Використання білків теплового шоку HSP70 для індикації стану рослин природних фітоценозів: підходи та проблеми

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного

Національної академії наук України

ВИКОРИСТАННЯ БІЛКІВ ТЕПЛОВОГО ШОКУ HSP70 ДЛЯ ІНДИКАЦІЇ СТАНУ РОСЛИН ПРИРОДНИХ ФІТОЦЕНОЗІВ: ПІДХОДИ ТА ПРОБЛЕМИ

Л.Є. Козеко, Є.Л. Кордюм

Київ



Анотація

рослина фізіологічний листок біомаркер

Визначення стану рослин в умовах варіабельного зовнішнього середовища є першочерговою проблемою біології та екології рослин у сучасних реаліях екологічних і кліматичних загроз. Актуальним є пошук універсальних біомаркерів, які б дозволяли визначати стан рослин незалежно від природи стресових чинників. На основі даних літератури і результатів власних досліджень доведено, що критеріям для такого показника відповідають білки теплового шоку 70 кДа (HSP70). Ця родина шаперонів присутня практично в усіх організмів, включаючи рослини. Індукція їх синтезу є індикатором порушення протеостазу клітин і невід'ємною складовою стресової реакції та адаптації організму до несприятливих факторів довкілля. Висока консервативність цих білків дозволяє використовувати моноклональні антитіла для їх імунодетекції у різних таксонів, що продемонстровано на прикладі рослин 11 видів 8 родин. Тестування різних за екологією видів за різних умов температурного і водного режимів в природі та експерименті підтвердило ефективність HSP70 як біомаркера. Розроблено спосіб визначення стану рослин природних фітоценозів та інтродукованих рослин, що включає оцінку фізіологічного стану рослини та впливу на нього екологічних факторів за вмістом HSP70 у листках. Розглянуто шляхи подальшого вдосконалення даного підходу для його використання у комплексних дослідженнях.

Ключові слова: стан рослини, вплив довкілля, стрес, HSP70, біомаркер



Annotation

USING OF HEAT SHOCK PROTEINS HSP70 FOR EVALUATION OF PLANT STATE IN NATURAL PHYTOCENOSES: APPROACHES AND PROBLEMS

L. Ye. Kozeko, E. L. Kordyum Kholodny Institute of Botany of the National Academy of Sciences of Ukraine (Kyiv, Ukraine)

Evaluation of the plant state in a variable environment is the primary problem of plant biology and ecology in the today's realities of ecologic and climatic changes. The search for universal biomarkers that would make it possible to determine the state of plants regardless of nature of stress factors is urgent. On the basis of literature data and the results of own studies, it has been shown that heat shock proteins 70 kDa (HSP70) meet the criteria for this biomarker. This family of chaperones is present in virtually all organisms, including plants. Their induction is an indicator of cellular proteostasis disturbance and an integral component of stress response and adaptation of an organism to adverse environmental changes. The high homology of these proteins allows using monoclonal antibodies for their immunodetection in various taxa, which was demonstrated for 11 plant species of 8 families. Testing species, different in their ecology, under contrasting conditions of temperature and water regimes in nature and experiments confirmed the effectiveness of HSP70 as a biomarker. A method for determining the state of plants of natural phytocenoses and introduced plants has been developed. It includes an assessment of physiological state of a plant and influence of environmental factors on it by HSP70 content in leaves. The ways of further improvement of this approach for its use in complex research are considered.

Key words: plant state, environmental change, stress, heat shock proteins HSP70, biomarker



Аннотация

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА HSP70 ДЛЯ ИНДИКАЦИИ СОСТОЯНИЯ РАСТЕНИЙ ПРИРОДНЫХ ФИТОЦЕНОЗОВ: ПОДХОДЫ И ПРОБЛЕМЫ

Л. Е. Козеко, Е. Л. Кордюм Институт ботаники им. Н. Г. Холодного Национальной академии наук Украины (Киев, Украина)

Оценка состояния растений в условиях вариабельной внешней среды относится к первоочередным проблемам биологии и экологии растений в современных реалиях экологических и климатических изменений. Актуальным является поиск универсальных биомаркеров, позволяющих определять состояние растений независимо от природы стрессовых факторов. На основе данных литературы и результатов собственных исследований показано, что критериям для такого показателя отвечают белки теплового шока 70 кДа (HSP70). Это семейство шаперонов присутствует практически у всех организмов, включая растения. Индукция их синтеза является индикатором нарушения клеточного протеостаза и неотъемлемым компонентом стрессовой реакции и адаптации организма к неблагоприятным изменениям среды. Высокая консервативность этих белков позволяет использовать моноклональные антитела для их иммунодетекции у разных таксонов, что продемонстрировано на примере растений 11 видов 8 семейств. Тестирование разных по экологии видов в контрастных условиях температурного и водного режимов в природе и эксперименте подтвердило эффективность HSP70 как биомаркера. Разработан способ определения состояния растений природных фитоценозов и интродуцированных растений, включающий оценку физиологического состояния растения и влияния на него экологических факторов по содержанию HSP70 в листьях. Рассмотрены пути дальнейшего совершенствования данного подхода для его использования в комплексных исследованиях.

Ключевые слова: состояние растения, влияние внешней среды, стресс, HSP70, биомаркер



Виклад основного матеріалу

Визначення стану рослин в умовах варіабельного зовнішнього середовища, якого вони не можуть уникнути внаслідок нерухомого способу життя, залишається актуальною проблемою біології та екології рослин в умовах посилення антропогенного пресингу і прогнозів глобальних змін клімату. Оскільки в природних / польових умовах рослини можуть зазнавати впливу комплексу несприятливих екологічних чинників, актуальним є пошук універсальних біомаркерів, які б дозволяли визначати стан рослин незалежно від природи і кількості стресових чинників. Такі біомаркери, без сумніву, можуть бути також корисними при використанні рослин у біоіндикації шкідливих чинників довкілля, таких як важкі метали, ксенобіо-тики, радіаційне опромінення тощо (Feder, Hofmann, 1999; Kovalchuk, Kovalchuk, 2008).

Очевидно, основним критерієм при виборі такого індикатора повинна бути його здатність значно змінюватися при переході будь - якого зовнішнього фактора із зони оптимуму до зони значень, критичних для виду. В літературі як можливі біомаркери стресу рослин розглядають різні структурно-функціональні та молекулярні ознаки: збільшення вмісту активних форм кисню (АФК), пероксидне окиснення ліпідів, вихід з клітин електролітів (показник проникності мембран), інтенсивність катаболічних процесів, швидкість синтезу білка, синтез стресових білків, активність антиоксидантних систем, зміни фітогормонального балансу, ефективність дихання, інтенсивність фотосинтезу, флюоресценція хлорофілу тощо (Лысенко и др., 2013; Ma et al., 2013; Sershen et al., 2016; Stirbet et al., 2018). При цьому кожна з ознак має свої сильні сторони і обмеження. Часто їх визначення проводиться для певного чинника та/або виду рослин: наприклад антиоксидантні ферменти як маркери окиснювального стресу рису (Ma et al., 2013); пероксидази як індикатори негативного впливу металів на рослини (Jouili et al., 2011). Як біомаркери стресу розглядають також леткі органічні сполуки, при цьому відзначається їх специфічність до фактора: наприклад, ізопрени і монотерпени - для високої температури; етанол, метанол і ацетальдегід - для аноксії (Niederbacher et al., 2015).

