Двухферментный электрод для анализа ингибиторов холинэстераз на основе наночастиц и нанослоев полиэлектролитов

Размещено на http://www.allbest.ru/

60

1

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

Двухферментный электрод для анализа ингибиторов холинэстераз на основе наночастиц и нанослоев полиэлектролитов

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Ингибиторы холинэстераз

1.2 Способы определения ингибиторов холинэстераз

1.3 Типы биосенсоров для анализа ингибиторов холинэстераз

1.3.1Биосенсоры, основанные на детекции тиохолина

1.3.1.1 Моноферментные холинэстеразные биосенсоры

1.3.1.2 Спектрофотометрическое определение активности холинэстераз

1.3.2 Биосенсоры, основанные на детекции Н⁺

1.3.3 Биосенсоры, основанные на детекции перекиси водорода

1.3.4 Биосенсоры, основанные на детекции фосфорорганических соединений

1.4 Технология «слой - за - слоем» (layer - by - layer, LBL)

1.4.1 Принцип метода.

1.4.2 Материалы, использующиеся в методе LBL

1.5 Особенности метода LBL и свойства наноструктурированных пленок полиэлектролитов

1.5.1 Электростатические и другие взаимодействия

1.5.2 Ионная сила и рН зависимость

1.5.3 Влияние природы поликатиона на структуру слоев и активность ферментов

1.5.4 Предварительная модификация поверхности электрода.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы

2.2 Методы

2.2.1 Спектрофотометрическое определение активности бутирилхолинэстеразы

2.2.2 Титрование активных центров бутирилхолинэстеразы

2.2.3 Формирование пероксидчувствительного слоя

2.2.4 Окисление мультистенных углеродных нанотрубок (МСУНТ) и стержней (УНС).

2.2.5 Титрование карбоксильных групп МСУНТ

2.2.6 Приготовление ферментных электродов

2.2.6.1 Общая схема приготовления электродов

2.2.6.2 Моноферментный биосенсор

2.2.6.3 Биферментный электрод

2.2.7 Измерение электрохимического отклика на холин

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Стабилизация холиноксидазного биосенсора

3.1.1 Формирование устойчивого подслоя

3.1.1.1 Обработка слоя оксида марганца поливиниловым спиртом

3.1.1.2 Обработка слоя оксида марганца полидиэтиламинофосфазеном (ПФ)

3.1.1.3 Формирование подслоя (ПДДА/ПАСК)₄

3.1.2 Использование мультистенных углеродных нанотрубок (МСУНТ) и углеродных наностержней (УНС)

3.1.3 Ковалентная прошивка холиноксидазы глутаровым альдегидом

3.1.4 Увеличение числа слоев

3.2 Стабилизация бутирилхолинэстеразного слоя

3.3 Ингибирование ДФФ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

ХЭ - холинэстераза,

АХЭ - ацетилхолинэстераза,

БХЭ - бутирилхолинэстераза,

ХО - холиноксидаза,

ОФГ - органофосфатгидролаза,

Тир - тирозиназа,

БСА - бычий сывороточный альбумин,

БТХ - бутирилтиохолин,

АТХ - ацетилтиохолин,

ФОС - фосфорорганические соединения,

ДФФ - диизопропилфторфосфат,

LBL - layer - by - layer,

ПК - поликатион,

ПА - полианион,

ПДДА - полидиаллилдиметиламмоний хлорид,

ПВС - поливиниловый спирт,

ПВС-SbQ - ПВС, модифицированный стирилпиридиновыми группами,

ПФ - полидиэтиламинофосфазен,

ПЭИ - полиэтиленимин,

ПАА - полиаллиламин,

ПСС - полистиролсульфонат,

ПАК - полиакриловая кислота,

ПАСК - полианетолсульфокислота,

ПГЭМА - поли(2 -гидроксиэтил)метакрилат,

ПАЗО - поли(1-(4-(3-карбокси-4-гидроксифенилазо)бензосульфамидо)-1,2-этандиил натрия)

CoФЦ - фталоцианин кобальта,

ДТНБ - 5,5'-дитиобис-2-нитробензойная кислота,

МСУНТ - мультистенные нанотрубки,

УНС - наностержни,

ЛД - летальная доза,

АСМ - атомно-силовая микроскопия,

ПДК - предельно допустимая концентрация,

ОБУВ - ориентировочный безопасный уровень воздействия.

ВВЕДЕНИЕ

ингибитор холинэстераза биосенсор биферментный

Несмотря на высокую токсичность, фосфорорганические соединения и карбаматы широко использовались и продолжают использоваться в промышленности и сельском хозяйстве, в качестве пестицидов, инсектицидов, а также в медицине для лечения некоторых болезней, благодаря их способности эффективно и необратимо ингибировать холинэстеразы, такие как ацетилхолинэстераза и бутирилхолинэстераза.

В последнее время требования по содержанию ингибиторов холинэстераз в природных объектах сильно ужесточились. Многие страны приняли ряд законопроектов, в России введены строгие Санитарные нормы и правила, в которых установлены предельно допустимые концентрации пестицидов в воздухе, питьевой воде и продуктах.

Одним из наиболее чувствительных ферментативных методов анализа фосфорорганических соединений и карбаматов является использование амперометрических сенсоров на основе холиноксидазы и холинэстераз (бутирилхолинэстеразы, ацетилхолинэстеразы).

С помощью быстрого и технологичного метода «слой - за - слоем» (layer - by - layer, LBL), основанного на последовательной адсорбции положительно и отрицательно заряженных объектов (полиэлектролитов, белков, ферментов, нанообъектов и проч.) на поверхности электрода, можно получить стабильные молекулярные тонкие пленки, способные включать оба фермента (как холиноксидазу, так и холинэстеразу), что позволит существенным образом снизить предел детекции как самих холинэстераз, так и их ингибиторов.

Детекция ингибитора основана на определении степени ингибирования холинэстераз после инкубации в растворе ингибитора в течение фиксированного промежутка времени; для определения активности холинэстераз используются реакции гидролиза холиновых эфиров до холина и соответствующей кислоты; окисление холина под действием холиноксидазы сопровождается накоплением электроактивного пероксида водорода, как одного из продуктов, концентрация которого определяется электрохимически при окислении на платиновом электроде.

Несколько лет назад в нашей лаборатории предпринимались попытки создания таких двухферментных электродов, но достичь необходимой стабильности и воспроизводимости так и не удалось.

