Основы клинико-биохимической аналитики

Размещено на http://www.allbest.ru/

Лекция 1. Основы клинико-биохимической аналитики: объекты и методы исследования; оценка и интерпретация результатов; единицы СИ; нормы (референтные величины); контроль качества исследований

1.1 Предмет клинической биохимии

Клиническая биохимия это прикладной раздел биологической химии. Как, Вы помните, биологическая химия это наука о химических основах жизнедеятельности, которая устанавливает структуру молекул и надмолекулярных образований живого, их функции, механизмы обмена веществ и энергии, механизмы воспроизведения.

Клиническая биохимия изучает биохимические изменения, происходящие в организме животных при различных заболеваниях и патологических состояниях, способы и методы обнаружения этих изменений. Изучение отклонений базируется на естественном течении процессов.

ЗАДАЧИ КЛИНИЧЕСКОЙ БИОХИМИИ (РИС.):

изучение биохимических изменений в организме животных разных видов при патологии;

освоение традиционных и перспективных методов биохимического исследования;

клиническая интерпретация результатов биохимического исследования;

разработка лечебно-профилактических мероприятий с учетом данных лабораторных анализов.

Предмет клиническая биохимия базируется на ряде общебиологических дисциплин (рис), а также является базой для специальных ветеринарных дисциплин.

2. Объекты исследования в клинической биохимии

Под объектом клинической биохимии понимается биологический материал, получаемый от исследуемого животного. В целом биохимическому исследованию может подвергаться любой орган или ткань.

С точки зрения практической клинической биохимии биологический материал, получаемый от животных можно классифицировать (рис 4) на универсальный, такой как кровь, моча, кал и лимфа. Исследование химического состава данных биологических объектов, отражающих функцию многих органов и систем, может иметь важное диагностическое значение при значительном числе заболеваний. Исследуется данный материал также для установления общего состояния здоровья животных и уровня обмена веществ. Материал специальный (выпотные жидкости, рубцовое и желудочное содержимое, мокрота, биоптаты органов и др.) - отбирается и исследуется при определенных показаниях с целью дифференциации процесса и постановки диагноза. Например, выпотные жидкости, скапливающие в полостях необходимо получать и исследовать для установления типа экссудации (транссудат это, либо экссудат). Перечисленные выше биологические материалы наиболее широко используются в клинической биохимической практике. В настоящее время, особенно в медицине, уделяется внимание нетрадиционным биологическим объектам, таким как волосы, слюна, ногти и др. Например, установлен факт резкого (в 10 и более раз) падения содержания кальция в волосе при развитии инфаркта миокарда, что в настоящее время широко применяется в кардиологии.

Химический состав биологического материала вариабелен. Он может за короткий промежуток времени значительно изменяться. Поэтому для получения сопоставимых результатов необходимо соблюдать ряд правил при отборе и хранении биологического материала. Это важно, так как нормативные значения определены с учетом этих правил.

Отбор материала необходимо производить с учетом суточной динамики. Кровь принято отбирать утром, до кормления. При повторном исследовании отбирать материал необходимо в одно и то же время.

В течение 4часов после кормления концентрация некоторых субстратов (общий белок, глюкоза, липиды и ряд. других) повышена (к примеру, норма для содержания глюкозы в сыворотке крови у крупного рогатого скота колеблется в пределах 2,2 - 3,2 ммолъ/л, однако в течение 1 - 2 часов после кормления ее концентрация может возрастать в 2-4 и более раз, при углеводном перекорме глюкоза может кратковременно появляться в моче). У некоторых видов животных: свиней и взрослых курей сразу после кормления ряд биохимических исследований в сыворотке крови невозможны вовсе из высокого содержания в ней жира ирядя др. веществ, придающих ей мутность.

Процесс отбора биологического материала должен быть максимально безболезненным и быстрым (беспокойство, болевая реакция, длительный венозный застой в месте инъекции значительно изменяют состав крови).

Взятие материала всегда проводят до лечебных процедур, особенно внутривенных инъекций электролитов, раствора глюкозы. Так же необходимо учитывать лекарственные препараты, которые вводились животному (например, вакцинация против КЧС живыми вакцинами приводит к снижению фагоцитарной активности нейтрофилов)

Полученный материал сразу же помещается в чистую и закрытую посуду. Контакт с внешней средой не допускается. В случае, если исследуемое вещество (например, билирубин, витамин В2 и др.) разрушаются на свету, биологический материал помещают в светонепроницаемый пакет или ящик.

Биологические процессы продолжаются и in vitro, поэтому их необходимо минимизировать. Для этого, если не используются консерванты, наиболее подходит низкая температура. Клеточные структуры сохраняют при температуре 4 - 8 0 С (не допуская замораживания). Сыворотку, плазму и другие безклеточные биологические материалы лучше сразу после получения замораживать и транспортировать в таком виде. Считается, что при температуре -25 0 С активность ферментов минимальна. Для каждого определяемого показателя при определенных условиях существуют максимальные сроки хранения (указываются обычно в методиках).

Кровь - основной объект клинической биохимии, наиболее часто подвергаемый биохимическому исследованию. Пробы крови берут у животных перед кормлением или через 5 - 6 часов после кормления.

Различают стабилизированную кровь, предохраненную от свертывания посредством внесения в нее стабилизатора (антикоагулянта). Она используется для получения плазмы и форменных элементов. В качестве антикоагулянгов применяют различные соли, осаждающие ионизированный кальций и другие катионы двухвалентных металлов, необходимых для свертывания крови, а так же вещества животного происхождения (гепарин, герудин), блокирующих вторую фазу свертывания Наиболее часто ис-пользуются следующие антикоагулянгы (рис):

соли щавелевой кислоты (калия или натрия оксалаты) в количестве 10 - 20 мг 10 мл крови или 0,15 мл 10 %-ного раствора;

натрий лимоннокислый прибавляют из расчета 16 мг на 10 мл крови, в 3,2 %-ном растворе берут одну часть на 19 частей крови;

трилон Б (динатривая или дикалевая соль ЭДТА - этилендиаминтетрауксусной кислоты) - 10 мгна 10 мл крови или 0,1 - 0,2 мл 10 %-ного раствора (3 - 4 капли на пробирку);

гепарин берут из расчета 50 ЕД на 10 мл крови (1-2 капли из иглы для внутрикожткинъекций).

