Хотя согласно основному уравнению резонанса поглощение происходит только при равенстве энергии падающего кванта разности энергии между уровнями неспаренных электронов, спектр ЭПР является не линейчатым, а непрерывным в некоторой окрестности точки резонанса. Функция, описывающая сигнал ЭПР называется функцией формы линии. В разбавленных растворах, когда можно пренебречь взаимодействием между парамагнитными частицами, кривая поглощения описывается функцией Лоренца:

где F_Л0 - функция кривой поглощения в точке резонанса, H₀ - значение поля в точке резонанса, ДH_1/2 - ширина сигнала на половине высоты. Аналогичные обозначения используются для кривой поглощения, описываемой функцией Гаусса.

Функция Гаусса является огибающей спектра ЭПР, если между парамагнитными частицами существует взаимодействие. Учитывать форму линии особенно важно при определении площади под кривой поглощения. Как видно из формул (17) и (18) у функции Лоренца более медленное убывание и соответственно более широкие крылья, что может давать значительную ошибку при интегрировании спектра.

Ширина линии

Ширина спектра ЭПР зависит от взаимодействия магнитного момента электрона с магнитными моментами окружающих ядер (решетки) и электронов. Рассмотрим механизм поглощения энергии неспаренными электронами подробнее. Если в низкоэнергетическом состоянии находится N₁ электронов, а в высокоэнергетическом N₂ и N₁>N₂, то при подаче электромагнитной энергии на образец разность заселенности уровней будет уменьшаться, пока не станет равной нулю. Это происходит потому, что вероятности одиночного перехода под действием излучения из низкоэнергетического состояния в высокоэнергетическое и наоборот (W₁₂ и W₂₁) равны между собой, а заселенность нижнего уровня выше. Введем переменную n=N₁-N₂. Тогда изменение разности заселенности уровней во времени можно записать

Однако, в эксперименте изменения разности заселенности уровней не наблюдается благодаря тому, что существуют процессы релаксации, поддерживающие постоянной эту разность. Механизм релаксации заключается в передаче кванта электромагнитной энергии решетке или окружающим электронам и возвращении электрона на низкоэнергетический уровень. Если обозначить вероятности переходов индуцируемых решеткой через P₁₂ и P₂₁, причем P₁₂<P₂₁, то изменение разности заселенности уровней будет

или если заменить N₁+N₂ на N, то

В стационарном состоянии, когда изменение разности заселенности равно нулю, начальная разность заселенности уровней (n₀) остается постоянной и равной

В этом случае уравнение (21) будет выглядеть

или заменив P₁₂+P₂₁ на 1/Т₁, получим

Величина Т₁ называется временем спин-решеточной релаксации и характеризует среднее время жизни спинового состояния. В итоге, изменение разности заселенности уровней системы неспаренных электронов, находящейся под воздействием электромагнитного излучения и взаимодействующей с решеткой, будет определяться уравнением

Отсюда следует, что в стационарном состоянии

и при 2WT1<<1, n=n₀, т.е. при относительно небольших мощностях разность заселенности уровней остается практически постоянной.

Из соотношения неопределенностей Гейзенберга следует, что

Если принять, что Дt равно Т1, а ДЕ соответствует gвДH, то уравнение (27) можно переписать в виде

т.е. неопределенность в ширине линии обратно пропорциональна времени спин-решеточной релаксации.

Кроме взаимодействия магнитного момента неспаренного электрона с решеткой, возможно, также его взаимодействие с магнитными моментами других электронов. Это взаимодействие приводит к уменьшению времени релаксации и тем самым к уширению линии спектра ЭПР. В этом случае вводят понятие времени спин-спиновой релаксации (T₂).

Наблюдаемое время релаксации считают суммой времени спин-решеточной и спин-спиновой релаксации.

Для свободных радикалов в растворах T₁>>T₂, следовательно, ширина линии будет определяться T₂. Среди механизмов уширения линий следует упомянуть следующие: диполь-дипольное взаимодействие; анизотропия g-фактора; динамическое уширение линии и спиновый обмен.

В основе диполь-дипольного взаимодействия лежит взаимодействие магнитного момента неспаренного электрона с локальным магнитным полем, создаваемым соседними электронами и ядрами. Напряженность магнитного поля в какой-либо точке зависит от расстояния до этой точки и взаимной ориентации магнитных моментов неспаренного электрона и другого взаимодействующего электрона или ядра. Изменение энергии неспаренного электрона будет определяться

где µ - магнитный момент электрона;

R - расстояние, до источника локального магнитного поля;

и - угол между взаимодействующими магнитными моментами.

