Основы клинико-биохимической аналитики

Для почек характерна высокая интенсивность обмена веществ. Так, до 90% энергетических веществ, поступающих в орган с кровью, расходуется на выделительную функцию, остальные - для других потребностей почек. Основным источником химической энергии в почках служат углеводы. В освобождении энергии преобладает аэробный путь и связанное с ним окислительное фосфорилирование. Часть энергии поступает за счет распада жиров, т.к. они содержат много продуктов бета-окисления ВЖК, в частности ацетоуксусной кислоты.

5.2 Биохимические тесты оценки функции почек

В связи с тем, что почки обеспечивают в первую очередь гомеостаз организма, то практически все факторы, которые могут его нарушить, вовлекают органы мочеотделения в целом и почки в частности в патологический процесс. Различные стресс-факторы вызывают снижение резистентности организма и способствуют проявлению вирулентности условно-патогенной микрофлоры. Токсины, образуемые этими микроорганизмами, вызывают аллергические и аутоиммунные реакции в почках с последующим развитием в них воспалительных и дистрофических процессов. Собственно болезни почек делят на три основные группы:

диффузный гломерулонефрит как инфекционно- или токсикоаллергическое заболевание;

токсические и инфекционные поражения без выраженных изменений реактивности организма (нефронекроз, эмболический или геморрагический нефрит);

дистрофические заболевания почек, развивающиеся при нарушениях обмена веществ, интоксикациях, хронических инфекциях.

Следует иметь ввиду, что точно диагностировать все эти заболевания возможно только на основании результатов морфологических исследований. К сожалению, прижизненное гистологическое или гистохимическое исследование почек у животных для нас пока что является неосуществимым. Вместе с тем, выход из такой ситуации представляется в использовании биохимических методов исследования, поскольку практически при всех этих заболеваниях происходит повреждение клубочков и канальцев почек.

Эти повреждения устанавливают на основании общего клинического анализа мочи и определения некоторых биохимических показателей крови. ОКА мочи включает:

физические свойства (количество, цвет, прозрачность, консистенция, запах, относительная плотность);

химические свойства (рН, белок, глюкоза, билирубин, уробилиноген, кетоновые тела, гемоглобин, кровь и др.);

микроскопию мочевого осадка.

Существенным недостатком лабораторного анализа является исследование случайной порции мочи (в медицине исследуют обычно суточную мочу) и использование качественных, в лучшем случае - полуколичественных, методик. Правда, такие исследования значительно облегчаются при использовании диагностических тест-полосок, производство которых налажено в РБ.

При исследовании крови о функции почечных клубочков можно судить по содержанию, в первую очередь, креати-нина и мочевины. Креатинин - компонент остаточного азота, в синтезе которого принимают участие аминокислоты. Он, будучи беспороговым веществом, выделяется с мочой. Уровень креатинина в крови определяется в основном мышечной массой и, что для нас очень важно, выделительной способностью почек. Если функция почек нарушена, то концентрация креатинина в крови значительно возрастает. Что касается мочевины, то она синтезируется, главным образом в печени, как продукт дезаминирования аминокислот. Мочевина свободно проникает через мембрану почечного фильтра и выделяется с мочой. Ее концентрация в крови значительно возрастает при нарушении функции клубочков. Однако следует иметь ввиду, гиперурикемия может быть и следствием потребления больших количеств белка, чрезмерного его распада, непроходимости кишечника, патологии печени, заболеваемости животного дизентерией или некоторыми тяжелыми инфекциями. Для дифференциации поражений печени от патологии почек рассчитывают соотношение концентрации азота мочевины к количеству остаточного азота. В норме оно составляет около 0,5. При почечной недостаточности коэффициент возрастает, а при гепатите - снижается.

Поскольку почки участвуют также в водно-электролитном и минеральном обменах, то определение их показателей (калий, натрий, магний, кальций, фосфаты) также представляется диагностически информативным.

5.3 Почечные расстройства у животных

При патологии почек у животных развивается достаточно сложный симптомокомплекс, проявляющийся такими синдромами как мочевой, отечный, нефротический, уремический и некоторые другие. Клинические их проявления вы рассматривали при изучении клинической диагностики и внутренних незаразных болезней. Поэтому останавливаться на этом не будем, за исключением синдромов почечной недостаточности и нефротического. Дело в том, что эти синдромы развивается практически всегда при недостаточной функции почек.

Почечная недостаточность.

Под почечной недостаточностью, а она может быть острой и хронической, понимают патологическое состояние, возникающее в результате нарушения основных функций почек (осмо- и йонорегулирующей, клубочковой фильтрации, поддержания кислотно-щелочного равновесия). В зависимости от характера развития различают острую и хроническую почечную недостаточность. При острой недостаточности нарушения функций почек, как правило, обратимы, при хронической почечной недостаточности развиваются необратимые изменения.