Таким образом, целью данной работы явилось создание одноразового биферментного биосенсора, на основе бутирилхолинэстеразы и холиноксидазы, с помощью метода LBL для анализа ингибиторов холинэстераз.

1. Литературный обзор

1.1 Ингибиторы холинэстераз

Млекопитающие имеют два класса холинэстераз (ХЭ): ацетилхолинэстераза (АХЭ) и бутирилхолинэстераза (БХЭ). Эти два фермента, хотя и родственные, но отличаются по локализации в тканях, кинетические свойства, специфичность к синтетическим и природным субстратам и селективным ингибиторам [1].

АХЭ присутствует главным образом в головном мозге и нервных тканях, а также в эритроцитах крови и является важным регуляторным ферментом, контролирующим передачу нервных импульсов через холинергический синапс благодаря гидролизу медиатора - ацетилхолина. Бутирилхолинэстераза содержится в различных тканях млекопитающих: в печени, сердце, эндотелии сосудов, нервной системе и плазме крови. В настоящее время существует множество гипотез, описывающих возможную биологическую роль этого фермента в развивающихся и зрелых организмах. Было показано, что БХЭ играет ключевую роль в нейрогенезе [2].

Активный центр холинэстераз состоит из холинсвязывающей части (анионный сайт) и каталитической части (ОН - группа серина). К обратимым ингибиторам, способным к комплексообразованию с анионным сайтом, относятся природные и синтетические алкалоиды: эзерин, морфин, кокаин, атропин, а также четвертичные аммониевые основания. Фосфорорганические соединения (ФОС) и карбаматы (Рис.1) являются соединениями, непосредственно и необратимо связывающимися с серином. Соединения, имеющие в своей структуре - Р = S связь: паратион, малатион, диазинон и другие, являются непрямыми ингибиторами холинэстераз. Попадая в организм, они метаболически окисляются до соответствующих оксопроизводных и только потом ингибируют холинэстеразы [3].



Рис.1. А) Фосфорорганические соединения, Б) Карбаматы

Токсичность ФОС характеризуется параметром ЛД₅₀ (средняя летальная доза препарата, при которой погибает 50% животных (крыс), в пересчете на людей). Показатели ЛД₅₀ для некоторых фосфорорганических соединений представлены в Таблице №1 [4].

Таблица №1. Токсичность некоторых ФОС для человека

Соединение	Токсичность, ЛД50, мг/70кг
Зоман	7-12
Зарин	8-12
VX	5
GV	8
Диизопропилфторфосфат	20-80
Параоксон	30-50
Паратион	50-200
Дихлорфос	500-1000
Малатион	граммы

Картина отравления ФОС зависит от степени интоксикации. В первую очередь нарушаются функции центральной и вегетативной нервной системы, сердечно-сосудистой и других систем организма. Набор симптомов при этом обусловлен возбуждением холинорецепторов: сужение зрачков, затруднение дыхания, понижение артериального давления, фибриллярные подергивания мышц и др. При тяжелых отравлениях наблюдаются судороги, сопорозное или коматозное состояние, что может привести к летальному исходу.

Фосфорорганические соединения широко используются в сельском хозяйстве, в качестве пестицидов, инсектицидов, в промышленности, в качестве пластификаторов, гидравлических жидкостей, антиоксидантов. Наиболее токсичные ФОС, такие как зарин, зоман, VX относятся к агентам нервно-паралитического действия и могут быть использованы в террористических целях. Также фосфорорганические соединения нашли свое применение в медицине и часто используются в офтальмологии для лечения глаукомы, в хирургии, акушерской практике, при лечении болезни Альцгеймера [5].

Карбаматы - производные карбаминовой кислоты, необратимые ингибиторы ХЭ, эффективно использующиеся в сельском хозяйстве и медицине. Карбаматы растительного происхождения (физостигмин), обладают высокой токсичностью, но в силу избирательности действия широко используются в качестве лекарственных препаратов. Многие синтетические аналоги, обладающие меньшей токсичностью для млекопитающих, но высокотоксичные для насекомых, применяются в качестве инсектицидов. Аминостигмин и альдикарб, относятся к высокотоксичным для человека синтетическим производным карбаминовой кислоты. Токсичность соединений определяется строением радикала (R₁) при кислородном атоме карбоксильной группы кислоты [6] (Рис. 1,Б).

Несколько примеров применения ингибиторов холинэстераз представлены в Таблице №2.

Таблица 2. Применение ФОС и карбаматов

Группа ингибиторов	Примеры веществ	Применение
Органофосфаты	Зоман Зарин Табун VX GV	боевые отравляющие газы нервно-паралитического действия
	Диизопропилфторфосфат Паратион Параоксон Дихлорфос Малатион Армин Фосфанол Ацефат	пестицид пестицид, в организме активируется превращением в параоксон пестицид, офтальмология инсектицид, акарицид инсектицид, для лечения педикулеза офтальмология офтальмология инсектицид
Карбаматы	Пиридостигмин Карбарил Карбофуран Амбенонил хлорид Пропоксур Изопрокарб Диоксакарб Альдикарб Физостигмин	медицина (миастения, атония кишечника) пестицид пестицид офтальмология инсектицид инсектицид инсектицид инсектицид глаукома

В результате повсеместного и часто бесконтрольного применения, в мире накопилось огромное количество фосфорорганических соединений и карбаматов, которые даже в очень малых дозах представляют опасность для здоровья человека.

В последнее время требования по содержанию ингибиторов ХЭ в природных объектах сильно ужесточились. Многие страны приняли законопроекты, такие как US Water Framework Directive 2000/60/EC (Европейская Комиссия, 2000), Drinking Water Directive 98/83/EC (Европейская Комиссия, 1998), в России введены строгие Санитарные нормы и правила (СанПиН), в которых установлены предельно допустимые концентрации пестицидов в воздухе, питьевой воде и продуктах.

В Таблицах №3-5 приведены санитарные нормы по содержанию пестицидов и боевых отравляющих веществ по данным Санитарно-эпидемиологических правил и нормативов РФ (СанПиН), 2002, Санитарно-эпидемиологического центра СВ США, 1999 и IUPAC, 2003.

