Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

Определение количественного содержания свободных радикалов в органах лабораторных животных методом электронного парамагнитного резонанса

Введение

Существование организма человека в условиях постоянного контакта с неблагоприятными факторами внешней среды невозможно без адекватного функционирования его неспецифических защитных систем. Одной из ключевых систем неспецифической защиты является антиоксидантная система (АОС), обеспечивающая поддержание соотношения прооксидантных и антиоксидантных факторов в организме на физиологическом уровне [1].

Изучением антиоксидантной активности воды с пониженным содержанием дейтерия занимается коллектив авторов из Румынии, ими опубликована статья [2], в которой были исследованы только показатели крови и выживаемость животных. Большое количество работ посвящены использованию легкой воды в медицинских целях в онкологии. Таким образом, в настоящий момент, проблеме изучения биологической активности воды с пониженным содержанием дейтерия посвящен ряд современных исследований.

В данной работе было изучено влияние длительного употребления воды со сниженным содержанием дейтерия на состояние прооксидантно-антиоксидантной системы организма в условиях окислительного стресса.

Впервые была изучена динамика изменения содержания дейтерия в лиофилизированных тканях печени, почек и сердца лабораторных животных для воды с остаточным содержанием дейтерия 40 и 100 ppm.

Определено, что вода с остаточным содержанием дейтерия 40 ppm и 100 ppm обладает практически одинаково выраженным антиоксидантным эффектом при развитии гнойно-воспалительных заболеваний у лабораторных животных, но более быстро этот эффект развивается при использовании воды с остаточным содержанием дейтерия 40 ppm.

В группах животных, употреблявших воду с пониженным остаточным содержанием дейтерия, количество выживших животных в нормальных условиях было больше, чем в контрольной группе на 12,5 и 15% для групп 40 ppm и 100 ppm соответственно.

Целью данной работы являлось выявление изменений количества свободных радикалов, а также влияния воды с пониженным содержанием дейтерия на показатели свободнорадикального окисления тканей у лабораторных животных в физиологических условиях и при воспалительных процессах.

Поставленные задачи:

1. Изучить литературу, посвященную методу ЭПР в биологии; свободно-радикальному окислению и методам коррекции окислительного стресса.

2. Изучить методику определения количества свободных радикалов в биологических тканях.

3. Провести эксперимент по моделированию окислительного стресса у лабораторных животных и его коррекции; определить количество свободных радикалов (ПМЦ) в тканях.

4. Определить содержание изотопов водорода в лиофилизированных тканях органов при использовании в питьевом рационе лабораторных животных воды со сниженным содержанием дейтерия;

5. Определить уровень свободнорадикального окисления при изменении изотопного состава водорода в организме лабораторных животных.

Поставленные задачи полностью выполнены.

1. Свободные радикалы в органах животных

1.1 Электронный парамагнитный резонанс

радикал свободный дейтерий воспалительный

В 1944 г. в Казанском университете Е.К. Завойский проводил исследования парамагнитной релаксации на высоких частотах (10⁷-10⁸ Гц) при параллельной и перпендикулярной ориентациях переменного и постоянного магнитных полей. Впервые осуществив систематическое изучение релаксации в перпендикулярных полях, он обнаружил в случае парамагнитных солей (MnCl₂, CuSO₄ 5H₂O и т.д.) интенсивное резонансное поглощение высокочастотной энергии при строго определенных отношениях напряженности постоянного магнитного поля к частоте. Так было открыто новое физическое явление, широко известное теперь под названием электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).

В первые годы после этого открытия метод ЭПР применялся в основном физиками для решения частных физических задач. В конце сороковых годов этот метод начал с успехом применяться для исследования тонких деталей электронной структуры парамагнитных ионов в кристаллических решетках разной симметрии. С начала пятидесятых годов началось бурное применение метода ЭПР к решению химических задач. Это связано с тем, что для современной химии имеет чрезвычайно большое значение выяснение структуры и химических свойств парамагнитных частиц, принимающих участие в сложных химических процессах. Это, с одной стороны, парамагнитные ионы металлов переходных групп периодической системы, являющиеся активными центрами огромного числа различных гетерогенных катализаторов и входящие в состав различных металлоорганических комплексов, определяющих активность сложных органических катализаторов, в том числе большинства биологических ферментов. С другой стороны, детальное исследование огромного числа сложных химических реакций в газовой и жидкой фазах, в том числе фотохимических, радиационно-химических и биохимических процессов, привело к представлению о чрезвычайно большой распространенности в химии свободно-радикальных и цепных механизмов. В большинстве случаев, и особенно в случае быстрых процессов, заключение о радикальном характере того или иного процесса в связи с трудностями непосредственного обнаружения, измерения концентраций и установления строения свободных радикалов основывалось на косвенных кинетических данных. Как будет показано ниже, метод ЭПР позволил подойти к решению обеих проблем, которые можно объединить под общим названием - роль частиц с неспаренным электроном в химических процессах, на совершенно новом, гораздо более высоком экспериментальном и теоретическом уровне.

Метод ЭПР основан на известном эффекте Зеемана, заключающемся в том, что при введении парамагнитной частицы, характеризующейся квантовым числом S, в постоянное магнитное поле ее основной энергетический уровень расщепится на 2S + 1 подуровней, отделенных друг от друга интервалами энергии, равными

(1)

где Н - напряженность магнитного поля;

в - единица атомного магнетизма - магнетон Бора;

g - фактор спектроскопического расщепления, определяющий, по существу, величину эффективного магнитного момента частицы.

Условие ЭПР

Электрон, обладая собственным моментом количества движения (спином) и являясь электрически заряженной частицей, имеет магнитный момент:

(2)

где g - безразмерная величина (g - фактор Ланде), равная для свободного электрона 2,00232;

µв - магнетон Бора (µв = ?h/(2mc) = 9,27*10^-24 А*мІ; ? - заряд электрона, Кл; m - масса покоя электрона, кг; c - скорость света, м/с);

S - вектор спинового углового момента (в единицах ? = h/2р).