В літературі зазвичай такі ознаки називають «біомаркерами стресу», проте важливо розрізняти власне стрес, тобто швидку реакцію організму на різкі значні зміни будь-яких факторів середовища, і адаптацію до тривалої або постійної їх дії (Lichtenthaler, 1998; Кордюм и др., 2003; Lamech, Haynes, 2015; Kordyum, Dubyna, 2019). Отже, обрана ознака повинна виявляти напружений стан організму під час як коротко-, так і довгострокового впливу чинника(ів). З цим пов'язані вимоги щодо наявності маркерної ознаки в усіх видів, неспецифічності до стресорів, рівня чутливості та надійності, а також точності вимірювання (Ma et al., 2013).

На основі даних літератури і результатів власних досліджень нами запропоновано використання як біомаркера стану рослин білків теплового шоку родини HSP70.

Теоретичні основи використання HSP70 як біомаркера стану рослин

Як молекулярні шаперони, HSP70 сприяють фолдингу клітинних білків під час трансляції та при транспортуванні між клітинними компартментами, запобігають небажаним міжбілковим взаємодіям, контролюють функціональну активність окремих білків. При виникненні у клітині великої кількості денатурованих білкових молекул під впливом несприятливих зовнішніх чинників шаперони HSP70 зв'язують їх короткі гідрофобні ділянки, тим самим запобігаючи агрегації, та сприяють рефолдингу в кооперації з іншими шаперонами (Mayer, Bukau, 2005). При цьому члени родини HSP70 посідають центральну позицію у функціонуванні системи шаперонів і за оцінками ряду авторів вважаються головними HSP у багатьох видів (Sorensen et al., 2003).

Родина HSP70 має у своєму складі конститутивні та індуцибельні члени. Транскрипція конститутивних генів відбувається на високому рівні за нормальних умов і може певною мірою активуватися за дії стресових факторів. Індуцибельні гени, навпаки, не експресуються або слабо експресуються за нормальних умов, проте значно активуються при стресі ( Sung et al., 2001; Swindell et al., 2007; Kozeko, 2021). Вважається, що основним первинним сигналом для індукції HSP є поява в клітині під впливом шкідливих чинників значної кількості ненативних поліпептидів (Ananthan et al., 1986; Scharf et al., 2012). Експресія генів HSP70 у відповідь на таки порушення індукується у перші хвилини (Bowen et al., 2002; Sung, Guy, 2003; Kozeko, 2021). Індуцибельний компонент шаперонної системи є ключовим інструментом захисту протеостазу і виживаності клітин за впливу несприятливих чинників (Feder, Hofmann, 1999; Sorensen et al., 2003). Отже, високий вміст HSP70 може бути індикатором порушення протеостазу організму. Важливими рисами стресової реакції є швидка активація до рівня, який точно відповідає ступеню ушкоджень, її тимчасовий характер та здатність до авторегуляції, зокрема, після завершення дії стресора (Lamech, Haynes, 2015). З іншого боку, шаперони також беруть участь в адаптації до довготривалої дії чинника (Feder, Hofmann, 1999; Sorensen, 2010; Lamech, Haynes, 2015). У табл. 1 наведено приклади активації синтезу HSP70 у рослин різних таксонів - дводольних, однодольних, мохів, водоростей - за впливу різних абіотичних і біотичних факторів.

Раніше ідея використання HSP70 як біоіндикатора стресу висловлювалася щодо тваринних об'єктів, переважно у рамках робіт з токсикології та моніторингу забруднення середовища важкими металами, пестицидами та іншими шкідливими сполуками (Feder, Hofmann, 1999; Sorensen, 2010). Проте відомі нам роботи на рослинах нечисленні. Так, HSP70 розглядався як біомаркер стресу для водних видів Fucus serratus і Lemna minor (Ireland et al., 2004). Хлоропластний HSP70B у Chlorella запропоновано використовувати як ранній маркер окиснювального стресу (Chankova, Yurina, 2016).

Відзначається висока чутливість HSP70 до стресових умов порівняно з іншими традиційними показниками, такими як інгібування росту (Feder, Hofmann, 1999). Стосовно переваг шаперонів HSP70 порівняно з іншими HSP у даному контексті відзначено їх більш істотну і стабільну реактивність за стресових умов (Tomanek, Somero, 2000; Shatilina et al., 2011; Kozeko, 2021).

Таблиця 1

Абіотичні та біотичні фактори, що викликають індукцію синтезу HSP70 у рослин [Table 1. Abiotic and biotic factors that induce HSP70 in plants]

