахінонів, так і діантронів) у всіх видів має вигляд одноверхівкової кривої (парабола) з максимумом у фазу масового цвітіння; динаміка вмісту суми флавоноїдів - вигляд одноверхівкової кривої з максимумом-плато у фази бутонізації - масового цвітіння або вигляд параболи з нечітким максимумом у фазу масового цвітіння.

Встановлено, що за кількісним вмістом діантронів і флавоноїдів перспективними для отримання лікарських засобів на їх основі є види секцій Adenosepalum, Hirtella, Taeniocarpium та Coridium. Як перспективні для отримання лікарських препаратів на основі діантронів рекомендовані види з секцій Crossophyllum, Oligostema, Drosocarpium, Origanifolia і Thasia; для отримання лікарських засобів на основі флавоноїдів - види з секцій Campylosporus, Androsaemum, Spachium, Psorophytum, Ascyreia і Brathys.

Хімічними та фізико-хімічними методами доведено, що діантрон гіперицин у сировині траві звіробою знаходиться у вигляді комплексної сполуки, утвореної гіперицином і a-D-глюкозою за допомогою системи водневих зв'язків між карбонільною групою діантрону та одним з гідроксилів глюкози.

У напівемпіричному s,p-валентному наближенні досліджено п'ять таутомерів молекули гіперицину, що мають симетричну структуру, та 41 таутомер з асиметричною структурою. Встановлено, що за величинами загальної енергії найбільш стабільним у синглетному мультиплетному стані є таутомер I (7,14-діон-1,3,4,6,8,13-гексагідроксидіантрон); у триплетному мультиплетному стані - таутомер IV (8,13-діон-1,3,4,6,7,14-гексагідроксидіантрон). Реакційна здатність атомів у молекулах таутомерів залежить від стану молекули і підвищується зі збільшенням мультиплетності. Найбільшим від'ємним надлишковим зарядом і відповідною відновною здатністю характеризуються атоми кисню карбонільних груп.

За результатами аналізу експериментальних та розрахункових УФ-, ІЧ-спектрів, і величин загальної енергії доведено, що гіперицин існує у вигляді суми як нейтральних, так і заряджених часток - відновлених форм, катіонів, аніон-радикалів, діаніонів та молекул відомої хіноїдної структури, - утворених, головним чином, на основі таутомерів IV, I і II (3,4-діон-1,6,7,8,13,14-гексагідроксидіантрон), що знаходяться у триплетному стані. Легким є протонування молекул таутомерів гіперицину за рахунок молекул води шляхом приєднання протону до кисневого атому карбонільних груп.

Вперше отримані модифіковані молекули діантронів (водорозчинні форми у вигляді комплексів із полівінілпіролідоном (ПВП) та глікозиди діантронів) і доведено механізми реакцій комплексоутворення молекул діантронів із ПВП та глікозилювання молекул діантронів.

Доведено, що в результаті реакції глікозилювання гіперицину глюкозою утворюються три типи O-3-a-D-глюкозидів гіперицину - моноглікозиди (утворені приєднанням однієї молекули глюкози до С₁₄ або С₇ атомів молекули гіперицину), диглікозиди (утворені приєднанням двох молекул глюкози до С₁ та С₁₄ або С₁ та С₇ атомів молекули гіперицину) та гептаглікозиди (утворені приєднанням семи молекул глюкози до С₁, С₃, С₄, С₆, С₇, С₈, С₁₄ або С₁, С₃, С₆, С₇, С₈, С₁₃, С₁₄, або С₁, С₄, С₆, С₇, С₈, С₁₃, С₁₄ атомів молекули гіперицину). Молекули глюкозидів діантронів знаходяться у триплетному стані і мають високий дипольний момент, який характеризує їх значну розчинність у воді.

Показано, що фізіологічна роль агліконів поліфенолів у рослинному організмі (в мембранних структурах хлоропластів і мітохондрій), пов'язана з інгібуванням синтезу АТФ, сполученого з переносом електронів по ЕТЛ хлоропластів і мітохондрій, і, паралельно, з інтенсифікацією дихання зазначених органел. Реакція глікозилювання поліфенолів відіграє регуляторну роль, нівелюючи інгібіторний вплив агліконів на процес переносу енергії.