В отсутствии внешнего поля спиновые векторы ориентированы беспорядочно, то есть спиновые состояния вырождены. При наложении внешнего магнитного поля В гамельтониан взаимодействия с ним

(3)

запишется в виде:

(4)

Ось z совпадает с направлением поля. В общем случае парамагнитной частицей (при одном или нескольких неспаренных электронах) суммарный вектор S связан со спиновым квантовым числом S известным соотношением:

(5)

а его проекция, входящая в выражение (5),

Sz=hm_s (6)

где m_s - квантовое число, которое может принимать значение от - S до +S (как и проекция Sz в единицах h), то есть всего (2S+1) значений.



Рисунок 1 - Расщепление спиновых энергетических уровней электрона в зависимости от индукции внешнего магнитного поля и индуцируемый радиочастотным полем переход

а) кривая первой производной спектра ЭПР; б) для лоренцевой формы линии

Рисунок 2 - Линия спектра поглощения ЭПР

Поскольку при отрицательном заряде m_е отрицателен, m_е выбирается в уравнении (3) положительным. Для одного электрона S = 1/2 и возможны только две ориентации спинового вектора - по полю и против поля, т.е. его проекции на направление поля характеризуются двумя значениями квантового числа m_s= ±1/2.

Соответствующие энергетические состояния, или зеемановские уровни, записываются в виде:

Е=gm_B Bm_s (6)

Из-за разных знаков m_е и m_n состояние с более низкой энергией взаимодействия с полем у электрона в отличие от протона соответствует m_s=1/2 и обозначается волновой функцией состояния |в>. Состоянию с более высоким значением энергии соответствует m_s = +1/2 и оно описывается волновой функцией |б>. Эти уровни показаны на рис. 1. Переходы между ними могут индуцироваться переменным радиочастотным полем, направленным перпендикулярно постоянному внешнему магнитному полю в сантиметровом (миллиметровом) диапазоне длин волн. 
Условием магнитного резонанса является совпадение разности энергий уровней, между которыми происходит переход, зависящий от внешнего поля B, с энергией кванта электромагнитного излучения, то есть

?E=2µ_eB= gm_B B=hv (7)

Для достижения этого условия используют обычно развертку по полю, то есть варьирование B при постоянной частоте излучения (v=const). Резонансный сигнал в спектре ЭПР обычно регистрируется в виде зависимости от напряженности поля первой производной интенсивности спектра поглощения, как это показано на рис. 2, а, б, что позволяет лучше выявить особенности и разрешить структуру спектра.

Метод ЭПР в медицине

Применения метода ЭПР в биологии и медицине весьма разнообразны. Ежегодно в мире проводятся несколько международных симпозиумов и научных конференций, посвященных различным аспектам медико-биологических применений метода ЭПР.

В последние годы метод ЭПР широко применяется к решению ряда медико-биологических задач. Он довольно успешно используется в следующих исследованиях: изучение состояния метаболических реакций и их молекулярного механизма, изучение молекулярных механизмов патологических изменений и установление возможности диагностики заболеваний методом ЭПР. Так, за прошедшие годы было установлено, что состояние эндогенных парамагнитных центров (ПМЦ) зависит от физиологического состояния организма, изменяется при лучевой болезни, злокачественном росте опухолей. В ряде работ получены данные, по-видимому, имеющие значение для диагностики некоторых заболеваний.

Применяется метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) для изучения плазмы, эритроцитов, слюны, секрета носа, желудочного, дуоденального и перитонеального содержимого, желчи, кала, синовиальной жидкости, содержимого кист верхнечелюстной пазухи, выделенных из организма здорового человека, а также больных ишемической болезнью сердца, железодефицитной анемией, язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, ревматоидным артритом и деформирующим остеоартрозом, поражением верхних дыхательных путей, больных перитонитом. Интерпретированы спектры ЭПР исследованных биологических жидкостей. Выяснены структуры, ответственные за ПМЦ. Изучены процессы формирования и роль гемового и негемового железа, меди, марганца, метгемоглобина, гем-NO, моно- и динитрозильных комплексов и свободных радикалов в развитии указанных заболеваний. Многолетний опыт применения метода ЭПР в медицине показывает, что он может с успехом применяться для решения ряда вопросов. Данный способ позволяет уточнить патогенез некоторых заболеваний внутренних органов терапевтического и хирургического профиля. Также им можно дифференцировать заболевания, изучать метаболизм и механизм действия лекарственных препаратов.

Медико-биологическое применение метода ЭПР состоит в исследовании свободных радикалов, что позволяет при изучении спектров облученных белков объяснить механизм образования свободных радикалов, проследить изменение первичных и вторичных продуктов при радиационном поражении.

ЭПР используется для изучения фотохимических процессов, в частности фотосинтеза, для изучения концентрации свободных радикалов в воздухе.

1.2 Окислительный стресс

Несмотря на то, что прооксиданты - свободные радикалы (супероксидный анион-радикал, оксид азота, гидроксильный радикал, алкилы, алкоксилы, пероксилы) и реактивные молекулы (пероксид водорода, гипохлорит-анион, гидропероксиды, пероксинитрит) - принимают активное участие в регуляции многих внутриклеточных процессов [3-7], включая иммунные механизмы, обезвреживание ксенобиотиков, апоптоз, метаболизм биологически активных соединений (простагландинов, биоаминов), обмен костной ткани и окисление гемоглобина, в случаях развития в организме дисбаланса прооксидантно-антиоксидантной системы с преобладанием прооксидантных факторов, последние начинают оказывать повреждающее действие на молекулярном и клеточном уровне, что сопровождается комплексом типовых патологических изменений в органах и тканях, называемых термином «окислительный стресс» [8].