Вклад анизотропии g-фактора в уширение линии ЭПР связан с тем, что орбитальное движение электрона создает переменное магнитное поле, с которым взаимодействует спиновый магнитный момент. Это взаимодействие приводит к отклонению g-фактора от значения 2,0023, соответствующего свободному электрону. Для кристаллических образцов величины g-фактора, соответствующие ориентации кристалла обозначают gxx, gyy и gzz соответственно. При быстром движении молекул, например в растворах, анизотропия g-фактора может усредняться.

Уширение сигнала ЭПР может быть связано с взаимным превращением двух форм радикала. Так, если каждая из форм радикала имеет свой спектр ЭПР, то увеличение скорости взаимного превращения этих форм друг в друга будет приводить к уширению линий, т.к. при этом уменьшается время жизни радикала в каждом состоянии. Такое изменение ширины сигнала называется динамическим уширением сигнала.

Спиновый обмен является еще одним способом уширения сигнала ЭПР. Механизм уширения сигнала при спиновом обмене заключается в изменении направления спинового магнитного момента электрона на противоположное при соударении с другим неспаренным электроном или иным парамагнетиком. Поскольку при таком соударении уменьшается время жизни электрона в данном состоянии, то сигнал ЭПР уширяется. Наиболее частым случаем уширения линии ЭПР по механизму спинового обмена является уширение сигнала в присутствие кислорода или парамагнитных ионов металлов.

Сверхтонкая структура

В основе расщепления линии ЭПР на несколько лежит явление сверхтонкого взаимодействия, т.е. взаимодействия магнитных моментов неспаренных электронов (M_S) с магнитными моментами ядер (M_N).

Поскольку в присутствии магнитного момента ядра суммарный магнитный момент равен M_S + M_N, где M_S - магнитный момент электрона, а M_N - магнитный момент ядра, то суммарное магнитное поле Н_сумм. = Н₀ ± Н_лок., где Н_лок. - локальное магнитное поле, создаваемое магнитным моментом ядра. В данном случае вместо одного резонансного значения поля будут два - Н₀ + Н_лок. и Н₀ - Н_лок., которым будут соответствовать две линии. Таким образом, вместо одной линии при Н₀ мы получаем две линии при Н₀ + Н_лок. и Н₀ - Н_лок..

Рисунок 10 - Расщепление линии ЭПР

Важной особенностью сверхтонкого взаимодействия являются правила отбора для переходов между уровнями. Разрешенными переходами являются переходы, при которых изменение спинового магнитного момента неспаренного электрона (ДM_S) равно 1, а спинового магнитного момента ядра (ДM_N) равно 0.

В рассмотренном нами примере спин ядра, взаимодействующего с неспаренным электроном, был полуцелочисленным и был равен ± 1/2, что в конечном итоге дало нам расщепление на две линии (рис. 10). Такая величина спина характерна для протонов. У ядер атомов азота (N₁₄) спин целочисленный. Он может принимать значения ±1 и 0. В этом случае при взаимодействии неспаренного электрона с ядром атома азота будет наблюдаться расщепление на три одинаковых линии, соответствующих величине спина +1, -1 и 0. В общем случае число линий в спектре ЭПР равно 2М_N+1.

Рисунок 11 - Формула спинового зонда ТЕМПО и его спектр ЭПР

В этом радикале неспаренный электрон локализован около ядра азота, магнитное поле которого накладывается на внешнее магнитное поле.

Естественно, что количество неспаренных электронов и соответственно площадь под кривой поглощения ЭПР не зависят от величины спина ядра и являются постоянными величинами. Следовательно, при расщеплении одиночного сигнала ЭПР на два или три, интенсивность каждой компоненты будет соответственно в 2 или 3 раза ниже.

Очень похожая картина возникает, если неспаренный электрон взаимодействует не с одним, а с несколькими эквивалентными (с одинаковой константой сверхтонкого взаимодействия) ядрами, имеющими магнитный момент отличный от нуля, например двумя протонами. В этом случае возникает три состояния, соответствующие ориентации спинов протонов - а) оба по полю, б) оба против поля и в) один по полю и один против поля.

Вариант в) имеет вдвое большую вероятность, чем а) или б), т.к. может быть осуществлен двумя способами. В результате такого распределения неспаренных электронов одиночная линия расщепится на три с соотношением интенсивностей 1:2:1. В общем случае, для n эквивалентных ядер со спином М_N число линий равно 2_nM_N+1 [30].

2.4. Масс-спектрометрия

1) В результате проведенного исследования установлено содержание дейтерия в тканях организма при использовании в питьевом рационе лабораторных животных воды со сниженным содержанием дейтерия.

