Двухферментный электрод для анализа ингибиторов холинэстераз на основе наночастиц и нанослоев полиэлектролитов

В этой связи целью данной дипломной работы является оптимизация технологии создания сопряженной системы ферментов ХО и БХЭ на поверхности графитовых электродов методом последовательного нанесения полиэлектролитов (LBL) для создания высокочувствительного амперометрического биосенсора для анализа ингибиторов холинэстераз.

2. Экспериментальная часть

2.1 Материалы

В данной дипломной работе использовались следующие реактивы:

Холиноксидаза (Е.С. 1.1.3.17), 13,5 U/mg из Alcaligenes sp., бутирилхолинэстераза (Е.С. 3.1.1.8) из сыворотки крови лошади, 1390 U/mg, бычий сывороточный альбумин, бутирилхолин хлорид, бутирилтиохолин хлорид, холин хлорид, диизопропилфторфосфат, глутаровый альдегид (50% масс.) (все Sigma), 5,5-дитиобис-4-нитробензойная кислота (Fluka), изопропанол, аммоний хлорид и аммиак водный (26%) (Химмед), соль MnCl₂·4H₂O (Merck), перекись водорода, 30% (Merсk), HEPES, (ICN), KCl, (Fluka), ацетат целлюлозы, ацетилированной на 40% (Sigma), поливиниловый спирт (M_w^ср = 86000) (Acros), любезно предоставлен профессором, зав. лаб. В.И. Лозинским (ИНЭОС РАН), 0,01% (по звен.) полидиэтиламинофосфазен (М_w^ср = 100000 г/моль) был любезно предоставлен профессором В.С. Папковым (ИНЭОС РАН), мультистенные углеродные нанотрубки (М_w = 800000 г/моль, d = 50нм, L<1 мкм, б(COOН) = 2,5% (масс.), любезно предоставленные зав. лаборатории Газовой электрохимии кафедры физической химии С.В. Савиловым, углеродные наностержни (d = 20 - 30 нм, L2 мкм) любезно предоставленные Б.В. Пешневым (МИТХТ). Полидиметилдиаллиламмоний хлорид, 20% (масс.) (M_w = 400000 -500000 г/моль) (Aldrich) и полианитолсульфокислота, были любезно предоставлены профессором кафедры ВМС А.А. Ярославовым.

Все остальные реактивы были марки не ниже ХЧ и использовались без предварительной очистки. Все растворы готовились в деионизованной воде, полученной при помощи системы очистки воды Milli-Q (США).

Амперометрические исследования проводились на потенциостате IPC-compact (Институт физической химии РАН). Спектрофотометрические измерения проводились на спектрофотометре для микропланшетов Anthos ht1, Австрия.

Измерения активности проводили в буфере HEPES (50мМ), KCl (30мМ), рН 7.5. Модификацию графитовых стержней проводили в 0,1М аммонийном буфере, содержащем хлорид аммония и 26% раствор аммиака, рН 9,5.

2.2 Методы

2.2.1 Спектрофотометрическое определение активности бутирилхолинэстеразы

Для определения активности БХЭ в лунки планшета раскапывались следующие растворы:

- 20 мкл свежеприготовленной смеси (1:1 по об.) раствора ДТНБ (2 мг/мл) и БТХ (19 мг/мг) буфере HEPES (pH 7.5)

- 20 мкл раствора БХЭ (4*10^-7М) в буфере HEPES (pH 7.5)

-160 мкл буфера HEPES (pH 7.5)

За начало реакции принималось время добавления аликвоты фермента.

Скорость образования окрашенного продукта определялась спектрофотометрически при длине волны 405 нм в кинетическом режиме.

Исходя из изменения оптической плотности во времени (?OD/мин), активность БХЭ рассчитывали по формуле:

V * dA₄₀₅/min

A_s =

₄₀₅ * v * c * d

где

V - общий объем лунки (0,2 мл)

dA₄₀₅/min - изменение оптической плотности в минуту при 405 нм

₄₀₅ - коэффициент экстинкции 5-тио-2-нитробензоата при 405 нм (13,3 ммоль^-1*cм^-1*мл)

d - оптический путь (0,6 cм)

v - объем аликвоты фермента(0,02 мл)

c - концентрация фермента в образце (мг/мл)

2.2.2 Титрование активных центров бутирилхолинэстеразы

Титрование активных центров БХЭ осуществлялось следующим образом. Препараты БХЭ (10^-7М), ДФФ (10^-6М) в буфере 50 мМ HEPES, содержащим 30 мМ KCl (рН 7,5) раскапывались в 7 пробирок по следующей схеме:

Таблица №7. Схема разведения препаратов для ингибирования.

№	Vбуф, мкл	VI, мкл	VE, мкл
1	900	0	100
2	890	10	100
3	880	20	100
4	860	40	100
5	820	80	100
6	800	100	100
7	700	200	100

Сначала в пробирку, добавлялся нужный объем ингибитора, затем буфер, после чего реакцию ингибирования стартовали добавлением аликвоты фермента. Затем каждые 10 мин. в течение 2 часов из инкубационных растворов отбирались аликвоты и переносились в лунки 96-луночного планшета, содержащие свежеприготовленную смесь БТХ и ДТНБ (см. п.3.2.2.). Прирост оптической плотности измеряли при 405нм в минуту.

Предварительные эксперименты показали, что полное связывание ингибитора с активным центром фермента наблюдается через 1 час. Для того, чтобы рассчитать количество активных центров, была построена зависимость активности фермента от концентрации ингибитора (время инкубации с ферментом 1 час.). Из Рис. 9. следует, что полная потеря активности происходит при инкубации с ингибитором в концентрации 18 нМ. Это означает, что в 0,1 мг/мл препарата БХЭ содержится 18*10^-9М активных центров.

Рис. 9. Зависимость активности фермента от концентрации ингибитора. Условия: БХЭ (0,1мг/мл), ДФФ (5*10^-8 - 10^-9М), буфер HEPES (рН = 7,5).

2.2.3 Формирование пероксидчувствительного слоя

Для приготовления рабочих электродов были использованы графитовые стержни (Sigma) диаметром 3 мм. Формирование слоя MnO₂ на поверхности предварительно отполированного электрода проводилось в 0,1 М аммонийном буфере (рН 9,5), содержащем Mn²⁺ (1мг/мл). Модификация осуществлялась при постоянном потенциале +600 мВ относительно Ag/AgCl электрода в течение 15 мин., затем такой электрод выдерживался 1 час при Т = 60⁰С. Модифицированные электроды хранили при комнатной температуре.