Таблица №3. Нормы содержания вредных веществ, в том числе ингибиторов холинэстераз по данным Санитарно-эпидемиологических правил и нормативов РФ

Название вещества	ПДК в водоеме, нМ	ПДК/ОБУВ в воздухе	ПДК в пище, мг/кг
		Рабочая зона, мг/м3	Атмосфера, мг/м3
Дикрезил	620	0,5	0,01	нд
Карбин	110	0,5	-	0,1
Дихлофос	45	0,2	0,002	0,05-0,3
Диазинон	13	0,2	0,0001	0,01-1
Атразин	9,2	2	0,0004	0,02-0,03
Симазин	нд	2	0,02	0,05-0,2
Карбарил	99	1	0,002	0,05 (0,2-10 в США)
Карбофуран	90	0,05	0,001	0,05-5
Тирам	41	0,5	0,05	нд
Малатион	105	0,05	0,015	0,3-3 (0,5-3 в США)
Паратион	7,6	0,1	0,001	0,1
Пропоксур	нд	нн	нн	нд

Таблица №4. Данные по допустимым уровням содержания нервно-паралитических газов в зоне защитных мероприятий и санитарной зоне на предприятиях по уничтожению.

Название вещества	ПДК в водоеме, нМ	ПДК/ОБУВ в воздухе
		Рабочая зона, мг/м3	Атмосфера, мг/м3
Зарин	0,36	2*10-5	2*10-7
Зоман	0,027	1*10-5	1*10-7
VX	0,0075	5*10-6	5*10-8

нд - содержание вещества не допускается в данной среде, нн - вещество не нормировано в данной среде, ПДК - предельно допустимая концентрация, ОБУВ - ориентировочный безопасный уровень воздействия

Таблица №5. Нормы содержания вредных веществ, в том числе ингибиторов холинэстераз по данным Санитарно-эпидемиологического центра СВ США, 1999 и IUPAC, 2003.

Название вещества	ПДК в питьевой воде
	СЭЦ США, GV, нМ	IUPAC, нМ
Диазинон	-	0,98
Атразин	9,3	0,0032
Симазин	9,9	0,015
Карбарил	-	0,0069
Карбофуран	32	0,031
Малатион	-	0,091
Зарин	-	0,02
Зоман	-	0,66
VX	-	0,56
Табун	-	0,086
Альдикарб	52	-

GV - концентрации, рекомендуемые ВОЗ, 1% от допустимой суточной дозы

Как видно из таблиц предельно допустимые уровни содержания ингибиторов ХЭ в воде варьируются от 6,2*10^-7 до 7,5*10^-12М в зависимости от степени токсичности. Таким образом, существует острая потребность в достоверном и чувствительном обнаружении таких соединений, выражающаяся в необходимости создания методов для быстрой и надежной оценки степени воздействия на здоровье человека и уровня загрязнения окружающей среды в целом.

1.2 Способы определения ингибиторов холинэстераз

Современные методы определения уровня загрязнения окружающей среды, в том числе определение содержания фосфорорганических соединений и карбаматов, включают газовую, жидкостную, тонкослойную хроматографию, различные спектроскопические методы, а также большой спектр биосенсорных устройств. Таблица №6 представляет собой краткий обзор наиболее чувствительных на данный момент способов определения пестицидов, в том числе ингибиторов ХЭ. Первые две колонки дают информацию о типе детекции определяемого аналита. Пределы обнаружения ингибиторов ХЭ сильно зависят от природы распознающего элемента, способа детекции, что можно увидеть из 5 колонки таблицы, и варьируются от 10^-8 до 10^-17М.

Использование хроматографических, спектроскопических и спектрометрических способов детекции позволяет определять требуемый аналит в достаточно низких концентрациях (10^-14М), но требует особой пробоподготовки (очистка, экстракция), больших временных и денежных затрат, что делает эти методики негодными для полевых экспресс-экспериментов.

Из этой таблицы видно, что сенсоры на основе биоматериала (ферментов) являются чувствительными, технически простыми, поддающимися миниатюризации, а, следовательно, и перспективными для экологического мониторинга. Так, например, что авторами работы [43] получен выдающийся результат: с помощью сонометрически приготовленного моноферментного амперометрического микроэлектрода был достигнут предел детекции параоксона 10^-17М.

Таким образом, мы остановимся на рассмотрении ферментативных способов детекции ингибиторов холинэстераз более подробно.

Таблица №6. Способы определения пестицидов и ингибиторов холинэстераз в воде.