2) Изучена динамика изменений изотопного состава в тканях организма, при использовании в питьевом рационе лабораторных животных воды со сниженным содержанием дейтерия (рис. 14), которая для крыс, потребляющих воду с пониженным содержанием дейтерия (№№2, 4), составила для воды с содержанием дейтерия 40 ppm:

· через 2 недели: а) в лиофилизированной ткани сердца содержание дейтерия снизилось на 6,9%, б) в лиофилизированной ткани печени содержание дейтерия снизилось на 5,4%, в) в лиофилизированной ткани почек содержание дейтерия снизилось на 10,3%;

· через 4 недели: а) в лиофилизированной ткани сердца содержание дейтерия снизилось на 12,1%, б) в лиофилизированной ткани печени содержание дейтерия снизилось на 6,3%, в) в лиофилизированной ткани почек содержание дейтерия снизилось на 13,6%.

Для воды с содержанием дейтерия 100 ppm содержание дейтерия в тканях составило (рис. 15):

· через 2 недели: а) в лиофилизированной ткани сердца содержание дейтерия снизилось на 5,5%, б) в лиофилизированной ткани печени содержание дейтерия снизилось на 4,9%, в) в лиофилизированной ткани почек содержание дейтерия снизилось на 8,2%;

· через 4 недели: а) в лиофилизированной ткани сердца содержание дейтерия снизилось на 6,3%, б) в лиофилизированной ткани печени содержание дейтерия снизилось на 5,2%, в) в лиофилизированной ткани почек содержание дейтерия снизилось на 10,7%.

Рисунок 12 - Изменение содержания дейтерия в органах лабораторных животных, потреблявших воду с пониженным содержанием дейтерия с концентрацией 40 ppm

Рисунок 13 - Изменение содержания дейтерия в органах лабораторных животных, потреблявших воду с пониженным содержанием дейтерия с концентрацией 100 ppm

3) В ходе исследования были определены оптимальные концентрации остаточного содержания дейтерия в воде для купирования окислительного стресса, вызванного гнойным воспалением мягких тканей у лабораторных животных.

Так у крыс, потреблявших воду с остаточным содержанием дейтерия 40 ppm, выраженный антиоксидантный эффект наблюдали уже в течение первой недели, в лиофилизированных органах (печени, почках, сердце) наблюдали снижение количества парамагнитных центров (по данным ЭПР) в исследуемых тканях примерно на 32-38% по сравнению с контрольной группой. Это свидетельствует об уменьшении количества свободных радикалов и подтверждает благоприятное воздействие легкой воды на организм животных.

В то же время, у крыс, потреблявших воду с остаточным содержанием дейтерия 100 ppm, выраженный антиоксидантный эффект наблюдали только после трех недель употребления воды с остаточным содержанием дейтерия 100 ppm: в лиофилизированных органах (печени, почках, сердце) наблюдали снижение количества парамагнитных центров (по данным ЭПР) в исследуемых тканях примерно на 24-27% по сравнению с контрольной группой (рис. 16). Это свидетельствует о менее существенном уменьшении количества свободных радикалов в органах в первые недели при употреблении воды с содержанием дейтерия 100 ppm

Рисунок 14 - Изменение количества парамагнитных центров в печени лабораторных животных потреблявших воду с различным содержанием дейтерия

Рисунок 15 - Изменение количества парамагнитных центров в почках лабораторных животных потреблявших воду с различным содержанием дейтерия

Рисунок 16 - Изменение количества парамагнитных центров в сердце лабораторных животных потреблявших воду с различным содержанием дейтерия

Рисунок 17 - Изменение количества парамагнитных центров в органах лабораторных животных потреблявших воду с различным содержанием дейтерия

Таким образом, вода с остаточным содержанием дейтерия 40 ppm обладает более быстрым развитием антиоксидантного эффекта при развитии гнойно-воспалительных заболеваний у лабораторных животных, хотя через 4 недели происходит стабилизация выраженности антиоксидантного эффекта как для воды 40 ppm, так и для воды 100 ppm, причем в обоих случаях имеются достоверные отличия в сравнении с контролем.

4) Установлено, что в группе крыс, получавших легкую воду количество выживших животных составило: а) для животных (c гнойным воспалением мягких тканей), пьющих дистиллированную минерализованную воду: 82,5% (7 умерших крыс), б) для животных (c гнойным воспалением мягких тканей), пьющих дистиллированную минерализованную воду с пониженным содержанием дейтерия (40 ppm): 95% (2 умерших крысы), в) для животных (c гнойным воспалением мягких тканей), пьющих дистиллированную минерализованную воду с пониженным содержанием дейтерия (100 ppm): 97,5% (1 умершая крыса).

Спектры ЭПР образцов сердца лабораторных мышей приведены на рис. 18 и содержат анизотропный синглетный сигнал, параметры спин-гамильтониана (g = 2.0074, g = 2.003) которого соответствуют стабильным радикалам Спектры ЭПР образцов печени и почек имеют аналогичных характер.

Рисунок 18 - Спектры ЭПР лиофилизированных тканей сердца лабораторных мышей контрольной (1) и опытной группы (2)

Содержание дейтерия в лиофилизированных органах определяли при помощи изотопной масспектрометрии по стандартной методике.