Фактор [Factor]	Вид [Species]	Джерело [References]
1	2	3
Висока температура [High temperature]	Arabidopsis thaliana Thellungiella salsuginea Solanum tuberosum Pisum sativum Brassica napus Medicago sativa Spinacia oleracea Camellia sinensis Chrysanthemum nankingense Malva spp. Malus domestica Citrus spp. Vitis vinifera Triticum aestivum Oryza sativa Zea mays Hordeum vulgare Panicum capillare Pyropia seriata	Sung et al., 2001; Swindell et al., 2007; Гамбург и др., 2011; Leng et al., 2017; Kozeko, 2021 Wong et al., 2005; Гамбург и др., 2011 Liu et al., 2018; Tang et al., 2020 DeRocher, Vierling, 1995 Young et al., 2004 Li et al., 2017 Li, Guy, 2001 Chen et al., 2018 Zhang et al., 2014 Козеко, Рахметов, 2016 Bowen et al., 2002 Fietto et al., 2007 Liu et al., 2012 Majoul et al., 2004 Hu et al., 2009; ShuiFeng et al., 2012; Sarkar et al., 2013 Hu et al., 2010; Jiang et al., 2021 Chaudhary et al., 2019 Song et al., 2018 San et al., 2015
Низька (вище і нижче 0°С) температура [Low (above and below 0°С) temperature]	Arabidopsis thaliana Thellungiella salsuginea Spinacia oleracea Solanum tuberosum Solanum lycopersicum Pisum sativum Populus spp. Eriobotrya japonica Triticum aestivum Hordeum vulgare Oryza sativa	Sung et al., 2001; Swindell et al., 2007 Wong et al., 2005; Gao et al., 2009 Guy, Li, 1998; Li et al., 1999 Liu et al., 2018 Li et al., 1999 Taylor et al., 2005 Renaut et al., 2004 Lin et al., 2019 Kosova et al., 2013 Hlavackova et al., 2013 Makoto, Setsuko, 2007; Hu et al., 2009
Посуха / водний дефіцит [Drought / water deficit]	Arabidopsis thaliana Thellungiella salsuginea Spinacia oleracea Alternanthera philoxerides Solanum tuberosum Populus trichocarpa Malva spp. Camellia sinensis Citrus spp. Piper nigrum Oryza sativa Zea mays Hordeum vulgare Cynodon dactylon Lemna minor Fucus serratus Physcomitrella patens	Bray, 2002; Rizhsky et al., 2004; Swindell et al., 2007; Leng et al., 2017; Kozeko, 2021 Wong et al., 2005 Guy, Li, 1998 Jia et al., 2015 Liu et al., 2018 Yer et al., 2015 Козеко, Рахметов, 2016 Chen et al., 2018 Fietto et al., 2007 George et al., 2017 Hu et al., 2009; Zou et al., 2009; ShuiFeng et al., 2012 Hu et al., 2010 Landi et al., 2019; Chaudhary et al., 2019 Ye et al., 2015 Ireland et al., 2004 Ireland et al., 2004 Tang et al., 2016
1	2	3
Глибоке зневоднення [Desiccation]	Physcomitrella patens	Wang et al., 2009
Затоплення / гіпоксія / анаеробіоз [Flooding / hypoxia / anaerobiosis]	Arabidopsis thaliana Glycine max Sium spp. Malva spp. Zea mays	Banti et al., 2008; Козеко, 2017 Komatsu et al., 2013 Козеко, Овчаренко, 2015; Козеко, 2017 Козеко, Рахметов, 2016 Chen et al., 2014
АФК / Оксидативний стрес [ROS / Oxidative stress]	Arabidopsis thaliana Medicago sativa Chlorella spp.	Swindell et al., 2007; Scarpeci et al., 2008 Li et al., 2017 Chankova, Yurina, 2016
Висока концентрація солі [High salt concentration]	Arabidopsis thaliana Solanum tuberosum Solanum lycopersicum Oryza sativa Hordeum vulgare Lemna minor Fucus serratus	Swindell et al., 2007; Leng et al., 2017 Liu et al., 2018 Manaa et al., 2011 Hu et al., 2009; Zou et al., 2009; ShuiFeng et al., 2012 Chaudhary et al., 2019; Landi et al., 2019 Ireland et al., 2004 Ireland et al., 2004
Важкі метали [Heavy metals]	Pisum sativum Oryza sativa Hordeum vulgare Panicum capillare Lemna minor Fucus serratus	Rodriguez-Serrano et al., 2009 Cong et al., 2019 Chaudhary et al., 2019 Song et al., 2018 Ireland et al., 2004 Ireland et al., 2004
Cbrrao високої інтенсивності [High light intensity]	Arabidopsis thaliana Lactuca sativa Spinacia oleracea Panax ginseng Chlamydomonas reinhardtii	Scarpeci et al., 2008; Crisp et al., 2017 Kim et al. (in press) Li, Guy, 2001 Nam et al., 2003 Nordhues et al., 2012
УФ-В / УФ-C [UV-B / UV-C]	Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Triticum aestivum Oryza sativa	Swindell et al., 2007; Scarpeci et al., 2008; Cuk et al., 2010 Kozeko et al., 2015 Гудкова и др., 2001 Hwang et al., 2013
Іонізуюча радіація Ionizing radiation
Змінена гравітація [Altered gravity]	Arabidopsis thaliana Pisum sativum	Paul et al., 2013; Zupanska et al., 2013 Kozeko, Kordyum, 2009
Поранення [Wounding]	Arabidopsis thaliana Spinacia oleracea	Swindell et al., 2007 Guy, Li, 1998
Фітопатогенні віруси [Phytopathogenic viruses]	Arabidopsis thaliana Nicotiana benthamina Citrus spp. Oryza sativa	Whitham et al., 2003; Aparicio et al., 2005 Chen et al., 2008; Jiang et al., 2014 Fietto et al., 2007 Jiang et al., 2014
Фітопатогенні бактерії [Phytopathogenic bacteria]	Arabidopsis thaliana Citrus spp.	Byth et al., 2001; Noel et al., 2007 Fietto et al., 2007
Фітопатогенні гриби [Phytopathogenic fungi]	Arabidopsis thaliana Solanum spp.	Noel et al., 2007; Swindell et al., 2007 Kubienova et al., 2013; Pan et al., 2013



Таблиця 2

Результати тестування рослин з використанням HSP70 [Table 2. Results of plant testing using HSP70]

Вид [Species]	Умови росту [Growth conditions]	Фактори середовища [Environmental factors]	Оцінка рівня HSP70 [HSP70 level evalutaion]	Рисунок [Figures]
S. latifolium	Повітряно -водна [Aerial-aquatic] Наземна [Terrestrial]	Ta = 40°С Ta = 40°С Tривала посуха Long-term drought	- - - - - - -	1, А (1-3) 1, А (4)
M. sylvestris	Наземна [Terrestrial]	Ta = 17°С, w = 30 ± 0,3% Ta = 41°С, w = 5 ± 0,1% Tривала посуха Long-term drought	± - - - -	1,B (1) 1, B (2)
M. pulchella	Наземна [Terrestrial]	Ta = 17°С, w = 30 ± 0,3% Ta = 41°С, w = 5 ± 0,1% Tривала посуха Long-term drought	± - - - -	1,B (3) 1, B (4)
S. purpurea	Наземна [Terrestrial]	Ta = 17°С, w = 28 ± 0,2 % Без поливу Without watering Ta = 17°С, w = 64 ± 0,3 % Полив Watering	-- - -	1,F (1) 1, F (2)
E. aureum	Наземна [Terrestrial]	Tа = 20°С, w = 88 ± 0,6% Полив Watering Ta = 20°С, w = 18± 0,2% Без поливу Without watering Tа = 20°С Затоплення Flooding Ta = 40°С, 2 год Ta = 40°С, 2 h	- ± - - - - - -	1, C (1) 1, C (2) 1, C (3) 1, C (4)
P. stratiotes	Водна плаваюча [Aquatic floating]	Ta = 20°С, Tw = 21°С	--	1,D (1)
	Наземна [Terrestrial]	Ta = 20°С	- - -	1, D (2)
H. verticillata	Занурена у воду [Submersed]	Tw = 21°С	--	1, E (1)
	Наземна [Terrestrial]	Ta = 20°С	- -	1, E (2)
	Занурена у воду [Submersed]	Ta = 40°С, 2 год Ta = 40°С, 2 h	- - -	1, E (3)
T. natans	Водна [Aquatic]	Ta = 23°С, Tw = 20°С Ta = 37°С, 2 год Ta = 37°С, 2 h	-H -

Примітки. Ta - температура повітря; Tw - температура води; w - вагова вологість ґрунту. Оцінка рівню HSP70 за результатами вестерн-блот-аналізу: (-) не визначається, (±) дуже мала кількість (на рівні чутливості методу), ( - ) мала кількість, ( - - - - - - - ) активація синтезу різного ступеня.

Важливим з методичної точки зору є високий ступінь гомології амінокислотних послідовностей HSP70 у різних видів. Зокрема, наявність в N-термінальній частині білків цієї родини високо консервативної ділянки (Lin et al., 2001; Mayer, Bukau, 2005) дає можливість використання специфічних до неї антитіл для тестування представників різних таксонів.