Метод детекции	Детектор	Молекулярные распознающие элементы	Детектируемые вещества, предел детекции	Ссылка
			Субстрат	Ингибитор
Спектрофотометрический	Спектрофотометр	АХЭ	Ацетилтиохолин	Карбарил - 2,5*10-12 М Пропоксур - 3,8*10-14 М	[7]
Спектрофотометрический	Спектрофотометр	Eu3+/сополимер	-	Продукт гидролиза зомана - 7*10-12 М	[8]
Спектрофотометрический	Спектрофотометр	Молибдат натрия	-	Тирам (тетраметилдитиокарбонат) - 1,25*10-9 М	[9]
Спектрофотометрический	Спектрофотометр	Моноклональные антитела и меченные пероксидазой хрена антигены	Колориметрический субстрат - о-дифенилендиаминдигидро-хлорид	Атразин- 2,3*10-10 М	[10]
Жидкостная хроматография	Масс- спектрометр	-	-	4 - нитрофенол (метаболит паратиона) - 6,4*10-10 М 3-метил-4-нитрофенол (метаболит фенитротиона)- 1,2*10-9 М	[11]
Жидкостная хроматография	Пламенный фотометрический детектор	-	-	(1,5-10)*10-11 М	[12]
Жидкостная хроматография on-line solid-phase extraction	Масс- спектрометр	-	-	Пестициды разных классов: 2*10-14 - 1,4*10-11 М	[13]
Конкурентный непрямой Иммуноферментный анализ (ciELISA)	Спектрофотометр	Поликлональные антитела, меченные пероксидазой хрена	3,3',5,5'- тетраметилбензидин - колориметрический субстрат	Ацефат/гаптен-4-БСА - 10-8 М	[14]
Оптический	Поляризатор	Cu2+	-	Диметилметилфосфонат - 10-8 М	[15]
Кондуктометрический		ХЭ/БСА	Ацетил-(бутирил)холин	ДФФ - 5*10-11 М	[16]
Амперометрический	Планарный электрод, модифицированный многостенными нанотрубками	АХЭ/ХО (соиммобилизация на нанотрубках)	Ацетилхолин	Метил паратион - 5*10-8 М	[17]
Амперометрический	Многостенные нанотрубки, нанесенные на стеклоуглеродный электрод	АХЭ	Ацетилтиохолин	Параоксон - 4*10-13 М	[18]
Амперометрический	Углеродный пастовый электрод	АХЭ/ХО/ ферофталоцианин	Ацетилхолин	Параоксон - 10-10 М Карбофуран - 10-10 М	[19]
Амперометрический	Кислородный электрод	АХЭ/ХО/ПГЭМА	Ацетилхолин	Алдикарб - 11.7*10-9 М Карбофуран - 4*10-10 М Карбарил - 1.9*10-9 М	[20]
Фототермальный	Спектрофотометр, термальный оптический спектрометр (TLS)	АХЭ/ крахмал. гель	Ацетилтиохолин иодид	Параоксон - 6,1*10-12 М	[21]
Амперометрический	Pt - электрод	АХЭ/ХО, соиммобил. В ПВС-SbQ	Ацетилтиохолин	Параоксон - 3*10-12 М	[22]
Амперометрический	SPE	АХЭ/ полианилин/ CoФЦ	Ацетилтиохолин	Параоксон - 10-17 М	[23]
Амперометрический	Pt - электрод	ХО/ацетатцеллюлоза БХЭ	Бутирилхолин	ДФФ - 4,5*10-9 М Параоксон - 25*10-9 М Диазинон - 1,8*10-9 М Хлорпирофос - 0,5*10-9 М Карбофуран - 43*10-9 М	[24]
Амперометрический	Планарный электрод	АХЭ/БХЭ	Ацетил-(бутирил)тиохолин	Карбарил - 26*10-9 М	[25]
Потенциометрический	рН - электрод	БХЭ/нитрат целлюлозы	Бутирилхолин	Диазинон - 10-9 М Фозалон - 7*10-10 М Метафос - 5*10-9 М	[26]
Потенциометрический	рН - электрод	АХЭ/БХЭ		Трихлорфорн - 3,9*10-14 М	[27]
Потенциометрический	рН - электрод	АХЭ	Ацетилтиохолин	Параоксон - 3*10-10 М	[28]
Потенциометрический	Стеклоуглеродный электрод	АХЭ	Ацетилтиохолин	Дихлофос - 2*10-10 М	[29]
Потенциометрический	рН - чувств. ион-селективный полевой транзистор (ISFET)	БХЭ/ ПВС	Ацетилтиохолин	Дихлофос - 2*10-10 М	[30]
Потенциометрический	рН - чувств. мембрана	АХЭ/стеклянные бусины	Ацетилтиохолин	Диазинон - 2*10-10 М	[31]

ХО - холиноксидаза, ПДДА - полидиаллилдиметиламмоний хлорид, ПВС - поливиниловый спирт, ПВС-SbQ - ПВС, модифицированный стирилпиридиновыми группами, ДФФ - диизопропилфторфосфат, БСА - бычий сывороточный альбумин,,CoФЦ - фталоцианин кобальта, ПГЭМА - поли(2 -гидроксиэтил)метакрилат.

1.3 Типы биосенсоров для анализа ингибиторов холинэстераз

Ферментативные способы детекции ингибиторов ХЭ основаны на их способности эффективно и необратимо взаимодействовать с активным центром ферментов, которые в свою очередь катализируют ряд реакций (Схема №1).

На схеме изображен набор ферментативных реакций, посредством которых можно определить падение активности ХЭ (степень ингибирования) после инкубации с ингибитором в течение фиксированного времени, а, следовательно, и его концентрацию. Из схемы видно, что ключевыми аналитами могут служить О₂, Н₂О₂, Н⁺, тиохолин.

В настоящее время используются следующие способы детекции аналитического сигнала (концентрации выделяющихся продуктов): потенциометрические, амперометрические, оптические, кондуктометрические и пьезоэлектрические.



Схема №1. Ферментативные реакции, с помощью которых можно определять степень ингибирования холинэстеразы. (АХЭ - ацетилхолинэстераза, I - ингибитор, ОФГ - органофосфатгидролаза, ХО - холиноксидаза, ПХ - пероксидаза хрена, ДТНБ - 5,5'-дитиобис-2-нитробензойная кислота)

Рассмотрим подробно способы определения ингибиторов ХЭ, основанные на измерении концентрации выделяющихся или вступающих в реакцию веществ.

1.3.1 Биосенсоры, основанные на детекции тиохолина

1.3.1.1 Моноферментные холинэстеразные биосенсоры (Реакции 1, 3)

Некоторые ХЭ биосенсоры в качестве субстратов используют неспецифические тиоаналоги: ацетилтиохолин (АТХ) для АХЭ и бутирилтиохолин (БТХ) для БХЭ. Схема их ферментативного гидролиза представлена на Рис 2 (А). Принцип анализа основан на измерении тока электроокисления тиохолина, происходящего при +400 мВ (относительно Ag/AgCl референсного электрода).

А)

Б)

Рис. 2. А) Гидролиз ацетил-(бутирил)тиохолина в присутствии холинэстеразы

Б) Схема электрохимического окисления тиохолина в присутствии медиатора.

Одним из ограничений в применении такой системы является относительно высокий спонтанный гидролиз субстрата в отсутствии фермента.

В качестве медиаторов электроокисления холина (см Рис. 2, Б)) для таких систем используют TCNQ - 7,7,8,8-тетрацианохинодиметан [32, 33, 34] и CoФЦ - фталоцианин кобальта [35, 36] Рис. 2 (Б). В этом случае потенциал рабочего электрода определяется окислительным потенциалом медиатора. Для быстрого переноса электронов, медиаторы обычно иммобилизированны на поверхность рабочего электрода и могут входить как в ферментативный слой, так и быть нанесены отдельно. Композитный слой может также содержать фермент и бифункциональный сшивающий агент (глутаровый альдегид) [33, 37, 38, 39].

В работе [40] для повышения амперометрического отклика на АТХ (БТХ) был предложен новый тип модификаторов электродов. Для этого производные каликс[4]аренов либо салицилальдиминметакрилат физически сорбировали на толстопленочные эпоксиграфитовые электроды, а затем иммобилизовали фермент (АХЭ или БХЭ). В результате, это позволило улучшить характеристики определения субстратов холинэстераз за счет селективного сорбционного накопления тиохолина, а также снизить влияние матрицы за счет уменьшения потенциала измерения сигнала биосенсора.

Преимущества: использование одного фермента ХЭ (не требуется использование ХО) упрощает конструкцию биосенсора, относительно не высокий потенциал детекции ниже (+410мВ).