Все формы жизни сохраняют восстанавливающую среду внутри своих клеток. Клеточный «редокс-статус» поддерживается специализированными ферментами в результате постоянного притока энергии. Нарушение этого статуса вызывает повышенный уровень токсичных реактивных форм кислорода, таких как пероксиды и свободные радикалы. В результате действия реактивных форм кислорода такие важные компоненты клетки как липиды и ДНК окисляются.

У человека оксидативный стресс является причиной или важной составляющей многих серьёзных заболеваний, таких как атеросклероз, гипертензия, болезнь Альцгеймера, диабет, а также является одной из составлющих процесса старения. В некоторых случаях, однако, оксидативный стресс используется организмом как защитный механизм. Иммунная система человека использует оксидативный стресс для борьбы с патогенами, а некоторые реактивные формы кислорода могут служить посредниками в передаче сигнала.

С химической точки зрения оксидативный стресс представляет собой значительное увеличение клеточного редокс-потенциала или существенное снижение восстановительной способности клеточных редокс-пар, таких как окисленный / восстановленный глутатион. Эффект оксидативного стресса зависит от силы его выраженности. Клетки могут вернуться в исходное состояние при небольших нарушениях. Однако, более выраженный оксидативный стресс вызывает клеточную смерть.

В человеческом организме наиболее распространены реакции Фентона и Габера-Вейса, генерирующие гидроксил-радикалы.

Наиболее опасная часть оксидативного стресса - это образование реактивных форм кислорода (РФК), в которые входят свободные радикалы и пероксиды. Один из наименее реактивных РФК, супероксид, спонтанно или в присутствии переходных металлов превращается в более агрессивные (гидроксильный радикал и др.), что может вызвать повреждение многих клеточных компонентов - липидов, ДНК и белков (как результат их окисления). Большинство РФК постоянно образуются в клетке, но их уровень в норме настолько небольшой, что клетка либо инактивирует их с помощью антиоксидантной системы, либо заменяет повреждённые молекулы. Таким образом РФК, образующиеся в качестве побочных продуктов нормального клеточного метаболизма (в основном из-за небольшой утечки электронов в дыхательной цепи митохондрий, а также других реакций в цитоплазме), не вызывают повреждения клетки. Однако уровень РФК, превышающий защитные возможности клетки, вызывает серьёзные клеточные нарушения (например, истощение АТФ) и как результат разрушение клетки. В зависимости от силы стресса клетки могут погибнуть в результате апоптоза, когда внутреннее содержимое клетки успевает деградировать до нетоксичных продуктов распада, или в результате некроза, когда сила оксидативного стресса слишком велика. При некрозе клеточная мембрана нарушается и содержимое клетки высвобождается в окружающую среду, что может в результате повредить окружающие клетки и ткани.

1.3 Свободные радикалы

Свободные радикалы в химии - частицы (как правило, неустойчивые), содержащие один или несколько неспаренных электронов на внешней электронной оболочке. По другому определению свободный радикал - вид молекулы или атома, способный к независимому существованию (то есть обладающий относительной стабильностью) и имеющий один или два неспаренных электрона. Неспаренный электрон занимает атомную или молекулярную орбиталь в одиночку. Как правило, радикалы обладают парамагнитными свойствами, так как наличие неспаренных электронов вызывает взаимодействие с магнитным полем.

Наиболее очевидным было использование ЭПР для исследования химических процессов, протекающих при участии свободных радикалов.

Свободные радикалы были открыты американским ученым Гомбергом в 1900 г., когда при исследовании реакций гексафенилэтана (Ph)₃C - C(Ph)₃ ему пришлось предположить существование в качестве самостоятельного химического образования частиц (Ph)₃c, обладающих трехвалентным углеродом. Предположение об образовании свободных радикалов - частиц с ненасыщенным атомом углерода позволило объяснить большое число химических фактов - образование продуктов димеризации, ряд кинетических особенностей сложных процессов и т.д.

В 1918 г. Нернстом было высказано предположение, что свободные радикалы играют существенную роль не только в жидкофазных превращениях, но и в быстрых газовых реакциях. Было получено много косвенных доказательств этого предположения, но только в начале 30-х годов были разработаны первые прямые - спектроскопические - методы обнаружения радикалов в ходе химических реакций - свободного гидроксила в зоне разреженных пламени водорода и окиси углерода.

После этого центр тяжести при исследовании роли радикалов как промежуточных продуктов при сложных химических процессах надолго перемещается в область газофазных реакций. Наряду со спектрами поглощения и излучения для этой цели начали успешно использовать масс-спектральный метод. Вопрос же об идентификации свободных радикалов в конденсированной фазе (в жидких и твердых средах) и об изучении их химических свойств до начала 50-х годов оставался практически нерешенным. Единственным источником наших сведений о строении этих частиц были косвенные химические данные, основанные на анализе конечных продуктов. Только в некоторых случаях - при образовании радикалов в концентрациях больше 5 - 10% от концентрации исходных веществ - возможно пользоваться для этой цели непосредственным измерением парамагнитной восприимчивости. Последний метод не позволял, однако, сделать почти никаких выводов о природе парамагнитной частицы. Положение резко изменяется после открытия метода электронного парамагнитного резонанса, позволяющего изучать радикалы в самых различных средах.

Применение метода ЭПР для исследования строения и превращения свободных радикалов в ходе химических реакций ограничивается в настоящее время чувствительностью метода.

В последнее время этот прием был применен В.Н. Панфиловым, В.В. Азатяном, А.Б. Налбандяном для доказательства образования сверхравновесных концентраций атомов водорода в пламени окиси углерода с небольшими добавками молекулярного водорода. Более того, поскольку из химического механизма горения СО следует, что в этом пламени должны образовываться очень высокие концентрации атомов кислорода, В.В. Азатян и А.Б. Налбандян поставили опыты по прямой идентификации атомов кислорода в зоне горения. Результаты этих опытов также полностью подтвердили выводы теории цепных реакций.

Хотя применение ЭПР для исследования сверхбыстрых газовых реакций и представляет несомненный интерес, однако развитие этой области еще только начинается, и других данных, позволяющих сравнить этот метод, например, с масс-спектрометрическим, пока нет.

