Химическая модификация амино- и полиаминокислот гетероциклами

Актуальность темы. Одним из перспективных направлений развития органической химии в XXI веке становится разработка и возрастающее применение так называемых "разумных" молекулярных материалов, реверсивно реагирующих на слабые изменения микросреды - температурные, механические, рН, излучение различных видов и другие. Синтетические полипептиды (ППТ) и полиаминокислоты (ПАК) как модели природных белковых структур могут рассматриваться в качестве предшественников биомиметических "разумных" материалов.

Химическая модификация ПАК/ППТ различными функциональными соединениями (хромофорами), в частности: люминофорами, фотохромами, красителями, биологически активными веществами и др., способность указанных полимеров существовать в различных конформациях (клубок, б-спираль, в-структура) в зависимости от условий, возможность образовывать супрамолекулярные комплексы и ансамбли за счет различного типа нековалентных взаимодействий, полифункциональность - позволяют создавать на их основе молекулярные / наноразмерные материалы.

Управляемая структурная организация/ реорганизация синтетических полипептидов и полиаминокислот в сочетании с иммобилизованными фрагментами дополнительно обладающими электро-, фото- или ионной проводимостью, люминесценцией и др., приводит к получению разумных/адаптивных биоинспирированных полимерных материалов для молекулярной и биомолекулярной электроники, молекулярных электронных устройств с оптической сенсорикой, фотомодулирующих систем, систем оптической записи и хранения информации, голографических сред, средств доставки лекарственных препаратов и т.д.

Целью настоящего исследования явилась: разработка методологии синтеза модифицированных различными гетероциклами модельных аминокислот, пептидов и полиаминокислот (все б-аминокислоты в L конфигурации); идентификация синтезированных соединений; изучение зависимостей свойств от состава, строения, природы и местоположения гетероциклических структур в макромолекуле.

В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи:

в зависимости от природы исходных соединений выбрать подходящие методы органического и полимерного синтеза, а также определенные защитные группировки для функциональных групп реагентов; обозначить ограничения и / или преимущества того или иного метода с применением прогнозирования конечных продуктов; унифицировать химические реакции для повышения выхода целевых соединений и упрощения многостадийного синтеза;

изучить строение образующихся модифицированных ПАК/ППТ и выявить условия образования супрамолекулярных ансамблей синтезированных соединений в виде самособирающихся систем и многослойных пленок типа Ленгмюра-Блоджетт;

исследовать функционирование модифицированных ПАК и ППТ в качестве молекулярных ("разумных") материалов нового поколения;

выработать общую методологию и концепцию целевого синтеза биомиметиков на основе химически модифицированных ПАК и ППТ.

Введение гетероциклов в состав ППТ и ПАК осуществлялось взаимодействием концевых или боковых групп модифицируемых аминокислот или полимеризацией N-карбоксиангидридов аминокислот с использованием в качестве активаторов функциональных групп гетероциклов.

Научная новизна работы:

Разработаны пути синтезов коротких пептидов, где в качестве замещающей аминокислоты был применен L-5-гидрокситриптофан, а также олиготриптофанов и олигоаланинов, содержащих триптамины (Trp). Впервые синтезирован поли-5-гидрокситриптофан (5-НОТry), при этом установлено влияние инициатора полимеризации N-карбоксиангидрида, в зависимости от природы которого можно целенаправленно получить циклические или линейные олигомеры 5_НОТry, синтезированы сополимеры L-?-глутаминовой кислоты и L-5-НОТry с различными соотношениями исходных аминокислот.

Разработаны пути синтеза ПАК при модификации их различными красителями, фотохромами, люминофорами, краун-эфирами. Максимальные степени введения хромофоров в боковые цепи ПАК методами дициклогексил-карбодиимидным (ДЦГК) и активированных эфиров (АЭ) можно прогнозировать при помощи квантово-химического анализа и компьютерного моделирования. Показана возможность получения структур "голова-хвост" N-карбоксиангидридным методом (NКА) при этом степень полимеризации n может соответствовать соотношению мономер: инициатор в пределах от 5 до 11.

Получены органо-неорганические гибриды на основе олигомерных циклофосфазенов и производных аминокислот. Рассмотрены преимущества и ограничения реакций аминолиза и алкоголиза циклотрифосфазенов триптаминами. Показано, что в случае аминолиза гексахлорциклотрифосфазена можно выделить циклотрифосфазены с различной степенью замещения, кроме пента, при алкоголизе максимально замещенным является тризамещенный циклофосфазен.

Осуществлен синтез полиаминокислотных производных циклотри - и циклотетрафосфазенов. Установлена возможность прямой реакции раскрытия N-карбоксиангидридов аминокислот аминозамещенными циклофосфазенами, при этом получены разветвленные (дендроноподобные) олигоаминокислотные производные циклофосфазенов.

Для всех полиаминокислотных производных различных гетероциклов показана их способность к образованию супрамолекулярных ансамблей, включая мультислойные пленки Лэнгмюра-Блоджетт. Впервые лэнгмюровские слои получены на структурах "голова-хвост", где в качестве ПАВ применены олигоаминокислоты, а в качестве "головы" - хромофоры.

Проведено комплексное исследование физико-химических свойств модифицированных ПАК, их супрамолекулярных ансамблей под действием температуры, УФ и лазерного облучения, электрического тока. Показано, что ультратонкие пленки модифицированных ПАК/ППТ проявляют свойства “разумных" молекулярных материалов, т.е. могут реверсивно изменять свои свойства за счет внутренних кооперативных взаимодействий.

Ряд производных гетероциклов обладают выраженной биологической активностью ? противоопухолевой, нейро - и радиозащитной при низкой токсичности в тестах in vivo.