Недостатки: высокий спонтанный гидролиз АТХ (БТХ).

1.3.1.2 Спектрофотометрическое определение активности холинэстераз (Реакция 2)

Спектрофотометрическое определение ингибиторов холинэстераз обычно проводится с использованием тиоаналогов ацетилхолина и бутирилхолина методом Эллмана [41]. Данный метод основан на спектрофотометрической детекции ферментативного гидролиза тиохолиновых эфиров карбоновых кислот в присутствии ДТНБ (Рис.3). Образующийся в результате гидролиза тиохолин вступает в реакцию тиол - дисульфидного обмена с ДТНБ с образованием окрашенного продукта - желтого 5-тио-2-нитробензоат-иона. Прирост оптической плотности в результате данной реакции измеряется с помощью спектрофотометра при длине волны 412 нм. Описано применение такой методики для спектрофотометрического определения ингибиторов с помощью одновременного нанесения АХЭ и БХЭ на рабочую поверхность [42]. Спектрофотометрическое определение активности холинэстераз нашло широкое применение в медицине. Существует много модификаций этого метода в зависимости от практического приложения. Так, в работе [43] разработаны и описаны методические изменения метода Эллмана.

Рис. 3. Определение активности БХЭ методом Эллмана

Преимущества: быстрый анализ, хорошая воспроизводимость.

Недостатки: недостаточная чувствительность, длительность пробоподготовки, интерференция с биологическими жидкостями (кровь).

1.3.2 Биосенсоры, основанные на детекции Н⁺ (Реакции 5)

Для детекции иона водорода обычно используют потенциометрические методы.

Потенциометрическое измерение АХЭ основано на определении разности потенциалов или рН в ферментативном слое. Изменение рН связано с выделением уксусной кислоты, образованной в результате гидролиза ацетилхолина и, следовательно, пропорционально активности АХЭ (Рис. 4).



Рис. 4. Гидролиз ацетил-(бутирил)холина в присутствии холинэстеразы

Как правило, потенциометрическое определение основано на использовании ионселективных электродов, при этом чаще всего используются pH-чувствительные электроды [44-46] или мембраны [47-48]. Первые ХЭ потенциометрические биосенсоры были основаны на простой физической иммобилизации фермента на поверхность стеклянного рН - электрода. [49,50]. Но чувствительность и стабильность таких методов была довольно низкой: пределы обнаружения фенитротиона и трихлофона составили 21*10^-6М [49] и 5,1*10^-9М [50], соответственно.

Современные сенсоры измеряют изменение рН с помощью рН - чувствительных ион-селективных полевых трансдукторов (ion-selective field-effect transductor, ISFET) [51,52] или светоадресуемых потенциометрических сенсоров (light-addressable potentiometric sensor, LAPS) [53,54]. Такие сенсоры, изготовленные с использованием микроэлектронных технологий, являются более чувствительными, дешевыми и компактными по сравнению со стеклянными электродами. Так, например, в работе [51] описан биосенсор на основе БХЭ, иммобилизированной на поливинилхлоридную мембрану, с использованием ион-селективного полевого трансдуктора. Предел обнаружения дихлофоса для такого электрода составил 2*10^-10М.

Преимущества: быстрый анализ

Недостатки: ограниченный рабочий диапазон измеряемых концентраций ионселективных сенсоров, недостаточная чувствительность, по сравнению с амперометрией.

1.3.3 Биосенсоры, основанные на детекции перекиси водорода (Реакция 8)

Для определения выделяющейся в процессе нескольких ферментативных реакций перекиси водорода используются самые разнообразные конструкции электродов. Один из самых распространенных способов - совместное использование двух ферментов: холинэстеразы и холиноксидазы.

Биферментный амперометрический электрод состоит из двух ферментов: АХЭ (БХЭ) и ХО. Система основана на ферментативном гидролизе АТХ (БТХ) до холина и ацетата (бутирата). Холин, окисляясь кислородом воздуха в присутствии ХО, позволяет легко измерять ток окисления выделяющейся в ходе реакции перекиси водорода, при постоянном потенциале относительно электрода сравнения (Ag/AgCl) (Рис. 5) .

Рис. 5. Гидролиз холина в присутствии холиноксидазы.

Биферментный электрод может быть образован либо посредством cоиммобилизации двух ферментов в одной или разных матрицах на поверхности рабочего электрода [55], либо один фермент иммобилизован, а второй добавлен в раствор [56]. Соиммобилизация двух ферментов обычно позволяет обнаружить определяемый субстрат в значительно меньших концентрациях. Например, за счет соиммобилизации ХЭ и ХО предел детекции по параоксону составляет 3*10^-12M [57], а в случае иммобилизации на электроде только одного из ферментов (ХО) предел детекции значительно возрастает и составляет 5*10^-10М [58]. 1,3* 10^-9M параоксона детектируется при использовании двух матриц, в каждой из которых иммобилизирован фермент: АХЭ - ковалентно присоединена к найлоновой мембране, ХО - ковалентно присоединена с помощью глутарового альдегида к БСА [59]. В работе [60] низкий предел обнаружения параоксона (3*10^-12M) был достигнут за счет соиммобилизации в поливиниловом спирте, содержащем стирилпиридиновые группы. Аналитический отклик формировался в результате детекции H₂O₂ платиновым электродом при потенциале +650мВ относительно Ag/AgCl.

Другим примером создания пероксидчувствительного биосенсора является трехферментная безмедиаторная система, где для детекции перекиси используется пероксидаза хрена [61]. Все три фермента соммобилизованны на поверхности рабочего электрода с использованием глутарового альдегида. Такой биосенсор способен измерять трихлорфон в концентрации 2*10^-13М.

Наиболее распространенными неферментативными датчиками на перекись водорода являются различные амперометрические датчики, модифицированные неорганическими электрохимически активными соединениями (медиаторами). В качестве медиаторов часто используются берлинская лазурь [62], гексоцианоферрат кобальта [63], поли(1,3-фениленлиамин) [64] и диоксид марганца (MnO₂), для которого предел обнаружения перекиси водорода составил 7*10^-8М [65].

Также в последнее время для детекции пероксида водорода стали использовать новые материалы и конструкции электродов. Так, успешное использование планарных электродов, полученных методом трафаретной печати (screen-printed) и многостенных углеродных нанотрубок описано в работах [66,67].

