Амилолитические препараты

Технология этилового спирта из крахмалистого сырья основана на ферментативном гидролизе зернового или картофельного крахмала и сбраживании образующихся сахаров дрожжевыми микроорганизмами, т.е. является биохимической технологией.

Процесс получения спирта из зерно-картофельного сырья включает следующие стадии: очистка и подготовка сырья, водно-тепловая обработка его, осахаривание разваренной массы и охлаждение сусла, приготовление засевной культуры дрожжей, сбраживание сусла, перегонка бражки и ректификация спирта.

Производство спирта из крахмалистого сырья осуществляется по периодической, полунепрерывной и непрерывной схемам. По периодической схеме с использованием разварников Генце получали этиловый спирт с конца XIX в. В настоящее время эта схема осталась только на некоторых спиртовых заводах малой мощности (до 800 дал). Полунепрерывная схема производства, основанная на использовании периодически действующих аппаратов, впервые была внедрена на заводах СССР в 1917--1950 гг. По этой схеме до сих пор работают около 15--20% спиртовых заводов страны.

Принципиальная технологическая схема получения этилового спирта из крахмалистого сырья

ОСАХАРИВАЮЩИЕ МАТЕРИАЛЫ

Крахмал, растворенный при разваривании зерна и картофеля, гидролизуют (осахаривают) амилолитическими ферментами зернового солода или культур микроорганизмов, преимущественно микроскопических (плесневых) грибов и бактерий.

Амилолитические ферменты содержатся во многих высших растениях, но наиболее богато ими пророщенное в определенных условиях зерно растений семейства мятликовых (злаков), называемое солодом. Способность солода осахаривать крахмал известна с древнейших времен, и с тех пор солод используется при получении спирта. Также давно известно свойство микроскопических грибов осахаривать крахмал. С их помощью восточные народы приготовляли различные охмеляющие напитки.

Культуры микроскопические грибовилиферментные препараты применяют в спиртовой промышленности большинства зарубежных стран, причем в основном в виде концентрированных сиропообразных препаратов или сухого порошка, реже -- в виде культуральной жидкости.

Культуры микроскопических грибов имеют ряд преимуществ по сравнению с солодом. Их выращивают на пшеничных отрубях или в составе питательной среды используют обычную кукурузную муку, тогда как для приготовления солода расходуется 14...20 % кондиционного (96 % проростаемости) зерна в расчете на массу крахмала сырья.

При солодоращении теряется 16...18 % крахмала, часть крахмала солода в процессе производства спирта остается неосахаренной и, следовательно, не сбраживается. Кроме того, с солодом вносятся в сусло посторонние микроорганизмы, вследствие чего в большей мере протекают и другие виды брожения, отрицательно отражающиеся на выходе спирта. В случае применения смеси солодов из различных злаков с целью полного осахаривания крахмала работа солодовен усложняется.

Культуры микроскопических грибов содержат комплекс амилолитических ферментов, отличающихся от ферментов солода и позволяющих глубже и полнее гидролизовать крахмал. В микроскопических грибах активнее целлюлозолитические ферменты, расщепляющие гемицеллюлозы до сахаров, часть которых сбраживается дрожжами, при этом повышается выход спирта.

С помощью культур микроскопических грибов можно увеличить концентрацию ферментов и таким образом сократить продолжительность осахаривания и последующего дображивания сусла в 2...3 раза.

Микроскопические грибы быстро размножаются, для выращивания поверхностной культуры достаточно около 1,5 сут, проращивание же зерна для получения солода длится 9... 10 сут. Глубинные культуры выращивают в стерильных условиях, что обеспечивает «чистоту» процесса спиртового брожения.

Действие солода и культур микроскопических грибов не ограничивается осахариванием крахмала, они еще способствуют накоплению в сусле достаточного количества органического азота для питания дрожжей и частичному растворению клеточных стенок эндосперма сырья. В осуществлении этих процессов, а также в выращивании солода и микроскопических грибов участвуют многочисленные ферменты, поэтому необходимо знание их химической природы, строения и механизма действия.

ПОЛУЧЕНИЕ СОЛОДА

Технология солода складывается из следующих основных процессов: замачивание и проращивание зерна; сушка солода и удаление ростков. На отечественных спиртовых заводах для осахаривания используют сырцовый -- несушеный солод (неправильно называемый «зеленым»). Этот солод не может долго храниться, поэтому на каждом спиртовом заводе его готовят в количествах, необходимых для текущей работы.