Практическое значение. Результаты работы являются перспективными для их использования в биомедицине и молекулярной электронике. Противоопухолевая активность ряда полученных триптаминоциклофосфазенов (в опытах in vitro и in vivo) при сравнительно низкой токсичности представляет интерес для применения их в практических целях, учитывая возможность введения соединений как парентерально, так и перорально (пента-этиленимино-5-мектокситриптаминциклотрифосфазен). Короткие пептиды, содержащие 5_гидрокситриптофан, проявляют нейроактивность (эффект возбуждения). Некоторые 5_метокситриптаминсодержащие олиго-аминокислоты проявляют радиопротекторные свойства с пролонгированным действием (амид 5_метокситриптамина и пентааланина). Способность модифицированных ПАК к образованию мультислойных структур делает их перспективными молекулярными материалами. Визуальные изменения окрашивания под действием внешних факторов: температуры (карбоцианиновые и спиропирановые), электрического тока (карбоцианиновые и акридиновые производные), УФ-облучения (спиропирановые и карбоцианиновые), позволяют рассматривать полученные соединения как исходные при конструировании пленочных молекулярных сенсоров. Зависимость люминесценции (флуоресценильные производные полиглутаминовой кислоты) от изменения рН среды, сохранение сорбционного эффекта ПАК краун-эфиров в растворах, являются свойствами, полезными для формирования молекулярных материалов с управляемыми сенсорными свойствами. Разветвленные ПАК структуры с центральными циклическими фосфазеновыми скелетами можно рассматривать как универсальные матрицы для иммобилизации: люминесцентных маркеров, биоактивных фрагментов, ферментов. Они могут быть применены как средства биодиагностики, переносчики лекарственных средств, нанобиокатализаторы и др.

Работа выполнялась в рамках следующих Программ и проектов: Программа Мин вуза РФ "Новые лекарственные препараты" (1997), Программа Госкомвуза РФ "Конверсия и высокие технологии" (1997-1999), Единый заказ-наряд Госкомвуза РФ (1999) и Минобрнауки РФ (2005), Федеральная целевая НТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского значения". Приоритетное направление "Новые материалы и химические продукты" (1999-2001); гранты РФФИ: №00-03-125; №01-03-32652; № 03-03-33157; Программы Минобр РФ "Химия и химические технологии" (1999), "Новые материалы" (2000-2001), Программа Госкомвуза РФ "Международное научное сотрудничество и экспортные технологии", Подпрограмма "ОММЭЛ - высокотехнологичные органические материалы для молекулярной электроники" (1995-2000), Программа Минобр РФ Международное Научно-техническое сотрудничество "Создание региональной сети международного сотрудничества Российских Университетов по теме - Молекулярные материалы и нанотехнологии" (2001-2004), Федеральная целевая Программа "Интеграция", проекты А0136"ОУНЦ - Супрамолекулярная химия для высоких технологий" (1999-2002); Б025 "Супрамолекулярная химия и высокие технологии для получения новых материалов" (2003-2004), П0059 Международное научное сотрудничество "Мультифункциональные адаптивные супрамолекулярные системы и материалы" (2003-2004), Проект Минобрнауки РФ "Международное научное сотрудничество по теме "Разумные органические молекулярные материалы" (2005), Проект Минобрнауки РФ "Развитие совместных научных и научно-образовательных программ и проектов с зарубежными партнерами" по теме "Международное университетское объединение Интелбиомемс - Интеллектуальные Биомиметические Системы" №5118 (2006-2007), Программа Минобр РФ "Ведущие научно-педагогические коллективы" (2003-2004), Проект Минобрнауки РФ "Проведение фундаментальных исследований в области естественных наук" по теме "Самоорганизующиеся ансамбли макромолекул - компьютерное моделирование, квантово-топологический анализ, программируемый супрамолекулярный синтез" №5051 (2006-2007). Проводившиеся исследования были поддержаны грантами Италии; Земли Верхняя Саксония; Общества Макса Планка, Германия; Общества содействия продвижению науки Японии; Госкомиссии по образованию и Министерства химической промышленности КНР; субконтрактом по программе ЕС "Esprit", Нидерланды.

Личный вклад диссертанта. В цикле работ, составляющих диссертацию, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследования, разработке методических подходов, обобщении достигнутых результатов и выработке рекомендаций по получению новых перспективных биомиметических полимеров. Все представленные данные получены при непосредственном участии автора в проведении и постановке эксперимента.

Автор приносит благодарность: И.В. Мягкову, к. х. н., Н.К. Матвеевой, к. х. н. ? Институт Физических Проблем им. Лукина, Зеленоград; С.Г. Юдину, д. ф. - м. н., С.П. Палто д. ф. - м. н. ? Институт Кристаллографии им. Шубникова РАН; А.Г. Витухновскому, д. ф. - м. н. ? Физический Институт им. Лебедева РАН; В.Г. Цирельсону, д. ф. - м. н. и М.Ф. Боброву, к. х. н. ? РХТУ им.Д.И. Менделеева, участвовавших в приборном и программном обеспечении исследований и обсуждении результатов. Автор благодарен за проведенные биологические испытания Г.А. Чернову д. б. н. - Институт биофизики МЗ РФ, М.В. Васину, д. б. н. - в/ч 64688, Ю.А. Ершовой, к. б. н., Т.К. Трубицыной, к. б. н. - ВНИХФИ им.С. Орджоникидзе, Н.Г. Луценко, доц. -РХТУ им.Д.И. Менделеева. Автор благодарит Минобрнауки РФ, Фонды РФФИ, Max-Planck Society, ESF, ГНФК, JSPS, за финансовую поддержку исследований.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены в виде стендовых, приглашенных и пленарных докладов на высокоуровневых профильных Российских и международных конференциях, в том числе: International Symposium "Liquid Cryst. and Related Polymers", (1999); International Symposium “Molecular Design and Synthesis of Supramolecular Architectures", (2002, 2004, 2006); International Conferences on Heterocyclic Compounds (2000, 2002); Conferences of European Federation of Chemical Societies “Heterocycles in Bioorganic Chemistry (2000, 2002); XVI IUPAC Photochemistry (1996); International Conferences on Unconventional Photoactive Systems (1999, 2001); NATO ARW (1996, 1997), NATO ASI (2006); European Conferences on Molecular Electronics (1994, 1996, 1997); EURESCO “Supramolecular Chemistry. Advanced Materials" (1998, 1999, 2002); International Conferences “Intelligent Materials Forum" (1998, 2003); Conference on Phosphororganic compounds (2000, 2003); Gordon Research Conferences on chemosensors (2001, 2003); RSC Conferences “Nanoscience & Nanotechnologies” (2005), “Advancing Materials by Chemical Design” (2007); III-ей Международной НП Конференции “Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности” (2007) и др. Ряд доложенных результатов получили награды High-Light Research (EURESCO, Gordon RC). Обсуждение результатов осуществлялось на семинарах с зарубежными партнерами: сотрудниками Института Органической Химии Католического Университета Наймегена (Nijmegen, the Netherlands, 1997), Лаборатории синтеза полимеров Факультета науки и технологии тканей (Shinshu Univ., Japan, 1998), Института Органической Химии Университета Иоганна Гутенберга (Mainz, Germany, 1999), Института Органической Химии ”Hebrew Univ. ” - Иерусалим, Израиль (2002), Центра защиты окружающей среды Канады (Ottawa, Canada, 2006).