При добавлении раствора антикоагулянта вносимый объем учитывается, т.к. он влияет на гематокритную величину. Химическое вещество, входящее в состав антикоагулянта при анализе не определяется.

Цельная кровь и другой клеточный биологический материал доставляется в лабораторию в термосе при 4 - 8°С.

Разделение крови на плазму и форменные элементы проводят путем отстаивания и центрифугирования стабилизированной крови при 500 - 800 g 10 - 20 мин.

Для получения сыворотки кровь отбирают в сухие чистые пробирки. Кровь при комнатной температуре сворачивается в течение 5-11 минут и при дальнейшем стоянии расслаивается. Над сгустком собирается сыворотка. Для ускорения отделения сыворотки в лаборатории свернувшуюся кровь отделяют от стенок пробирки спицей из нержавеющей стали и помещают в термостат при температуре 37 - 38 °С (на 15 - 45 мин). Отделившуюся сыворотку выливают в центрифужные пробирки и центрифугируют при тех же условиях, что и плазму.

При определении значительного количества веществ в крови (например, глюкозы, мочевины, кальция, фосфора, аскорбиновой кислоты, каротина и ряда др.) необходимо освободить ее от белка. Достигается это посредством осаждения белка под действием определенных химических реактивов. В качестве универсального осаждающего раствора в лабораторной практике используются 5 - 40 % растворы трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Концентрация ТХУ выбирается в зависимости от степени осаждения. Конечная концентрация ее должна составлять 2,5 - 5 %. Наиболее часто сыворотку разводят в определенной пропорции дистиллированной водой и затем добавляютравное количество 10 % ТХУ (например, в пробирку вносится 0,1 мл сыворотки, 0,4 мл дистиллированной воды и 0,5 мл 10 % ТХУ). Хорошо осаждаются белки при смешивании сыворотки или плазмы крови с 96 % этанолом в соотношении 1:3. Если сыворотка, плазма или безбелковый фильтрат получены на ферме, то в лабораторию они доставляются в замороженном состоянии.

Дефектом, искажающим результаты исследований по целому ряду показателей, является гемолиз (лизис форменных элементов) крови. Признакам его является равномерное окрашивание отстоявшейся плазмы или сыворотки в вишнево-красный цвет (за счет гемоглобина). Гемолизированная сыворотка практически, не для каких исследований не пригодна.

Наиболее частыми причинами гемолиза являются:

взятие крови в шприц (вакуум, создающийся в шприце при оттянутом поршне, разрушает мембраны эритроцитов);

вспенивание крови при взятии, когда струйка крови направляется не по стенке пробирки, а на дно;

взятие крови в холодную пробирку, с наличием на стенках конденсата или замерзание ее при транспортировке в холодное время года;

центрифугирование на больших оборотах центрифуги (более 1000 g).

Подготовка мочи для исследований.

Мочу у животных получают несколькими способами: при естественном акте мочеиспускания; посредством катетеризации; при помещении мелких животных в специальные клетки. При этом посуда должна быть чистой и сухой. Для проведения обычных качественных тестов подходит произвольно взятая порция мочи. При подозрении на сахарный диабет получают мочу через 2 - 3 часа после дачи корма. При подозрении на нефрит анализу подвергают утреннюю порцию мочи, поскольку она имеет более высокую относительную плотность и низкий уровень рН.

Лучше всего исследовать свежеполученную (не более 2 ч после взятия) мочу, но если такой возможности нет, то хранят ее в закрытой посуде в холодильнике (не более 36 часов) или консервируют, используя следующие вещества (рис):

толуол - 2 млна 100 мл мочи;

тимол (1-2 кристалика на 100-150 мл мочи), может давать ложноположительную пробу на белок;

хлороформ или формалин (1- 2 капли на такое же количество);

борная кислота (0,3 г на 120 мл мочи.

При проведении бактериологического исследования консервированная моча непригодна.

Подготовка полостных жидкостей для исследований.

По характеру полостные жидкости, которые скапливаются в полостях организма, делят на экссудаты и транссудаты. Получают их путем прокола стенки соответствующей полости. В лабораторию доставляют все количество пунктата, если его получено меньше 1л. При большем объеме доставляет последнюю порцию (до 1 л), так как она наиболее богата клеточными элементами. Полученную выпотную жидкость помещают в чистую, сухую посуду, добавляют стабилизаторы (натрия цитрат - 1 мг/мл, гепарин) и подвергают исследованию.

Подготовка для биохимического исследования содержимого желудка и рубца. Желудочное и рубцовое содержимое получают посредством зондирования. Необходимо извлекать его под действием вакуума и недопустимо исследование содержимого, полученного путем промывки. Рубцовое и желудочное содержимое сохраняется при температуре 4 - 80 С, никакие химические консерванты не используются.

Получение тканей и предварительная подготовка их для биохимического анализа. Изучение метаболизма тканей и органов в процессе развития заболеваний может иметь важное диагностическое значение и осуществляется посредством биопсии.

Биопсия - прижизненное получение ткани (биоптата) органа для гистологического и химического исследования. В лаборатории из биоптатов готовят гомогенаты. Для приготовления гомогенатов применяют изотонические растворы: 0,25 М глюкозы, 0,88 М сахарозы, 0,9 натрия хлорида. Гомогенаты получают двух типов: с разрушенными и не разрушенными клеточными органеллами. Для получения гомогенатов биоптаты отмывают от крови физиологическими жидкостями, удаляют соединительнотканные прослойки и измельчают (гомогенизируют) сначала ножницами, а затем в гомогенизаторах. Измельчения и разрушение клеток можно достичь многократным размораживанием и оттаиванием ткани, а также ультразвуком.