Перевірка ефективності зазначеного підходу потребувала підтвердження наступних положень: 1) високий рівень HSP70 може бути індикатором стресового/напруженого стану рослин за дії несприятливих чинників різної природи і різної тривалості; 2) можливість використання окремих органів для характеристики стану всього організму; 3) можливість використання моноклональних антитіл до HSP70 для тестуРезультати тестування стану рослин вання рослин різних таксонів. шляхом імонуодетекціїHSP70

Для імунодетекції нами обрано моноклональні антитіла, генеровані до цитозольних HSP70 миші, афінність яких підтверджена для низки видів тварин (H5147, Sigma). Ефективність їх використання для тестування різних таксонів рослин продемонстрована на прикладі 11 різних за екологією видів 8 родин: Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (Brassicaceae), Pisum sativum L. (Fabaceae), Salix purpurea L. (Salicaceae), Malva pulchella Bernh. І M. sylvestris L. (Malvaceae), Epipremnum aureum Linden & Andre і Pistia stratiotes L. (Araceae), Sium latifolium L. і S. sisaroideum DC., (Apiaceae), Hydrocotyle verticillata Thunb. (Araliaceae), Trapa natans L. (Trapaceae). Рослини цих видів аналізували за допомогою вестерн-блотингу за різних умов температурного і водного режимів в природі та експерименті. Показано значну активацію синтезу HSP70 у відповідь на високу температуру (37-45°С), посуху і ґрунтове затоплення (Козеко та ін., 2011; Кордюм та ін., 2011; Козеко, 2014; 2017; Козеко, Овчаренко, 2015; Козеко, Рахметов, 2016).

Слід відзначити, що для аналізу брали сформовані зелені листки. Можливість використання окремих органів для характеристики стану всього організму була продемонстрована на рослинах, які піддавалися ґрунтовому затопленню. Показано, що затоплення коренів, що спричиняє кореневу гіпоксію, призводить також до активації синтезу HSP70 в листках (Козеко, Овчаренко, 2015; Козеко, Рахметов, 2016; Козеко, 2017). Це свідчить про системний характер реакції HSP70 на зміни умов середовища і, отже, можливість використання окремих органів (листків) для визначення загального стану організму. Крім того, порівняння в цих експериментах динаміки стресової індукції синтезу HSP70 як неспецифічної стресової реакції з активацією синтезу алкогольдегідрогенази (ключового ферменту спиртового бродіння) як специфічної відповіді на гіпоксію показало більш швидку реакцію HSP70 (Козеко, Овчаренко, 2015; Козеко, 2017), що підтверджує можливість його використання як індикатора ранньої стресової реакції.

Приклади тестування рослин природних угруповань та інтродукованих рослин наведено в табл. 2 і на рис. 1. Так, у рослин S. latifolium, одні з яких зростали на мілководді, інші - на невеликій відстані на березі, високий рівень HSP70 виявляли за жарких посушливих погодних умов, причому в суходільних - більшій (рис. 1, А). Очевидно, для повітряно-водних рослин в цьому разі критичним чинником була висока температура, для рослин суходолу - комплексна дія високої температури і посухи. У видів мальви HSP70 не визначався при помірних вологості та температурі, проте, як і у попереднього виду, активно синтезувався за жарких посушливих умов (рис. 1, B). У трав'янистої ліани E. aureum HSP70 виявляли у малій кількості за нормальних умов та умов ґрунтової посухи, тоді як значний його вміст - при тривалому перезволоженні ґрунту і максимальний - після 2 год теплової експозиції (рис. 1, C). У деревного виду S. purpurea малу кількість HSP70 в листках детектували за природної зволоженості ґрунту, і значну кількість - за умов надмірного поливу (рис. 1, F). Це відповідає екологічній характеристиці виду, згідно з якою сприятливими для нього є пухкі, добре аеровані, помірно зволожені ґрунти. У двох водних видів, які можуть адаптуватися до умов суходолу - плаваючого P. stratiotes і прикріпленого до ґрунту H. verticillata - спостерігали однакову закономірність: HSP70 не детектувався у водних рослин, проте у значній кількості синтезувався у рослин, які зростали на березі (рис. 1, D, E). Крім того, у водних рослин H. verticillata відзначали високий рівень індукції синтезу HSP70 після 2 год теплової експозиції. У справжньої водної рослини T. natans, що не може існувати поза водою, білок детектували у слідовій кількості (на межі чутливості методу) за нормальних умов і в невеликій порівняно з іншими видами кількості після 4 год теплової експозиції. Слабку індукцію синтезу HSP70 у цього виду у відповідь на високу температуру ми пов'язуємо з його спеціалізацією до зростання у воді та неможливістю існування поза водою. Відомо, що амплітуда температурних коливань у воді значно менша, ніж у повітрі. Такий феномен відомий для ряду спеціалізованих і ендемічних видів тварин, вузько адаптованих до певних умов існування (Feder, Hofmann, 1999; Tomanek, Somero, 2000; Shatilina et al., 2011; Bedulina et al., 2013).

Важливо зазначити, що у наведених прикладах підвищення вмісту HSP70 відзначалось як у межах швидкої стресової реакції (години), так і під час довготривалої дії несприятливого фактора. Яскравим прикладом останнього також може бути прогресивна активація синтезу цього білка у S. latifolium і S. sisaroideum упродовж 10-добової адаптації, під час якої відбувалася перебудова енергетичного метаболізму і формування системи адвентивних аеренхімоносних коренів (Козеко, Овчаренко, 2015; Козеко, 2017).



Рис. 1 Вестерн-блот-аналіз HSP70 в листках (Козеко та ін., 2011; Кордюм та ін., 2011). (А) Sium latifolium - повітряно-водних (1-3) та суходільної (4) рослин при температурі повітря 41°С; (B) Malva pulchella (1, 2) і M. sylvestris (3, 4) - за помірного зволоження ґрунту при температурі 17°С (1, 3) і за посушливих умов при 41°С (2, 4); (C) Epipremnum aureum - за нормальних умов (1), посушливих умов (2), затоплення ґрунту (3) і після експозиції при 40°С протягом 2 год (4); (D) Pistia stratiotes - плаваючі рослини при температурі води 21°С (1) і суходільні рослини при температурі повітря 20°С (2); (E) Hydrocotyle verticillata - при зростанні у воді за температури 21°С (1), на суші за температури повітря 20°С (2) і водні рослини після експозиції при 40°С протягом 2 год; (F) Salix purpurea - за надмірного поливу (1) і нормального зволоження ґрунту (2) при температурі 17°С. PAGE - фрагменти електрофореграм, забарвлених Кумассі. [Fig. 1 Western-blot-analysis of HSP70 in leaves (Kozeko et al., 2011; Kordyum et al., 2011). (А) Sium latifolium - aerial-aquatic (1-3) and terrestrial (4) plants at air temperature of 41°С; (B) Malva pulchella (1, 2) and M. sylvestris (3, 4) - under moderate soil moisture at temperature of 17°С (1, 3) and under drought at 41°С (2, 4); (C) Epipremnum aureum - under normal conditions (1), water deficit (2), waterlogging (3) and after heat shock at 40°С for 2 h (4); (D) Pistia stratiotes - floating plants at water temperature of 21°С (1) and terrestrial plants at air temperature of 20°С (2); (E) Hydrocotyle verticillata - submersed rooted plants at water temperature of 21°С (1), terrestrial plants at air temperature of 20°С (2) and submersed plants after heat shock at 40°С for 2 h; (F) Salix purpurea - under abundant watering (1) and without watering (2) at temperature of 17°С. PAGE - fragments of electrophoregrams stained with Cumassi.]