2.2.4 Окисление мультистенных углеродных нанотрубок (МСУНТ) и стержней (УНС)

Для химического модифицирования образец нанотрубок (наностержней) кипятили в концентрированной азотной кислоте в течение 6 часов [80], затем промывали водой до нейтрального значения рН супернатанта. После каждого промывания МСУНТ(УНС) откручивали в центрифуге при 8 тыс. об/мин в течение 15 минут.

На Рис.10 схематично изображен процесс окисления МСУНТ.

Рисунок 10. Реакция окисления МСУНТ.

2.2.5 Титрование карбоксильных групп МСУНТ

Титрование карбоксильных групп проводилось в лаборатории Газовой электрохимии кафедры физической химии в группе С.В. Савилова.

Проводилось по методу обратного кислотно - основного титрования согласно методике [100].

Рассчитанная степень функционализации поверхности МСУНТ карбоксильными группами составила 2,44±0,13% (масс.).

2.2.6 Приготовление ферментных электродов

2.2.6.1 Общая схема приготовления электродов

Для формирования полиэлектролитных нанопленок методом LBL модифицированный диоксидом марганца графитовый стержень помещали на 10 минут в водный или буферный раствор с заданной концентрацией поликатиона, после чего 2 минуты промывали дистиллированной водой (Рис. 10) и сушили на воздухе. Затем электрод с нанесенным на его поверхность поликатионом погружали на 10 минут в раствор отрицательно заряженных объектов (ферменты, наночастицы), после чего снова отмывали водой в течение 2 минут и высушивали. Данная процедура повторялась необходимое для эксперимента количество раз.

Рис. 11. Формирование нанопленок ПК/ПА методом LBL. ПК - поликатион, Е - фермент, окисленные мультистенные нанотрубки (МСУНТ), наностержни (УНС).

2.2.6.2 Моноферментный биосенсор

1. Изготовление холиноксидазных электродов

Для формирования моноферментного электрода ПДДА/ХО методом LBL, в качестве полианиона использовался раствор ХО (рI 4,1), которая при рН 7,5 имеет суммарный отрицательный заряд глобулы, а в качестве поликатиона раствор ПДДА. Для этого стержни, модифицированные диоксидом марганца погружали в 0,5% (масс.) раствор поликатиона в 0,05 М Na-фосфатном буфере, содержащем 0,1 М NaCl (рН 7,0), после чего 1-2 минуты промывали дистиллированной водой. Затем электрод погружали на 10 минут в 5.10^-5 М раствор ХО в буфере 50 мМ HEPES, содержащем 30 мМ KCl (рН 7,5), и промывали водой 1-2 минуты.

2. Предобработка поверхности поливиниловым спиртом.

ПВС - плохо растворимый в воде полимер, поэтому для образования водного раствора необходимы сутки для набухания полимера и следующее за этим нагревание полученной вязкой массы при ?90°С до полного растворения вещества. Стержни, модифицированные диоксидом марганца, помещали на 10 мин в 1% раствор ПВС, отмывали 1-2 мин., после чего помещали под УФ-лампу ( л=365 нм) на 2 часа (расстояние от лампы до электрода 1 см, тип лампы: VL-6.LC) [99]. Далее наносили слои ПДДА и ХО (см. п. 1).

3. Модификация графита полидиэтиламинофосфазеном (ПФ).

Модифицированные графитовые стержни погружались на 10 мин. в раствор ПФ с концентрацией 0,002 М в 0,1 М HCl, рН 2,0, затем промывались водой. Далее электроды на 10 мин. погружали в раствор полианетолсульфокислоты, 0,5% (масс.) в 50 мМ HEPES и 30мМ KCl буфере при рН 3,0. После чего следующие слои ПДДА и ХО наносили, как описано в п.1. из растворов при рН 7,5.

4. Формирование подслоя (ПДДА/ПАСК)₄.

Модифицированные графитовые стержни помещали в раствор ПДДА на 10 мин., промывали, высушивали, затем на 10 мин погружали в раствор полианиона (полианетолсульфокислоты, 0,5 % (масс.) в фосфатном буфере, рН 7,0), и снова промывали и высушивали. Данная процедура повторялась 4 раза, после чего электрод погружался последовательно в растворы поликатиона и холиноксидазы по методике описанной выше.

5. Ковалентная прошивка холиноксидазы глутаровым альдегидом.

Приготовленные холиноксидазные электроды (см. п. 1) погружались в 1% раствор глутарового альдегида в буфере 50 мМ HEPES, содержащем 30 мМ KCl (рН 7,5), выдерживали 1 час, промывали водой 2 минуты и высушивали на воздухе.

6. Нанесение пленки ацетата целлюлозы на холиноксидазные электроды.

На предварительно полученный моноферментный электрод (ПДДА/ХО/ГА), наносили капли (4мкл) раствора ацетата целлюлозы в ацетоне разной концентрации (0,05 мг/мл до 0,01 г/мл) и высушивали на воздухе в течение 15 мин.

7. Нанесение пленки поливинилового спирта на холиноксидазные электроды.

Капли раствора поливинилового спирта в воде (1%) (4мкл) наносили на предварительно полученный холиноксидазный электрод. Затем стержень высушивался под УФ - лампой в течение 2 часов.

8. Использование окисленных препаратов МСУНТ и УНС.

Моноферментные электроды различной структуры, полученные с использованием окисленных мультистенных углеродных нанотрубок и стержней в качестве полианионов, готовились также по стандартной методике, описанной в п.1. Растворы нанотрубок и стержней (1мг/мл) в воде перед использованием озвучивали в ультразвуковой ванне в течение 7 мин.

9. Использование неокисленных препаратов МСУНТ_неОх и стержней УНС_неОх.

Моноферментные электроды различной структуры, полученные с использованием неокисленных мультистенных углеродных нанотрубок и стержней, готовились также по стандартной методике, описанной в п.1. Растворы нанотрубок и стержней (1мг/мл) в воде перед использованием озвучивали в ультразвуковой ванне в течение 7 мин.