Получение и предварительная подготовка спинномозговой жидкости для биохимического анализа. Лик-вор (спинномозговую жидкость) подвергают исследованию с целью диагностики и дифференциальной диагностики болезней нервной системы, в первую очередь при органических поражениях головного и спинного мозга (менингоэнце-фалит, менингомиелит, кровоизлияния, новообразования и др.). Ликвор исследуют сразу же после получения, т.к. через 10-12 ч хранения спинномозговая жидкость обычно мутнеет и изменяются ее химические свойства. Не замораживать.

3. Оценка результатов исследования. Единицы измерения, используемые в клинической биохимии

Оценка результатов исследования проводится путем сравнения полученных данных с эталонной (референтной или нормативной) величиной.

Норма не всегда соответствует физиологическому состоянию. Так в настоящее время уровень общего белка в крови КРС более низкий, чем был ранее. Так же уровень некоторых микроэлементов в крови животных в РБ более низкий, чему животных другихрегионов мира и связано это с особенностями нашей геобиохимической провинции.

Эталонную (норму) величину получают путем исследования большой группы животных, отобранных по совокупности каких-то признаков. Цифровой материал, получаемый при этом, затем статистически проверяется, определяются интервалы значений. В настоящее время по многим показателям почти для всеххозяйственно важных животных данные величины определены, и они находятся в соответствующих справочниках по клинической биохимии и физиологии. При наличии каких-то специфических условий - эталонные единицы определяются самостоятельно. (Например, хозяйство находится в экологически неблагоприятном районе и в таком случае создается 2 группы обследуемых животных: группа с какой-то патологией и клинически здоровые животные. Вторая группа и будет эталонной. Количество животных в ней должно быть не менее 10).

Что касается единиц измерения в клинической биохимии, то здесь, как и во всех областях производства, науки и техники в нашей стране используется система единиц СИ. Еще с 1980 года это нормативно закреплено.

СИ состоит из единиц 3 типов - основных, дополнительных и производных. Универсальна она потому, что 7 основных и 2 дополнительных единицы имеют постоянный природный эталон, который может быть достоверно измерен. Так по скорости движения света в вакууме можно определить длину. Производные единицы получаются из сочета-ниядвух или более основных единиц, путем умножения или деления. Для каждой отрасли, в т. ч. и для клинической биохимии, учитывая спецификуразмерности величин, определеноряд допустимых правил:

В качестве единиц объема следует применять литр. Не рекомендуется в знаменателе применять дольные или кратные от литра (1 мл, 100 мли т.п.).

Концентрация измеряемых веществ указывается как молярная (моль/л) или как массовая концентрация (г/л).

Молярная концентрация используется для веществ с известной относительной молекулярной массой. Ионная концентрация указывается в виде молярной.

Массовую концентрацию используют для веществ, относительная молекулярная масса которых неизвестна.

Плотность указывается в г/л; клиренс - в мл/с.

Активность ферментов выражается количеством исходного вещества или продукта катализируемой реакции в единицу времени на объем биологического материала как моль/(с- л) - катал; мкмоль/(с- л); нмоль/(с-л).

В ряде случаев, строго ограниченных и определенных используют традиционные единицы, например мм. рт. столба, т.к. существующие приборы градуированы в этих единицах, а переход в Па трудоемок (1 мм. рт. столба = 133,5 Па) и специальные - в ряде методик количественный учет не возможен (так в тимоловой пробе используют единицы помутнения по S-H шкале). При использовании специальных единиц в методиках обязательно оговаривается, что под ними понимается.

При переводе внесистемных единиц в системные существуют два подхода:

для когерентных величин не требуется коэффициентов перевода, например г/% переводятся в/г умножением на 10;

для некогерентных единиц перевод осуществляется с помощью коэффициентов пересчета, например г/л переводятся в моль/л с помощью коэффициента находимого по формуле 1/М вещества. Такие коэффициенты есть в справочных таблицах (рис).

1.2 Аналитическая надежность и диагностическая значимость лабораторных тестов

Используемые тесты должны бать аналитически надежными. Аналитическая надежность устанавливается для каждого метода посредством определения четырех показателей таких как: воспроизводимость, правильность, чувствительность и специфичность. Обычно указывается в методиках.

Воспроизводимость результатов - соответствие результатов повторных определений в одном и том же материале. Рассчитывают по результатам повторных определений на одном и том же контрольном материале в течение не менее 20 дней, следующих друг за другом. Статистическим показателем разброса результатов является среднеквадрати-ческое отклонение S и относительный показатель разброса результатов -- коэффициент вариации V. Чем меньше коэффициент вариации, тем выше воспроизводимость результатов, получаемых тем или иным методом. Результаты воспри-зводимы, если X = (или Z 3s).

Правильность результатов это соответствие среднего значения результатов повторных определений одного и того же материала должной (номинальной) величине. Статистическим критерием правильности является средняя арифметическая (X) и степень ее отклонения от должного (номинального) значения. Способами определения правильности могут быть следующие.

Способ добавки - внесение в биологическую жидкость точно взвешенного количества анализируемого вещества и определение его с помощью исследуемого метода.

Способ смешивания проб - биологическая жидкость с низкой и с высокой концентрацией исследуемого вещества смешивается в различных соотношениях.

Процент выявления вещества, равный 90--110, считается удовлетворительным для клинических лабораторных

методов.

Исследование контрольного материала с известным содержанием компонентов - наиболее простой способ оценки правильности.

Сравнение методов. Наиболее информативным способом является способ сравнения методов, который позволяет определять общую систематическую погрешность метода. Сравнивается исследуемый метод с референтным, т.е. тем у которого максимальная специфичность, правильность и воспроизводимость, без учета экономических затрат.

Аналитическая специфичность метода это способность метода измерять лишь тот компонент или те компоненты, для определения которых он предназначен. Низкая специфичность приводит к получению неправильных результатов и должна быть указана в описании метода. Так, например, при определении магния с магоном, повышенное содержание кальция завышает результаты.