Преимущества: быстрый анализ, хорошая воспроизводимость, высокая чувствительность, возможность миниатюризовать конструкцию биосенсора

Недостатки: высокий потенциал детекции (+650мВ), интерференция с побочными электроактивными веществами, сложность фиксации двух ферментов без потери активности.

1.3.4 Биосенсоры, основанные на детекции фосфорорганических соединений (Реакция 9)

Органофосфатгидролаза (ОФГ) катализирует гидролиз большого числа разнообразных фосфорорганических соединений [68, 69]. Благодаря этому биосенсоры, основанные на ОФГ успешно применяются для создания амперометрических, потенциометрических и оптических датчиков, при этом фермент используется как в очищенном виде, так и в составе живых клеточных культур [70].

Как правило, детекция основана на электрохимическом окислении п-нитрофенола, выделяющемся в результате ферментативного гидролиза п-нитрофенил - замещенных ФОС, таких как параоксон и паратион (Рис. 6).

Рис. 6. Гидролиз параоксона в присутствии ОФГ.

В работе [71] описан амперометрический датчик для анализа фосфорорганических соединений на основе органофосфатгидролазы. Биосенсор состоит из иммобилизированной на поверхность пастового графитового электрода генномодифицированных бактерий Pseudomonas putida JS444, экспрессирующих ОФГ на поверхность электрода. В результате гидролиза параоксон и метилпаратион выделяют п-нитрофенол, который окисляется бактериями до электроактивных интермедиатов: 4-нитрокатехола и 1,2,4-тригидроксибензола. Пределы детекции по параоксону и метилпаратиону для данного сенсора составляют 10^-9М и 2*10^-8М, соответственно.

В работе [72] разработан потенциометрический датчик, основанный на измерении Н⁺, выделяющихся в результате ферментативного гидролиза параоксона и паратиона с помощью ОФГ из бактерий Flavobacterium, иммобилизированных в полиуритановом геле и нанесенных на стеклянный рН-чувствительный электрод. Линейные диапазоны для данных ФОС лежат в пределах от мкМ до мМ.

В статье [73] ОФГ иммобилизировалась на кварцевый электрод и активность фермента измерялась с помощью определения концентрации п-нитрофенола спектроскопическим и световым детектором, за счет изменения интенсивности флуоресценции пленки.

Преимущества: простая конструкция, возможность повторного использования, низкая стоимость сенсора, высокая операционная стабильность

Недостатки: коммерчески недоступный фермент, ограничение в широком применении (для каждого типа ингибитора своя генноинженерная ОФГ).

1.4 Технология «слой - за - слоем» (layer - by - layer, LBL)

В современных технологиях все большее значение приобретает развитие методов создания ультратонких упорядоченных органических пленок. Впервые предложенный Р. Илером в 1966 г. [74], новый метод создания многослойных ультратонких органических пленок, получивший название «самосборки путем чередующейся адсорбции полиионов» или метода «слой - за - слоем» (layer - by - layer, LBL), в начале 1990-х был обнародован Г. Дехером и его сотрудниками [75].

С тех пор метод LBL стал активно развиваться и модифицироваться, но в основном для формирования небелковых структур.

По результатам поиска в базе данных Pubmed (Рис. 7), можно отметить растущий интерес к этой проблеме. Так, было выявлено, что количество статей, посвященных применению метода LBL для создания сенсоров, где в качестве полиионов используются ферменты, увеличивается с каждым годом.

Рис. 7. Количество публикаций в год, посвященных применению метода LBL для создания биосенсоров.

1.4.1 Принцип метода

Технология LBL основана на последовательной адсорбции положительно и отрицательно заряженных полиэлектролитов, что позволяет быстро и технологично «собирать» сложные сенсорные элементы микронного размера с включением в их состав: ферментов, медиаторов, проводящих материалов, наночастиц и проч. [76].

Метод «слой - за - слоем» состоит из следующих стадий: на первом этапе отрицательно (положительно) заряженная подложка помещается в раствор поликатиона (ПК) или полианиона (ПА), который адсорбируется и удерживается на ней вследствие электростатического взаимодействия (Рис. 8). После этого подложку помещают в ванну с дистиллированной водой, промывают для удаления капель раствора и частиц, слабо связанных с поверхностью и высушивают. При этом если ПК(ПА) имеет избыточный заряд относительно заряда подложки, происходит перезарядка границы раздела адсорбированного слоя и раствора. Следующим этапом является адсорбция ПА(ПК) из другого раствора на модифицированной ПК(ПА) подложке. На этом этапе также возможна перезарядка поверхности подложки в том случае, если ПА(ПК) имеет избыточный (по сравнению с зарядом адсорбированного до него слоя) заряд.

Рис. 8. Создание многослойных ультратонких пленок «слой - за - слоем» (LBL).

Для достижения перезарядки поверхности необходима такая концентрация полимера, чтобы при осаждении в силу стерических или иных ограничений (петли, свободные концы) оставались нескомпенсированные заряды с внешней стороны адсорбированного слоя. Кроме того, было показано, что процесс адсорбции полиионов носит двухстадийный характер: сначала происходит закрепление отдельных участков полимера (“заякорение цепи”) и на втором этапе - адсорбция остальных частей цепи, что приводит к появлению свободных петель и концов цепи с некомпенсированными зарядами [76].

Таким образом, на поверхности подложки формируются два разноименно заряженных слоя полиионов. Этот двухстадийный цикл можно повторять далее десятки и сотни раз, пропорционально увеличивая толщину пленки до нужного размера.

1.4.2 Материалы, использующиеся в методе LBL

Одним из основных преимуществ метода «слой - за - слоем» является его универсальность, обусловленная тем, что процесс сорбции зависит, главным образом, от сил притяжения между противоположно заряженными молекулами. Именно поэтому спектр используемых в данной методике материалов очень широк, и кроме полимеров (полиэлектролитов) в конструировании многослойных структур методом LBL используются белки, красители, полинуклеотиды, полупроводниковые наночастицы, углеродные нанотрубки [77] и другие соединения [78].

Наиболее часто при создании тонких пленок методом LBL используются полиэтиленимин (ПЭИ), полидиметилдиаллиаммоний хлорид (ПДДА), полиаллиламин (ПАА), полилизин, хитозан и другие соединения в качестве поликатионов, а также полистиролсульфонат (ПСС), поливинилсульфат, полиакриловая кислота (ПАК), полианетолсульфокислота (ПАСК), декстрансульфат и другие соединения в качестве полианионов. Из природных полиионов можно выделить заряженные полипептиды, полисахариды (гепарин, хитозан, хондроитин, коллаген), конканавалин А, ДНК, полинуклеотиды, и проч., которые широко используются для создания многослойных ультратонких структур при их чередовании со соответствующими полиионами.