ЗАМАЧИВАНИЕ ЗЕРНА

Основная цель замачивания -- увлажнить зерно; дополнительная -- отмыть от остатков пыли, удалить легкие зерновые и незерновые примеси и подавить микроорганизмы. Замачивание ведут с применением воздуха и воды, чередуя насыщение зерна водой и аэрацию.

Во время замачивания протекают физико-химические и биохимические процессы, приводящие к глубоким изменениям в зерне.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ПРИ ЗАМАЧИВАНИИ ЗЕРНА

Зерно прорастает нормально при влажности 40...46 %. При меньшей влажности ростки быстро увядают, накапливается мало ферментов, эндосперм плохо и неравномерно растворяется. Переувлажненное зерно долго не начинает прорастать, а затем быстро трогается в рост с большим выделением теплоты. Замачивание обычно заканчивается по достижении влажности 38...40 %, но обильно орошают зерно водой во время проращивания.

Вода поступает в зерно через плодовую и семенную оболочки, обладающие полупроницаемостью, поэтому в процессе замачивания главную роль играют ультрафильтрация и осмодиффузия. Цветочная пленка (мякинная оболочка) в начале замачивания непроницаема, и вода впитывается по тонким капиллярам -- трахеидам зародышевой части, не покрытой этой оболочкой. Сорбируясь крахмалом, белками и другими высокополимерами и растворяя минеральные вещества, через полупроницаемые стенки клеток зародыша и эндосперма вода проникает внутрь зерна.

Со временем вследствие вымывания инкрустирующих веществ становится проницаемой и мякинная оболочка.

В нормально замоченном зерне ячменная влага распределена неравномерно. Наибольшая влажность (около 47 %) в основании -- в зоне расположения зародыша; в самом зародыше влажность еще выше (68...75 %). В середине зерна влажность 38 %, в кончике 39 %.

Скорость замачивания зависит от структуры, размера зерна и температуры. Пленчатое, высокобелковое и крупное зерно обычно увлажняются медленнее, чем голое, низкобелковое и мелкое, хотя нередки исключения из этого правила. Зерно, выращенное в сухом жарком климате, впитывает влагу хуже зерна, полученного во влажном умеренном теплом климате. С повышением температуры скорость замачивания возрастает

Зерно большинства культур замачивают при 18...20 °С (смеси зерна и воды). При более высокой температуре необходимы частая смена воды, энергичное аэрирование, тщательное подавление микрофлоры, что усложняет управление процессом. Исключение составляет просо, которое насыщается влагой труднее, поэтому температуру замачивания его поддерживают в пределах 25...30 °С.

В воде с высокой жесткостью (14... 15 мгэкв/л) и большой щелочностью замачивание замедляется. Такое же действие оказывают хлориды; сульфаты, наоборот, ускоряют замачивание.

Во время замачивания зерно набухает, увеличиваясь в объеме, например, на 40...45 % (ячмень). Из твердого и хрупкого оно становится мягким и эластичным.

БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ПРИ ЗАМАЧИВАНИИ ЗЕРНА

В результате увеличения влажности зерна при замачивании резко усиливается жизнедеятельность и в первую очередь дыхание зерна, сопровождающееся потребностью в кислороде. Вместе с тем запас кислорода в воде очень быстро уменьшается, например при замачивании ячменя на 60...80 мин он исчезает, поэтому обеспечение зерна кислородом затруднено. Проникновению кислорода в зерно через зародыш (в начале замачивания) препятствует щиток, а через оболочки впоследствии -- большое количество воды в тканях. Диффузия кислорода в воде примерно в 10 000 раз медленнее, чем в газе; кроме того, растворимость его в воде в 40 раз меньше, чем диоксида углерода. Недостаток кислорода в процессе замачивания подтверждается и значением дыхательного коэффициента, который выше единицы (около 1,07), а через 8 ч от начала замачивания равен 1,38, т. е. наблюдается уже анаэробное дыхание.

При кислородном голодании образуется этиловый спирт, вредно влияющий на жизнеспособность зародыша. В таких условиях частично нарушается структура тканей и зерно легко переувлажняется. Во время последующего проращивания требуются длительная перестройка типа дыхания, сжигание спирта и других метаболитов, на образование которых были затрачены углеводы. Отсюда следует, что с самого начала замачивания должны быть созданы условия для нормального дыхания зерна.

При замачивании зерна одновременно с усилением дыхания происходит глубокая перестройка всего ферментного комплекса.