Аналитическая чувствительность метода это наименьшее количество вещества, которое выявляет данный метод (обладая при этом вышеописанными характеристиками).

При постановке нозологического диагноза с использованием лабораторных тестов следует учитывать его диагностическую надежность при определенных заболеваниях. Для количественной характеристики диагностической надежности лабораторного теста рекомендованы критерии: диагностической чувствительности (ЦЧ), диагностической специфичности (ЦС),

Диагностическая чувствительность -- вероятность того, что у больного будет получен положительный результат теста. О ДЧ судят по доле (%) ложительных результатов анализа у пациентов с соответствующим заболеванием.

Диагностическая специфичность - вероятность того, что у здорового будет получен отрицательный результат теста. О ДС судят по доле (%) отрицательных результатов у лиц, не страдающих соответствующим заболеванием.

5. Методы количественного анализа, используемые, в клинической биохимии

При проведении биохимических анализов используют методы количественного определения компонентов биологических жидкостей, которые принципиально подразделяются на две группы физико-химические и иммунохими-ческие.

Физико-химические методы основаны на учете физических изменений в системе (цвет, электропроводность и др.) происходящих в результате определенных химических реакций. Иммунохимические методы основаны на реакции взаимодействия антигена и антигела.

Весовой (гравиметрический) анализ, основанный на выделении вещества в результате определенных реакций, высушивания и точного взвешивания его на аналитических либо торсионных весах. Примером этого анализа может служить определение содержания фибриногена по методу Рутберг.

Объемный (титрометрический) анализ, основанный на точном измерении объемов реагирующих между собой веществ в эквивалентных (равных) количествах. Примером может служить определение кислотности желудочного сока, хлоридов в биологических жидкостях титрометрическим способом и др.

Электрообъемные (электроаналитические) методы, основанные на электрохимических свойствах растворов. Примером этих методов является определение концентрации ионов водорода, хлора, натрия, калия, кальция в биологических жидкостях с помощью ионоселективных электродов.

4. Оптические методы анализа нашли наибольшее распространение в клинических лабораториях. Они, в свою очередь, подразделяютсяна: фотометрию (абсорбционнуюи эмиссионную), рефракгометриюиполяриметрию.

Все оптические методы основаны на изменении свойств проходящего через исследуемый объект света или на измерении свечения выделяемого искомым веществом.

Абсорбционная фотометрия. В основе метода лежит способность исследуемого вещества поглощать часть проходящего через него света определенной длины волны. Степень поглощения при всех прочих равных условиях (основное из которых длина оптического пути - расстояние, которое проходит световой пучок в исследуемом веществе) прямо пропорционально концентрации вещества.

Теоретическим обоснованием для всех фотометрических методов является закон Ламберта-Бэра, упрощенная формула которого имеет следующий вид: А = E'OL,

где - А - условная величина экстинкция, Е - молярное погашение вещества (величина постоянная для каждого конкретного вещества при одинаковых условиях проведения анализа), С - концентрация исследуемого вещества, L -длина оптического пути.

Практически фотометры определяют отношение между интенсивностью светового потока (J0) после прохождения слоя исследуемого вещества и интенсивностью данного потока до входа в вещество(1), которое называется свето-пропусканием (Т): Т= J0/ J. А величина экстинция определяется путем расчета логарифма данного отношения (А = lgT). Расчет результатов ведут путем сравнения со стандартным раствором.

С помощью фотометрии можно определить две величины: светопоглощение истинных растворов и суспензий и светорассеивание коллоидных растворов. В зависимости от этого методы подразделяются на собственно фотометрию и нефелометрию, турбодимитрию соответственно. Принципиальные различия в устройстве приборов представлено на рис.

Распыление исследуемого вещества в пламене газовой горелки позволяет перевести его в атомарное состояние. Атом вещества способен поглощать кванты света определенной длины волны, переходя в возбужденное состояние. При этом интенсивность излучения будет уменьшаться, а величина светопоглощения пропорциональна концентрации вещества. Данный метод фотометрии носит название атомноабсорбционной спектроскопии. Он является более точным по сравнению с обычной фотометрией и широко используется при определении макро- и микроэлементов в биологическом материале.

Эмиссионная фотометрия основана на измерении интенсивности светоизлучения (эмиссии) исследуемым веществом. Физический смысл метода в том, что атомы исследуемого вещества способны поглощать внешнюю энергию и переходить в возбужденное состояние, характеризующееся расположением электронов на более высоких энергетических уровнях. Возвращаясь на исходный, стационарный уровень электроны испускают избыточную энергию в виде квантов световой энергии. Длина волны испускаемого света, зависящая от структуры электронной оболочки атома, позволяет идентифицировать химический элемент, а интенсивность свечения позволяет судить о количественном содержании.

В лабораторной практике используется две разновидности данного метода: пламенная фотометрия и флюо-риметрия.

Флюориметрия использует такое явление, как люминисценция, т. е. свечение веществ без нагревания. Флюо-риметрические приборы (флюориметры) чаще всего используют фотолюминисценцию - свечение, возникающее под действием ультрафиолетового облучения и хемилюминисценцию - свечение, возникающее в процессе протекания химической реакции. Методы флюориметрии характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью.

Электрофорез. Под электрофорезом понимают процесс разделения заряженных частиц в электрическом поле. Многие биологически важные молекулы (белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты и др.) имеют в своем составе ионизирующие группы. Поэтому в биологических жидкостях (крови, лимфе и др.) они существуют в виде катионов и анионов. Помимо этого молекулы имеющие примерно одинаковый заряд могут отличаться молекулярными массами и отношением заряда к массе. На этих различиях и основано разделение ионов при движении их в растворе под действием электрического поля.

Скорость перемещения зависит от величины заряда, а также в ряде случаев, от размера и формы молекул. Так как в большинстве случаев молекулы отличаются по своим физическим и химическим свойствам то очень немногие из них имеют одинаковую электрофоретическую подвижность. Скорость движения частиц (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью.