2.2.6.3 Биферментный электрод

Для создания биферментных электродов использовались графитовые стержни, предварительно модифицированный диоксидом марганца, 0,5 % раствор ПДДА, растворы ферментов: холиноксидаза (10^-4 - 10^-5 моль/л) и бутирилхолинэстераза (0,4-0,008 мг/мл), 1% раствор глутарового альдегида, бычий сывороточный альбумин (1,6-5 мг/мл). Все электроды, не зависимо от структуры, изготовлялись по методике, аналогичной для моноферментных электродов.

Ковалентная пришивка БХЭ к БСА осуществлялась следующим образом: на полученный холиноксидазный электрод наносился слой ПДДА, затем после отмывки слой БСА (1 мг/мл) (в течение 10 мин.); далее стержень выдерживали 2 часа при комнатной температуре в 12,5% растворе ГА, и затем, после стандартной отмывки, погружали в раствор БХЭ (0,4 мг/мл) на 2 часа также при комнатной температуре.

2.2.7 Измерение электрохимического отклика на холин

Ферментативную активность электродов анализировали в ячейке с перемешиванием в рабочем буфере (50 мМ HEPES с 30 мМ KCl, рН 7,5). Рабочий электрод погружали в электрохимическую ячейку объемом 1 мл, снабженной Ag/AgCl электродом, относительно которого поддерживался заданный потенциал. Все измерения проводили при потенциале +350 мВ относительно Ag/AgCl электрода в режиме реального времени при помощи потенциостата - гальваностата IPC-2000 (производства Института Физической Химии РАН).

Для тестирования электродов использовали стандартные концентрации перекиси водорода (10^-6М), холина (10^-4М) и бутирилхолина (0,2-15)мМ.

3. Результаты и обсуждение

3.1 Стабилизация холиноксидазного биосенсора

В нашей лаборатории, было показано, что на поверхности графитового стержня, покрытого слоем оксида марганца, с помощью метода LBL могут быть сформированы сенсорные электроды на основе ХО. Был проведен скрининг полиэлектролитов и выбраны наиболее оптимальные из них для нанесения слоя фермента. Исследования природы взаимодействия ХО в пленках полиэлектролитов показали, что при прямой адсорбции фермента на электрод, модифицированный оксидом марганца, а также при его нанесении на предварительно осажденный полианион (ПАС) и пленки незаряженных полиэлектролитов отклик электрода на введение в систему холина не наблюдается.

Только ПК способен удерживать активный фермент на поверхности электрода. Полученный холиноксидазный сенсор позволяет достичь исключительно низкого предела обнаружения холина (10^-7М).

В качестве оптимального поликатиона на предварительном этапе работы был выбран полидиметилдиаллиламмоний хлорид (ПДДА):

Рис. 12. Полидиметилдиаллиламмоний хлорид (ПДДА).

На Рис. 13 представлено схематическое изображение холиноксидазного электрода (ПДДА/ХО).



Рис.13. Схема холиноксидазного биосенсора.

Типичный вид аналитического сигнала холиноксидазного электрода при добавлении в ячейку 1*10^-4М холина представлен на Рис. 14. Как видно из графика, электроды быстро реагируют на добавление субстрата: 90% сигнала развивается за 15-20 секунд.

Рис. 14. Типичный вид аналитического сигнала холиноксидазного электрода (ПДДА/ХО). Условия измерения: холин, 1*10^-4М.

Несмотря на то, что холиноксидаза имеет положительно заряженный субстрат (холин), ее адсорбция на поликатион не приводила к ухудшению кинетические параметров по сравнению с ферментом, находящимся в растворе (значения кинетических параметров: на электроде - К_м = (5,1±0,75)*10^-4М, в растворе - (5,3±2,0)*10^-4М). Этому можно дать как минимум два объяснения: во-первых, при адсорбции ХО на ПДДА происходит перезарядка поверхности и, во-вторых, скорее всего при адсорбции фермент образует многослойную структуру.

Изучение операционной стабильности таких электродов показало (Рис. 15), что при последовательных измерениях наблюдается падение амперометрического отклика. Это падение можно охарактеризовать величиной инкремента падения за одно измерение, которая рассчитывалась по тангенсу угла наклона зависимости отклика электрода от номера измерения по формуле:

=

Для системы ПДДА/ХО = -4,1±1,3%.

Рис. 15. Операционная стабильность холиноксидазного биосенсора. Условия измерения: холин, 10^-4М.

Такая величина инкремента падения является достаточно большой и поэтому, данная конструкция электрода не может служить основой формирования двухферментной системы. Таким образом, для создания двухферментного электрода в первую очередь необходимо было сконструировать стабильный и активный холиноксидазный сенсор. Можно выделить следующие причины падения ферментативной активности в пленке в условиях измерения:

- недостаточно прочное удерживание созданной конструкции на поверхности электрода

- нестабильность верхнего слоя фермента.

3.1.1 Формирование устойчивого подслоя

3.1.1.1 Обработка слоя оксида марганца поливиниловым спиртом

В качестве подхода к улучшению эффективности адсорбции полиэлектролитов на графите, модифицированном оксидом марганца, а также увеличения прочности их удерживания на поверхности в литературе описаны различные методы предобработки подложки, предшествующей адсорбции биологически активных веществ методом LBL.

Так одним из подходов является покрытие исследуемой поверхности гидрофильным полимером. В этом случае в качестве подслоя был выбран поливиниловый спирт, который под действием УФ - излучения формирует прочную сплошную пленку [99]. На Рис.16. приведена схема данного сенсора.



Рис. 16. Схема конструкции ПВС/ПДДА/ХО.

Полученная конструкция была охарактеризована с точки зрения операционной стабильности. Инкремент падения составил -6,6±2,1%.

3.1.1.2 Обработка слоя оксида марганца полидиэтиламинофосфазеном

В качестве другого варианта улучшения эффективности адсорбции полиэлектролитов на поверхности графита, а также увеличения прочности их удерживания можно использовать нековалентную его модификацию с помощью полидиэтиламинофосфазена (Рис. 16). Как это было описано для тирозиназы, использование ПФ привело к формированию активных и стабильных слоев фермента [98]. Особенностью этого полимера является то, что, будучи положительно заряженным только при pH ниже 3, он не растворим в водных растворах с более высокими значениями рН [124].

Рис. 17. Полидиэтиламинофосфазен.

Полученные топографические изображения пленок полианиона на поверхности высокоориентированного пиролитического графита, обработанной ПФ, показали, что полианион образует сплошной слой на поверхности полифосфазена. В случае с тиразиназой, такая предобработка поверхности позволила увеличить отклик тирозиназных электродов в 2 раза. Поэтому для стабилизации пленок ХО на поверхности электрода было решено также использовать ПФ.