Публикации. Результаты диссертации изложены в 90 печатных работах, включая статьи в центральных отечественных и зарубежных изданиях, обзоры, авторское свидетельство. Приводится список основных публикаций - 48.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

?Синтез и идентификация пептидов и полиаминокислот, содержащих биологически активные ингредиенты - индольные гетероциклы и производные хинолина.

?Целенаправленная модификация полиаминокислот с применением приемов комбинаторной химии и компьютерного моделирования молекулярной архитектуры: химическое взаимодействие полиаминокислот с гетероциклическими хромофорами (красителями, люминофорами, фотохромами, макроциклами).

?Модификация неорганических гетероциклов - циклофосфазенов - производными аминокислот и полиаминокислотами: получение нового типа гибридных мультифункциональных соединений.

?Исследование свойств синтезированных соединений для использования их в биомедицине и молекулярной электронике.

?Выработка общей концепции целенаправленного синтеза биомиметиков на основе полиаминокислот и / или полипептидов модифицированных гетероциклами. Стратегия и оценка перспектив.

Объем и структура диссертации: Диссертация состоит из пяти глав, три из которых посвящены синтезу и идентификации новых соединений - ППТ и ПАК-производных ГЦ. В 4 главе представлены свойства полученных веществ в контексте их перспективного использования в биомедицине и молекулярной электронике. В 5 главе изложена основная концепция стратегии и развития биомиметиков на основе полипептидных производных ГЦ. Главы 1-3 снабжены аналитическими обзорами литературы и резюме в связи с поставленными задачами. Главы 1-4 содержат экспериментальную часть. Выводы изложены отдельно в конце диссертации. Объем диссертационной работы составляет 294 страницы машинописного текста, содержит __39__ схем, __44__ таблицы, __18__ рисунков, 18 приложений. Список цитируемой литературы содержит _429_ наименований.

Содержание работы. В общем введении обсуждаются актуальность темы, цели и задачи диссертации, научная и практическая значимость, приводится общая структура диссертации.

Глава 1. Модификация амино- и полиаминокислот биологически активными азотистыми гетероциклами

Обзор литературы рассматривает синтез и свойства производных гетероциклов биомедицинского назначения, в том числе нейропептидов на примере энкефалинов. Обсуждение результатов состоит из четырех разделов:

1. Синтез и идентификация коротких пептидов, модифицированных L-?-5-гидрокситриптофаном;

2. Синтез и идентификация полипептидов и полиаминокислот, содержащих индольные гетероциклы.3. Пептидные производные хинолина.4. Заключение.

Синтез и идентификация коротких пептидов, модифицированных L-?-5-гидрокситриптофаном. Широкий спектр фармакологического действия 5-гидрокситриптофана и то обстоятельство, что он является предшественником серотонина и аналогом тирозина послужили предпосылкой для введения 5-OTrp в цепь нейропептида, в данном случае пентапептида Leu⁵-энкефалина, с целью возможного усиления нейротропной активности. В основу синтеза коротких пептидов был положен принцип построения олигомерной цепи от димера до пентамера и далее до макромолекулы ПАК, содержащей в среднем до 40 остатков аминокислот.

Тетрааналоги [l-5_OTrp] ¹-Leu⁵-энкефалина и пентааналоги метилового эфира [5-OTrp] Leu⁵-энкефалина и амидов [5-OTrp] Leu⁵-энкефалина представлены нижеприведенными формулами: Trp (OH) - Gly-Gly-Phe-NH₂; Trp (OH) - Gly-Gly-Phe-Leu-метиловый эфир; Trp (OH) - Gly-Gly-Phe-Leu-метиловый эфир; Trp (OH) - Gly-Gly-Phe-Leu-изопропил амид.

При осуществлении синтеза для защиты аминогрупп применяли, в основном, бензилоксикарбонильную защиту, и иногда трет-бутилоксикарбонильную группу. Для модификации карбоксильных групп использовали метиловый эфир, амидную и изопропиламидную группировки. Использование для всех аминокислот бензилоксикарбонильной и бензильной блокировок позволило унифицировать методы их отщепления. В данном случае применяли каталитический гидрогенолиз на Рd-катализаторах. Выход свободного пентапептида в виде гидрохлорида 5-ОТrp-Gly-Gly-Phe-Leu-OMe составил 15%.

Учитывая опыт работы по синтезу эфирного аналога [l-5-ОТrp] ¹-Leu⁵-энкефалина, для синтеза амидного производного выбрали блочную схему синтеза 3+2, как более эффективную. Тример Z-5- (Bzl) OTrp-Gly-Gly конденсировали с дипептидом Phe-Leu-NH_i_Pr ДЦГК методом. Выход пентамера составил 50% после хроматографического разделения и переосаждения. Если каталитическое отщепление Z-защиты у Z-Phe-Leu-изопропиламида проходило без осложнений, то на заключительной стадии получения свободного пентапептида ? аналога Leu-энкефалина обнаружились трудности. Одновременное удаление Z - и Bzl-защит с фрагмента 5-гидрокситриптофана в пентапептиде происходит не полностью. По данным ЯМР ¹³С и ¹Н достаточно легко отщеплялась Z-блокировка и только после введения многократного избытка катализатора, повышения температуры и введения эквивалента хлористого водорода были достигнуты положительные результаты и удалось практически полностью отщепить Z - и Bzl-группы. Значительное влияние оказывала природа растворителя. В присутствии эквивалента НС1 гидрогенолиз приводил к образованию пентапептида с выходом ~20%, таблица 1.