Метод ЭПР начинает применяться и при исследовании радикалов в жидкофазных реакциях. Правда, по отмеченным выше причинам, область применяемости его ограничивается в большинстве случаев сравнительно малоактивными радикалами и ионами-радикалами. При этом довольно часто, как известно, радикалы можно рассматривать практически как совершенно устойчивые продукты и изучать их химическими методами или простым магнитным взвешиванием. В этих случаях ЭПР играет, тем не менее, незаменимую роль, поскольку он позволяет точно установить истинную структуру радикала (или иона-радикала). Так, применение метода ЭПР позволило точно установить строение ион-радикалов различных семихинонов, ароматических положительных и отрицательных ионов-радикалов и многих других малоактивных парамагнитных частиц.

Если говорить о кинетических измерениях в жидкостях с помощью ЭПР, то следует, прежде всего, рассмотреть один пример, который можно назвать промежуточным. Радикал, о котором идет речь (трифенил-метил), настолько устойчив, что его концентрация достигает нескольких процентов от гексафенилэтана, но сведения о его концентрациях и о скоростях его превращения были получены до сих пор только на основе косвенных химических измерений. Поскольку спектр ЭПР трифенилметила имеет весьма характерный и специфический вид, он представляется весьма удобным объектом для проведения строгих количественных кинетических измерений. В проведенных в Институте химической физики (ИХФ) в 1958 г. работах Ф.С. Дьячковского, Н.Н. Бубнова, А.Е. Шилова были поставлены две задачи:

1. Непосредственное измерение константы равновесия:

(Ph)₃C - C(Ph)₃?2 (Ph)₃C (8)

и константы скорости рекомбинации трифенилметильных радикалов в интервале температур, достаточно широком для точного определения энергии связи Q в гексафенилэтане и энергии активации процесса рекомбинации Е.

2. Прямое подтверждение гипотезы Н.Н. Семенова о возможности образования радикалов при бимолекулярной реакции:

AB+CD>A+BC+D (9)

в тех случаях, когда связь В-С значительно прочнее связей АВ и CD. В качестве примера была выбрана реакция

(Ph)₃CCl+LiC₂H₅>(Ph)₃C+LiCl+C₂H₅, (10)

за ходом которой можно было следить по накоплению устойчивого радикала (Ph)₃C.

Для решения первой задачи измерения проводились в разбавленных растворах гексафенилэтана в толуоле, непосредственно после их быстрого охлаждения от комнатной температуры до температуры опыта.

Несмотря на огромный интерес, который представляет метод ЭПР для исследования химических превращений, протекающих в жидкой фазе при участии радикалов, и для установления детальных механизмов этих превращений, насколько нам известно, имеется еще лишь два систематических исследования в этом направлении. Это работы американских ученых Гарднера и Френкеля по превращениям в жидкой сере и работа Я.С. Лебедева, В.Ф. Цепалова, В.Я. Шляпинтоха по идентификации свободных радикалов при жидкофазном окислении кумола.

В первом из этих исследований было найдено, что при нагревании жидкой серы возникают свободные радикалы, обусловленные разрывом полимерных цепочек серы. Из самого факта обнаружения этих радикалов в заметных концентрациях следует, что либо подвижность их в жидкой сере весьма невелика, либо они представляют собой своеобразные «клубки», причем свободная валентность размещена в центре такого клубка, что и объясняет ее малую активность и, как следует из этого, достаточно высокую стационарную концентрацию.

Следует отметить, что совершенно идентичные по форме линии спектры наблюдались авторами статьи при применении в качестве инициаторов окисления столь различных веществ, как азоизобутиронитрил и дицикло-гексилперкарбонат, и при каталитическом инициировании в присутствии стеарата кобальта.

Концентрация радикалов с точностью до 50% совпадала с рассчитанной теоретически и однозначно определялась значением скорости процесса окисления. Из этого следует, что спектр ЭПР обусловлен радикалом цепи окисления, а не влиянием добавок. Весьма удивительно, что, несмотря на то, что измерения проводились в жидкой фазе, усреднение анизотропии g - фактора за счет вращения не наблюдается.

Хиноны - полностью сопряжённые циклогексадиеноны и их аннелированные аналоги. Существуют два класса хинонов: пара-хиноны с пара - расположением карбонильных групп (1,4-хиноны) и орто-хиноны с орто-расположением карбонильных групп (1,2-хиноны). Благодаря способности к обратимому восстановлению до двухатомных фенолов некоторые производные пара-хинонов участвует в процессах биологического окисления в качестве коферментов ряда оксидоредуктаз.

Коферменты, или коэнзимы - малые молекулы небелковой природы, специфически соединяющиеся с соответствующими белками, называемыми апоферментами, и играющие роль активного центра или простетической группы молекулы фермента.

Оксидоредуктамзы - отдельный класс ферментов, катализирующих лежащие в основе биологического окисления реакции, сопровождающиеся переносом электронов с одной молекулы (восстановителя - акцептора протонов или донора электронов) на другую (окислитель - донора протонов или акцептора электронов).

Реакции, катализируемые оксидоредуктазами, в общем виде выглядят так:

A^? + B > A + B^? (11)

где A - восстановитель (донор электронов);

B - окислитель (акцептор электронов).

В биохимических превращениях окислительно-восстановительные реакции иногда выглядят сложнее. Вот, например, одна из реакций гликолиза:

P_н +глицеральдегид-3-фосфат+НАД⁺ >

>НАД·H+H⁺ +1,3-дифосфоглицерат (12)

Здесь в качестве окислителя выступает НАД⁺, а глицеральдегид-3-фосфат является восстановителем.

Молекула хинона многоцентровая, поэтому для хинонов характерны реакции:

- по карбонильной группе (идут под действием сильных нуклеофильных реагентов): реакции нуклеофильного замещения и нуклеофильного присоединения.