Так как ПФ заряжен положительно только при рН ниже 3, а нанесение фермента и ПК происходит из буфера, имеющего нейтральное значение рН, было необходимо сформировать дополнительный слой полианиона, заряженный отрицательно при этих значениях рН. Для этого мы использовали ПАСК (Рис. 18).

Рис. 18. Схема конструкции ПФ/ПАСК/ПДДА/ХО.

Для полученной конструкции ПФ/ПАСК/ПДДА/ХО инкремент падения составил -6,7±2,5%.

3.1.1.3 Формирование подслоя (ПДДА/ПАСК)₄

Ранее, в нашей лаборатории методом АСМ было выяснено, что сплошная и стабильная полиэлектролитная пленка формируется только после четырехкратного нанесения слоев ПК и ПА на поверхность графита. Таким образом, еще одним способом предобработки поверхности является формирование пленки (ПДДА/ПАСК)₄ на графите, модифицированном оксидом марганца (Рис. 19).



Рис. 19. Схема конструкции холиноксидазного электрода с подслоем из четырех бислоев ПДДА и ПАСК.

В результате, для полученной конструкции (ПДДА/ПАСК)₄/ПДДА/ХО инкремент падения составил - 4,6±1,9%.

Анализируя полученные в этих экспериментах данные (Таблица №9), можно заключить следующее: адсорбция ХО на поверхность, предварительно модифицированную ПФ, привела к полуторократному увеличению ферментативной активности ХО, в то время как падение отклика в процессе измерений осталось прежним; при формировании подслоя (ПДДА/ПАСК)₄, активность и стабильность не изменились, а предварительное нанесение на оксид марганца ПВС привело к ухудшению обоих параметров.

Таким образом, можно сказать, что изменение условий адсорбции ПК и степени его заполнения поверхности электрода не привело к увеличению операционной стабильности сенсора.

Таблица №9. Сравнение ферментативной активности холиноксидазы при формировании подслоя.

Конструкция	Величина отклика на холин, нА (X±X)	?100%
ПВС/ПДДА/ХО	89±20	-6,6±2,1
ПФ/ПАСК/ПДДА/ХО	882±150	-6,7±2,4
(ПДДА/ПАСК)4/ПДДА/ХО	595±98	-4,6±1,9
ПДДА/ХО	588±70	-4,1±1,3

3.1.2 Использование мультистенных углеродных нанотрубок (МСУНТ) и углеродных наностержней (УНС)

При изучении литературы, нас заинтересовала методика использования мультистенных углеродных нанотрубок для создания биосенсоров.

Мультистенные нанотрубки, модифицированные карбоксильными группами, могут быть использованы в качестве отрицательно заряженного многозарядного объекта для последующей адсорбции на электрод и формирования холиноксидазного электрода с целью увеличить содержание фермента в слоях.

Для исследования влияния МСУНТ и УНС на активность и стабильность были проанализированы и охарактеризованы различные конструкции. Первая конструкция была получена прямой адсорбцией фермента на МСУНТ (Рис. 20, 1)). Во втором случае, ХО наносилась на нанотрубки через слой поликатиона (Рис. 20, 2)). На (Рис. 20, 3)), изображена конструкция, где в качестве отрицательно заряженного объекта были использованы окисленные наностержни. Четвертый тип электрода отличается от второго тем, что входящая в его состав холиноксидаза, для стабилизации ее внутри слоя, была прошита глутаровым альдегидом (Рис. 20, 3)).

1) ПДДА/МСУНТ/ХО 2) ПДДА/МСУНТ/ПДДА/ХО



3) ПДДА/УНС/ПДДА/ХО 4) ПДДА/МСУНТ/ПДДА/ХО/ГА

Рис. 20. Схема конструкций холиноксидазных электродов с использованием окисленных мультистенных углеродных нанотрубок и углеродных наностержней.

Результаты анализа данных конструкций в сравнении с первоначальной конструкцией холиноксидазного электрода представлены в Таблице №10.

Таблице №10. Анализ конструкций холиноксидазного биосенсора с использованием окисленных МУНТ и УНС.

Конструкция	Величина отклика на холин, нА (X±X)	?100%
ПДДА/МСУНТ/ПДДА/ХО	1340±74	-3,0±2,5
ПДДА/МСУНТ/ПДДА/ХО/ГА	862±49	-0,3±0,7
ПДДА/МСУНТ/ХО	880±71	-3,8±1,0
ПДДА/УНС/ПДДА/ХО	1380±95	-2,2±0,9
ПДДА/ХО	588±70	-4,1±1,3

Из Таблицы №10 видно, что использование окисленных МСУНТ позволяет в ~2,5 раза увеличить ферментативную активность ХО в пленках, причем использование УНС приводить к такому же увеличению активности, из чего следует, что адсорбция ХО происходит не во внутренней полости трубок, а на поверхности наночастиц. Прямая адсорбция на нанотрубки также увеличивает активность ХО, что говорит о значительном вкладе гидрофобных взаимодействий при формировании пленок. Также было установлено, что стабилизация ХО глутаровым альдегидом приводит к увеличению операционной стабильности, что связано с образованием дополнительных связей внутри холиноксидазного слоя.

Таким образом, использование окисленных мультистенных углеродных нанотрубок и стержней для формирования холиноксидазного биосенсора, позволяет значительно повысить активность фермента. Операционная стабильность этих конструкций за эксперимент осталась на уровне - 4%. Прошивка ХО глутаровым альдегидом приводит к стабилизации системы.

Также было интересно выяснить способность неокисленных препаратов нанотрубок и наностержней формировать наноструктурированные пленки (Рис. 21).

Рис.21. Схема конструкций холиноксидазных электродов с использованием неокисленных мультистенных углеродных нанотрубок и углеродных наностержней.

Результаты анализа данных конструкций представлены в Таблице №11.

Таблица №11. Анализ конструкций холиноксидазного биосенсора с использованием МУНТ_неОх и УНС_неОх.

Конструкция	Величина отклика на холин, нА (X±X)	?100%
ПДДА/МСУНТнеОх/ПДДА/ХО	618±29	-3,4±1,3
ПДДА/УНСнеОх/ПДДА/ХО	624±38	-4,2±1,2
ПДДА/ХО	588±70	-4,1±1,8

Из Таблицы №11 видно, что неокисленные наностержни и нанотрубки, которые не несут на своей поверхности отрицательных зарядов, не приводят к изменению активности и стабильности сенсора.