Таблица 1.

Каталитический гидрогенолиз [5-OH-Trp] ¹-пептидов

Использование принципа минимальных защитных групп и их унификация, а также унификация методов пептидного синтеза позволяет сократить общее число стадий.

Структуры синтезированных соединений были подтверждены УФ, ИК, ЯМР (¹Н и ¹³С) и, в отдельных случаях, масс-спектрами, которые приведены в диссертации и свидетельствуют о наличии внутримолекулярной водородной связи, аминокислотном составе и последовательности пептидной цепи.

Синтез и идентификация полипептидов и полиаминокислот, содержащих индольные гетероциклы. Рассмотрены возможные пути синтеза поли-L-5-гидрокситриптофана методом активированных эфиров и N-карбоксиангидридным методом. Получение непосредственно мономеров - гидрохлоридов пентахлорфенилового эфира моно - и ди-5-бензилокситриптофана - оказалось малоэффективным. Циклический мономер - NKA-5-Бензилокситриптофана удалось получить с выходом до 40% в тетрагидрофуране с PCl₅ при ступенчатом повышении температуры от -15 до 30°С. Полимеризацию с раскрытием цикла N-карбоксиангидрида L-5-бензилокситриптофана осуществляли при действии различных инициаторов: триэтиламина, метилата натрия, а также биологически активного амина ? 5_метокситриптамина. В последнем случае 5-метокситриптамин входит в цепь полиаминокислоты. Отношение M/I коррелировало со степенью полимеризации n в пределах 5-15. Полученный олигомер 5_гидрокситриптофана содержал при этом в своей цепи инициатор, т.е.5_метокситриптамин. Для дальнейших исследований были выбраны олигомеры с соотношением M/I = 5, схема 1.

Синтез поли-L-?-5-гидрокситриптофанов осуществляли полимеризацией NKA 5_гидрокситриптофана при его 10% -ной концентрации в ДМФА (20°С) под действием триэтиламина или метилата натрия. При значениях отношения M/I ? 5 влияние концентрации инициаторов (триэтиламин или MеONa) на молекулярно-массовое распределение незначительно. По данным ЯМР ¹Н и масс-спектрометрии, при инициировании триэтиламином при M/I=15 из реакционной массы выделены циклический пента-5-бензилокси-триптофан (~75%) и линейный продукт (менее 5%). С увеличением отношения M/I возрастает доля линейного полимера. При M/I=30, по данным ЯМР и ТСХ, образуется смесь линейных олигомеров разной молекулярной массы. При M/I=50 образуется линейный поли-5-бензилокситриптофан ([?] = 0.6 дл/г) более узкого молекулярно-массового распределения, чем при значении отношения M/I = 30.

Инициирование MeONa уже при M/I = 5 дает возможность получать в основном линейные продукты полимеризации. При M/I = 15 из реакций выделены только линейные поли-5-бензилокситриптофаны с выходом до 60% ([?] = 0.4 дл/г). Удаление Bzl-защиты у поли-5-бензилокси-триптофанов проводили каталитическим гидрогенолизом на Pd-катализаторе, схема 1. Полученные поли-5-гидрокситриптофаны в воде растворимы ограниченно.

Нерегулярные полипептиды 5_гидрокситриптофана и глутаминовой кислоты получали сополимеризацией их N-карбоксиангидридов в присутствии триэтиламина, cхема 2. Мольное соотношение аминокислот в полипептидах соответствовало соотношению исходных мономеров N-карбоксиангидридов аминокислот и составило 1: 9, 1: 3, 1: 1, 3: 1, 9: 1 (глутаминовая кислота: 5_бензилокситриптофан). Данные спектров ЯМР ¹Н и ИК хорошо коррелировали с данными аминокислотного анализа и спектрофотометрического метода.

Удаление бензильных групп с сополимеров проводили каталитическим гидрогенолизом на палладиевом катализаторе, средний выход продукта составил 30-40%. Характеристическая вязкость в ДМФА составляла [?] = 0.60 - 0.78 дл/г. Растворимость полученных сополимеров в воде возрастала с увеличением содержания глутамильных остатков.

Изучение условий полимеризации N-карбоксиангидрида L-б-Аla при инициировании производными индолилалкиламинов показало, что N-тритил-5-бензилокситриптамин и индол не инициировали процесс. N-Тритил-5-окситриптамин и N-тритилтриптамин вызывали полимеризацию N-карбоксиангидрида аминокислоты, которая в стандартных условиях протекала свыше 240 часов. Олигомеры, выделенные в результате реакции, индольных фрагментов не содержали. Триптамин, б-метилтриптамин, 5-метокситриптамин, натриевая соль N-тритил-5-окситриптамина инициировали полимеризацию N-карбоксиангидрида L-б-Аlа, причем образующиеся олигомеры содержали на конце растущей цепи фрагмент индолилалкиламина, т.е. были получены амиды и эфиры полиаланина и триптаминов соответственно. Степень полимеризации аланина (n) и содержание триптамина в олигомерах по данным ЯМР ¹Н, аминокислотного анализа, масс-спектроскопии соответствовали соотношению мономер: инициатор при n=3ч10 для олигоамидов (выход 75%) и n=5ч10 для олигоэфиров (выход 60%) соответственно. Дальнейшее увеличение такого соотношения приводило к значительной полидисперсности образующихся олигомеров, что подтверждалось и данными тонкослойной хроматографии. Исходя из характера ИК и КД спектров, можно заключить, что образование спиральных структур в полиаланинах, содержащих 5-метокситриптамин, возможно при n?8. Каталитический гидрогенолиз бензильной группы в полиаланил-5-бензилокситриптамидах сопровождался N>O миграцией триптаминового фрагмента в смеси ДМФА-этанол и переэтерификацией в ледяной уксусной кислоте, схема 3 (На схеме выделен концевой триптаминовый фрагмент).

Продукты перегруппировок были охарактеризованы данными ЯМР, ИК, масс-спектров. Удаление тритильной группы было проведено обработкой соединений 80% -ной уксусной кислотой. Полученные водорастворимые ацетаты олигомеров (n = 5, 7,10) были выделены и охарактеризованы. Данные элементного анализа дополнительно подтверждают правильность предложенных структур.