- по сопряжённой системе связи: неароматический первичный продукт присоединения перегрупировывается в замещённый гидрохинон (1,4 - гидроксибензол), в результате возникает термодинамически более выгодный ароматический продукт. Например, при реакции парабензохинина (1,4 - бензохинон) с HCl образуется 1,4-гидрокси, 3-хлорбензол.

- по двойной связи (с образованием циклопродуктов):

Рисунок 3 - Реакция хинона по двойной связи

- восстановление сопровождается переносом одного электрона. Присоединение одного электрона приводит к образованию семихинона (анион-радикала), после присоединения второго электрона образуется дианион двухатомного фенола, конечный продукт восстановления - гидрохинон:



Рисунок 4 - Восстановление хинона по стадиям

Семихинонные (4-гидроксифеноксильные) радикалы в качестве интермедиатов участвуют во многих важных процессах с участием хинонов и гидрохинонов. В частности, они играют огромную роль в процессах ингибирования перекисного окисления липидов. В этом случае семихинонные радикалы возникают в результате реакции восстановленных форм природных биоантиоксидантов (таких как убихиноны (коэнзимы Q), витамины группы К) с образующимися в организме свободными радикалами (чаще всего с перекисными ROO* радикалами). Реакции диспропорционирования семихинонных радикалов, когда один радикал отрывает атом Н от другого радикала и восстанавливается в гидрохинон, а другой при этом окисляется в хинон, являются важнейшими реакциями гибели семихинонных радикалов в большинстве процессов с их участием.

1.4 Лёгкая вода

Под легкой водой ученые подразумевают воду, содержание дейтерия в которой снижено по отношению к природному уровню, а, точнее, к стандартной среднеокеанической воде (SMOW) [9]. В легкой воде изменяется скорость протекания химических реакций, сольватация ионов, их подвижность и т.д. Употребление легкой воды приводит к нормализации углеводного и липидного обмена, коррекции веса, выведению шлаков и токсинов из организма и т.д. Доказано [10, 11], что при употреблении такой воды повышается работоспособность, физическая активность, выносливость и сопротивляемость организма.

Легкая вода оказывает стимулирующее действие на живые системы, существенно повышает их активность, жизнестойкость к различным негативным факторам, репродуктивную деятельность, улучшает и ускоряет обмен веществ. Для сельскохозяйственных культур действие легкой воды проявляется в повышении всхожести и урожайности, для человека - в оздоровительном эффекте.

Основное действие, оказываемое легкой питьевой водой на организм - постепенное снижение содержания дейтерия в жидкостях тела за счёт реакций изотопного обмена. Исследованием биологического действия воды с пониженным содержанием дейтерия занимается коллектив в Институте медико-биологических проблем РАН. Ими доказано, что вода с пониженным содержанием дейтерия обладает стимулирующим действием на репродуктивную функцию организма и не оказывает токсического действия на организм лабораторных животных: длительное употребление воды с пониженным содержанием дейтерия приводит к снижению степени тяжести лучевых повреждений, обусловленных действием гамма-излучения в низких дозах в условиях ежедневного воздействия [12].

Также, установлено, что употребление воды с пониженным содержанием дейтерия относительно природного уровня, приводит к снижению концентрации этого элемента в гомогенате сердца лабораторных животных [13]. Такие изменения в свою очередь, ведут к уменьшению прооксидантной нагрузки в организме и восстановлению баланса прооксидантно-антиоксидантной системы, что в дальнейшем сопровождается повышением иммунитета у лабораторных животных.

Методы получения биологически активной легкой воды, их влияние на ее свойства

Методы разделения изотопов основаны на различиях в свойствах изотопов и их соединений, связанных с различием масс их атомов (изотопные эффекты) [14]. Для большинства элементов относительная разность масс изотопов весьма мала, малы и изотопные эффекты, что и определяет сложность задачи.

Во всякой разделительной установке исходная смесь делится не менее чем на две фракции, одна из которых обогащается концентрируемым изотопом за счет других. Эффективность работы разделительной установки определяется её производительностью G и коэффициентом разделения б.

Основные производители лёгкой воды в настоящее время применяют метод ректификации (дистилляция, фракционная перегонка), который основан на различии в равновесном составе жидкой и газообразных фаз. Дистилляция использует различие в скорости испарения различных по массе изотопов, которая зависит от массы атома - чем она меньше, тем выше скорость.

Эффект разделения умножается в ректификационных колоннах благодаря противотоку фаз. Поскольку, как правило, изотопы имеют различные давления насыщенного пара, (p₁ и p₂) и различные температуры кипения, то возможно разделение изотопов путём фракционной перегонки, для чего используют фракционирующие колонны с большим числом ступеней разделения; б зависит от отношения p₁/p₂ и его значение уменьшается с ростом молекулярной массы и температуры. Поэтому процесс наиболее эффективен при низких температурах [14].

Для обычной воды при нормальных условиях температура кипения равна 100,0°С, для тяжёлой она составляет 101,4°С. Недостатком данного метода является низкий коэффициент разделения, обусловленный сложностью поддержания равномерной температуры кипения. Для достижения существенного снижения содержания дейтерия требуется множество ступеней, использование ректификационных колонн, что делает метод дорогостоящим.

В работе [15] описана установка для получения легкой воды (рис. 5), состоящая из узла приготовления водяного пара из исходной воды с концентрацией ¹Н₂¹⁶О, равной С₁ 1, узла подачи водяного пара в ректификационную колонну 2, узла взаимодействия пар-жидкость, представляющего собой ректификационную колонну 3 с контактным устройством внутри нее 4, узла конденсации водяного пара с концентрацией ¹Н₂¹⁶О, равной С₂ 5 (С₂>С₁), стрелками показаны направления потоков восходящего пара и нисходящей жидкости. Ректификационная колонна представляет собой узел взаимодействия пар-жидкость между нисходящим потоком жидкости и восходящим потоком пара на поверхности расположенного внутри контактного устройства, при направлении основного потока жидкости и основного потока пара вдоль оси колонны. Давление пара в ректификационной колонне 0,05-0,6 бар, выход конденсированной легкой воды - 0,001-0,25 от общего объема водяного пара, прошедшего через ректификационную колонну. Установка позволяет получить в промышленных масштабах легкую воду с содержанием ¹Н₂ ¹⁶O не менее 997,13 г./кг и суммарным содержанием ¹Н₂¹⁷O, ¹Н₂¹⁸O, ¹HD¹⁶O, ¹HD¹⁷O, ¹HD¹⁸O, D₂¹⁶O, D₂¹⁷O, D₂¹⁸O не более 2,87 г./кг от общего количества H₂O.