Рис. 2 Вестерн-блот-аналіз HSP70 у листках Trapa natans (1), Malva silvestris (2), Malva pulchella (3), Sium sisaroideum (4) and Arabidopsis thaliana (5) за нормальних умов (T. natans при температурі води 20°С, інші при температурі повітря 22 ± 1°С і вологості ґрунту ~ 70%). Типовий блот розташовано під результатами денситометричного аналізу. Внизу - мембрана, забарвлена Ponseau S після електропереносу для контролю завантаження білка. На графіку рівень білка виражено у відсотках до 5. sisaroideum (М ± SD). [Fig. 2 Western-blot-analysis of HSP70 in leaves of Trapa natans (1), Malva silvestris (2), Malva pulchella (3), Sium sisaroideum (4) and Arabidopsis thaliana (5) under normal conditions (T. natans - at water temperature of 20°С, the other - at air temperature of 22 ± 1°С and soil water content ~ 70%). A typical blot is shown under the results of densitometric analysis. Ponseau S-stained membrane after electrotransmission for protein loading control (bottom). On the graph, the protein level is expressed as a percentage of 5. sisaroideum (М ± SD).]

Описані результати дозволяють розглядати рівень HSP70 як інтегральний індикатор стану рослин за формулою: більший вміст HSP70 в клітинах є показником напруженого стану рослин і негативного впливу середовища. При цьому напівкількісна імунодетекція (вестерн-блотинг) виявилася достатньою для визначення суттєвих змін у вмісті білка, залишаючи за межами аналізу його тонкі варіації, що загалом відповідає задачам оціночного тестування. На основі даних літератури і результатів власних досліджень нами розроблено спосіб визначення стану рослин природних фітоценозів та інтродукованих рослин, що включає оцінку фізіологічного стану рослини та впливу на нього екологічних факторів шляхом імунодетекції білків HSP70 у зразках рослинного матеріалу (листках) (Патент на корисну модель № 65170). Без сумніву, зазначений підхід може бути корисним і у тестуванні сільськогосподарських культур.

Проблеми і перспективи

Проте широке застосування HSP70 як біомаркера пов'язано з рядом проблем. При використанні HSP70, як і будь-якого іншого молекулярного маркера, необхідно враховувати, що ступінь індукції їх синтезу залежить від виду рослин, його екологічної ніші, генотипу, стадії розвитку, наявності денних і сезонних ритмів (Feder, Hofmann, 1999; Sorensen, 2010). Поріг індукції генів HSP у різних видів також є різним (Evgen'ev et al., 2007; Shatilina et al., 2011; Bedulina et al., 2013). Представники різних таксонів можуть суттєво відрізнятися за базовим (конститутивним) рівнем синтезу. Як приклад, на рис. 2 наведено базовий рівень HSP70 рослин п'яти видів за умов, близьких до оптимальних. Врахувати вказані особливості, ймовірно, можна шляхом побудови калібрувальної шкали для кожного цільового виду - від мінімуму за оптимальних умов до максимальної індукції, наприклад, за теплового шоку.

Крім того, враховуючи трудомісткість вестерн-блотингу та необхідність для його проведення відповідного обладнання і кваліфікованого персоналу, доцільним є створення більш зручної у використанні тест-системи.

У подальшому корисним також може бути порівняння HSP70 з іншими показниками. Такий підхід є близьким до концепції інтегрованої відповіді біомаркерів (Integrated Biomarker Response), згідно з якою надійна оцінка може бути отримана шляхом використання добре стандартизованих мультіпараметричних індексів (Stirbet et al., 2018), та відповідає сучасній тенденції щодо комплексного підходу при моніторингу природних об'єктів (Ma et al., 2013). Вирішення цих питань зробить можливим застосування HSP70 як складової комплексної системи моніторингу стану рослинності з використанням наземних та дистанційних методів досліджень.



Література

1. Гамбург К.З., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Таусон Е.Л., Рихванов Е.Г., Боровский Г.Б., Войников В.К. 2011. Сравнение устойчивости к высокой температуре суспензионных культур Арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) и Теллунгиеллы (Тііеііипдіеііа salsuginea). Докл. РАН. 439 (3): 421-424.

2. Гудкова Н.В., Косаковская И.В., Кравець В.С., Майор П.С. 2001. Влияние ионизирующего излучения на синтез белков этиолированных проростков озимой пшеницы. Физиология и биохимия культ. растений 33 (2): 121-126.

3. Козеко Л.Є. 2017. Синтез білка теплового шоку HSP70 і алкогольдегідрогенази у листках Arabidopsis thaliana і Sium sisaroideum у відповідь на затоплення ґрунту. Вісн. Харків. нац. аграрн. унту. Сер. Біологія. 3 (42): 46-51.

4. Козеко Л.Є. 2014. Изменения в синтезе белков теплового шока и термоустойчивости проростков Arabidopsis thaliana при ингибировании Hsp90 гелданамицином. Цитология. 56 (6): 419-426.

5. Козеко Л.Є., Артеменко О.А., Заславський В.А., Дідух Г.Я., Рахметов Д.Б., Мартинюк Г.М., Дідух Я.П., Кордюм Є.Л. 2011. Оцінка стану рослин при несприятливих змінах екологічних факторів з використанням білка теплового шоку 70 кДа (Hsp70). Укр. ботан. журн. 68 (6): 890900.

6. Козеко Л.Є., Овчаренко Ю.В. 2015. Динаміка структурно-функціональної адаптації Sium latifolium (Apiaceae) до затоплення кореневої системи. Укр. ботан. журн. 72 (2): 172-179.

7. Козеко Л.Є., Рахметов Д.Б. 2016. Особливості динаміки синтезу білків теплового шоку HSP70 у Malva silvestris і M. pulchella (Malvaceae) у зв'язку зі стійкістю до високої температури, затоплення та посухи. Укр. ботан. журн. 73 (2): 194-203.

8. Кордюм Є.Л., Дідух Я.П., Козеко Л.Є., Артеменко О.А., Заславський В.А., Дідух А.Я. 2011. Розробка та підготовка до впровадження методу оцінки стану рослин у несприятливих умовах зовнішнього середовища. Наука та інновації. 7 (5): 73-78.

9. Кордюм Е.Л., Сытник К.М., Бараненко В.В., Белявская Н.А., Климчук Д.А., Недуха Е.М. 2003. Клеточные механизмы адаптации растений к неблагоприятным воздействиям экологических факторов в естественных условиях. Киев: 277 с.

10. Лысенко В.С., Вардуни Т.В., Сойер В.Г., Краснов В.П. 2013. Флуоресценция хлорофилла растений как показатель экологического стресса: теоретические основы применения метода. Фундаментальные исследования. 4 (1): 112-120. (

11. Патент на корисну модель № 65170. Козеко Л.Є., Кордюм Є.Л., Дідух Я.П., Артеменко О.А., Дідух А.Я., Заславський В.А. Спосіб визначення стану рослин природних екоценозів та інтродукованих рослин. 25.11.2011, Бюл. №22.

12. Ananthan J., Goldberg A.L., Voellmy R. 1986. Abnormal proteins serve as eukaryotic stress signals and trigger the activation of heat shock genes. Science. 232 (4749): 522-524.

13. Aparicio F., Thomas C.L., Lederer C., Niu Y., Wang D., Maule A.J. 2005. Virus induction of heat shock protein 70 reflects a general response to protein accumulation in the plant cytosol. Plant Physiol. 138 (1): 529-36.