Пептидные производные хинолина были получены с применением различных методов пептидного синтеза - ДЦГК, активированных эфиров, внутренних ангидридов - для аминокислот цистеина, аланина, глутаминовой кислоты.

Было показано, что гетероциклический амин хипазин достаточно инертен в условиях пептидного синтеза, хотя и реагирует с указанными аминокислотами. Большое значение имеет природа защитных групп аминокислот и применяемый метод конденсации. Более благоприятно протекала пептидная конденсация глутаминовой кислоты и 2- (1-пиперазинил) хинолина. При сравнении подобных реакций аминокислот и/или пептидов с 5-метокситриптамином, другими индолилалкиламинами и 5_гидрокситриптофаном, видно, что вторичная аминогруппа пиперидинового цикла обладает пониженной реакционной способностью, однако при выделении целевых соединений, азот пиридинового фрагмента образует гидробромиды и гидрохлориды, что может осложнить дальнейшие реакции и биологические испытания. Наибольшие выходы были достигнуты для глутамилпроизводного хипазина - 75% и цистеинил-глутамил-пептида, связанного с двумя молекулами хипазина - 70%. По данным ИК и ЯМР-спектроскопии все синтезированные соединения обладают способностью к межмолекулярному нековалентному связыванию с образованием ассоциатов и ансамблей различной природы ввиду наличия соответствующих центров водородного связывания.

Глава 2. Разработка путей модификации полиаминокислот гетероциклическими хромофорами (красителями, люминофорами, фотохромами, макроциклами)

В обзоре литературы дан анализ методов синтеза и свойств светочувствительных ПАК/ППТ, с целью получения как макрообъектов (для традиционных технологий), так и наноразмерных агрегатов (мономолекулярные пленки и жидкие кристаллы). Обсуждение результатов содержит разделы:

1. Модификация полиглутаминовой кислоты люминофорами: флуоресцеином, родамином, нафтальимидом, аминоакридином;

2. Синтез и идентификация полиаминокислот, содержащих красители: карбоцианины, кумарины, сафранин;

3. Получение фотоактивных полиаминокислот - спиропирановых производных;

4. Получение полиаминокислот, содержащих краун-эфиры, и завершается Заключением.

Модификация полиглутаминовой кислоты люминофорами: флуоресцеином, родамином, нафтальимидом, аминоакридином.

Введение люминофоров в ПАК было осуществлено для дальнейшего изучения процесса переноса энергии вдоль цепи макромолекулы, что представляет интерес для конструирования светоиспускающих молекулярных электронных устройств.

Поэтому были рассмотрены пары люминофоров, в которых максимум испускания (люминесценции) одного фрагмента был бы комплиментарен максимуму поглощения другого фрагмента. Конкретно рассматривались модификации ПАК донорно-акцепторными парами "флуоресцеин / родамин" и "акридин / нафтальимид".

Рис.1. Оптимизированная модель флуоресцеин-содер-жащей полиглутаминовой кислоты, фрагмент с n=10 (вид сбоку).

В синтезе производных ковалентно связанных красителей и полиглутаминовой кислоты получение N-карбоксиангидрида пространственно объемных производных аминокислот не всегда результативно в силу стерических причин. Для полимераналогичных превращений мы применяли метод ДЦГК, cхема 4, рассчитывая предварительно стехиометрическое соотношение компонентов, исходя из оптимизированных моделей молекул синтезируемых соединений (рис.1). Были получены амиды полиглутаминовой кислоты (n=40, ММ 5200), раздельно и совместно связанной с люминесцирующим фрагментами флуоресцеин / родамин (Fl/Rod) ? донором и акцептором (D/A).

Природа хромофора оказывала влияние на выход целевых полиаминокислот, связанных с люминофорами. Более легко и с большими выходами были получены производные флуоресцеина и родамина. Средняя степень содержания люминофора в полимере 34% мол. и 25% мол. соответственно. Сравнительные данные условий синтеза полиглутаминовой кислоты, связанной с люминофорами, приведены в табл.2.

Таблица 2.

*Растворитель ДМФА; [С] _пм = 30% вес; Т = - 5ч0°C.

Максимумы поглощения в электронных спектрах полиглутамидов красителей соответствовали 370 нм для аминоакридинового производного и 440 нм ? нафтальимидного. В спектре поглощения флуоресценильного производного (D) полиглутаминовой кислоты появилось два максимума 462 нм и 490 нм; в спектре излучения родаминового производного (A) появляются две мало интенсивные полосы в области 449 и 542 нм. Длинноволновые максимумы поглощения донора и акцептора увеличились на 1.5 нм и 8 нм соответственно. ?_мах испускания донора сдвинулась в коротковолновую область на 13 нм, ?_мах испускания акцептора сдвинулась в длинноволновую область на 18 нм. Следствием этих изменений является уменьшение Стоксового сдвига донора после реакции с полиглутаминовой кислотой и увеличение Стоксового сдвига у акцептора на 10 нм. Таким образом, синтезированные n-Glu- (D) и n-Glu- (А) сохраняют свойства начальной пары D?А: ?_мах испускания производного флуоресцеина (D) находится близко от ?_мах поглощения производного родамина (А) - 552 нм и 566 нм соответственно. Масс-спектры n-Glu (Fl) и n_Glu (Rod) не содержат пиков молекулярных ионов, однако фрагментация макромолекул подтверждает состав ПАК. Протонные спектры недостаточно информативны в силу перекрывания сигналов большого числа ароматических протонов, но сравнительная оценка общей интегральной интенсивности ароматических протонов фрагментов хромофоров и протонов ?-СН групп в полиглутаминовой кислоте позволяет оценить отношение люминофоров и аминокислотных звеньев в макромолекуле. Спектрофотометрический метод последовательных разведений модифицированных ПАК также был применен для установления содержания флуоресцеина и родамина в ПАК.

Синтез и идентификация полиаминокислот, содержащих красители: карбоцианины, кумарины, сафранин.