3.1.3 Ковалентная прошивка холиноксидазы глутаровым альдегидом

Из предыдущих экспериментов было выявлено, что прошивка ГА привела к заметной стабилизации системы при адсорбции ХО на нанотрубки. Поэтому было решено использовать этот метод для стабилизации более простой конструкции.

Принцип действия основан на взаимодействии альдегидных групп глутарового альдегида с аминогруппами белка, в данном случае с холиноксидазой (Рис. 22).

Рис. 22. Схема ковалентной пришивки холиноксидазы глутаровым альдегидом.

В результате, использование такой методики позволило создать стабильный электрод, практически не меняющий свою активность в процессе анализа (Рис. 23).



Рис.23. Операционная стабильность холиноксидазного биосенсора, прошитого глутаровым альдегидом. Условия измерения: холин 10^-4М.

Сравнительная характеристика стабильности и активности электродов без прошивки и с прошивкой глутаровым альдегидом, а также кинетических параметров ХО, включенной в состав сенсорного покрытия, по сравнению с ферментом в растворе приведена в Таблице №12.

Таблица №12. Анализ конструкции с использованием сшивающего агента.

Конструкция	Кмэфф*10-4, М	Величина отклика на холин, нА (X±X)	?100%
ПДДА/ХО/ГА	5,0±0,4	605±11	-0,1±0,1
ПДДА/ХО	5,1±0,8	588±70	-4,1±1,3
ХО в растворе	5,3±2,0	-	-

Как видно из таблицы обработка слоя ХО глутаровым альдегидом не приводит к уменьшению ферментативной активности в пленке и не влияет на величину эффективной константы Михаэлиса, но значительно улучшает стабильность в процессе измерения.

3.1.4 Увеличение числа слоев

Для исследования возможности наращивания числа слоев, была сконструирована конструкция, схематическое изображение которой представлено на Рис. 25.

Рис. 25. Схематическое изображение электрода с двумя слоями ХО.

Результаты анализа полученной конструкции представлены в Таблице №14.

Таблица №14. Анализ конструкции с двумя слоями холиноксидазы, прошитой глутаровым альдегидом.

Конструкция	Величина отклика на холин, нА (X±X)	?100%
(ПДДА/ХО/ГА)2	882±22	-2,2±3,4
ПДДА/ХО/ГА	605±11	-0,1±0,1

Из данных, приведенных в Таблице №14, следует, что увеличение числа слоев ХО в два раза, приводит лишь к полуторократному увеличению отклика электрода, при этом наблюдается значительное падение стабильности. Такое поведение может быть объяснено многими причинами, рассмотрение которых требует дополнительного исследования и выходит за рамки дипломной работы.

3.2 Стабилизация бутирилхолинэстеразного слоя

Итак, в ходе исследований холиноксидазного слоя были получены высоко активные сенсоры на основе окисленных нанотрубок и наностержней и показано, что обработка внешнего слоя ХО глутаровым альдегидом ведет к значительной стабилизации электродного отклика. За основу формирования двухферментной системы была взята наиболее стабильная и простая конструкция холиноксидазного биосенсора - ПДДА/ХО/ГА.

Были рассмотрены различные варианты нанесения второго фермента и выбран наиболее оптимальный из них. Варианты конструкций представлены на Рис. 26.

1) ПДДА/ХО/ГА/БХЭ 2) ПДДА/ХО, БХЭ/ГА

3) ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ 4) ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ/ГА

Рис. 26. Схема конструкций двухферментного электрода.

Как и прежде, основным критерием отбора явилась средняя величина откликов электродов и инкремент падения за одно измерение.

Таблица №15. Анализ конструкций двухферментного электрода.

Конструкция	Величина отклика на бутирилхолин, нА (X±X)	?100%
ПДДА/ХО/ГА/БХЭ	92±26	-5,5±3,1
ПДДА/ХО, БХЭ/ГА	0	-
ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ	590±85	-2,5±1,2
ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ/ГА	71±40	+15,5±10,6

Чтобы исключить влияние ПДДА на способность БХЭ взаимодействовать с субстратом (БХ тоже имеет положительный заряд), было решено наносить второй фермент непосредственно на слой ХО, стабилизированной ГА (Рис. 26. 1)). Однако полученная таким способом конструкция, является как нестабильной, так и не очень активной (Таблица №15).

При совместной адсорбции БХЭ и ХО на поликатион с последующей прошивкой ГА (Рис. 26. 2)), отклика на добавление субстрата не наблюдается.

При адсорбции БХЭ на поликатион (Рис. 26. 3)) для создания двухферментной конструкции, мы получили очень активный электрод, инкремент падения которого составил -2,5%. Но при попытке дополнительно стабилизировать систему за счет прошивки БХЭ глутаровым альдегидом (Рис. 26. 3)), наблюдался значительный спад отклика на бутирилхолин, что, скорее всего, связано с падением активности фермента еще на стадии обработки ГА.

Результаты проведенных экспериментов представлены в Таблице №15.

На основании полученных данных была выбрана следующая конструкция - ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ.

Следующим этапом работы была оптимизация содержания БХЭ в пленке. Для этого была исследована зависимость ферментативной активности от концентрации БХЭ в растворе, из которого формировался слой (Рис. 27).

Рис. 27. Зависимость ферментативной активности двухферментного электрода (ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ) от концентрации БХЭ в растворе. Условия измерения: бутирилхолин,10^-3М.

Результаты анализа конструкции ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ с разными количествами БХЭ в пленке представлены в Таблице №16.

Таблица №16. Анализ конструкции ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ при разных концентрациях бутирилхолинэстеразы.

Концентрация БХЭ *10-7, М	Величина отклика на бутирилхолин, нА (X±X)	?100%
10	590±85	-2,5±1,4
5	471±40	-0,2±0,1
2	210±25	-5,9±2,1
1	99±20	-3,5±1,8
0,2	30±5	-0,7±0,2

Далее, для каждой концентрации БХЭ было изучено ингибирование диизопропилфторфосфатом в концентрации 10^-7М (Рис. 28).

Рис. 28. Зависимость степени ингибирования от концентрации БХЭ в растворе. Условия измерения: бутирилхолин, 10^-3М, ДФФ, 10^-7М.