14. Banti V., Loreti E., Novi G., Santaniello A., Alpi A., Perata P. 2008. Heat acclimation and cross-tolerance against anoxia in Arabidopsis. Plant Cell Environ. 31 (7): 1029-1037.

15. Bedulina D.S., Evgen'ev M.B., Timofeyev M.A., Protopopova M.V., Garbuz D.G., Pavlichenko V.V., Luckenbach T., Shatilina Z.M., Axenov-

16. Gribanov D.V., Gurkov A.N., Sokolova I.M., Zatsepina O.G. 2013. Expression patterns and organization of the hsp70 genes correlate with thermotolerance in two congener endemic amphipod species (Eulimnogammarus cyaneus and E. verrucosus) from Lake Baikal. Mol. Ecol. 22: 1416-1430.

17. Bowen J., Lay-Yee M., Plummer K., Ferguson I. 2002. The heat shock response is involved in thermotolerance in suspension-cultured apple fruit cells. J. Plant Physiol. 159: 599-606.

18. Bray E.A. 2002. Classification of genes differentially expressed during water-deficit stress in Arabidopsis thaliana: an analysis using microarray and differential expression data. Ann. Bot. 89: 803-811.

19. Byth H.A., Kuun K.G., Bornman L. 2001. Virulencedependent induction of Hsp70/Hsc70 in tomato by Ralstonia solanacearum. Plant Physiol. Biochem. 39 (7-8): 697-705.

20. Chankova S., Yurina N. 2016. Chloroplasts heat shock protein 70B as marker of oxidative stress. In: Heat Shock Proteins and Plants. Springer, pp. 169-188.

21. Chaudhary R., Baranwal V.K., Kumar R., Sircar D., Chauhan H. 2019. Genome-wide identification and expression analysis of Hsp70, Hsp90, and Hsp100 heat shock protein genes in barley under stress conditions and reproductive development. Funct. Integr. Genomics. 19: 1007-1022.

22. Chen Y., Chen X., Wang H., Bao Y., Zhang W. 2014. Examination of the leaf proteome during flooding stress and the induction of programmed cell death in maize. Proteome Sci. 12: 33.

23. Chen J., Gao T., Wan S., Zhang Y., Yang J., Yu Y., Wang W. 2018. Genome-wide identification, classification and expression analysis of the HSP gene superfamily in tea plant (Camellia sinensis). Int. J. Mol. Sci. 19: 2633.

24. Chen Z., Zhou T., Wu X., Hong Y., Fan Z., Li H. 2008. Influence of cytoplasmic heat shock protein 70 on viral infection of Nicotiana benthamiana. Mol. Plant Pathol. 9: 809-817.

25. Cong W., Miao Y., Xu L., Zhang Y., Yuan C., Wang J., Zhuang T., Lin X., Jiang L., Wang N., Ma J., Sanguinet K.A., Liu B., Rustgi S., Ou X. 2019. Transgenerational memory of gene expression changes induced by heavy metal stress in rice (Oryza sativa L.). BMC Plant Biol. 19: 282.

26. Crisp P.A., Ganguly D.R., Smith A.B., Murray K.D., Estavillo G.M., Searle I., Ford E., Bogdanovic O., Lister R., Borevitz J.O., Eichten S.R., Pogson B.J. 2017. Rapid recovery gene downregulation during excess-light stress and recovery in Arabidopsis. Plant Cell. 29 (8): 1836-1863.

27. Cuk K., Gogala M., Tkalec M., Vidakovic-Cifrek Z. Transgenerational stress memory in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.: antioxidative enzymes and HSP70. Acta Bot. Croat. 69 (2): 183-197.

28. DeRocher A., Vierling E. 1995. Cytoplasmic HSP70 homologues of pea: differential expression in vegetative and embryonic organs. Plant Mol. Biol. 27: 441-456.

29. Evgen'ev M.B., Garbuz D.G., Shilova V.Y., Zatsepina O.G. 2007. Molecular mechanisms underlying thermal adaptation of xeric animals. J. Biosci. 32: 489499.

30. Feder M.E., Hofmann G.E. 1999. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology. Annu. Rev. Physiol. 61: 243-282.

31. Fietto L.G., Costa M.D.L., Cruz C.D., Souza A.A., Machado M.A., Fontes E.P.B. 2007. Identification and in silico analysis of the Citrus HSP70 molecular chaperone gene family. Genet. Mol. Biol. 30 (3, Suppl.): 881-887.

32. Gao F., Zhou Y., Zhu W., Li X., Fan L., Zhang G. 2009. Proteomic analysis of cold stress-responsive proteins in Thellungiella rosette leaves. Planta. 230: 10331046.

33. George K.J., Malik N., Vijesh Kumar I.P., Krishnamurthy K.S. 2017. Gene expression analysis in drought tolerant and susceptible black pepper (Piper nigrum L.) in response to water deficit stress. Acta Physiol. Plant. 39 (4): 104.

34. Guy C.L., Li Q.B. 1998. The organization and evolution of the spinach stress 70 molecular chaperone gene family. Plant Cell. 10: 539-556.

35. Hlavackova I., Vitamvas P., Santrucek J., Kosova K., Zelenkova S., Prasil I.T., Ovesna J., Hynek R., Kodicek M. 2013. Proteins involved in distinct phases of cold hardening process in frost resistant winter barley (Hordeum vulgare L.) cv Luxor. Int. J. Mol. Sci. 14 (4): 8000-8024.

36. Hu W., Hu G., Han B. 2009. Genome-wide survey and expression profiling of heat shock proteins and heat shock factors revealed overlapped and stress specific response under abiotic stresses in rice. Plant Sci. 176 (4): 583-590.

37. Hu X., Liu R., Li Y., Wang W., Tai F., Xue R., Li C. 2010. Heat shock protein 70 regulates the abscisic acid-induced antioxidant response of maize to combined drought and heat stress. Plant Growth Regul. 60 (3): 225-235.

38. Hwang J.E., Hwang S.G., Kim S.H., Lee K.J., Jang C.S., Kim J.B., Kim S.H., Ha B.K., Ahn J.W., Kang S.Y., Kim D.S. 2014. Transcriptome profiling in response to different types of ionizing radiation and identification of multiple radio marker genes in rice. Physiol. Plant. 150 (4): 604-19.

39. Ireland H.E., Harding S.J., Bonwick G.A., Jones M., Smith C.J., Williams J.H.H. 2004. Evaluation of heat shock protein 70 as a biomarker of environmental stress in Fucus serratus and Lemna minor. Biomarkers. 9 (2): 139-155.

40. Jia D., Zhang B., Zhang P.P., Zhang J.Y., Liu Y.H., Wang J.S., Ma R.Y. 2015. Identification of differentially expressed genes in Alternanthera philoxerides under drought stress using suppression subtractive hybridization. Russ. J. Plant Physiol. 62 (1): 93-100.

41. Jiang L., Hu W., Qian Y., Ren Q., Zhang J. 2021. Genome-wide identification, classification and expression analysis of the Hsf and Hsp70 gene families in maize. Gene. 770: 145348.

42. Jiang S., Lu Y., Li K., Lin L., Zheng H., Yan F., Chen J. Heat shock protein 70 is necessary for rice stripe virus infection in plants. Mol. Plant Pathol. 15: 907-917.