Осуществлен синтез некоторых ПАК с максимальным содержанием кумаринов, сафранина, карбоцианинов в боковой цепи, а также олигомеров аминокислот с фиксированным положением красителя на конце цепи (модель "голова-хвост"). В связи с этим для создания ковалентной связи между ПАК и фрагментом красителя были применены карбодиимидный и N-карбоксиангидридный методы, схемы 5 и 6.

В процессе полимеризации NKA аминокислот, Ala и Glu, с использовании в качестве инициаторов кумариновых красителей и сафранина соотношение M/I = n не соблюдалось. Не удалось получить олигомеры, содержащие на конце макромолекулы сафранин Т. По данным ЯМР, соотношение аминокислота: краситель в среднем составило 30:

1. Характер спектров ПМР, анализ тонкослойных хроматограмм и данных гель-хроматографии полученных полиаминокислот указывали на довольно узкое ММР. Учитывая строение кумариновых красителей и сафранина Т, пониженную реакционную способность их амино - и гидроксигрупп, можно предположить, что при раскрытии N-карбоксиангидридного цикла аминокислоты амином, образующийся форполимер сам инициирует дальнейший рост цепи, в результате чего образуется полиаминокислота с более высокой молекулярной массой, чем предполагали первоначально выбранные условия, и соотношение М/I = n в этом случае не соблюдается.

Прямое введение карбоцианиновых и кумариновых красителей, а также сафранина Т в цепь полиглутаминовой кислоты (ММ 6000) осуществляли методом ДЦГК, схема 6.

Предварительное рассмотрение оптимизированных моделей и их квантово-химический анализ показал, что оксикарбоцианиновый краситель может присоединяться к полиглутаминовой кислоте не менее чем через три свободных аминокислотных единицы, а аминофункциональный - через четыре. Для кумарина и сафранина интервал составил 4 АК звена. При этом удалось ввести 1-3% кумаринов и 5% сафранина с выходом менее 20%.

Стехиометрическое соотношение аминокислотное звено: оксикарбоцианин составило максимально 4: 1 и далее 8: 1, 12:

Введение аминокарбоцианина в полиглутаминовую кислоту возможно не менее чем через четыре свободные аминокислоты, т.е. стехиометрия аминокислота: краситель соответствует 5:

Выход амида полиглутаминовой кислоты 75 - 80%, сложного эфира - до 75%.

Для всех синтезированных соединений были рассмотрены их УФ, ЯМР, ¹Н, ¹³С, ИК-спектры, которые подтверждают предполагаемые структуры.

Получение фотоактивных полиаминокислот - спиропирановых производных. Анализ опубликованных данных показывает, что обычно спиропирановые фрагменты присоединяли к полиглутаминовой кислоте и полилизину только через кольцевой атом азота индольного цикла. Мы применили функциональные индолспиропираны с первичной аминогруппой в положении 5 индольного кольца, или 5 спиранового цикла, присоединение N-гидразинового производного спиропирана к полиаминокислоте позволяет значительно расширить возможности синтеза спиропирансодержащих полимеров и проследить возможное влияние природы спиропирана на фотохромные свойства конечной полиаминокислоты. Впервые индолспиропираны были использованы в качестве инициирующих первичных аминов в реакции раскрытия N-карбоксиангидридного цикла ?-метилового эфира L-?-глутаминовой кислоты, схема 7:

Применение стандартных условий реакции полимеризации NKA ?_метилового эфира L_?_глутаминовой кислоты (10% -ная концентрация NKA в ДМФА, 20? С, аргон) позволяет синтезировать олигомер с определенной степенью полимеризации n, которая соответствует отношению n = [M] / [I] в пределах 5?9, для гидразина спиропирана при [M] / [I] = 5 ? 8 был выделен продукт только с n = 6 с выходом до 50%.

Индолспиропираны, содержащие первичную аминогруппу в положении 5 индольного цикла или в положении 5 спиранового кольца, давали олигомеры n = [M] / [I] = 5; 7 и 9 с выходом до 75%.

Строение полученных соединений подтверждено данными ИК-, УФ-, ЯМР-спектроскопии и элементного анализа. Соотношение [M] / [I] с достаточной степенью точности характеризуется спектрами ЯМР_¹Н. Соотношение сигналов ?_СН группы аминокислотной цепи (? = 4.1 м. д) и сигналов ароматических протонов спиропиранового фрагмента (? = 6.6ч7.5 м. д), а также ?_СН₃ сложноэфирной группы глутаминовой кислоты (? = 2.07 м. д) и 6Н-СН₃ групп спиропирана приводит к соотношению [M] / [I] равное отношению количества аминокислотных остатков к фрагменту спиропирана, что согласуется с условиями эксперимента. В дальнейшем при конструировании монослоев полученных соединений на границе раздела фаз вода / воздух и применения оптических методов был произведен расчет ММ олигомеров и содержания фотохромов, что полностью коррелирует с данными ЯМР спектроскопии.

Синтез полиглутаминовой кислоты (ММ 5200, n=40), содержащей индолспиропираны в боковой цепи, проведен методом ДЦГК, схема 8:

Компьютерное моделирование позволило прогнозировать максимальную степень введения спиропирана ~ 30-32%, т.е. на каждые две свободные аминокислотные единицы может быть одна, связанная с фотохромом. Таким образом изначальное стехиометрическое соотношение компонентов должно составить 3:

В нашем случае в качестве матрицы был использован практически монодисперсный олигомер, реакцию вели в спиралеобразующем растворителе ДМФА, при незначительном (1: 1.1) избытке фотохрома и конденсирующего агента (ДЦГК). Все это благоприятствовало образованию полиаминокислоты, регулярно замещенной на хромофор в боковой функциональной группе, обладающей спиральной конформацией в растворе и так же, как и поли_?_ (оксикарбоцианин) - глутаматы, со структурой "волосатого стержня" ("hairy-rod"). Изменение соотношения исходных компонентов (уменьшение количества спиропирана) приводит к нарушению жесткой регулярной структуры замещенной полиаминокислоты, поэтому весь эксперимент мы проводили для теоретически максимально замещенных полиаминокислот. Зависимость выхода от условий реакции методом ДЦГК (диметилформамид, 20?С, [с] = 30% вес., ? = 72 ??100 час) приведена в табл.3.