Из графика видно, что чем больше концентрация фермента в растворе из которого производится адсорбция, тем хуже идет ингибирование. Это может быть связано с тем, что с увеличением содержания фермента в пленке, проникновение ингибитора к активным центрам молекул БХЭ затрудняется.

Таким образом, для последующих экспериментов была выбрана такая концентрация БХЭ (2*10^-8М), для которой наблюдалось максимальное ингибирование (74%) и как следует из Таблицы №16 одно из минимальных значений инкремента падения (0,7%).

Для определения кинетических параметров БХЭ, иммобилизованной на электрод, была исследована зависимость ферментативной активности от концентрации бутирилхолина в диапазоне концентраций от 2*10^-4 до 1,5*10^-2М (Рис. 29).



Рис. 29. Зависимость активности бутирилхолинэстеразы от концентрации бутирилхолина в системе ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ. Условия: БХЭ, 2*10^-8М, БХ, (0,2-15)мМ.

В результате, полученное значение эффективной константы Михаэлиса БХЭ в пленке составило 3,5 мМ, что в 17 раз больше, чем в растворе (по данным, полученным в нашей лаборатории). На основании этих данных можно сделать вывод о том, что в отличие от ХО, при адсорбции БХЭ на поликатион, анионный сайт фермента предположительно обращен к положительно заряженным группам, что может создавать дополнительные препятствия при связывании субстрата.

С целью исключить отрицательное влияние поликатиона при адсорбции БХЭ, было решено ввести в систему бычий сывороточный альбумин, который при рН 7,5 имеет суммарный отрицательный заряд (Рис. 30).



1) ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ, БСА 2) ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БСА/ГА/БХЭ

Рис. 30. Схема двухферментного электрода с использованием бычьего сывороточного альбумина.

Результаты анализа представлены в Таблице №17.

Таблица №17. Анализ конструкций двухферментного электрода с включением бычьего сывороточного альбумина.

Конструкция	Величина отклика на бутирилхолин, нА (X±X)	?100%
ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ, БСА (1,6мг/мл)	191±15	-7,6±3,2
ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ, БСА (5мг/мл)	199±43	-8,4±5,1
ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БСА/ГА/БХЭ	26±3	-0,6±0,4
ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ	590±85	-2,5±1,4

В первом случае (Рис. 30, 1)), когда БХЭ (10^-6М) наносилась на электрод в смеси с БСА в разных концентрациях (1,6мг/мл, 5мг/мл), наблюдалось заметное снижение активности БХЭ (более чем в 3 раза). Вероятно, это связано с тем, что при совместном нанесении на ПК перезарядка поверхности происходит преимущественно за счет БСА, который присутствует в большом избытке.

Во втором случае, БСА после адсорбции на поликатион, обрабатывался избытком ГА для возможности последующей ковалентной пришивки БХЭ (Рис. 30, 2)). В результате активность БХЭ также значительно снижалась.

В Таблице №18 представлены кинетические параметры БХЭ в составе данных конструкций.

Таблица №18. Кинетические параметры бутирилхолинэстеразы в пленках.

Конструкция	Кмэфф., мМ
ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ, БСА (1,6мг/мл)	1,1±0,2
ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ, БСА (5мг/мл)	1,4±0,7
ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БСА/ГА/БХЭ	2,2±0,6
ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ	3,5±0,3

Таким образом, исходя из данных суммированных в Таблице №18, при добавлении в систему бычьего сывороточного альбумина, приводит к понижению эффективных констант Михаэлиса в 1,5 - 3 раза.

3.3 Ингибирование ДФФ

В ходе оптимизации бутирилхолинэстеразного сенсора, для проведения ингибиторного анализа нами были выделены две наиболее стабильных конструкции - ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ и ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БСА/ГА/БХЭ, инкремент падения которых за 1 измерение составляет < 1%.

В первую очередь необходимо было изучить кинетическую зависимость взаимодействия необратимого ингибитора ДФФ с активными центрами БХЭ, для того чтобы оценить время ингибирования для последующих экспериментов. (Рис. 31).



Рис. 31. Кинетическая зависимость ингибирования конструкции ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ. Условия: ДФФ, 20 нМ.

Как видно из графика, уже через 20 мин. наблюдается 60%-ное падение активности, а полное связывание ДФФ с активным центром фермента происходит через 50 - 60 мин. Для второй конструкции кинетика ингибирования аналогичная.

Изучение концентрационной зависимости степени ингибирования сенсорного электрода ДФФ проводилось в условиях 20 мин. инкубации ингибитора с ферментом. В этом случае реализуется режим псевдо - первого порядка, когда расходом ингибитора можно пренебречь ([I]_t~[I]₀). В таком случае для схемы:

k_ин

Е + I > EI, (1)

Кинетическое уравнение записывается в виде:

- = k*[E]_t*[I]₀ (2)

Решение уравнения (2) при постоянной температуре можно записать в виде:

ln([E]_t/[E]₀) = ln(A_i/A₀) = - k_ин*[I]₀, (3)

где А₀ - начальная активность фермента, А_t - активность фермента, измеряемая после инкубации фермента с ингибитором в течение фиксированного времени t, k=k_ин*t.

Полученные зависимости представлены на Рис. 32, 33. Время инкубации электродов различной конструкции в растворе ДФФ составляло 20 мин.

Рис. 32. Концентрационная зависимость ингибирования для конструкции ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ. Условия измерения: С(ДФФ) = (1-10) *10^-8М, время инкубации 20 мин.



Рис. 33. Концентрационная зависимость ингибирования для конструкции ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БСА/ГА/БХЭ. Условия измерения: С(ДФФ) = (1-10) *10^-8М, время инкубации 20 мин.

Рассчитанные коэффициенты ингибирования и пределы детекции ДФФ при 10%-ном ингибировании представлены в Таблице №19 (см. уравнение (3)).

Таблица №19. Коэффициенты ингибирования и пределы детекции ДФФ.

Конструкция	Kин., М-1	Предел детекции, нМ (10% ингиб.)
ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БХЭ	-0,068±0,014	15
ПДДА/ХО/ГА/ПДДА/БСА/ГА/БХЭ	-0,0512±0,008	20

Из Таблицы видно, что коэффициенты чувствительности и пределы детекции обеих конструкций сравнимы и составляют 15-20 нМ и могут быть значительно снижены при увеличении инкубационного периода до 1 часа.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что для получения стабильных и активных сенсорных элементов на основе холиноксидазы с использованием метода «слой-за-слоем» необходима стабилизация внешнего слоя фермента за счет обработки глутаровым альдегидом.