Острая почечная недостаточность - синдром, характеризующийся внезапно развивающейся азотемией в результате нарушения или прекращения гомеостатической функции почек при воздействии различных внешних и внутренних факторов. У животных достоверно не диагностируется, затушевываясь симптомами основной острой болезни (отравление, аллергические реакции немедленного типа). Болезнь быстро проходит начальную стадию и наступает оли-гоурия вплоть до анурии.

Из-за задержки натрия и воды развивается внеклеточная гипергидратация, быстро развивается отек легких и мозга. Если это не происходит и не развивается уремическая кома, то наступает выздоровление.

Хроническая почечная недостаточность - это состояние, возникающее при любом хроническом, прогрессирующем заболевании почек вследствие гибели нефронов, сопровождающееся развитием азотемии, нарушением кислотно-щелочного и водно-электролитного балансов. Вследствие этого развиваются патологические процессы в сердечнососудистой, дыхательной, кроветворной и других системах. Клиническое проявление хронической почечной недостаточности наступают при утрате более половины массы функционирующих нефронов. В результате нарушения секреции и экскреции метаболитов накапливаются токсические субстанции, ведущие к аутоинтоксикации организма.

В крови типичны биохимические изменения, связанные с увеличением количества калия, мочевины, креатинина, фосфатов, магния и ионов водорода. Одновременно с этим происходит снижение количества натрия, кальция и бикарбонатов (рис. 2).

Биохимические изменения в плазме крови при ХПН

Увеличение	Снижение
Калий	Натрий
Мочевина	Бикарбонат
Креатинин	Кальций
Фосфат
Магний
Ионы водорода

Гипонатриемия связана в первую очередь со сниженным выведением воды из организма. Гиперкалиемия развивается из-за сниженной экскреции калия в сочетании с его выходом из клеток во внеклеточную жидкость. Сниженная экскреция ионов водорода вызывает ацидоз. Задержка фосфата приводит к гиперфосфатемии, повышению концентрации кальцитриола в плазме и к гипокальциемии. Гипермагниемия обусловлена также снижением экскреции магния. Со временем у животных с ХИН возникает остеодистрофия.

При хронической недостаточности у животных развиваются трудно поддающиеся специфическому лечению стоматиты и гастриты, хронический энтерит с длительной диареей. Устойчивый характер имеют анемия и нарушения минерального обмена. В терминальный период болезни развивается отечный синдром и коматозное состояние.

Выявление и лечение причин ХПН может предотвратить или замедлить дальнейшее ухудшение состояния больного животного. Однако, поскольку причина либо неизвестна, либо не поддается лечению, для облегчения симптомов и улучшения биохимических показателей показана консервативная терапия.

Когда почки уже не способны регулировать баланс воды и натрия, важно, чтобы их поступление в организм покрывало потери. Одновременно с натрия хлоридом применяют и диуретики, чтобы способствовать экскреции натрия. Для контроля ацидоза перорально назначают бикарбонат. Гиперфосфатемию регулируют назначением внутрь солей алюминия или магния. Предотвратить остеодистрофию или лечить ее в случае возникновения можно с использованием кальцитриола или других производных витамина Д, но при этом следует контролировать содержание в крови кальция, чтобы не вызвать гиперкальциемию.

В кормах ограничивают содержание белка, чтобы снизить образование азотсодержащих веществ. При этом важно контролировать поступление в организм достаточного количества углеводов и жиров.

Нефротический синдром.

Это клинико-лабораторный симптомокомплекс, представляющий собой первичное или вторичное иммуновоспале-ние собственно почек, возникающее при различных заболеваниях и патологических состояниях, а также под воздействием многих токсических и химических факторов.

Синдром ярко очерчен и характеризуется массивной протеинурией, гипо- и диспротеинемией (гипоальбуминеми-ей), гиперлипидемией (гиперхолестеринемией), отеками (до асцита, гидроторакса, гидроперикарда). Отечный почечный синдром включается в картину нефротического синдрома.

Нефротический синдром, независимо от его происхождения, всегда выражается однотипно.

Протеинурия - появление белка в моче - один из самых важных симптомов заболеваний почек и мочевых путей. Она может быть связана либо с повреждением почек - ренальная (почечная) протеинурия, либо иметь внепочечное происхождение - преренальная и постренальная протеинурия. Почечная протеинурия обусловлена нарушением проницаемости мембран клубочков. Наблюдается при большинстве воспалительных заболеваний почек, их токсических повреждениях, лихорадке.