Концентрация полимера в пределах 20?70% вес. не оказывала значительного влияния на выход конечной модифицированной полиаминокислоты. Однако, в более концентрированных растворах реакции заканчивались быстрее с количественным выходом. Содержание замещающего спиропирана в полиаминокислоте найдено из данных ЯМР-спектров и удовлетворительно коррелирует с начальными соотношениями исходных компонентов.

При сопоставлении условий реакции методами NKA и ДЦГК и выходов целевых соединений, явного преимущества какого-либо из этих двух методов не отмечено. Конечные продукты получены примерно с равными выходами.

Фотохромное поведение спиропирановых производных полиглутаминовой кислоты было рассмотрено при облучении видимым светом в гексафтор-2-пропаноле. КД-спектры окрашенного раствора полиглутамил-?-амидоспиропирана содержит две полосы поглощения около 500 и 370 нм, соответствующих мероцианиновой форме, конформация клубка. Облучение видимым светом (500ч550 нм) или выдержка раствора на свету приводит к появлению поглощения с максимумом 355 и 272 нм, относящихся к спироформе, конформация ?-спирали. При этом фотоиндуцированный конформационный переход полностью обратим.

Таблица 3.

Синтез полиаминокислот, содержащих краун-эфиры. Исследование возможностей синтеза и свойств новых супрамолекулярных соединений, включающих модельные макроциклические фрагменты, важно для понимания механизма многих биохимических реакций и для разработки молекулярных материалов, обладающих необычными структурой и свойствами.

Были рассмотрены пути синтеза ПАК, содержащих краун-эфирные макроциклические группировки в боковой цепи (структура А) или между двумя ПАК цепями - структуры Б и В (кольцо - макроцикл, волнистая линия - полиаминокислотная цепь).

ПАК типа А синтезировали реакцией полилизина с активированными эфирами карбоксифункциональных аза-краун-эфиров. Структуры типа Б получали взаимодействием N-карбоксиангидрида L-?-аланина с диаминодибензо-18-краун-6, а полимеры типа В - реакцией того же макроцикла с избытком полиглутаминовой кислоты.

Введение функциональных краун-эфиров в боковые группы ПАК осуществляли с использованием наиболее распространенных методов образования амидной связи: метода активированных эфиров и прямого карбодиимидного синтеза, схема 9: Наиболее благоприятным оказалось мольное соотношение аминокислотное звено: краун-эфир =3: 1 и концентрация исходных реагентов в ДМФА 40-50 мол.%. Указанные условия позволили получить полилизин (ММ=100000 n=158) с содержанием краун-эфирных групп ~40% с выходом 38-50%. Структура синтезированных соединений подтверждена данными ИК и ЯМР. Сравнение интегральных интенсивностей сигналов протонов четырех групп СН₂ в полилизине и протонов групп СН₂ аза-краун-эфира привело к соотношениям 12: 1 и 3: 1, что соответствует содержанию макроциклов ~39% мол. в полилизине.

Определенный интерес представляло связывание бифункциональным диаминодибензо-18-крауном-6 полиаминокислотных цепей. Два возможных способа иммобилизации макроциклов на полиаминокислотных цепях представлены на схемах 10 и 11.

Для получения линейной структуры типа Б (полиаминокислота-краун-эфир-полиаминокислота) наиболее подходящим представлялся полиаланин из-за его склонности к образованию устойчивой ?-спирали при n ? 8 и отсутствия функциональных боковых групп. В этом случае диаминодибензо-18-краун_6 был использован как инициатор полимеризации N-карбоксиангидрида аланина, в результате чего был получен ди-амид-диаланил-дибензо-18-краун-6 с выходом 65%. Реакция протекала достаточно гладко при мольном соотношении мономер: инициатор = 10: 1, 14: 1 и 18:

Соотношение интегральных интенсивностей ?-СНз-протонов в остатках аланина и ароматических протонов краун-эфира при соотношении мономер: инициатор =10: 1 и 18: 1 составляло 1: 1.5 и 1: 2.7, что соответственно относится к структурам, где на один фрагмент краун-эфира приходится ~10 или ~18 звеньев олигоаланина.

Полиглутаминовая кислота явилась достаточно удобным объектом для введения диаминоди-бензо-18-крауна_6 в ее боковую цепь из-за наличия ?-функциональной СООН-группы.

Конденсацию полиглутаминовой кислоты (MM=6000, n=45) с диаминодибензо-18-краун-6 легче всего было осуществить дициклогексилкарбодиимидным методом при соотношении исходных реагентов из расчета 2 моля олигомера на 1 моль краун-эфира, температуре 20°С, концентрации полимера 30% вес., продолжительности реакции 72 ч в ДМФА. Учитывая возможность образования в реакционной массе разветвленных и сшитых полиглутамильных производных, после окончания реакции были удалены все нерастворимые продукты и проведено многократное переосаждение конечной ПАК, после чего выход целевого продукта составил 60%. В выделенном продукте реакции соотношение ?-СН и ?-СН₂ протонов полиглутаминовой кислоты и ароматических протонов диаминодибензокрауна равно 16: 1, т.е., вероятно, одна молекула краун-эфира связывает две макромолекулы полиглутаминовой кислоты. Характеристическая вязкость [з] продукта реакции в ДМФА составляет 0.84 дл/г, что выше характеристической вязкости исходной полиаминокислоты (0.76 дл/г).

Таким образом, модификация ПАК органическими гетероциклическими хромофорами может быть осуществлена различными методами: NКА, ДЦГК, АЭ и т.д. Защитные группы должны быть легко удаляемыми, не затрагивать связь АК-хромофор, не влиять на природу вводимого хромофора. Получение линейных ПАК производных приводит к двум типам структур: "голова - хвост" и хромофор в боковой цепи макромолекулы. Модифицированные олигоаминокислоты типа "голова - хвост" со степенью полимеризации n?10 предпочтительнее получать NKA методом в одну стадию, при этом соотношение M/I как правило соответствует соотношению аминокислота/хромофор в пределах от 3 до 10. Введение хромофоров в боковую цепь ПАК может привести к регулярной структуре макромолекулы, если достигается максимальная степень замещения. Для правильного выбора стехиометрии и дальнейшей характеризации структуры модифицированной ПАК, необходимо провести квантово-химический анализ целевой макромолекулы или ее фрагмента с компьютерным моделированием и расчетом электронных свойств. При этом следует учитывать природу вводимого гетероцикла и его функциональных групп. Наибольшего выхода можно добиться, меняя растворители (эффект сольватации), однако надо учитывать конформационное состояние ПАК в примененном растворителе.