ПРОРАЩИВАНИЕ ЗЕРНА

Цель солодоращения -- накопление ферментов, растворение межклеточных пластинок и стенок клеток эндосперма, что необходимо для снабжения развивающегося зародыша питательными веществами и перехода ферментов в сусло.

Зерно проращивают в таких условиях, чтобы расход крахмала на дыхание и образование новых вегетативных органов был минимальным, при возможно меньшем обсеменении микроорганизмами, особенно кислотообразующими.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОЛИТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЗЕРНА

При проращивании в зерне происходят процессы распада и синтеза. В эндосперме гидролизуются резервные вещества -- крахмал, белки, а также пектиновые вещества, гемицеллюлозы, целлюлоза; образующиеся растворимые продукты поступают через щиток в зародыш. В результате процессов синтеза из зародыша вырастают стебелек и корешки.

БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЗЕРНА

Ферменты синтезируются в вегетативных частях растения -- листьях и стеблях -- и уже из них мигрируют в созревающее зерно. По исследованиям А.Н. Баха и А.И. Опарина, активность ферментов в зерне вначале увеличивается, в период молочной спелости достигает максимума, в период восковой спелости снижается и, наконец, во вполне созревшем зерне еле проявляется. При проращивании зерна активность ферментов вновь увеличивается, достигая даже значительно большей величины, чем в период молочной спелости.

Понижение активности амилаз при созревании зерна объясняется связыванием их с белками. В таком, зимогенном, состоянии амилазы нерастворимы и потому неактивны. Активность их восстанавливается после воздействия протеаз, освобождающих амилазы из зимогена.

В созревающем зерне ячменя, ржи, пшеницы и овса присутствуют - и -амилазы, но в зрелом зерне обнаруживаются лишь следы -амилазы. Заметное содержание свободной -амилазы найдено в зерне ржи и овса. В пророщенном зерне всех этих культур содержание р-амилазы не превышает таковое при действии папаина на исходное зерно, т. е. р-амилаза накапливается в солоде в результате освобождения из зимогена. Полагают, что ос-амилаза накапливается таким же путем и частично синтезируется.

Динамика изменения ферментативной активности ячменя при его проращивании (по Г. И. Фертману и А. Н. Лазаревой) показана на рис. 3. Видно, что величины АС и ДС достигают максимального значения на 10-е сутки, по другим данным, у ржи -- на 7...8-е сутки. Декстринолитическая способность возрастает v овса на 10... 12-е, у проса -- на 5...6-е сутки. Исходя из этого, устанавливают и продолжительность солодоращения.

Рис. 3. График изменения ферментативной активности в прорастающем ячмене

В солоде амилолитические ферменты распределены неравномерно: в ячменном приблизительно 70 % амилаз локализовано в нижней части эндосперма, прилегающей к щитку, в верхней части их около 25, в щитке 4, в стебельке и корешках 1 %.

Цитолитические ферменты в процессе проращивания зерна также активируются, и активность их возрастает до определенного времени, у ячменя -- до 5...7 сут. Наибольшей активности цитазы соответствует переход твердого состояния мучнистого тела в рыхлое, когда эндосперм легко может быть растерт между пальцами.

Главная роль в растворении клеточных стенок принадлежит гемицеллюлазам и пектиназам. Основной составной частью гемицеллюлоз ячменя является -глюкан, гидролиз которого катализируется эндо--глюканазой. Меньшая роль принадлежит арабинозидазе и ксиланазе.

В зерне злаков из протеиназ содержится фермент типа папаина, из пептидаз -- аминопептидазы, карбоксипептидазы и дипептидазы.

В результате действия протеиназ из зимогена освобождаются амилазы, под действием пептидаз накапливаются аминокислоты, главным образом аспарагиновая и глутаминовая. Активность протеаз возрастает в процессе солодоращения соответственно увеличению активности амилаз

Протеиназы ячменя, как и папаин, в зависимости от природы гидролизуемого белка могут проявлять свою активность при рН 3,8; 6,3 и 8,6, в соответствии с чем их подразделяют на кислые, нейтральные и щелочные. При солодоращении наибольшую каталитическую активность проявляют кислые протеиназы, активаторами которых служат сульфгидрильные соединения, содержащие группу -- Н, цистин и восстановленный глютатион. В первые сутки проращивания зерна количество глютатиона значительно увеличивается, причем в зародыше более энергично, чем в эндосперме. В последующие сутки накопление глютатиона в зародыше происходит медленнее, но все время в зародыше его больше, чем в эндосперме.