В зависимости от способа проведения электрофореза его делят на свободный или фронтальный, когда элек-трофоретическое разделение осуществляется в водной фазе и зональный, или электрофорез на поддерживающей среде, когда разделение осуществляется на каком-либо инертном носителе (бумага, асбестовые пластины, целлюлоза, агаровый, крахмальный и полиакриламидный гели и др.).

Важными характеристиками процесса зонального электрофореза являются градиент потенциала (В/см) и сила тока, приходящаяся на 1 см поперечного сечения полосы (плотность тока - мА/см).

Низковольтный электрофорез используется для разделения высокомолекулярных соединений типа белков, ли-попротеинов, гликопротеинов и др.

Высоковольтный электрофорез используется для разделения низко молекулярных веществ, типа аминокислот, их производных и др. Так как различие в разряде и молекулярной массе у таких веществ невелико, то нужен большой градиент потенциала, чтобы произошло эффективное разделение частиц. Так как при этом происходит значительное разогревание носителя, требуются специальные устройства для его охлаждения.

Хроматография. Это метод разделения многокомпонентных систем, основанный на использовании явлений сорбции в динамических условиях. В процессе хроматографии происходит многократное повторение актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента. Вещество подвижной фазы непрерывно вступает в контакт с новым участком сорбента и частью сорбируется, а сорбированное вещество контактирует со свежими порциями подвижной фазы и частично десорбируется.

Методы хроматографического анализа различаются: по агрегатному состоянию системы, в которой проводится разделение на газовую и жидкостную: по механизму разделения- на адсорбционную, распределительную, ионообменную, гель- хроматографию, аффинную и др.

Иммунохимические методы в клинической биохимии

В клинической лабораторной практике широко используются иммунохимические методы для определения традиционных биохимических объектов-белков, ферментов, гормонов, медиаторов, фармакологических препаратов и др. Достоинством их является высокая чувствительность и специфичность. Внедрение иммунохимических методов -один из способов дальнейшего совершенствования диагностики заболеваний сельскохозяйственных животных, так как многие серологические и аллергические методы, используемые в настоящее время для диагностики ряда важнейших заболеваний (туберкулез, бруцеллез, колибактериоз, сальмонеллез и др.), не обладают достаточной чувствительностью и специфичностью. Основой успеха в иммунохимических исследованиях является получение иммунных сывороток высокого титра и нужной специфичности.

При проведении клинико-биохимических исследований наиболее широко используются реакция иммунодиф-фузии в геле (РИД), иммуноэлектрофорез, радиоиммунологический анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА) и некоторые другие.

Радиоиммунологический анализ (РИА). В 1959 году был разработанколичественныйиммунологический метод определения инсулина с использованием гормона, меченого радиоактивным изотопом иода 131 J. В основе метода лежала конкуренция между нативным инсулином плазмы и меченым 131J- инсулином за ограниченное число специфических мест связывания на антителах к инсулину.

В основе метода, как и других методов связывания лежит один из фундаментальных законов химии- закон действия масс.

Основной принцип радиоиммунологического анализа состоит в том, что при неизменном количестве связывающего агента (антитела) отношение связанного антигена к свободному в состоянии равновесия находится в количественной зависимости от суммарного количества присутствующего антигена.

В состоянии равновесия отношение связанного антигена (В) к свободному (F) определяется соотношением

B/F= [АгАт ]/ [Агисх ]- [Агсв ]

где: [Агисх ]- исходная концентрация антигена; [Агсв ]- количество антигена, связанного в виде комплекса АгАт.

Меченый антиген ведет себя так же, как и немеченый, и отношение концентрации связанного антигена и свободного описывается тем же уравнением.

Иммуноферментный анализ (ИФА). В начале семидесятых годов (1971-1972 гг.) был разработан метод имму-ноферментного анализа, в основе которого также как и метода и РИА лежал закон действия масс, но вместо радиоактивной метки была использована ферментативная. Метод иммуноферментного анализа имел ряд преимуществ перед методом радиоиммунологического анализа.

В нем не использовались радиоактивные изотопы. Отсутствие радиационной опасности значительно упрощало условия проведения (специальные помещения, оборудование ит. д.)

Гораздо большая устойчивость меченых соединений (в РИА она определяется периодом полураспада изотопов.)

Возможность быстрого определения результатов ферментативной реакции с помощью обычных общедоступных приборов (фотометров). Возможность даже визуальной оценки реакции.

ИФА легко поддается автоматизации.

Так же как и в РИА специфичность и чувствительность ИФА в сильной степени зависят от качества иммунной сыворотки. Необходимо использовать только высокоавидные и высокоспецифические антитела.

Метод ИФА можно широко использовать для обнаружения специфических антигенов возбудителей тех же заболеваний, а также самых различных химических соединений, которые могут выступать в качестве антигенов или гап-тенов-антибиотиков, гормональных препаратов, микотоксинов, пестицидов и др.

Методы ИФА могут быть разделены на гетерогенные (твердофазные, ELISA) и гомогенные(ЕМ.ГГ ) отличающиеся по принципу проведения анализа. Гетерогенные методы ИФА основаны на использовании антигенов и антител, иммобилизованных на нерастворимых носителях (как правило пластик). Гетерогенные методы включают обязательную стадию разделения комплекса (меченое ферментом соединение - связьшаюший агент) от свободного меченого соединения.

Гомогенные методы основаны на эффекте модуляции антителами активности фермента (или кофактора) используемого в качестве метки антигена.

Лекция 2. Обмен веществ - основные понятия и термины

Патобиохимия белкового обмена. Клинико-диагностическое значение показателей, характеризующих белковый и углеводный обмены обмен у животных.

2.1 Основные понятия обмена веществ. Основы патобиохимии обмена веществ

Обмен веществ (метаболизм) - сложная система химических реакций, связанных между собой общими метаболитами, регуляторами и целями. Целями этих реакций являются извлечение энергии, синтез компонентов восстановителей, структурных блоков и синтез полимеров, строение которых соответствует индивидуальной генетической программе организма (анаболизм), а также инактивация отработавших метаболитов собственного синтеза и метаболитов чужеродного происхождения (ксенобиотиков).