2. Использование окисленных углеродных нанотрубок и наностержней позволяет в 2,5 раза увеличить активность холиноксидазных электродов.

3. На основе метода «слой-за-слоем» разработаны способы получения стабильных биферментных электродов, содержащих холиноксидазу и бутирилхолинэстеразу.

4. Определенные пределы обнаружения диизопропилфторфосфата с использованием разработанных электродов составили 15-20 нМ.

Список литературы

1. Muller T.C., Batista J., Rocha T., Morsch V.M., Neis R.T., Schetinger M.R.C., Antidepressants inhibit human acetlcholinesterase and butyrylcholinesterase activity, Boichimica et Biophisica Acta, 2002, v. 1587, p. 92-98.

2. Соколовская Л.Г., Сиголаева Л.В., Еременко А.В., Курочкин И.Н. и др., Семейство биосенсорных анализаторов для оценки “эстеразного статуса” организма, 2002.

3. Whittaker M., Cholinesterase, 1986, p. 132.

4. Bajgar J., Laboratory diagnosis of organophosphates/nerve agent poisoning, Klin. Biochem. Metab., 2005, v. 13, p. 40-47.

5. Jaffrezic-Renault N., New trends in biosensors for organophosphorus pesticides, sensors, 2001, v. 1, p. 60-74.

6. Miller D.B., Neurotoxicity of the pesticidal carbamates, Neurobehavior. Toxicol. And Teratol., 1982, v. 4, p. 779-787.

7. Palchetti M., Cagnini A., Del Carlo M., Coppi C., Mascini M., Turner A.P.F, Determination of anticholinesterase pesticides in real samples using a disposable biosensor, Analyt.Chim.Acta, 1997, v. 337, p. 315-321Jenkins A.L., U O.M., Murray G.M., Polymer-based lanthanide luminescent sensor for detection of the hydrolysis product of the nerve agent soman in water, Anal Chem., 1999, v. 153, p. 73-378.

8. Sharma V.K., Aulakh J.S., Malik A.K. Fourth derivative spectrophotometric determination of fungicide thiram (tetramethyldithiocarbamate) using sodium molybdate and its application, Talanta, 2005, v. 65, p. 375-379.

9. Bhand S., Surugiu I., Dzgoev A., Ramanathan K., Sundaram P.V., Danielsson B. Immuno-arrays for multianalyte analysis of chlorotriazines, Talanta, 2005, v. 65, p. 331-336.

10. Hernandez F., Sancho J.V., Pozo O.J., An estimation of the exposure to organophosphorus pesticides through the simultaneous determination of their main metabolites in urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Analyt. Technol. Biomed., 2004, v.5, p. 229-39.

11. Berijani S., Assadi Y., Anbia M., Milani Hosseini M.R., Aghaee E., Dispersive liquid-liquid microextraction combined with gas chromatography-flame photometric detection. Very simple, rapid and sensitive method for the determination of organophosphorus pesticides in water, J. Chromatogr. A., 2006, v.1, p. 1-9.

12. Kampioti A.A., Borba da Cunha A.C., Lopez de Alda M., Barcelo D., Fully automated multianalyte determination of different classes of pesticides, at picogram per liter levels in water, by on-line solid-phase extraction-liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry, Anal. Bioanal. Chem., 2005, v. 382, p. 1815-25.

13. Lee J.K., Ahn K.C., Stoutamire D.W., Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of the organophosphorus insecticide acephate, J. Agric. Food Chem., 2003, v. 51, p. 3695-703.

14. Yang K.-L., Cadwell K., Abbott N.L., Use self-assembled monolayers, metal ions and smectic liquid crystals to detect organophosphonates, Sensors and Actuators , 2005, v. 104, p. 50-56.

15. Дзядевич С.В., Солдаткин А.П., Шульга А.А., Стриха В.И. и Ельская А.В., Кондуктометрический биосенсор для определения фосфорорганических пестицидов, Ж. Анал. Химии, 1994, v. 49, p. 874-878.

16. Bucur B., Danet A., Marty J.-L., Versatile method of cholinesterase immobilization via affinity bonds using Concanavalin A applied to the construction of screen-printed biosensor, Biosens. Bioelectron., 2004, v. 20, p. 217-225.

17. Liu G., Lin Y., Biosensor based on self-assembling acetylcholinesterase on carbon nanotubes for flow injection/amperometric detection of organophosphate pesticides and nerve agents, Anal. Chem., 2006, v. 78, p. 835-43.

18. Bhand S., Surugiu I., Dzgoev A., Ramanathan K., Sundaram P.V., Danielsson B. Immuno-arrays for multianalyte analysis of chlorotriazines, Talanta, 2005, v. 65, p. 331-336.

19. Kok F., Hasirci V., Determination of binary pesticide mixtures by an acethylcholinesterase-choline oxidase biosensor, Biosens. Bioelectron., 2004, v. 19, p. 661-665.

20. Pogachnik L., Determination of organophosphate and carbamate pesticides in fruit and drinking water by a biosensor with phototermal detection, School of environmental Sciences, 1998.

21. Mionetto N., Rouillon R., Marty J.-L., Inhibition of acetylcholinesterase by organophosphorus and carbamate compounds. Studies on Free and immobilised enzymes. Z. Wasser-Abwasser-Forch, 1992, v. 25, p. 171-174.

22. Gulla K.C., Gouda M.D., Thakur M.S., Karanth N.G. Reactivation of immobilized cholinesterase in an amperometric biosensor for organophosphorus pesticide, Biochim. Biophys. Acta, 2002, v. 1597, p. 133-139.

23. Еременко А.В., Курочкин И.Н., Сиголаева Л. В. и др., Автоматический проточно-инжекционный экспресс-анализатор фосфорорганических соединений и других ингибиторов холинэстераз, Химическая и биологическая безопасность, 2004, v. 3-4, p. 26-35.

24. Hart A.L., Collier W.A., Janssen D., The response of screen-printed enzyme electrodes containing cholinesterases to organo-phosphates in solution and from commercial formulations, Biosensors & Bioelectronics, 1997, v. 12, p. 645-65.

25. Будников Г.К., Евтюгин Г.А., Экспресс-тестовые методы определения ингибиторов гидролитических ферментов с помощью электрохимических биосенсоров, Ж. Рос. Хим., 2001, v. 4, p. 86-94.