В последнее время для создания электродов методом LBL большой популярностью пользуются окисленные мультистенные нанотрубки, содержащие большое количество карбоксильных групп. В водных растворах эти группы обеспечивают отрицательный заряд, что позволяет им взаимодействовать с положительно заряженными полиионами [79-81].

Также при создании пленок методом «слой - за - слоем» в качестве одного из полиионов могут быть использованы молекулы белков. Так, цитохром С, P450, лизоцим, гистоны, миоглобин, пепсин, гемоглобин, лактат дегидрогеназа, различные пероксидазы, бычий сывороточный альбумин, глюкозоксидаза, каталаза, инвертаза и другие белки были успешно использованы для создания наноструктур с заранее заданными свойствами [82].

В качестве подложек для создания ультратонких пленок методом LBL используются самые разные материалы с заряженной поверхностью: стекло, кварц, слюда и т.д. Изначально исследование возможностей метода «слой - за - слоем» проводилось на сравнительно больших, плоских и гладких подложках. Тем не менее, метод LBL может быть использован более широко: самоорганизующиеся пленки также можно создавать и на шероховатых поверхностях или малых, имеющих размер несколько микро- или нанометров, подложках [83]. Так, в настоящее время широко исследуются пленки на поверхностях микросфер и наночастиц, интерес к которым растет благодаря особенностям их поверхностных свойств и разнообразным возможностям применения. На эти носители могут быть адсорбированы функциональные нанокомпозитные пленки, что раскрывает дополнительный спектр возможностей по изучению каталитических межфазных реакций. Ключевой стадией процесса получения пленок на наночастицах является их отделение от раствора полиэлектролита, из которого велась сорбция, центрифугированием или фильтрацией [84].

1.5 Особенности метода LBL и свойства наноструктурированных пленок полиэлектролитов

1.5.1 Электростатические и другие взаимодействия

Необходимыми требованиями для молекулярного конструирования является наличие на поверхности полиэлектролита участков со значительной плотностью зарядов и достаточно большой молекулярный вес, так как для последующего формирования устойчивого слоя необходимо, чтобы после адсорбции на противоположно заряженную поверхность полная компенсация зарядов не наблюдалась.

Исследования показали, что примерно треть зарядов поверхностного слоя связана с предыдущим слоем, а оставшиеся заряды компенсированы противоионами, которые высвобождаются в раствор при нанесении следующего слоя. Также следует отметить, что первый и внешний слои полиионов менее плотные, чем область внутренних слоев. Область проникновения соседних пленок была измерена и составила примерно 1-2 слоя, из чего следует, что физически разделенными сегментами ультратонких пленок являются только первый и третий, а не соседние слои.

Несмотря на то, что основной вклад в формирование мультислоев вносят многоточечные электростатические взаимодействия, гидрофобные взаимодействия между участками полимерной цепи и специфическое связывание, основанное на молекулярном узнавании, также оказывают влияние на образование, стабилизацию и реорганизацию образованных слоев[76].

1.5.2 Ионная сила и рН зависимость

С практической точки зрения является необходимым контроль толщины пленки после адсорбции полиионов. Используя солевые растворы с разной ионной силой можно довольно широко варьировать толщину пленок.

Так, в работе [75] добавление в раствор солей позволило значительно увеличить толщину нанесенного слоя. При этом можно добавлять соли как в один из растворов, так и в оба раствора. Так, для пары ПВС/ПАА было показано, что добавление в раствор ПАА 2 М NaCl дает увеличение толщины слоя от 10.9 до 25A, при этом шероховатость пленки практически не изменяется. Аналогичные результаты были получены для солей одно- и двухвалентных металлов (KCl, LiCl, BaCl₂). При этом состав соли влияния не оказывал.

Также была изучена способность пленок к набуханию. В работе [85] было показано, что пленки, приготовленные из солевых растворов, захватывали воду, как из воздуха, так и из водного окружения, а слои приготовленные в отсутствии дополнительных солей набухают при погружении в солевой раствор. При погружении свежеприготовленных мультислоев (ПСС/ПДДА)_n в солевые растворы с разной ионной силой, наблюдалась значительное уменьшение шероховатости поверхности. Анализируя изображения, полученные с помощью АСМ, было выявлено, что при выдерживании пленок (ПСС/ПДДА) в растворе 1М NaCl в течение 2 часов, наблюдалось сглаживание поверхности на 10 нм [86].

В настоящее время эффект увеличения толщины пленок объясняется тем, что при добавлении солей полиионные цепи в растворе формируют клубки, которые и обуславливают большую толщину нанесенного слоя. Данный результат еще требует объяснения, но сам факт возможности варьирования толщины пленки представляется весьма полезным. Однако следует отметить, что наличие малых примесей солей в растворах (менее 0.1М) практически не влияет на величину толщины слоя. Это означает, что при адсорбции из растворов можно не принимать в расчет образующиеся в данном процессе соли [87].

Плотность заряда адсорбирующейся молекулы полиэлектролита играет ключевую роль в процессе формирования пленки [88]. Было показано, что для достижения насыщения и полной перезарядки поверхности необходимо, чтобы, как минимум, половина мономерных звеньев находилась в ионизированной форме [89]. При формировании пленок из слабых полиэлектролитов плотность заряда молекул можно регулировать путем изменения значения рН раствора, таким образом, контролируя результирующие свойства образующейся структуры. Для пленок, в которых оба компонента являются слабыми полиэлектролитами, рН растворов, из которых ведется адсорбция, влияет на толщину формируемых слоев. В случае, если и поликатион, и полианион ионизованы полностью, происходит формирование тонких пленок. Если один из компонентов ионизирован не полностью, толщина слоев значительно возрастает. Таким образом, меняя значение рН раствора, можно менять толщину пленок в пределах целого порядка [84].