43. Jouili H., Bouazizi H., El Ferjani E. 2011. Plant peroxidases: biomarkers of metallic stress. Acta Physiol. Plant. 33: 2075.

44. Komatsu S., Makino T., Yasue H. 2013. Proteomic and biochemical analyses of the cotyledon and root of flooding-stressed soybean plants. PLoS ONE. 8 (6): e65301.

45. Kordyum E.L., Dubyna D.V. 2019. Phenotypic plasticity in plant adaptation and coexistence. Int. J. Adv. Res. Bot. 5 (3): 8-13

46. Kosova K., Vitamvas P., Planchon S., Renaut J., Vankova R., Prasil I.T. 2013. Proteome analysis of cold response in spring and winter wheat (Triticum aestivum) crowns reveals similarities in stress adaptation and diferences in regulatory processes between the growth habits. J. Proteome Res. 12: 4830-4845.

47. Kozeko L. 2021. Different roles of inducible and constitutive HSP70 and HSP90 in tolerance of Arabidopsis thaliana to high temperature and water deficit. Acta Physiol. Plant. 43: 58.

48. Kozeko L., Kordyum E. 2009. Effect of hypergravity on the level of heat shock proteins 70 and 90 in pea seedlings. Microgravity Sci. Technology. 21 (1): 175-178.

49. Kozeko L., Talalaiev O., Neimash V., Povarchuk V. A protective role of HSP90 chaperone in gamma-irradiated Arabidopsis thaliana seeds. Life Sci. Space Res. 6: 51-58.

50. Kovalchuk I., Kovalchuk O. 2008. Transgenic plants as sensors of environmental pollution genotoxicity. Sensors. 8: 1539-1558.

51. Kubienova L., Sedlarova M., Wunschova A., Piterkova J., Luhova L., Mieslerova B., Lebeda A., Navratil M., Petrivalsky M. 2013. Effect of extreme temperatures on powdery mildew development and Hsp70 induction in tomato and wild Solanum spp. Plant Protect. Sci. 49: 41-54.

52. Lamech L.T., Haynes C.M. 2015. The unpredictability of prolonged activation of stress response pathways. J. Cell Biol. 209 (6): 781-787.

53. Landi S., Capasso G., Ben Azaiez F.E., Jallouli S., Ayadi S., Trifa Y., Esposito S. 2019. Different roles of heat shock proteins (70 kDa) during abiotic stresses in barley (Hordeum vulgare) genotypes. Plants. 8: 248.

54. Leng L., Liang Q., Jiang J., Zhang C., Hao Y., Wang X., Su W. 2017. A subclass of HSP70s regulate development and abiotic stress responses in Arabidopsis thaliana. J. Plant Res. 130: 349-363.

55. Li Q.B., Guy C.L. 2001. Evidence for non-circadian light/dark-regulated expression of Hsp70s in spinach leaves. Plant Physiol. 125: 1633-1642.

56. Li Q.B., Haskell D.W., Guy C.L. 1999. Coordinate and noncoordinate expression of the stress 70 family and other molecular chaperones at high and low temperature in spinach and tomato. Plant Mol. Boil. 39: 21-34.

57. Li Z., Long R., Zhang T., Wang Z., Zhang F., Yang Q., Kang J., Sun Y. 2017. Molecular cloning and functional analysis of the drought tolerance gene MsHSP70 from alfalfa (Medicago sativa L.). J. Plant Res. 130: 387-396.

58. Lichtenthaler H.K. 1998. The stress concept in plants: an introduction. In: Stress of life from molecules to man. Ann. N. Y. Acad. Sci. 851: 187-198.

59. Lin B., Wang J., Liu H., Chen R., Meyer Y., Barakat A., Delseny M. 2001. Genomic analysis of the Hsp70 superfamily in Arabidopsis thaliana. Cell Stress & Chaperones. 6 (3): 201-208.

60. Lin S., Wu T., Li M., Huang X., Zhang Y., Han L., Wu B., Chen Y., Lin S., Lin D., Wu M., Wu J. 2019. Cloning, in silico characterization, subcellular localization, and expression of a heat shock cognate 70 kDa protein/gene (EjHsc70-2) from Eriobotrya japonica. Acta Physiol. Plant. 41: 119.

61. Liu J., Pang X., Cheng Y., Yin Y., Zhang Q., Su W., Hu , Guo Q., Ha S., Zhang J., Wan H. 2018. The Hsp70 gene family in Solanum tuberosum: genomewide identification, phylogeny, and expression patterns. Sci. Rep. 8: 16628.

62. Liu G.T., Wang J.F., Cramer G., Dai Z.W., Duan W., Xu H.G., Wu B.H., Fan P.G., Wang L.J., Li S.H.

63. Transcriptomic analysis of grape (Vitis vinifera L.) leaves during and after recovery from heat stress. BMC Plant Biol. 12: 174.

64. Ma N.L., Rahmat Z., Lam S.S. 2013. A review of the “Omics” approach to biomarkers of oxidative stress in Oryza sativa. Int. J. Mol. Sci. 14: 7515-7541.

65. Majoul T., Bancel E., Triboi E., Hamida J.B., Branland G. 2004. Proteomic analysis of the effect of heat stress on hexaploid wheat grain: characterization of heat-responsive proteins from non-prolamins fractions. Proteomics. 4: 505-513.

66. Makoto H., Setsuko K. 2007. Proteomic analysis of rice seedlings during cold stress. Proteomics. 7: 12931302.

67. Manaa A., Ben Ahmed H., Valot B., Bouchet J.P., Aschi-Smiti S., Causse M., Faurobert M. 2011. Salt and genotype impact on plant physiology and root proteome variations in tomato. J. Exp. Bot. 62: 2797-2813.

68. Mayer M.P., Bukau B. 2005. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell. Mol. Life Sci. 62: 670-684.

69. Nam M.H., Heo E.J., Kim J.Y., Kim S.I., Kwon K.H., Seo J.B. Kwon O., Jong S.Y., Park Y.M. 2003. Proteome analysis of the responses of Panax ginseng A. Meyer leaves to high light: use of electrospray ionization quadrupole-time of flight mass spectrometry and expressed sequence tag data. Proteomics. 3 (12): 2351-2367.

70. Niederbacher B., Winkler J.B., Schnitzler J.P. 2015. Volatile organic compounds as non-invasive markers for plant phenotyping. J. Exp. Bot. 66 (18): 5403-5416.

71. Noel L.D., Cagna G., Stuttmann J., Wirthmuller L., Betsuyaku S., Witte C.-P., Bhat R., Pochon N., Colby T.,Parker J.E. 2007. Interaction between SGT1 and cytosolic/nuclear HSC70 chaperones regulates Arabidopsis immune responses. Plant Cell. 19: 40614076.

72. Nordhues A., Schottler M.A., Unger A.K., Geimer S., Schonfelder S., Schmollinger S., Rutgers M., Finazzi G., Soppa B., Sommer F., Muhlhaus T., Roach T., Krieger-Liszkay A., Lokstein H., Crespo J.L.,

73. Schroda M. 2012. Evidence for a role of VIPP1 in the structural organization of the photosynthetic apparatus in Chlamydomonas. Plant Cell. 24 (2): 63759.

74. Pan X., Zhu B., Luo Y., Fu D. 2013. Unraveling the protein network of tomato fruit in response to necrotrophic phytopathogenic rhizopus nigricans. PLoS ONE. 8: e73034.