Рисунок 5 - Установка для получения легкой воды в ректификационной колонне

Для получения легкой воды также предлагается использовать мембраны [16]. Установка представлена на рис. 6 и состоит из отдельной емкости 1 для хранения исходной воды, насоса 2 для подачи исходной воды в фильтровальный элемент 3, продуктовой емкости 7 и регулятора потока 6 в виде ламинарного сопротивления. В корпусе фильтровального элемента 3 поток воды V с концентрацией ¹H₂¹⁶О, равной С, пропускают вдоль оси мембраны 4. Под действием давления от 0,1 до 30 бар часть воды объемом V₁ проходит через мембрану 4 и в виде легкой высокочистой воды ¹H₂¹⁶О с концентрацией C₁ направляется в продуктовую емкость 7. Второй поток воды объемом V₂ движется вдоль мембраны 4, омывая и регенерируя ее, затем поступает на слив 5 в виде отработанной воды, проходя через регулятор соотношения потоков 6. При этом V=V₁+V₂ и C₁>C. Полученный объем легкой воды V₁ составляет от 0,05 до 0,8 от общего объема V исходной воды, поступившей на фильтрацию. Содержание C₁ легких молекул ¹H₂¹⁶О в полученной легкой воде составляет не менее 99,734% от общего количества Н₂О, концентрация ¹⁷O в полученной легкой воде составляет не более 372 ppm, а концентрация ¹⁸О в полученной легкой воде составляет не более 1960 ppm.

Рисунок 6 - Установка для получения легкой воды с помощью мембраны

Метод кристаллизации позволяет уменьшить содержание дейтерия не ниже 136 ppm, поэтому такая вода не может применяться в медицинских целях. Метод можно применять для последующих стадий обогащения разделенных фракций: в работе [17] предложен способ разделения изотопов водорода в четырех насадочных колоннах криогенной ректификации и четырех блоках гомомолекулярного изотопного обмена. Переработке подвергают два сырьевых потока, первый из которых содержит от 0,80 до 0,99 ат. долей протия и от 0,01 до 0,20 ат. долей трития, а второй сырьевой поток содержит от 0,01 до 0,03 ат. долей протия, от 0,64 до 0,72 ат. долей дейтерия и от 0,25 до 0,35 ат. долей трития. В качестве продуктов получают протий с изотопной чистотой 0,99999 ат. долей, дейтерий с изотопной чистотой 0,9999 ат. долей и тритий с изотопной чистотой 0,9999 ат. долей.

Известно множество других способов, которые могут использоваться для разделения изотопов водорода [14], однако большинство из них имеют очень низкий коэффициент разделения: 1,01-1,1, остальные слишком дороги в создании и эксплуатации. Таким образом, существует необходимость в разработке более дешёвого и эффективного способа получения лёгкой воды.

Нами разработан способ получения воды, обеднённой тяжёлыми изотопами водорода и кислорода, основанный на различии окислительно-восстановительных потенциалов и кинетических характеристик процесса восстановления водорода из лёгкой и тяжёлой воды [18-23]. Электрохимический способ применялся ранее для обратного процесса - получения тяжёлой воды, использующейся в ядерной энергетике.

Разделение происходит следующим образом. Производится электролиз воды, при котором разложению подвергаются в основном молекулы, содержащие протий, по причине меньшей энергии ковалентной связи. Далее идёт синтез воды из смеси кислорода и водорода, обогащённого протием. Для увеличения коэффициента разделения и уменьшения перенапряжения водорода электроды изготовлены из никеля. Установка позволяет получить продукт с любой заданной степенью обеднения, вплоть до очень низкого содержания дейтерия - 10 ppm (миллионных долей).

Способ реализован с помощью различных конструкций линии по получению легкой воды [18-23], позволяющих возвратить в производственный цикл большую долю энергии, потраченной в процессе электролиза, что приводит к существенному уменьшению энергозатрат и, как следствие, приводит к снижению себестоимости конечного продукта.

Для рекуперации энергии могут использоваться:

1) Топливный водород-кислородный элемент [18, 19]. Линия снабжена разделителем газовой смеси, содержащим паладиево-серебряную мембрану, установленным между осушителем и топливным элементом, а преобразователь электролизных газов в воду выполнен в виде низкотемпературного водород-кислородного топливного элемента с ионообменными мембранами, причем топливный элемент электрически соединен с электролизером

2) Газовая турбина [20, 21]. Преобразователь электролизных газов выполнен в виде газовой высокотемпературной турбины, вал которой механически связан с валом генератора, подающего ток на блок питания.

3) Магнитогидродинамический генератор (МГД) [22]. Газовая смесь подаётся в магнитогидродинамический генератор, где, сгорая, разогревается до 2700 - 3000°С, куда также из ёмкости подсасывается солевой раствор с необходимым для получения питьевой воды составом. Образовавшаяся плазма проходит в поперечном магнитном поле МГД-генератора, и сила Лоренца [24] разделяет её на положительный и отрицательный потоки, которые попадают на соответствующие электроды, а произведённая электроэнергия направляется в электролизёр.