Принципиально основной обмен, т.е. обмен, направленный на производство энергии и строительных блоков (энергетический и пластический, который отождествляется с обменом белков, углеводов и липидов) можно подразделить на общие стадии:

- деполимеризация, происходящая в ЖКТ(это способ поддержания гомеостаза и зашиты от чужеродной генетической информации).

- поступление метаболитов в кровь, транспортировка по организму и трансмембранный перенос в клетки, посредством 3 видов транспорта (диффузии, облегченной диффузии и активного транспорта).

III - тканевой метаболизм (а) синтез, б) окислительно-восстановительный распад (образование единого С2-
фрагмента, образование конечных продуктов обмена).

На второй стадии тканевого метаболизма происходит продукция энергии в виде АТФ. АТФ - не накапливается в организме. А энергия запасается в виде накопления углеводов(1 г = 17 кДж), жиров (1 г = 39 кДж) и белков (1 г = 17 кДж). Основные энергетические метаболиты - глюкоза (универсальный), жирные кислоты (не приникают в ЦНС, но более энергемкие и кетоновые тела.

Для регуляции обмена веществ эволюционно сформировались различные механизмы, влияющие на инструменты метаболизма - то есть на каталитическую активность энзимов. Особенности химических реакций метаболизма в том, что они все регулируются. Не регулируемые реакции опасны для организма.

Биохимическая схема обмена веществ включает цепи, каскады и циклы химических превращений, связанные метаболическими путями. Под метаболическим путем понимают характер и последовательность превращения определенного вещества в организме. Различают метаболические пути центральные, специальные и резервные. Кроме того, различают частные метаболические пути (строго специфические для данного вещества) и общие для нескольких сходных веществ. Некоторые вещества до какого-то метаболита могут иметь специфические метаболические пути, а затем превращаться одинаково.

Как разнонаправленная равновесная система процессов, обмен веществ не может быть весь изменен в каком-то одном направлении, поэтому выражения типа «обмен веществ усилился», «болезнь привела к снижению обмена веществ» являются не точными и неверными. Метаболизм процесс необратимый. Он всегда стремиться достичь своих целей (основные это извлечение энергии и построение структурных блоков), при любых условиях, с максимальным КПД и минимумом побочных продуктов. Метаболические пути взаимосвязаны и имеют общую регуляцию, поэтому изменения в одном звене обязательно приводят к изменению в других звеньях. Так, например, при ИЗСД, недостаток инсулина первичен, он приводит к снижению запасания глюкозы в виде глюкогена и усиления глюконеогенеза, при этом тормозится ЦТК, избыток А-КоА уходит на другие цели, т.е. включается в синтез трикарбоновых кислот и кетогенез, и поэтому частыми спутниками ИЗСД является ожирение и кетоацидоз. Следовательно, знание метаболических путей в организме необходимо для выбора диагностической тактики.

2.2 Основные положения метаболизма белков

Белок - важнейший пластический компонент диеты, незаменимый источник биогенного азота, необходимый для роста и регенерации. В пересчёте на сухой вес белки составляют 44% массы тела. На долю протеинов приходится более половины его органических соединений. (О. Эдхольм, А. Бахаранч). В соматическом отсеке тела (скелет, скелетные мышцы, кожа) находится около 63% белка тела, остальные 37% - в висцеральном отсеке. Важность белка как пластического компонента доказывается тем, что при хронической белковой недостаточности в питании населения ряда тропических регионов рост и развитие целых народов может замедляться. Известно, что представители многих низкорослых этносов тропической Африки, Азии, Латинской Америки, переселяясь в раннем детстве в развитые страны и следуя диете с достаточной в качественном и количественном отношении поставкой белка, приобретают антропометрические показатели, сходные с таковыми у коренного населения развитых стран (Ж. де Кастро, 1950; Р. Котран и соавт., 1997). Роль белка:

структурная;

транспортная (антитоксическая);

регуляторная (гормональная, ферментативная);

защитная.

Белки - носители чужеродной антигенной информации и должны расщепляться при переваривании, утрачивая ан-тигенность, что и происходит в ЖКТ, под действием протеиназ до амнокислот. Через облегченную диффузию и активный транспорт (система пермиаз) аминокислоты попадают в кровяное русло.

Часть из них уходит на:

синтез белков и функциональных белков клетки;

синтез гормонов и др. регуляторных молекул;

синтез функциональных белков плазмы крови;

в реакции переаминирования, для синтеза заменимых аминокислот;

для синтеза энергии и в др. виды обмена (избыток).

В организме различают матричный синтез белка (преимущественно) и нематричный - в отдельных случаях (синтез небольших пептидов, например трипептида глютатиона) - он экономически не выгоден.

Конечным продуктом для простых белков является аммиак, который в печени переводится в менее токсичную мочевину и экскретируется через почки.

При утилизации сложных белков вначале отщепляется небелковая часть, которая утилизируется в зависимости от вида (углеводная поступает в окислительный распад, при распаде гемоглобина отщепляется гем, разрывается пирольное кольцо по следующей схеме, с образованием биллирубина; нуклеопротеиды разрушаются с образованием мочевины и мочевой кислоты).

2. Биохимические показатели, характеризующие белковый обмен у животных

Интегральным показателем общего белкового метаболизма служит азотистый баланс. Это разница между суточным количеством поступающего с пищей азота и количеством азота, выделенного за тот же период в составе азотсодержащих компонентов мочи и кала (мочевина, мочевая кислота, аминокислоты, креатинин, соли аммония). Косвенно его можно оценить по соотношению небелкового остаточного азота в сыворотке крови и общим белком. У здорового взрослого животного, азотистый баланс нулевой или стремится к нулю.