Виявлено, що діантрон гіперицин має виражену антидепресантну дію, реалізація механізму якої здійснюється шляхом оборотного впливу на моноаміноксидазу та впливом на зворотній захват медіаторних моноамінів (серотоніну, дофаміну, норадреналіну). Антидепресантна активність флавоноїдів є значно меншою.

В результаті вивчення взаємозв'язку віруліцидної дії зі структурою сполук рекомендовані для поглиблених досліджень з метою створення перших вітчизняних препаратів, ефективних проти вірусів родин Rhabdoviridae (вірус везикулярного стоматиту) і Picornaviridae (вірус поліомієліту типу 2, віруси Коксакі В1, В4, В6), водорозчинні форми діантронів, глікозиди діантронів і два сухі екстракти трави звіробою з вмістом суми діантронів 2.0%.

Розроблено сполучену з одержанням антибактеріального препарату “Новоіманін” технологію отримання Антидепресину - нового препарату антидепресантної дії, з трави звіробою звичайного. Оформлено НТД для промислової технології препарату у вигляді субстанції та лікарської форми. Апробацію регламентів на промислове виробництво та методик контролю якості здійснено на НВЦ “Борщагівський ХФЗ”.

Розроблено рецептуру для приготування тонізуючого і загальноукріплюючого безалкогольного напою “Бадьорий”, що містить траву звіробою звичайного. Рецептуру включено до технічних умов ТУ У 15.8-13931591-001 “Суміші рослинні “Екоплант” - напівфабрикати для виготовлення безалкогольних напоїв”. Виробництво напою здійснюється Командитним Товариством “Еко”, м. Кременчук.

Результати роботи впроваджені в навчальний процес Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця (м.Київ), Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика та Національної фармацевтичної академії (м. Харків).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ ВИКЛАДЕНО У НАСТУПНИХ РОБОТАХ

Маковецька О.Ю., Бойко I.I., Усачoва М.Н., Ковальова Т.В., Капінус Є.I., Лебеда А.П. Антивірусна активність гіперицину в експерименті // Фармац. журн. - 1997. - № 2. - С.93-97. (Маковецька О.Ю. здійснила літературний пошук, приймала безпосередню участь в експерименті, зробила аналіз та узагальнення експериментальних даних, підготовила статтю)

Маковецька О.Ю., Бойко I.I., Капінус Є.I., Лебеда А.П. Речовини фотодинамічної дії з рослин роду звіробій Hypericum L. та їх антивірусна активність. Повідомлення 1. Хімічний склад діючих речовин та властивості гіперицинів // Фармац. журн. - 1997. - № 3. - С.19-24. (Маковецька О.Ю. здійснила літературний пошук, обробила експериментальні дані, підготовила статтю)

Маковецька О.Ю., Бойко I.I., Капінус Є.I., Лебеда А.П. Речовини фотодинамічної дії з рослин роду звіробій Hypericum L. та їх антивірусна активність. Повідомлення 2. Механізм противірусної дії // Фармац. журн. - 1997. - № 4. - С.49-52. (Маковецька О.Ю. здійснила літературний пошук, обробила експериментальні дані, підготовила статтю)

Маковецька О.Ю. Дослідження біологічно активних речовин видів роду звіробій Hypericum L. Повідомлення 1. Секції Campylosporus (Spach) R.Keller та Psorophytum (Spach) Nyman. // Фармац. журн. - 1998. - № 5. - С.38-44.

Маковецька О.Ю. Дослідження біологічно активних речовин видів роду звіробій Hypericum L. Повідомлення 2. Секція Ascyreia Choisy // Фармац. журн. - 1999. - № 1. - С.47-52.

Маковецька О.Ю. Дослідження біологічно активних речовин видів роду звіробій Hypericum L. Повідомлення 3. Секції Takasagoya (Y.Kimura) N.Robson та Androsaemum (Duhamel) Godron // Фармац. журн. - 1999. - № 2. - С.24-29.