4) Термоэлектрический генератор [23]. Представляет собой герметичную металлическую ёмкость прямоугольной формы, внутри которой расположены встречно направленные перегородки, смещённые друг относительно друга таким образом, чтобы максимально увеличить путь прохождения газа. На поверхность блока прикрепляются термоэлектрические модули, преобразующие часть тепловой энергии в электрическую на основе эффекта Зеебека [25].

5) Линия, одновременно использующая МГД-генератор, термоэлектрический генератор-охладитель и низкотемпературную турбину [23], представлена на рис. 7. Переменный ток внешней электрической сети преобразуется блоком питания 1, поступает на электролизер 2, куда подается и дистиллированная вода. Образовавшаяся смесь кислорода и обедненного дейтерием водорода для предотвращения обратного изотопного обмена водорода с парами воды поступает по газовому трубопроводу в осушитель 3, где осушается регенерируемым водопоглощающим веществом. Далее осушенная газовая смесь поступает в МГД генератор 4 через форсунку-распылитель 9, подсасывая солевой раствор с необходимым для получения питьевой воды солевым составом из емкости 10, где, сгорая, разогревается до 2800 - 3000 ^оС. При этом соли ионизируются, образуя плазму, которая проходя в магнитном поле, производит электроэнергию, при этом ее температура снижается до 1000-1500 ^оС. После этого водяной пар поступает в генератор-охладитель 5, в котором газ проходит по змеевику, с прикрепленными к нему термоэлементами, далее газ направляется в низкотемпературную турбину 6 где пар остывает и преобразует часть своей внутренней энергии в кинетическую энергию вращения вала турбины 6 и далее - вала генератора 7, производя электроэнергию, также направляемую на вход блока питания 1. Пары воды содержат нейтральные соли и после турбины 6 направляются в конденсатор 8, а затем поступают в сборник 9.



Рисунок 7 - Схема линии для получения легкой воды с использованием МГД-генератора, генератора-охладителя и газовой турбины

Использование электролитического способа с блоком рекуперации позволяет в 4-6 раз снизить энергозатраты на получение лёгкой воды по сравнению с применяемыми в настоящее время ректификационными методами. Отсюда можно сделать вывод, что в ближайшее время данный метод станет одним из основных способов получения лёгкой воды.

2. Методика

При выполнении дипломной работы использованы оригинальные методы и подходы, большей частью, модифицированные или разработанные участниками проекта.

Приведенные в данной работе опыты проводились на крысах одного возраста, приблизительно одного веса, содержавшихся в стандартных условиях освещения и пищевого режима вивария. Животные на протяжении всего эксперимента получали воду с пониженным содержанием дейтерия.

Образцы тканей предварительно подвергали лиофилизации, затем измеряли в кварцевой ампуле. Далее проводили измерение спектров ЭПР. Концентрацию ПМЦ в образцах определяли путем сравнения с сигналом стандартного образца (TEMPOL). Интегральную интенсивность сигнала ЭПР в исследуемых образцах определяли путем двойного численного интегрирования по методу прямоугольников.

При моделировании гнойной раны у крыс, использовали двухэтапную модель окислительного стресса. Первый этап представлял собой острую фазу окислительного стресса и моделировался путем создания межмышечного абсцесса в мягких тканях длинных мышц спины лабораторного животного с использованием имплантированного инородного тела. Второй этап отражал хроническую фазу окислительного стресса и моделировался гнойной раной, которая формировалась естественным образом при дренировании абсцесса и удалении инородного тела.

Основой модели окислительного стресса явилась известная модель раневого процесса, предложенная Л.А. Мамедовым и основанная на хирургическом лечении модели абсцесса, нами в ходе экспериментальных исследования проведена ее модификация и подан патент на изобретение [26].

Воду с пониженным содержанием дейтерия получали на установке, разработанной в Кубанском государственном университете участниками проекта [19,21] Исходная концентрация дейтерия в получаемой воде составляла 40 ppm. Далее последовательными разбавлениями получали воду с различным содержанием дейтерия.

2.1 Методика моделирования окислительного стресса

Крысы были разделены на следующие группы:

1 Пьющие дистиллированную минерализованную воду (n=40).

2 Пьющие дистиллированную минерализованную воду с пониженным содержанием дейтерия (n=80 - подгруппа 40 ppm, n=40; подгруппа 100 ppm, n=40).

3 Пьющие дистиллированную минерализованную воду, лабораторные животные с гнойным воспалением мягких тканей (n=40).

4 Пьющие дистиллированную минерализованную воду с пониженным содержанием дейтерия, лабораторные животные с гнойным воспалением мягких тканей (n=80 - подгруппа 40 ppm, n=40; подгруппа 100 ppm, n=40).

Состояние животных до начала эксперимента находилось в пределах физиологической нормы. Крысы были подвижны и активны; мышцы в тонусе; тактильная реакция сохранена; шерсть плотно прилегает к телу, не взъерошенная, гладкая, чистая, блестящая, кожный покров эластичный, без нарушения целостности; видимые слизистые оболочки бледно-розового цвета, истечений и других признаков воспалительных реакций нет. Глаза ярко-красного цвета. Акты мочеиспускания и дефекации находились в пределах физиологической нормы. Крысы активно поедали корм. В течение всего эксперимента у животных контрольной группы не отмечалось каких-либо различий в поведенческих реакциях.

Для создания модели абсцесса крысе до начала эксперимента срезали и выбривали шерсть на средней и нижней третях спины. Затем под местной анестезией р-ром новокаина 0,5% - 10 мл иглой шприца наносилось повреждение мягких тканей (область длинных мышц спины) на глубине 3 см шириной 2 см в предполагаемой зоне формирования абсцесса. В день начала эксперимента под хлоралозо-нимбуталовым наркозом производился разрез скомпрометированной накануне области длиной 3 см и в мягкие ткани вводился стерильный марлевый шарик диаметром 10 мм, пропитанный 1 мл жидкости с патогенным штаммом St. aureus. На рану накладывались первичные швы.