1.5.3 Влияние природы поликатиона на структуру слоев и активность ферментов

Используемые при создании самоорганизующихся пленок полиэлектролиты могут оказывать существенное влияние на структуру образующихся мультислоев. Так, в работе [90] было проведено сравнение структуры слоев (ПАА/Тир) и (ПДДА/Тир) и показано, что в первом случае поверхностная плотность фермента одинакова для всех слоев и составляет (0,47±0,03) мкг/см^-2. В случае ПДДА адсорбция тирозиназы составляет 0,73 мкг/см^-2 для первых четырех слоев и (1,6±0,4) мкг/см^-2 для пятого и последующих слоев. Авторы работы предполагают, что это может быть объяснено тем, что поликатион ПДДА имеет большую плотность заряда и способен удерживать большее количество фермента на поверхности. Такой же эффект гетерогенного распределения полифенол оксидазы с захватом значительного количества воды и ионов, при последовательной адсорбции на ПДДА отмечен в статье [90]. Для системы самоорганизующихся слоев (ПАА/Тирозиназа) в работе [91] была посчитана константа Михаэлиса по пирокатехолу, составившая (0,8±0,1)^.10^-4 М, что существенно меньше K_М, характерной для нативной тирозиназы, (2,2±0,2) ^.10^-4 М [92]. Также, в статье [93] исследовалось влияние типа поликатиона (ПДДА, ПЭИ, поли-п-винилбензилхлоридпиридин, диметиламиноэтилметакрилат, полидиметилэтиламмоний-этилметакрилатбромид, поли-4-винилпиридины, с различной степенью гидрофобности) на активность тирозиназных электродов. Было выяснено, что с увеличением гидрофобности поликатиона активность биосенсора, покрытого пленкой (ПК/Тир), уменьшается, что может быть связано с затруднением контакта субстрата с активным центром фермента из-за наличия длинных углеводородных радикалов в используемом поликатионе.

В статье [94] проводилось сравнение каталитической активности в - галактозидазы при ее адсорбции на поликатион (ПЭИ) и полианион (ПАЗО). Было выяснено, что на поверхность обоих полиионов адсорбируются сравнимые количества фермента, но в случае иммобилизации фермента на поверхность ПАЗО (система (ПЭИ/ПАЗО)₃/в - Gal), наблюдалось снижение ферментативной активности, по сравнению с адсорбцией на ПЭИ (система (ПЭИ/ПАЗО)₃/ПЭИ/в-Gal). Это может быть связано со способностью поликатиона экранировать активный центр в - галактозидазы.

1.5.4 Предварительная модификация поверхности электрода

Необходимость в модификации поверхности перед нанесением слоев полиэлектролитов, связана с необходимостью увеличения количества адсорбирующихся полиионов, а, следовательно, и чувствительности биосенсора в целом.

Так, в работе [95] при создании пероксидазного биосенсора поверхность золотых электродов была предварительно модифицированна 3-меркаптопропионовой кислотой. Далее последовательно наносили полиаллиламин (ПАА) и пероксидазу. Чувствительность и предел детекции данного сенсора по катехолу составили 48,9.10^-3 А^.М^-1 и 7^.10^-7 М, соответственно. Такой же способ предобработки поверхности использовался в работе [96] для конструирования тирозиназного амперометрического биосенсора для определения фенольных соединений в проточных условиях. После осаждения тирозиназы на покрытую 3-меркаптропропионовой кислотой поверхность электрода, проводилась сшивка фермента и кислоты с помощью глутарового альдегида. Авторы отмечают хорошую воспроизводимость полученных электродов. Чувствительность по фенолу составила 13,9•10^-3 А•М^-1·см^-2.

Для разработки биосенсора на холестерин методом LBL были использованы холестеролоксида, полистиролсульфонат (ПСС) и полиэтиленимин (ПЭИ) [97]. Сначала поверхность платины подготавливалась последовательной сорбцией на электроде ПСС и ПЭИ. Затем поочередно наносились слои холестеролоксидазы и ПЭИ до достижения нужной толщины пленки. В статье [94] перед нанесением фермента в - галактозидазы на подложке был также сформирован подслой, состоящий из 5 последовательно адсорбированных слоев (ПЭИ/ПАЗО).

В работе [90] тирозиназа была закреплена на поверхности модифицированного тиольными группами золотого электрода с использованием полиаллиламина в качестве поликатиона. Полученный методом LBL сенсор был использован для детекции различных катехоламинов, являющихся специфическими субстратами тирозиназы.

В работе [92] проводится сопоставление теоретической макрокинетической модели иммобилизованной тирозиназы с экспериментальными данными. Наноструктурированные пленки тирозиназы в данном случае были получены последовательной адсорбцией ПДДА и фермента на поверхности стеклоуглеродного электрода, предварительно модифицированном 4-фенилкарбоксилатными анионными группами. Чувствительность по фенолу для полученных биосенсоров составила 3•10^-3А•М^-1•см^-2, что значительно ниже чувствительности, полученной для этих же электродов по катехолу, составившей 0,46 А•М^-1•см^-2.

В работе [98] в качестве модифицирующего графитовую подложку агента использовался полидиэтиламинофосфазен (ПФ), нерастворимый при рН ? 4. В результате удалось увеличить отклик тирозиназных электродов в 2 раза, а также полностью исключить эффект диссоциации тирозиназы с поверхности электрода при повторном его погружении в раствор поликатиона или фермента.

Также, в качестве одного из вариантов модификации поверхности, в статье [18] использовались окисленные многостенные углеродные нанотрубки, нанесенные на стеклоуглеродный электрод. Далее на отрицательно заряженную поверхность нанотрубок последовательно наносили слои ПДДА и АХЭ. Полученный биосенсор использовался для анализа ингибиторов холинэстераз и предел детекции по параоксону составил 4*10^-13М.

Таким образом, процесс формирования нанопленок полиэлектролитов и факторы, определяющие их структуру и свойства, к настоящему времени освещены достаточно широко. Однако информации, касающийся пленок, сформированных полиэлектролитами и белками, недостаточно. А сенсоры, полученные последовательным нанесением двух различных по свойствам и структуре ферментов, таких как БХЭ и ХО вообще в литературе не описаны.

Кроме того, исследования самоорганизующихся систем полиэлектролитов проводились с использованием различных подложек (слюда, стекло, платина, золото, графит), в то время как процессы образования пленок на оксиде марганца, который используется нами в качестве медиатора, не изучены.

Чувствительное определение ингибиторов холинэстераз осложнено нестабильностью ХЭ, как субъединичных ферментов, в низких концентрациях. Метод «слой - за - слоем» позволяет на необходимой для анализа поверхности получать стабильные молекулярные тонкие пленки холинэстераз, может существенным образом снизить предел детекции как самих ХЭ, так и их ингибиторов.