26. Kulys J., Scmid R. Bienzyme sensors based on chemically modified electrodes, Biosensors & Bioelectronics, 1991, v. 6, p. 43-48.

27. Andreescu S., Marty Jean-Louis, Twenty years research in cholinesterase biosensors: From basic research to practical applications, Biomolecular Engineering, 2006, v. 23, p. 1-15.

28. Tran-Minh C., Pandey P.C., Kumaran S., Studies on acetylcholine sensor and its analytical application based on the inhibition of cholinesterase, Biosens. Bioelectron., 1990, v. 5, p. 461-47.

29. Ivnitskii D.M., Rishpon J., A potentiometric biosensor for pesticides based on the thiocholine hexacyanoferrate (III) reaction, Biosens. Bioelectron., 1994, v.9, p. 569-575.

30. Imato T., Ishibashi N., Potentiometric butyrylcholine sensor for organophosphate pesticides. Biosens. Bioelectron., 1995, v. 10, p. 435-441.

31. Lee H.S., Kim Y.A., Chao Y.A., Lee Y.T., Oxidation of organophosphorus pesticides for the sensitive detection by a cholinesterase-based biosensor, Chemosphere, 2002, v. 4, p. 6571-576.

32. Gogol E.V., Evtugyn G.A., Marty J.-L., Budnikov H.C., Winter V.G., Amperometric biosensors based on nafion coated screen-printed electrodes for the determination of cholinesterase inhibitors, Talanta, 2000, v. 53, p. 379-389.

33. Montesinos T., Perez-Munguia S., Valdez F., Marty J.-L., Disposable cholinesterase biosensor for the detection of pesticides in water miscible organic solvents, Analyt. Chim. Acta, 2001, v. 431, p. 231-237.

34. Albareda-Sirvent M., Merkoci A., Alegret S., Thick-film biosensors for pesticides produced by screen-printing of graphite-epoxy composite and biocomposite pastes, Sensors & Actuators B, 2001, v. 79, p. 48-57.

35. Arkhypova V.N., Dzyadevych S.V., Soldatkin A.P., El`skaya A.V., Jaffrezic-Renault N., Jaffrezic H., Martelet C., Multibiosensor based on enzyme inhibition analysis for determination of different toxic substances, Talanta, 2001, v. 55, p. 919-927.

36. Lee H.-S., Kim Y.A., Cho Y.A., Lee Y.T., Oxidation of organophosphorus pesticides for the sensitive detection by a cholinesterase-based biosensor, Chemosphere, 2002, v. 46, p. 571-576.

37. Schulze H., Schmid R.D., Bachmann T.T., Rapid detection of neurotoxic insecticides in food using disposable acetylcholinesterase-biosensors and simple solvent extraction, Anal. Bioanal. Chem., 2002, v. 372, p. 268-272.

38. Vilatte F., Schulze H., Schmid R.D., Bachmann T.T., A disposable acetylcholinesterase-based electrode biosensor to detect anatoxin-a(s) in water, Anal. Bioanal. Chem., 2002, v. 372, p. 322-326.

39. Ivanov A.N., Lukachova L.V., Evtugyn G.A., Karyakina E.E., Kiseleva S.G., Budnikov H.C., Orlov A.V., Karpacheva G.P., Karyakin A.A., Polyaniline-modified cholinesterase sensor for pesticide determination, Bioelectrochemistry, 2002, v. 55, p. 75-77.

40. Иванов А.Н., Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук, 2002.

41. Ellman G.L. et al., A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity, Biochemical Pharmacology, 1961, v. 7, p. 88-9.5

42. Nunes G.S., Barcelo D., Grabaric B.S., Diaz-Cruz J.M., Ribeiro M.L., Evaluation of a highly sensitive amperometric biosensor with low cholinesterase charge immobilized on a chemically modified carbon paste electrode for trace determination of carbamates in fruit, vegetable and water samples, Analyt.Chim.Acta, 1999, v. 399, p. 37-49.

43. Worek F., Mast U., Kiderlen D., Diepold C., Eyer P., Improved determination of acetylcholinesterase activity in human whole blood, Clin. Chim. Acta, 1999, 288, p. 73-90.

44. Beattle P.D., Infelta P.P., Glrault H.H., Determination of butyrylcholinesterase inhibition using ion transfer across the interface between two immiscible liquids, Anal. Chem., 1994, v. 66, p. 52-57.

45. La Rosa С., Pariente F., Hernandez L., Lorenzo E., Determination of organophosphorus and carbamic pesticides with an acetylcholinesterase amperometric biosensor using 4-aminofenyl acetate as substrate, Analyt. Chim. Acta, 1994, v. 295, p. 273-282.

46. Palchetti M., Cagnini A., Del Carlo M., Coppi C., Mascini M., Turner A.P.F., Determination of anticholinesterase pesticides in real samples using a disposable biosensor, Analyt. Chim. Acta, 1997, v. 337, p. 315-321.

47. Nunes G.S., Skladal P., Yamanaka H., Barcelo D., Determination of carbamate residues in crop samples by cholinesterase-based biosensors and chromatographic techniques, Analyt.Chim.Acta, 1998, v. 362, p. 59-68.

48. Doretti L., Gattolin P., Burla A., Ferrara D., Lora S., Palma G., Covalently immobilized choline oxidase and cholinesterases on a methcrylate copolymer for disposable membrane biosensors, Appl. Biochem. Biotechnol., 1998, v. 74, p. 1-12.

49. Nunes G.S., Barcelo D., Grabaric B.S., Diaz-Cruz J.M., Ribeiro M.L. Evaluation of a highly sensitive amperometric biosensor with low cholinesterase charge immobilized on a chemically modified carbon paste electrode for trace determination of carbamates in fruit, vegetable and water samples, Analyt. Chim. Acta, 1999, v. 399, p. 37-49.

50. Doretti L., Ferrara D., Lora S., Palma G., Amperometric biosensor involving covalent immobilization of choline oxidase and butyrylcholinesterase on a methacrylate-vinylene carbonate co-polymer, Biotechnol. Appl. Biochem., 1999, v. 29, p. 67-72.

51. Ivanov A.N., Evtugyn G.A., Gyurcsanyi R.E., Toth K., Budnikov H.C., Comparative investigation of electrochemical cholinesterase biosensors for pesticide determination, Analyt.Chim.Acta, 2000, v. 404, p. 55-65.