Активность кислой протеиназы в продолжение солодоращения возрастает приблизительно в 40 раз. Пептидазная активность проявляется также сильно, но позже протеиназной.

К концу проращивания в зерне накапливаются довольно активные липаза и фосфатаза (фитаза, нуклеотидаза). Активность фосфатазы тем выше, чем ниже температура солодоращения.

По данным А. Н. Баха и А. И. Опарина, в зерне активность ферментов дыхания -- оксидазы, пероксидазы и каталазы -- выше активности гидролитических ферментов. В результате проращивания повышается активность обеих групп ферментов, но соотношение их активности резко изменяется в обратную сторону и тем сильнее, чем ниже температура. Поэтому в процессе солодоращения накапливается значительное количество гидролитических ферментов при сравнительно небольших тратах крахмала на дыхание.

ИЗМЕНЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ЗЕРНА

Несмотря на то, что солодоращение протекает при сравнительно низких температурах, сильно отличающихся от оптимальных для действия ферментов, за время проращивания зерна происходят существенные изменения его химического состава.

Наибольшие преобразования претерпевает крахмал -- основной резервный углевод зерна. Приблизительно 20 % от всего его количества гидролизуется: из них 8...9 % расходуется на дыхание, 3...4 % на построение стебля и корней и 8... 10 % остается в виде сахара, придающего солоду сладкий вкус.

Свободные сахара состоят главным образом из сахарозы, ин-вертного сахара и мальтозы. При температуре проращивания 15...16 °С образуются преимущественно сахароза и продукты ее гидролиза, при температуре 20...23 °С -- мальтоза.

В нерастворенных гранулах крахмала при рассмотрении под микроскопом хорошо видны канальцы и повреждения поверхности, что является результатом действия амилаз. Размер гранул несколько уменьшается, повышается содержание амилозы, внешние цепи амилопектина укорачиваются. Температура клейстеризации возрастает приблизительно на 4 С, а вязкость клейстера, наоборот, понижается.

Количество целлюлозы в зерне и солоде почти одинаково. Это объясняется тем, что наряду с растворением клеточных стенок эндосперма примерно такое же количество клетчатки образуется в новых вегетативных органах. Количество пентозанов в солоде на 2...3 % больше, чем в исходном зерне. Большая часть пентозанов растворима в воде и состоит не только из высокомолекулярных продуктов гидролиза, но и из моносахаридов (ксилозы, арабинозы).

Белковые вещества также претерпевают значительные изменения. При существующих способах производства спирта азотистое питание для дрожжей накапливается в основном процессе солодоращения. Некоторое количество растворимого азота образуется и при осахаривании разваренной массы, но оно относительно невелико.

Изменения состава белковых веществ ячменя и солода характеризуют данные, приведенные в табл. 1. Наиболее сильному гидролизу подвергается гордеин, несколько меньшему -- глютелин; количество альбумина и глобулина почти не изменяется. Одновременно в 4...5 раз увеличивается содержание аминокислот. Об их составе некоторое представление может дать анализ ячменя и пивоваренного солода.

Содержание общего азота в зерне и солоде, %

Общее содержание азота на протяжении всего периода солодоращения остается практически таким же, содержание аминного азота резко возрастает на 6...8-е сутки, а затем темпы роста замедляются. Белки исходного ячменя гидролизуются примерно на 55 %, из которых около 23 % сосредоточивается в проростках в виде качественно иных белков.

В процессе солодоращения содержание жиров уменьшается на 10...30 %. От фосфорорганических соединений отщепляются фосфаты. Образуются продукты неполного окисления углеводов -- лимонная, щавелевая, молочная и другие органические кислоты, которые вместе с аминокислотами повышают общую кислотность, например с 1,5...2,5 мл 1 н. раствора NaOH на 100 г ячменя до 4,4...7,5 мл на 100 г солода. Однако значения рН в вытяжках из ячменя и солода вследствие буферных свойств мало различаются, но буферная емкость вытяжки из солода на 20...40 % больше.

При солодоращении освобождается инозит и возрастает содержание других витаминов -- тиамина и рибофлавина, имеющих важное значение для жизнедеятельности и бродильной энергии дрожжей. Образуются эфиры и другие соединения, придающие солоду специфический запах: свежих огурцов -- ячменному, стручков акации, медовый или яблочный -- просяному и т. д.

ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССА СОЛОДОРАЩЕНИЯ

Для интенсификации солодоращения с сокращением срока проращивания и повышением ферментативной активности в спиртовой промышленности применяют биостимуляторы -- гибберелловую кислоту и комплексный ферментный препарат МЭК-1.

Гибберелловую кислоту используют в виде водного раствора при поливе зеленого солода в процессе выращивания, а также при замачивании зерна перед солодоращением. При поливе расход гибберелловой кислоты (в пересчете на чистое ее количество) -- 600 мг/т (ячмень, рожь и овес) и 400 мг/т (просо). Если эту кислоту добавляют на стадии замачивания зерна, то расход ее увеличивается и составляет 660...800 мг/т.

При использовании гибберелловой кислоты продолжительность выращивания ячменного и овсяного солода 8...9 сут. Ферментативная активность зеленого солода, обработанного гибберелловой кислотой, повышается не менее чем на 15 % по сравнению с необработанным солодом.

Для интенсификации солодоращения нормального зерна, а также при получении солода из нестандартного зерна в целях повышения прорастаемости и увеличения ферментативной активности в качестве биостимулятора кроме гибберелловой кислоты применяют комплексный ферментный препарат МЭК-1. Под его действием интенсифицируются процессы растворения мучнистой части зерна, образования амилолитических ферментов при проращивании, в результате чего продолжительность солодоращения сокращается с 10...12 до 6...7 сут.

В комплексный ферментный препарат МЭК-1 входят Амилосубтилин Г1Ох и Амилоразин П1Ох.

Препарат МЭК-1 (мультиэнзимная композиция, тип I) представляет собой порошок светло-бежевого цвета влажностью 12...13 %. Амилолитическая активность препарата (АС) 2650 ед/г, протеолитическая (ПС) -- 30 ед/г. Расход МЭК-1 составляет 50 г стандартного препарата на 1 т солодового зерна при замачивании. Препарат применяют в виде рабочего водного раствора (50... 100 г препарата растворяют в 10 л воды). Рабочий раствор используют не только для замачивания, но и для полива при проращивании из расчета 200 л на I т солодового ячменя.

Повышение ферментативной активности солода с помощью биостимуляторов при уменьшении общей продолжительности проращивания способствует сокращению удельных потерь крахмала.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ СОЛОДОВОГО МОЛОКА

Готовый солод, направляемый в производство, учитывают по массе или объему. Лучший способ его подачи -- гидравлический: он удобен, солод хорошо промывается водой и очищается от микроорганизмов. Недостатки гидроподачи -- большой расход воды (около 1000 % массы солода) и потеря части отломанных корешков со сточной водой.

Солод вместе с водой насосом перекачивается на барабанное разделительное сито, транспортная вода проходит через уловитель корешков, а солод направляется в дробилку и далее в бак для приготовления солодового молока. Чтобы улучшить доступ ферментов к разваренной массе сырья, солод измельчают на молотковых, дисковых или вальцовых дробилках. Более тщательное измельчение достигается на дисковых дробилках.

Рабочий орган дисковой дробилки -- два вертикальных стальных диска, из которых один установлен неподвижно, другой вращается с частотой 750 об/мин. Зубья дисков поставлены так, что зуб одного диска входит в выемку между зубьями второго, образуя бороздки, по которым солод проходит от центра к периферии дисков. Расстояние между зубьями дисков регулируется с помощью специального приспособления, расположенного между поддерживающими вал подшипниками и состоящего из коробки и двух регулирующих маховичков. В некоторых конструкциях дисковых дробилок для лучшего измельчения солода предусмотрена многократная циркуляция его между дисками дробилки и баком. В таких циркуляционных дробилках корпус улиткообразный, а зубья привариваются тангенциально.

Для дезинфекции солода при гидротранспортировании в транспортную воду добавляют хлорную известь или хлорамин ХБ технический. Раствор хлорной извести готовят из расчета 400 мг активного хлора на 1 л воды. Например, хлорной извести марки Б II сорта, содержащей не менее 32 % активного хлора, берут 125 г на 100 л воды. В воде с указанной концентрацией активного хлора солод выдерживают 25...30 мин.

При подаче ленточным транспортером или ковшовым элеватором солод обрабатывают в течение 25...30 мин в сборнике с мешалкой водным раствором хлорной извести, который затек спускают в канализацию. При отсутствии хлорной извести используют формалин из расчета 2,8 л 30 %-ного формальдегида на 1 м³ воды.