Маковецька О.Ю. Дослідження біологічно активних речовин видів роду звіробій Hypericum L. Повідомлення 4. Секції Inodora Stef., Roscyna (Spach) R.Keller та Bupleuroides Stef. // Фармац. журн. - 1999. - № 3. - С.39-44.

Маковецька О.Ю. Дослідження біологічно активних речовин видів роду звіробій Hypericum L. Повідомлення 5. Секція Hypericum // Фармац. журн. - 1999. - № 4. - С.30-36.

Маковецька О.Ю. Дослідження біологічно активних речовин видів роду звіробій Hypericum L. Повідомлення 6. Секції Olympia (Spach) Nyman, Campylopus Boiss. та Origanifolia Stef. // Фармац. журн. - 1999. - № 6. - С.46-50.

Маковецька О.Ю., Громов Л.О., Пішель В.Я., Лебеда А.П. Антидепресантна активність та токсичність сухого екстракту трави звіробою // Ліки. - 1999. - № 3-4. - С.29-32. (Маковецька О.Ю. приймала безпосередню участь в експерименті, самостійно проаналізувала дані експериментів, підготовила статтю)

Маковецкая Е.Ю. Флавоноиды некоторых видов Hypericum L. // Химия природ. соедин. - 1999. - № 5. - С.671-673.

Маковецкая Е.Ю. Изучение связанных полифенолов травы зверобоя // Хим.-фарм. журн. - 2000. - № 2. - С.55.

Маковецька О.Ю. Біологічно активні речовини Hypericum attenuatum Choisy // Укр. біохім. журн. - 2000. - № 3. - С.110-113.

Маковецька О.Ю. Дослідження біологічно активних речовин видів роду звіробій Hypericum L. Повідомлення 7. Секції Drosocarpium Spach, Oligostema (Boiss.) Stef., Thasia Boiss. та Crossophyllum Spach. // Фармац. журн. - 2000. - № 3. - С.53-59.

Маковецька О.Ю. Дослідження біологічно активних речовин видів роду звіробій Hypericum L. Повідомлення 8. Секції Hirtella Stef., Taeniocarpium Jaub. & Spach та Coridium Spach // Фармац. журн. - 2000. - № 5. - С.40-47.

Маковецька О.Ю. Дослідження біологічно активних речовин видів роду звіробій Hypericum L. Повідомлення 9. Секції Myriandra (Spach) R. Keller. // Фармац. журн. - 2000. - № 6. - С.44-48.

Маковецька О.Ю. Дослідження біологічно активних речовин видів роду звіробій Hypericum L. Повідомлення 10. Секції Webbia (Spach) R. Keller, Arthrophyllum Jaub. & Spach, Triadenioides Jaub. & Spach, Heterophylla N.Robson, Adenotrias (Jaub. & Spach) R. Keller та Humifusoidaeum R. Keller. // Фармац. журн. - 2001. - № 1. - С.75-80.

Маковецька О.Ю., Дегтярьов Л.С., Лебеда А.П. Дослідження електронної будови гіперицину та енергетики переходів у його спектрах поглинання // Укр. біохім. журн. - 2000. - № 6. - С.39-42. (Маковецька О.Ю. самостійно провела квантово-хімічні розрахунки та проаналізувала дані експериментальних досліджень, підготовила статтю)

Маковецкая Е.Ю., Бойко И.И. Исследование антивирусной активности двух форм гиперицина по отношению к вирусу везикулярного стоматита // Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л.Шупика. - 2000. - Вип.9, кн.1. - С.665-669. (Маковецька О.Ю. приймала безпосередню участь в експерименті, самостійно зробила аналіз експериментальних даних, підготовила статтю)

Маковецька О.Ю., Громов Л.О., Пішель В.Я., Лебеда А.П. Порівняльне дослідження спектру антидепресантної активності сухого екстракту трави звіробою // Клін. фармація. - 2001. - Т.5, № 1. - С.73-77. (Маковецька О.Ю. здійснила літературний пошук, самостійно розробила новий тест визначення антидепресантної активності - резерпіно-плавальний тест, - приймала безпосередню участь в експерименті, проаналізувала дані експериментів, підготовила статтю)