К непосредственным причинам внепочечной протеинурии относятся: появление повышенной концентрации в крови низкомолекулярных белков, легко фильтрующихся в клубочках почек при гемолизе, ожогах - преренальная протеинурия; выделение белка из распадающихся лейкоцитов, эпителиальных и других клеток - постренальная протеинурия. Нарушения почечной гемодинамики, чаще при сердечной недостаточности, также приводят к протеинурии (так называемая застойная почка). Почечная протеинурия различного происхождения отличается от внепочечной наличием гиалиновых цилиндров в моче, представляющих собой белок, свертьшаюпшйся в почечных канальцах.

Гипопротеинемия характеризуется снижением концентрации общего белка в сыворотки крови (у крупного рогатого скота менее 70 г/л, у свиней менее 62 г/л). При нефротическом синдроме неизменно сопутствует диспротеинемия, выражающаяся в резком уменьшении концентрации альбумина в сыворотке крови, повышении альфа-2- и бета-глобулярных фракций и снижении гамма-глобулинов.

Гиперлипидемия - также типичный признак нефротического синдрома. Она проявляется повышением содержания в крови липидов и холестерина (гиперхолестеринемия), триглицеридов, дислипопротеидемией. Интенсивное образование липопротеинов провоцирует гипоальбуминемия. Общий уровень в плазме крови липидов и холестерина повышен постоянно, при этом их уровень пропорционален гипоальбуминемии.

Следует обратить внимание, что у животных при нефротическом синдроме сыворотка крови приобретает молочно-белый оттенок в связи с повышенным содержанием в ней липидов. Этот показатель, при одновременной гипопротеине-мии, может служить критерием отбора подозрительных в заболевании животных.

Первичный нефротический синдром развивается при всех морфологических формах гломерулонефрита и при пиелонефрите. Вторичный нефротический синдром развивается при следующих заболеваниях и патологических состояниях: хронических воспалениях бронхов, легких, эндокарда; аллергических заболеваниях; передозировке отдельных лекарственных средств и отравлении тяжелыми металлами; укусах змей и пчел; при сахарном диабете.

У крупного рогатого скота синдром может развиться при ряде внутренних незаразных болезней (кетоз, травматический ретикулоперитонит и перикардит); акушерско-гинекологических заболеваниях (паренхиматозный мастит, эндометрит, вагинит); инфекционных и инвазионных болезнях (ящур, туберкулез, лептоспироз, вирусные респираторные инфекции, бабезиоз, и др.). Кроме того, при скармливании большого количества веток березы, ольхи, хвойных деревьев. У лошадей нефротический синдром может быть при миоглобинурии, инфекционной анемии и мыте.

У свиней синдром может развиться при роже, чуме, эшерихиозе и лептоспирозе. У овец - при оспе, энтеротоксемии и клостридиозе. У плотоядных - при акушерско-гинекологических заболеваниях и чуме. У молодняка животных всех видов - как осложнение при болезнях, протекающих с диспепсическим неонатальном синдроме (см. выше), при бело-мышечной болезни и на фоне возрастных иммунодефицитов.

Из экзогенных токсинов, вызывающих повреждение канальцевого аппарата почек, следует иметь в виду соли висмута, ртути и меди, мышьяк, фосфор, хлорорганические соединения, другие пестициды, гербициды и удобрения, растительные яды. При передозировке антибиотиков аминогликозидного и цефалоспоринового рядов, сульфаниламидных препаратов, нитрофуранов.

Лечение нефротического синдрома имеет два аспекта: устранение расстройства, которое лежит в основе синдрома и лечение последствий потери белка. Обычной мерой противодействия потере белка является диета с высоким содержанием белка и низким количеством солей. Если нефротическому синдрому сопутствует почечная недостаточность, то обогащенное протеинами кормление следует проводить осторожно. Важно не вызывать слишком быстрого диуреза, поскольку он может привести к гиповолемии и, таким образом, к нарушению функции почек. Также следует избегать обеднения организма калием. В качестве диуретика лучше назначать спиринолактон, но дополнительно могут оказаться необходимыми тиазиды и фуросемид. С целью профилактики инфекции должен проводиться курс антибиотикотерапии. Одновременно с этим для устранения риска развития тромбоза, который, затрагивая печеночные вены, способен привести к усилению протеинурии, следует применять антикоагулянты.

Мочевыеконкременты (камни).