Через сутки у животных появлялась клиника нагноения раны, и начинался первый (острый) период моделирования окислительного стресса. Швы снимались через 5 суток с момента инфицирования, что соответствовало переходу во вторую фазу окислительного стресса. В дальнейшем проводилось местное лечение гнойной раны под мазевыми повязками до ее полного заживления вторичным натяжением.

2.2 Методика приготовления образцов

По истечении эксперимента крыс умерщвляли, извлекали сердце, печень и почки. Органы помещали в лиофильную сушилку, затем из них приготавливали гомогенат для удобства дальнейших исследований.

Препаративная лиофильная сушилка, ЛС-1000

Характерные особенности:

- Наикратчайшая траектория паров;

- Визуальный контроль продукта;

- Минимальный объем для достижения быстрого откачивания до рабочего вакуума;

- Стерилизуемая камера из нержавеющей стали;

- Компактность, легкость;

Технические характеристики:

- Скорость сушки не менее 100 г./ч;

- Температура конденсатора -50°C, мощность 6 кг льда;

- Рабочее давление в вакуумной камере сушилки 6,67 Па (5*10-2 мм рт. ст.);

- Вакуумный насос с газовым балластным устройством;

- Регулируемая температура полки до +45°C;

- Контроль параметров вакуума и температуры конденсатора и продукта. Время непрерывной работы не менее 30 ч;

- Питание сушилки осуществляется от трехфазной сети переменного тока 380 В. Потребляемая мощность составляет 1,5 кВт;

- Внешние габариты: 720х1040х820 мм;

- Вес 150 кг.

2.3 Методика снятия спектров ЭПР

Устройство радиоспектрометра ЭПР

Устройство радиоспектрометра ЭПР во многом напоминает устройство спектрофотометра для измерения оптического поглощения в видимой и ультрафиолетовой частях спектра (рис. 8).

Рисунок 8 - Устройство радиоспектрометра ЭПР

Источником излучения в радиоспектрометре является клистрон, представляющий из себя радиолампу, дающую монохроматическое излучение в диапазоне сантиметровых волн. Диафрагме спектрофотометра в радиоспектрометре соответствует аттенюатор, позволяющий дозировать мощность, падающую на образец. Кювета с образцом в радиоспектрометре находится в специальном блоке, называемом резонатором. Резонатор представляет собой параллелепипед, имеющий цилиндрическую или прямоугольную полость, в которой находится поглощающий образец. Размеры резонатора таковы, что в нем образуется стоячая волна. Элементом отсутствующем в оптическом спектрометре является электромагнит, создающий постоянное магнитное поле, необходимое для расщепления энергетических уровней электронов.

Излучение, прошедшее измеряемый образец, в радиоспектрометре и в спектрофотометре, попадает на детектор, затем сигнал детектора усиливается и регистрируется на самописце или компьютере. Следует отметить еще одно отличие радиоспектрометра. Оно заключается в том, что излучение радиодиапазона передается от источника к образцу и далее к детектору с помощью специальных трубок прямоугольного сечения, называемых волноводами. Размеры сечения волноводов определяются длиной волны передаваемого излучения. Эта особенность передачи радиоизлучения по волноводам и определяет тот факт, что для регистрации спектра ЭПР в радиоспектрометре используется постоянная частота излучения, а условие резонанса достигается изменением величины магнитного поля. Еще одной важной особенностью радиоспектрометра является усиление сигнала посредством его модуляции высокочастотным переменным полем. В результате модуляции сигнала происходит его дифференцирование и превращение линии поглощения в свою первую производную, являющуюся сигналом ЭПР.

Измерение спектров электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) проводили при комнатной температуре на спектрометре JES Fa 300 (JEOL, Япония) в X-диапазоне. Условия измерения: СВЧ мощность 1 мВт, частота микроволнового излучения 9144 МГц, амплитуда высокочастотной модуляции 0,1 мТл.

Спектрометр электронного парамагнитного резонанса JES-FA300 ESR

- Чувствительность: не хуже 7х10⁹/10"⁴ Тл (при модуляции 100 кГц);

- Разрешение: не хуже 2.35 мкТл (при модуляции 100 кГц);

- Диапазон СВЧ: X (9000 МГц);

- Точность установки частоты: 7 порядков;

- Диапазон выходной мощности: от 0,1 мкВт до 200 мВт;

- Диапазон изменения магнитного поля: от 0 до 2 Тл;

- Точность установки: 2 мкТл;

- Амплитуда развёртки: от ±0.01 до ±500 мТл;

- Линейность: ±5 мкТл или ±0.1% и лучше;

- Частота модуляции магнитного поля: 100 кГц, желательно дополнительно 80 Гц;

- Глубина модуляции магнитного поля: от 0,2 мкТл до 2мТл (при модуляции 100 кГц).

Позволяет провести качественный и количественный анализ парамагнитных материалов, исследовать динамику молекул, механизмы химических реакций, в том числе фотоиндуцированных, исследовать магнитные свойства материалов, анализировать состав пищевых продуктов, биологических объектов и т.п. на содержание парамагнитных металлов, свободных радикалов.

Концентрацию ПМЦ в образцах определяли путем сравнения с сигналом стандартного образца (TEMPOL). Интегральную интенсивность сигнала ЭПР в исследуемых образцах определяли путем двойного численного интегрирования по методу прямоугольников [27].

Спектры ЭПР образцов органов лабораторных крыс содержат анизотропный синглетный сигнал, параметры спин-гамильтониана (g = 2.0074, g = 2.003) которого соответствуют стабильным радикалам [28-30].

Характеристики спектров ЭПР

Амплитуда сигнала

Сигнал ЭПР (рис. 9) представляет собой первую производную от лин. Площадь под линией поглощения пропорциональна концентрации парамагнитных частиц в образце. Таким образом, концентрация парамагнитных центров пропорциональна первому интегралу под линией поглощения или второму интегралу от спектра ЭПР. Если два сигнала имеют одинаковую ширину, то концентрации парамагнитных центров соотносятся как амплитуды сигналов и поглощения.