Маковецька О.Ю., Бойко І.І. Дослідження противірусної дії деяких похідних гіперицину проти вірусів Коксакі В // Ліки України. - 2001. - № 4. - С.27-28. (Маковецька О.Ю. приймала безпосередню участь в експерименті, самостійно зробила аналіз експериментальних даних, підготовила статтю)

Маковецька О.Ю. Дослідження біологічно активних речовин видів роду звіробій Hypericum L. Повідомлення 11. Секції Adenosepalum Spach та Elodes (Adans.) W. Koch. // Фармац. журн. - 2001. - № 4. - С.50-55.

Маковецька О.Ю. Дослідження біологічно активних речовин видів роду звіробій Hypericum L. Повідомлення 12. Секції Brathys (Mutisex L. f.) Choisy та Spachium (R.Keller) N.Robson. // Фармац. журн. - 2001. - № 5. - С.46-53.

Патенти на винаходи:

Маковецька О.Ю., Максютіна Н.П., Дідковський В.Є., Лебеда А.П. Спосіб отримання водорозчинної речовини. Патент України № 24693 A від 04.08.98. (Маковецька О.Ю. самостійно здійснила патентний пошук, запропонувала методику отримання водорозчинної речовини, провела хроматографічні та УФ-спектральні дослідження нової речовини, зробила аналіз експериментальних даних, сформулювала формулу винаходу, підготовила опис до Патенту)

Маковецька О.Ю., Максютіна Н.П., Дідковський В.Є., Лебеда А.П. Глікозиди діантронів і спосіб їх отримання. Патент України № 24768 А від 06.10.98. (Маковецька О.Ю. самостійно здійснила патентний пошук, запропонувала методику отримання глікозидів діантронів, провела хроматографічні та УФ-спектральні дослідження нових сполук, зробила аналіз експериментальних даних, сформулювала формулу винаходу, підготовила опис до Патенту)

Маковецька О.Ю., Максютіна Н.П., Громов Л.О., Пішель В.Я. Спосіб отримання екстракту зі звіробою, що має антидепресивну активність. Патент України № 31616 А від 15.12.2000. (Маковецька О.Ю. самостійно здійснила патентний пошук, запропонувала спосіб отримання екстракту трави звіробою, провела дослідження антидепресантної активності екстракту, зробила аналіз експериментальних даних, сформулювала формулу винаходу, підготовила опис до Патенту)

Наукові статті:

Громов Л.А., Маковецкая Е.Ю. Фармакотерапия тревожных состояний // Таврический журнал психиатрии. - 1999. - Т.3, № 2 (9). - С.146. (Маковецька О.Ю. приймала безпосередню участь в експериментальних дослідженнях по визначенню антидепресантної активності in vivo, самостійно проаналізувала дані власних експериментів, приймала безпосередню участь у підготовці статті)

Маковецкая Е.Ю., Бойко И.И., Лебеда А.Ф. Оценка антивирусного действия некоторых форм диантронов по отношению к вирусу полиомиелита // Фитотерапия в Украине. - 2000. - № 1. - С.24-26. (Маковецька О.Ю. приймала безпосередню участь в експерименті, зробила аналіз та узагальнення експериментальних даних, підготовила статтю)

Матеріали з'їздів і конференцій

Маковецкая Е.Ю. Качественный состав биологически активных веществ некоторых видов зверобоя и его значение для эволюционной систематики рода // Четверта Міжнародна конференція з медичної ботаніки: Тез. доп. - Київ, 1997. - С.412-413.

Маковецкая Е.Ю. Исследование биологически активных веществ видов рода Hypericum L. секции Ascyreia Choisy // Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений: Тез. докл. Междунар. совещ., посвященного памяти В.Г.Минаевой (15-18 апреля 1998). - Новосибирск, 1998. - С.90-91.