Положительный азотистый баланс - указывает на то, что аминогруппа задерживается в организме в реакциях аминирования и переаминирования, т.е. идет на синтез белка. Может быть не только в норме (при росте, интенсивной регенерации, лактации и беременности), но и при патологии - опухолевом росте и при гиперсекреции гормона роста.

Отрицательный азотистый баланс указывает на то, что аминокислоты в организме интенсивно дезаминируются, сопровождает состояния с активированным глюконеогенезом (голодание, белково-энергетическая недостаточность, инсулинзависимый сахарный диабет, гиперкортицизм, стресс).

Композиция белков плазмы - т.е. количество общего белка определяемое в плазме крови и количество отдельных видов белков. Характеризует скорость синтеза и распада белка в организме.

Небелковые азотсодержащие компоненты плазмы крови или остаточный азот крови - под которым понимают азотсодержащие соединения остающееся после осаждения в плазме (сыворотке) белков. К ним относятся мочевина - на долю которой приходится около 50 % от всех азотсодержащих веществ, мочевая кислота и азот аминокислот по 20 %, креатин и креатинин, полипептидный азот.

Коллоидно-осадочные пробы. Сущность этих проб в том, что белки, находящиеся в виде коллоидных растворов осаждаются какими-то химическими соединениями. Степень осаждения зависит от заряда и размеров белка. Альбумины наиболее сложно осаждаются, а иммуноглобулины легче всего. Поэтому данные пробы позволяют косвенно судить о соотношении между отдельными фракциями общего белка. Наиболее часто используют тимоловую пробу и пробу Вельтмана.

4. Виды нарушений белкового обмена

Собственно нарушения обмена белков включают:

нарушения количественного поступления белка в организм (белковый перекорм и белковая недостаточность);

нарушения качественного состава белков (недостаток незаминимых аминокислот, дефицит и избыток отдельных аминокислот, причём последний может приводить как к их антагонизму, так и прямой токсичности);

нарушения переваривания белков в ЖКТ (что ведет в белковой недостаточности и кишечной аутоинтоксикации, продуктами гнилостного распада белка);

нарушения чрезмембранного транспорта аминокислот (расстройства кишечного всасывания при заболеваниях ЖКТ);

нарушения промежуточного обмена аминокислот (расстройства дезаминирования; переаминирования; декарбокси-лирования при заболеваниях печени, прежде всего, а так же недостаточности ферментных систем).

нарушения композиции белков плазмы (при заболеваниях органов синтезирующих плазменные белки).

нарушения конечных этапов обмена белка (аномалии и недостаточность цикла мочевины, и прежде при функциональной недостаточности печени, а также при нарушениях почек - нарушение экскреции конечных продуктов).

2.3 Нарушения композиции белков плазмы

Около 7% массы плазмы крови составляют различные белки. Современными методами специфика их обмена заключается в том, что они возникают в одних клетках и органах, а утилизируются, как правило, - в других. В связи с этим, плазма крови - динамическая равновесная система, и её протеинограмма, подобно зеркалу, отражает состояние разных тканей. Количество белков в плазме или сыворотке достаточно постоянный для каждого вида животных показатель (табл..). Количественные изменения в сторону увеличения называются гиперпротеинемией, а в сторону у менынения гипопротеинемией.

Различают абсолютную и относительную гипер или гипопротеинемии.

Абсолютная гиперпротеинемия встречается редко и может наблюдаться при: внутривенном введении белковых препаратов (при переливании крови, плазмозаменители и др.), после вакцинаций, аутоиммунных заболеваниях, бело-ксинтезирующих опухолях и др.

Относительная гиперпотеинемия сопровождает патологические состояния, связанные с потерей организмом жидкости при диареиных заболеваниях, усиленном потоотделении, хроническом нефрите и т.д.

А задержка жидкости в организме (отмечают при уменьшении диуреза, повышенной секреции антидиуретического гормона, водной нагрузке и др.) сопровождается относительной гипопротеинемией. Дополнительными лабораторным тестами для дифференциации этих состояний служат определение гематокритной величины и СОЭ, т.е. необходимо выяснить соотношение между плазмой и форменными элементами.

Абсолютная гипопротеинемия наиболее часто встречаемая форма нарушения обмена белка и может указывать на:

физиологическое состояние (наблюдается при тяжелых мышечных нагрузках, в последние месяцы беременности, в период интенсивной лактации);

недостаточное поступление белка в организм (при алиментарном голодании, нарушении функции желудочно-кишечного тракта, печени, поджелудочной железы);

подавление биосинтеза белка, сопровождающее хронические патологические процессы в печени;

повышенный распад белков в организме (при тиеротоксикозе, обширных ожогах, длительных лихорадках, опухолях, передозировке кортикостероидов);

повышенное выделение белка с мочой (нефротический синдром, гломерулонефрит, сахарный диабет) и калом (профузная диарея);

перемещение белка из сосудистого русла (при развитии асцита, экссудативном плеврите, выпотевании транссудата, кровотечении).

ДИСПРОТЕИНЕМИИ

В сыворотке крови содержится большое число простых и сложных белков. В настоящее время с помощью электро-форетических, хроматографических, иммунохимических методов удалось показать наличие в сыворотке крови более 100 индивидуальных белков. Но только меньшую часть из них удалось выделить, достаточно хорошо очистить, изучить строение и свойства, а также биологическую функцию.

Наиболее распространенным методом исследования фракций белка является электрофорез. Возможность исследования белковой композиции плазмы в решающей степени была достигнута благодаря разработке А. Тиселиусом метода электрофореза на бумаге, с подвижной границей, разделяющего плазменные протеины. В 1948 г. это открытие, в связи с его гигантским прикладным медицинским значением, было удостоено Нобелевской премии по химии. Электоро-форетически удается разделить белок на 4-16 фракций. При классических условиях электрофореза белки подразделяются на 4 фракции (альбумины, а-глобулины, в-глобулини и гаммаглобулины). (Таблица).

При исследовании фракций белка сыворотки крови можно выявить такие нарушения, как диспротеинемия (нарушение количественного состава белков крови) и парапротеинемия (накопление в крови аномальных белков).