Тонкоизмельченный солод дополнительно обрабатывают формалином в сборнике с мешалкой. В этой емкости солод смешивают с водой в соотношении 1:(2...2,5), после чего в солодовое молоко (на 1 м³) приливают 25...28 мл 37 %-ного раствора формалина с таким расчетом, чтобы концентрация его в сусле составляла 0,025 %. Раствор выдерживают в течение 25...30 мин, разбавляют чистой водой и перекачивают в расходный сборник. Общий расход воды 4...5 л на 1 кг солода.

Для осахаривания зерно-картофельного крахмала применяют смесь ячменного (50 %), просяного (25 %) и овсяного (25 %) солодов, причем общее содержание просяного и овсяного солодов должно быть не менее 30 %. Можно использовать смесь из двух солодов: ячменного и овсяного или просяного. Ячменный солод можно заменить ржаным полностью или частично, а просяной -- солодом из чумизы. Запрещается применять солод из одной культуры, например ячменя, при производстве спирта из зерна той же культуры.

При осахаривании разваренной массы смесью солодов, состоящей, например, из 70 % ячменного и 30 % просяного солодов, с нерастворенным крахмалом в бражке теряется до 20...40 % крахмала солода, так как крахмала ячменного солода растворяется 60...64 %, просяного -- 24 %. При проращивании на солод нестандартного зерна, имеющего пониженную прорастаемость, эти потери могут быть значительными только за счет непроросших зерен.

ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОБНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Микроорганизмы способны синтезировать разнообразные ферменты. В зависимости от состава питательной среды и условий культивирования они легко переключаются с синтеза одного фермента на синтез другого. У микроорганизмов сравнительно короткий цикл развития (10... 100 ч), вследствие чего можно получать сотни «урожаев» в год.

Продуцентами ферментов могут быть бактерии, грибы, дрожжи и актиномицеты. Для промышленного получения ферментных препаратов используют как природные штаммы микроорганизмов, выделенные из естественных сред, так и мутантные, отселекционированные в результате воздействия на природные штаммы физических и химических мутагенов.

Микроорганизмы синтезируют одновременно комплекс ферментов, но некоторые из них, особенно мутантные штаммы, продуцируют один фермент в значительных количествах. Для лучшего использования крахмалсодержащего сырья в спиртовом производстве осахаривающие материалы должны содержать не только амилолитические ферменты, но и ферменты, гидролизующие другие углеводы сырья -- целлюлозу и гемицеллюлозы. Для обеспечения дрожжей азотистым питанием имеют значение и протеолитические ферменты.

Несмотря на то, что для успешного осахаривания нужен комплекс ферментов, отбор микроорганизмов-продуцентов до сих пор проводился главным образом по высокой активности амилолитических ферментов -- -амилазы и глюкоамилазы.

МИКРООРГАНИЗМЫ - ПРОДУЦЕНТЫ ФЕРМЕНТОВ

Наиболее часто в качестве продуцентов амилолитических ферментов в спиртовом производстве используют микроскопические грибы, реже -- дрожжеподобные организмы и споровые бактерии.

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ

Для получения амилаз широко применяют микроскопические грибы рода Aspergillus, видов: niger, oryzae, usamii, awamori, bata-tae, рода Rhizopus, видов: delemar, tonkinensis, niveus, japonicum и др., а также отдельные штаммы Neurospora grassa и Mucor.

Микроскопические грибы очень широко распространены в природе; основное место их обитания -- почва. Несмотря на наличие многих родов и видов микроскопических грибов, все они характеризуются нитевидным строением тела и специфическим строением плодоносящих органов. Тело гриба состоит из длинных переплетенных нитей сероватого или белого цвета, называемых гифами. Они распространяются по поверхности питательного субстрата, образуя мицелий, и частично врастают в него. Некоторые гифы, поднимающиеся над поверхностью в виде легкого пушка, имеют более сложное строение и представляют собой органы плодоношения, называемые конидие- или спорангиеносцами. У мукоровых грибов на конце спорангиеносца находится шаровидное вздутие, окруженное оболочкой, внутри которого образуются споры. У аспергиллов конец конидиеносца имеет булавовидное утолщение, от которого отходят удлиненные клетки, называемые стеригмами; от стеригм отшнуровываются более мелкие круглые клетки -- конидии.

Отделившиеся конидии или споры, попадая в благоприятные условия, начинают прорастать, затем гифы ветвятся, образуя мицелий; при истощении питательных веществ в среде гриб переходит в стадию споро- или конидиеобразования. Споры и конидии микроскопических грибов содержат пигменты, что и придает зрелым культурам характерную окраску.