75. Paul A.L., Zupanska A.K., Ostrow D.T., Zhang Y., Sun Y., Li J.L., Shanker S., Farmerie W.G., Amalfitano C.E., Ferl R.J. 2012. Spaceflight transcriptomes: unique responses to a novel environment. Astrobiology. 12: 40-56.

76. Renaut J., Lutts S., Hofmann L., Hausman J. 2004. Responses of poplar to chilling temperatures: proteomic and physiological aspects. Plant Biol. 6: 81-90.

77. Rizhsky L., Liang H., Shuman J., Shulaev V., Davletova S., Mittler, R. 2004. When defense pathways collide. The response of Arabidopsis to a combination of drought and heat stress. Plant Physiol. 134: 16831696.

78. Rodriguez-Serrano M., Romero-Puertas M.C., Pazmino D.M., Testillano P.S., Risueno M.C., Del Rio L.A., Sandalio L.M. 2009. Cellular response of pea plants to cadmium toxicity: cross talk between reactive oxygen species, nitric oxide, and calcium. Plant Physiol. 150 (1):229-43.

79. San C., Sun-Hee K., Sung Oh I., Won-Joong J., Mi Sook H., Eun-Jeong P., Dong-Woog C. 2015. The heat shock protein 70a from 'Pyropia seriata' increases heat tolerance in 'Chlamydomonas'. Plant Omics. 8 (4): 327-334.

80. Sarkar N.K., Kundnani P., Grover A. 2013. Functional analysis of Hsp70 superfamily proteins of rice (Oryza sativa). Cell stress chaperones. 18 (4): 427-37.

81. Scarpeci T.E., Zanor M.I., Carrillo N., Mueller Roeber B., Valle E.M. 2008. Generation of superoxide anion in chloroplasts of Arabidopsis thaliana during active photosynthesis: A focus on rapidly induced genes. Plant Mol. Biol. 66: 361-78.

82. Scharf K.D., Berberich T., Ebersberger I., Nover L. 2012. The plant heat stress transcription factor (Hsf) family: Structure, function and evolution.

83. Biochimica et Biophisica Acta. 1819: 104-119.

84. Sershen, Varghese B., Naidoo C., Pammenter N.W. The use of plant stress biomarkers in assessing the effects of desiccation in zygotic embryos from recalcitrant seeds: challenges and considerations. Plant Biol. J. 18 (3): 433-444.

85. Shatilina Z.M., Riss H.W., Protopopova M.V., Trippe M., Meyer E.I., Pavlichenko V.V., Bedulina D.S., Axenov-Gribanov D.V., Timofeyev M.A. The role of the heat shock proteins (HSP70 and sHSP) for the thermotolerance of freshwater amphipods from contrasting habitats. J. Therm. Biol. 36: 142-149.

86. ShuiFeng Y.E., ShunWu Y.U., LieBo S.H.U., JinHong W.U., AiZhong W.U., LiJun L.U.O. 2012. Expression profile analysis of 9 heat shock protein genes throughout the life cycle and under abiotic stress in rice. Chinese Sci. Bull. 57 (4): 336-343.

87. Song G., Yuan S., Wen X., Xie Z., Lou L., Hu B., Cai Q., Xu B. 2018. Transcriptome analysis of Cdtreated switchgrass root revealed novel transcripts and the importance of HSF / HSP network in switchgrass Cd tolerance. Plant Cell Rep. 37: 14851497.

88. Sorensen J.G. 2010. Application of heat shock protein expression for detecting natural adaptation and exposure to stress in natural populations. Curr. Zool. 56 (6): 703-713.

89. Sorensen J.G., Kristensen T.N., Loeschcke V. 2003. The evolutionary and ecological role of heat shock proteins. Ecol. Lett. 6: 1025-1037.

90. Stirbet A., Lazar D., Kromdijk J., Govindjee. 2018. Chlorophyll a fluorescence induction: Can just a one-second measurement be used to quantify abiotic stress responses? Photosynthetica. 56: 86-104.

91. Sung D.Y., Guy C.L. 2003. Physiological and molecular assessment of altered expression of Hsc70-1 in Arabidopsis. Evidence for pleiotropic consequences. Plant Physiol. 132 (2): 979-987.

92. Sung D.Y., Vierling E., Guy C.L. 2001. Comprehensive expression profile analysis of the Arabidopsis Hsp70 gene family. Plant Physiol. 126: 789-800.

93. Swindell W.R., Huebner M., Weber A.P. 2007. Transcriptional profiling of Arabidopsis heat shock proteins and transcription factors reveals extensive overlap between heat and non-heat stress response pathways. BMC Genomics. 8: 125.

94. Taylor N.L., Heazlewood J.L., Day D.A., Millar A.H. 2005. Differential impact of environmental stresses on the pea mitochondrial proteome. Mol. Cell. Proteom. 4: 1122-1133.

95. Tomanek L., Somero G.N. 2000. Time course and magnitude of synthesis of heat-shock proteins in congeneric marine snails (genus Tegula) from different tidal heights. Physiol. Biochem. Zool. 73 (2): 249256.

96. Tang R., Gupta S.K., Niu S. Li X.Q., Yang Q., Chen G., Zhu W., Haroon M. 2020. Transcriptome analysis of heat stress response genes in potato leaves. Mol. Biol. Rep. 47: 4311-4321.

97. Tang T., Yu A., Li P., Yang H., Liu G., Liu L. 2016. Sequence analysis of the Hsp70 family in moss and evaluation of their functions in abiotic stress responses. Sci Rep. 6: 33650.

98. Wang X.Q., Yang P.F., Liu Z., Liu W.Z., Hu Y., Chen H., Kuang T.Y., Pei Z.M., Shen H.S., He Y.K. Exploring the mechanism of Physcomitrella patens desiccation tolerance through a proteomic strategy. Plant Physiol. 149: 1739-1750.

99. Whitham S.A., Quan S., Chang H., Cooper B., Estes B., Zhu T., Wang X., Hou Y. 2003. Diverse RNA viruses elicit the expression of common sets of genes in susceptible Arabidopsis thaliana plants. Plant J. 33: 271-283.

100. Wong C.E., Li Y., Whitty B.R., Diaz-Camino C., Akhter S.R., Brandle J.E., Golding G.B., Weretilnyk A., Moffatt B.A., Griffith M. 2005. Expressed sequence tags from the Yukon ecotype of Thellungiella reveal that gene expression in response to cold, drought and salinity shows little overlap. Plant Mol. Biol. 58: 561-574.

101. Ye T., Shi H., Wang Y., Chan Z. 2015. Contrasting changes caused by drought and submergence stresses in bermudagrass (Cynodon dactylon). Front. Plant Sci. 6: 951.

102. Yer E.N., Baloglu M.C., Ziplar U.T., Ayan S., Unver T. 2015. Drought-responsive Hsp70 gene analysis in Populus at genome-wide level. Plant Mol. Biol. Rep. 34: 483-500.

103. Young L.W., Wilen R.W., Bonham-Smith P.C. 2004. High temperature stress of Brassica napus during flowering reduces microand megagametophyte fertility, induces fruit abortion, and disrupts seed production. J. Exp. Bot. 55 (396): 485-495.