По изменению содержания отдельных белковых фракций можно судить о причинах и направленности нарушений белкового обмена.

Около половины всех содержащихся в сыворотке белков приходится на долю альбумина. Синтезируется в печени. Снижение концентрации альбумина (гипоальбуминемия) наблюдается при голодании, воспалительных заболеваниях, циррозе печени, злокачественных опухолях, кровотечениях, хронических гастритах, выходе белка из русла крови: в просвет кишечника - при завороте кишок, перитоните; на ожоговую поверхность - при обширных ожогах; с мочой - при нефротическим синдроме (для которого характерно повышенное выделение почками альбумина и некоторых других белковых фракций). То же отмечается при остром и хроническом гломерулонефрите, острой и хронической печеночной недостаточности.

Возрастание уровня альбумина в плазме крови (гиперальбуминемия) практически не встречается, а если и обнаруживается, то оно, как правило, вызывается уменьшением содержания воды в русле крови (дегидратация). То же отмечается при внутривенном введении больших количеств концентрированных растворов альбумина.

Белки фракций альфа-1- и альфа-2-глобулинов включают в себя белки "острой фазы", и их количество возрастает при многих острых, подострых и хронических воспалительных процессах, в том числе пневмонии, туберкулезе легких (экссудативном), острых инфекциях, остром ревматизме, сепсисе, острых некрозах (омертвении ткани).

Бетаглобулины - самая богатая липидами фракция общего белка. Содержание бета-глобулинов обычно увеличивается при злокачественных новообразованиях, тяжелой форме туберкулеза легких, инфекционном, токсическом гепатите, желтухе.

Основное количество белков с электрофоретической подвижностью гамма-глобулинов составляют иммуноглобулины A, G, М, обладающие свойствами антител. Содержание белков этой фракции увеличивается при хронических воспалительных процессах, при инфекционном гепатите, токсическом поражении печени, механической (обтурационной) желтухе и ряде других заболеваний. Гипогаммаглобулинемия может указывать на иммунодефицитное состояние организма.

Изменения остаточного азота в крови

Повышение концентрации остаточного азота - гиперазотемия (часто не совсем правильно в этих случаях используют слово «азотемия»). Гиперазотемия может быть абсолютной, связанной с действительным накоплением в крови компонентов остаточного азота, и относительной, обусловленной, например, обезвоживанием, дегидратацией.

А по происхождению ретенционной и продукционной.

Ретенционная гиперазотемия наблюдается при нарушении выделительной способности почек, поэтому определение остаточного азота приобрело большое значения для клинико-лабораторной диагностики заболеваний почек (острого и особенно хронического нефрита). В ряде случаев важно исследовать содержание остаточного азота в динамике развития заболевания. Так, констатация у больных хроническим нефритом стойкой гиперазотемии обычно указывает на развившуюся недостаточность почек. Степень повышения концентрации остаточного азота при этом коррелирует с тяжестью патологического процесса.

Продукционная гиперазотемия, как правило, сопровождает процесс усиленного распада белков. Она сопутствует патологическим состояниям, сопровождающимся синдромом эндогенной интоксикации, пролонгированного стресса (часто наблюдается в послеоперационном периоде). Отмечается при инфекционных заболеваниях, протекающих с лихорадкой и прогрессирующим распадом ткани (крупозной пневмонии). То же отмечается при туберкулезе, сахарном диабете (особенно в прекоматозной стадии), злокачественных новообразованиях (умеренное увеличение содержания остаточного азота идет параллельно возрастанию степени кахексии), острой желтой атрофии, тяжелых циррозах печени.

Наиболее часто в лабораторной практике используют определение мочевины и креатинина.

Незначительное изменение содержания мочевины в крови (снижение или увеличение) может наблюдаться при потреблении пищи со слишком малым или чрезмерно большим количеством белка.

Гораздо более выраженные сдвиги в уровне этого продукта отмечаются у больных с нарушением выделительной функции почек, а также у пациентов, страдающих заболеваниями, при которых происходит усиленный распад белка, а значит, и повышенное образование мочевины. Так, содержание мочевины в крови увеличивается при острой и хронической почечной недостаточности, опухолях мочевыводящих путей, предстательной железы, почечнокаменной болезни, недостаточности деятельности сердца, а также при лейкозах, паренхиматозной желтухе, тяжелых инфекционных заболеваниях, непроходимости кишечника, кровотечениях из верхних отделов желудочно-кишечного тракта, дизентерии, ожогах, шоке, после приема некоторых лекарств: сульфониламидов, левомицетина, тетрациклина, гентамицина, фуро-семида и др. Увеличение концентрации мочевины - уремиея (гиперуремия).

Поскольку мочевина образуется в печени, при тяжелых поражениях этого органа (декомпенсированном циррозе; отравлениях фосфором, мышьяком и другими гепатотропными, печеночными ядами) концентрация мочевины в крови может быть снижена (гипоуремия).

Креатинин это продукт дегидратации креатина - макроэргического соединения. В лабораторной практике используется как показатель фильтрационной способности почек, так как это вещество фильтруется и не реабсорбируется.

2.4 Нарушение количественного поступления белка (белковая недостаточность и белковый перекорм)

Как впервые показано русским учёным Б.А. Словцовым (1898), белки не депонируются в организме. Избыток или недостаток белка немедленно приводит к метаболическим сдвигам.

Белковая недостаточность самая распространенная форма патологии белкового обмена. При дефиците белка в рационе организм вынужден извлекать аминокислоты из структурных белков для синтеза регуляторных и функциональных, а также для включения их энергетический метаболизм при общем голодании. Белковая недостаточность значительно сказывается на рост и развитие организма, состояние иммунной защиты (снижается синтез белковых защитных факторов). Наиболее часто бывает алиментарного происхождения (недостаток белка в рационах, его неполноценность) и вторичного происхождения (при заболеваниях ЖКТ, с нарушением переваривания и всасывания).