Аспергиллы -- типичные аэрофилы, поэтому они могут развиваться только на поверхности твердой или жидкой среды или в жидкой, достаточно аэрируемой среде. Оптимальная температура для большинства аспергиллов 25...30 "С, для некоторых -- до 35 °С. Большинство грибов при поверхностном культивировании могут переносить кратковременное повышение температуры до 40 °С и даже 45 °С без заметной потери активности ферментов. Оптимальная влажность среды для них около 65 %.

Для питания аспергиллов необходимы углеводы, азотистые и минеральные вещества. В качестве источника углевода, кроме моносахаридов, многих олиго- и полисахаридов, могут служить спирты и органические кислоты, однако для накопления амилазы в среде обязательно должны присутствовать крахмал, декстрины или мальтоза. В средах, содержащих другие сахара, в том числе глюкозу, грибы не образуют амилазы. Источником азота могут быть белки и их гидролизаты, аммонийные соли и нитраты.

Среда должна содержать соединения, в состав которых входят сера, фосфор, калий, магний и микроэлементы. Большинство микроскопических грибов усваивают серу из сульфатов, а фосфор -- из фосфатов. Аспергиллы не нуждаются в готовых витаминах и факторах роста, так как способны сами синтезировать их из более простых соединений, имеющихся в среде. Препараты ферментов из микроскопических грибов включают, как правило, широкий набор ферментов, поэтому могут полностью заменять зерновой солод.

На спиртовых заводах стали широко применять высокоактивный по глюкоамилазе штамм Asp. awamori 466 и ВУД-Т2, выращиваемые на концентрированном кукурузном сусле (18 % сухих веществ). Готовая культура имеет активность до 250 ед. ГлА на 1 мл, других ферментов образует мало.

ДРОЖЖЕПОДОБНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

Амилолитические ферменты синтезируют также некоторые дрожжи и дрожжеподобные грибы родов Saccharomyces, Candida, Endomycopsis и Endomyces.

В спиртовом производстве нашли применение End. bispora и End. species 20-9, выращиваемые глубинным способом и продуцирующие главным образом активную глюкоамилазу; осамилазная активность проявляется слабо. Высокоактивный End. bispora имеет разветвленный мицелий, образует бластоспоры; гифы -- септированные, зернистые; на твердых агаризованных средах образуют колонии с воздушным серовато-белым мицелием, на жидких питательных средах -- гифы и некоторое количество бластоспор.

Дрожжеподобные грибы в спиртовом производстве самостоятельно не применяют, так как они не содержат других ферментов, необходимых для нормального осахаривания сусла из крахмалсодержащего сырья. Обычно их используют в смеси с ферментными препаратами из микроскопических грибов или бактерий.

БАКТЕРИИ

Активные амилазы способны синтезировать многие бактерии: Вас. subtilis, Вас. diastaticus, Вас. mesentericus, Вас. macerans и Вас. polymycus и др.

Бактерии -- продуценты амилолитических ферментов представляют собой палочки длиной 1,2...1,3 мкм и диаметром 0,6...0,8 мкм. Палочки соединяются по две, три, иногда образуют цепочки. Цикл развития бактерий короче, чем микроскопических и дрожжеподобных грибов. Например, культуру Вас. diastaticus выращивают в глубинных условиях при температуре 60 °С в течение 10... 12 ч.

Бактерию Вас. subtilis-82, применяемую в настоящее время на спиртовых заводах как продуцент -амилазы в смеси с препаратами глюкоамилазы, выращивают в течение 48...60 ч при температуре 30...35 'С.

Особенность бактерий -- их способность образовывать высокоактивную термостойкую -амилазу, необходимую для разжижения и декстринизации крахмального клейстера на стадии под-варивания замесов и осахаривания сусла.

ПРОИЗВОДСТВЕННЫЕ СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ - ПРОДУЦЕНТОВ ФЕРМЕНТОВ

Существует два способа культивирования микроорганизмов -- продуцентов ферментов: поверхностный и глубинный.

Первый способ, применяемый для культивирования микроскопических грибов, характеризуется развитием мицелия на поверхности твердого или жидкого субстрата. На жидком субстрате образуется пленка мицелия, продуцирующего не только амилолитические ферменты, но и органические кислоты, инактивирующие их, поэтому используют твердые субстраты с развитой поверхностью -- пшеничные отруби, дробину барды, картофельную мезгу и др.