Глава 3. Модификация неорганических гетероциклов - циклофосфазенов - производными аминокислот и полиаминокислотами: получение нового типа гибридных мультифункциональных соединений

В обзоре литературы этой главы рассмотрены циклофосфазены как темплаты (шаблоны) в синтезе органо-неорганических гибридов, включая ковалентное связывание различных фрагментов с циклофосфазенами для получения звездчатых или гиперразветвленных структур - дендронов и дендримеров, и нековалентное связывание функциональных циклофосфазенов - синтез супрамолекулярных структур. Обсуждение результатов состоит из трех разделов:

1. Взаимодействие циклофосфазенов с производными аминокислот;

2. Получение полиаминокислот на циклофосфазеновых темплатах;

3. Заключение.

В данной части диссертации приведены реакции три - и тетра циклофосфазенов (ЦФ) с производными триптофана - триптаминами, дальнейшее нуклеофильное замещение оставшихся атомов хлора с целью выявления химического поведения ЦФ в подобных реакциях, установление структуры синтезированных соединений и получение веществ, пригодных для биологических испытаний, а также для синтеза темплатов, используемых при получении полиаминокислотных производных циклофосфазенов.

Взаимодействие циклофосфазенов с производными аминокислот. Рассматривая триптамины как аналоги аминокислоты 5-гидрокситриптофана, осуществили аминолиз циклофосфазенов триптаминами, замещенными в 5_ом положении на окси-, нитро-, метокси-, бензилокси-группы и б_метилтриптамином (индопаном). Основная экспериментальная работа была направлена на получение производных гексахлорциклотрифосфазена (ГХЦТФ), 5-метокситриптамина (5-МОТ) и, в отдельных случаях, 5_гидрокситриптамина (5_НОТ).

Аминолиз циклофосфазенов аналогами аминокислот. Взаимодействие ГХЦТФ с 5_МОТ проводили по схеме 12.

Рассмотрение влияния стехиометрии, природы растворителей, температуры, продолжительности реакции на выход 5-метокситриптаминциклофосфазенов с различными степенями замещения показало, что синтез производных со степенью замещения n>3 требует избытка триптамина, применения полярного растворителя, проведения реакции при высокой температуре в течение длительного времени. Во всех случаях в реакционной массе наблюдали образование соединений с различными степенями замещения n. Выделение и очистку конечных соединений осуществляли при помощи колоночной хроматографии. Зависимости выходов триптаминциклофосфазенов от условий синтеза приведены в таблице 4.

Таблица 4.

Выход 5-метокситриптаминоциклотрифосфазенов общей формулы

P₃N₃Cl_6-n (5-MOT) _n, в зависимости от степени замещения (n = 1, 2, 3, 4,6) *⁾

*⁾ Пентазамещенный циклотрифосфазен выделить не удалось.

**⁾ Указан общий выход изомеров (геминального и негеминального).

***⁾ Растворители: ТГФ - тетрагидрофуран, Х - хлороформ, А - ацетонитрил.

Образование геминального и негеминального изомеров у дизамещенного фосфазена в нашем случае отмечено не было. Для тетразамещенного были выделены 2 изомера - геминальный в негеминальный, для триптаминофосфазенов со степенью замещения n>3 наблюдали связывание выделяющегося в реакции хлористого водорода циклическим атомом азота, т.е. реализовался "эффект насыщения", наиболее выраженный у триптаминоциклофосфазенов со степенью замещения n>3.

Состав и строение синтезированных триптаминоциклотрифосфазенов были установлены на основании данных элементного анализа, УФ-, ИК-, ЯМР-спектроскопии. При рассмотрении УФ-спектров триптаминофосфазенов было подтверждено наличие в них триптаминовых фрагментов, причем экстинкция замещенных фосфазенов возрастает пропорционально степени замещения атомов хлора на триптамин. Из рассмотрения ИК-спектров очевидно, что характеристические полосы поглощения валентных групп P=N-Р и P-Nбок для 5_нитротриптаминофосфазенов несколько сдвинуты в область более низких частот, для ?-метилтриптаминофосфазенов - в область более высоких частот.

Изучение ЯМР-спектров триптаминозамещенных циклотрифосфазенов показало, что спектры ¹³C ЯМР триптаминофосфазенов близки к спектрам триптаминов. Заметные изменения в химсдвигах после взаимодействия с фосфазеном наблюдается только для ?, ?, C₃ углеродных атомов. Спин-спиновое взаимодействие ядер Р_А и С_? заместителя также является подтверждением существования связи между циклическим атомом фосфора и индольным производными. Константы спин-спинового взаимодействия J_Pa-C? хорошо заметны в спектрах ¹³С триптаминофосфазенов, кроме моно- (?-метил-3-индолил) циклотрифосфазена, где величина J_Pa-C? может быть меньше (принимая во внимание индуктивный эффект при С? метильной группы). Сравнение спектров ¹³С дли моно-, ди-, три-, тетра - и гекса-производных 5-МОТ и ГХЦТФ показывает практически полное совпадение (в пределах ошибки) значений химсдвигов в триптаминовом фрагменте, что свидетельствует об эквивалентности заместителей, независимо от их количества в триптаминофосфазене. Сопоставляя значения химических сдвигов ядер фосфора, в исходном циклотрифосфане, моно - и дизамещенном тримере, можно сказать, что дизамещенный триптаминофосфазен представляет собой негеминальный изомер, так как в противном случае изменения химических сдвигов всех атомов фосфора с введением второй замещающей группы 5-МОТ должны сохраниться, что привело бы к дифференциации химсдвигов ядер ³¹Р в кольце (рис.2). Синглетный сигнал (? = ?24,02 м. д) в спектре три- (5-метокси-триптамино) - трихлорциклотрифосфазена также свидетельствует о негеминальном механизме замещения.