Максимальная активность ферментов достигается при культивировании грибов на пшеничных отрубях. Дробина барды бедна питательными веществами, и активность ферментов в культурах грибов, выращенных на ней, в 4...5 раз ниже, чем на отрубях. Зрелая культура грибов вследствие обволакивания частиц отрубей мицелием имеет вид плотной войлокообразной массы.

При поверхностном культивировании пшеничные отруби должны быть увлажнены и простерилизованы. В стерильных условиях готовят посевную культуру, но выращивают грибы в нестерильных условиях в кюветах, устанавливаемых в негерметичных растильных камерах. Теплоту, выделяющуюся в процессе роста грибов, удаляют продуванием через растильную камеру стерильного кондиционированного воздуха.

Поверхностный способ выращивания микроскопических грибов имеет ряд преимуществ. Так как во время роста гриба отруби не перемешиваются, посторонние микроорганизмы не распространяются по всей их массе и вызывают лишь незначительное местное инфицирование, которое, как правило, не влияет на активность ферментов. Это, однако, не исключает необходимости тщательной стерилизации воздуха, среды и оборудования. Культуру на отрубях высушивают до содержания влаги 10... 11 %. В таком виде она может храниться продолжительное время без значительной потери активности. Это позволяет организовать централизованное снабжение спиртовых заводов сухой культурой микроскопических грибов, что является одним из преимуществ поверхностного способа выращивания.

Недостаток поверхностного способа -- необходимость устанавливать множество кювет, работу с которыми трудно механизировать. Себестоимость культуры гриба-продуцента высока, причем в основном из-за затраты большого количества ручного труда. Механизация процесса выращивания возможна путем создания непрерывнодействующих установок или бескюветных аппаратов с вертикальным толстым слоем питательной среды и интенсивным продуванием воздуха через этот слой.

Глубинную культуру микроорганизмов выращивают на жидкой питательной среде при энергичной аэрации в герметически закрытых аппаратах и в стерильных условиях. Процесс полностью механизирован. Стерильность глубинной культуры микроорганизма -- продуцента ферментов положительно отражается на результатах сбраживания сусла дрожжами.

ПОВЕРХНОСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ

Питательные среды. При поверхностном культивировании твердой средой обычно служат пшеничные отруби, содержащие в достаточных количествах все вещества, необходимые для питания грибов. Лучшие результаты достигаются при содержании не менее 16 % крахмала в отрубях или в другой питательной среде.

Получение посевного материала. Для засева производственной питательной среды может быть использован посевной материал трех видов: споры, мицелий и спороносящая культура, выращенная на твердой питательной среде.

Споровый материал готовят поверхностным культивированием гриба на твердой или жидкой питательной среде в специальных аппаратах с кюветами. В первом случае гриб выращивают в пробирке на косом агаре до обильного образования спор, затем спорами засевают колбы со стерильными пшеничными отрубями, наконец, спороносящую культуру передают в специальный аппарат. По окончании спорообразования в этом аппарате отбирают споры посредством специального вибросепаратора при тщательной аспирации. Споры фасуют в полиэтиленовые мешочки, стеклянные или дюралюминиевые банки, в которых они могут сохраняться при температуре от 8 до 24 °С около 1,5 лет.

Во втором случае из спор, собранных в пробирке с косым агаром, готовят водную суспензию и ею засевают жидкую питательную среду, которую направляют в растильный аппарат. Из-под выросшей спороносящей пленки удаляют жидкую среду, пленку подсушивают, снимают с кювет, измельчают и упаковывают. Готовый споровый материал не содержит примеси среды и обладает высокой всхожестью (90...95 %), которая сохраняется свыше 3 лет.

Споры (конидии), полученные любым методом, обладают водоотталкивающей способностью и почти не смачиваются водой. Это свойство приводит к неравномерности засева среды и, следовательно, к неодинаковой скорости роста культуры. Смачиваемость спор можно улучшить, если добавить в их водную суспензию 25...50 мг поверхностно-активного вещества, например алкилбензолсульфата на 1 г спорового материала. При этом всхожесть спор остается без изменения.

Для сокращения длительности культивирования микроскопических грибов в производственных условиях можно применять предварительное проращивание спор в течение 7 ч в жидкой питательной среде до появления ростовых трубочек. При этом продолжительность лагфазы сокращается на 8...9 ч и увеличивается оборачиваемость растильных камер.