Предрасполагающие факторы	Состав камней	Биохимические исследования
^ Несбалансированное кормение (избыток белка, наруш. соотн. кислых и щелочных кормов) ^ Обезвоживание, избыток солей ^ Гиперкальцийурия ^ Инфекция мочевых путей ^ Застой мочи	^ Оксалат кальция ^ Фосфат кальция ^ Фосфат магния и аммония ^ Соли мочевой к-ты ^ Цистин	^ Анализ камней ^ Микроскопия осадка > рН ^ Кальций в моче (проба Сулковича) Кровь: ^ Резервн. щелочность ^ Кальций ^ Фосфор

В заключение несколько слов о мочевых камнях. Они образовываются в моче, если она пресыщена соединениями, способными к кристаллизации. Предрасполагающие к этому факторы и наиболее обычные типы конкрементов у животных (овцы, кр. рог. ск., собаки, кошки) следующие:

Факторы образования и состав камней в почках, биохимические исследования приуролитиазе

Выявление причины камнеобразования в моче должно способствовать выработке эффективных мер, предотвращающих этот процесс в дальнейшем. Это особенно важно, если камни у животного образуются регулярно или заболевание регистрируется у большого количества животных.

При наличии гиперкалыгиемии необходимо контролировать поступление кальция с кормом (часто этого бывает достаточно). Показано также использование диуретических тиазидов, которые снижают экскрецию кальция с мочой. При цистинурии показано применение пеницилламина (он уменьшает выведение цистина с мочой). При наличии инфекции мочевыводящих путей используют соответствующую этиотропную терапию. Одновременно с этим больное животное должно иметь свободный доступ к воде.

Лекция 6. Патобиохимия гемостаза клинико-лабораторная диагностика нарушений коагуляционной системы крови

6.1 Общие представления о химизме гемостаза и его нарушения

Общие представления о химизме гемостаза и его нарушения Кровь - это ткань организма, состоящая из жидкой части (плазмы) и взвешенных в ней клеточных (форменных) элементов. Она выполняет в организме ряд важнейших функций, основными из которых, являются транспортная и го-меостатическая. Выполнение функций крови напрямую зависит от ее количества, непрерывности и равномерности движения. Эти условия обеспечиваются системой гемостаза.

Кровь обладает способностью к свертыванию и образованию плотного сгустка (тромба), удерживающего в русле сосуда кровь. С другой стороны этого в нормальных условиях не происходит в организме и не должно происходить. Система гемостаза, которая выполняет двуединую задачу: с одной стороны, удерживать кровь в сосудистом русле обязательно в жидком состоянии, с другой - быстро образовывать кровяной сгусток в случае повреждения сосуда и кровотечения.

Система гемостаза включает в себя сосуды, удерживающие кровь в кровеносном русле, тромбоциты и факторы плазмы, одна часть которых является свертывающими (прокоагулянты), а другая - противосвертываюшими (антикоагу-пянты).

Химизм свертывания крови.

Свертывание крови представляет собой сложную ферментативную реакцию, в которой участвуют факторы свертывания крови. В этом процессе участвуют тканевые и сосудистые компоненты, а так же тромбоциты.

Тканевые компоненты - представлены компонентом лимфы липопротеидной природы - тканевой тромбопластин, который при нарушении целостности сосуда контактирует с кровью и запускает механизм свертывания крови. Этот фактор обладает ничтожной активностью, но он активизирует сосудистые факторы. На настоящее время их описано 12 (рис. 1). Ключевыми являются фибриноген, протромбин, тромбин, конвертин, ионы кальция и др. На участии ионов кальция в коагуляции крови следует лбратить особое внимание, т.к. именно он наиболее доступное лекарственное средство при патологии системы гемостаза. В плазме крови находится до 3 ммоль/л кальция. До 60 % кальция входит в состав солей и находится в виде иона. Этот кальций участвует в свертывании крови. Удаление из крови ионов кальция предотвращает свертывание, на этом и основан способ консервации крови для исследований. Внутривенное введение солей кальция ускоряет свертывание крови. Чем соль быстрее диссоциирует, тем быстрее наступает эффект. Поэтому предпочтение в этих случаях нужно отдавать CaCl2. Ионы кальция играют важную роль на всех фазах свертывания. Они необходимы на всех фазах свертывания (образование тромбопластина, участвуют в потенциировании действия тромбина на фибриноген, обеспечивают стабилизацию тромба и др. функции). Подобным действием обладают и другие ионы двухвалентных металлов (Mg, Ba, St).

Тромбоциты на своей поверхности также несут факторы свертывания крови и их выделяют 8 (рис 2.).

Современное представление о свертывание крови.

В данном процессе еще не все ясно. Наиболее сложной частью является образование тромбопластина крови. Процесс протекает в 4 фазы (рис 3).

Профаза. Свертывание крови начинается с контакта крови с тканевыми факторами или поврежденной стенкой сосуда (нарушается смачиваемость этого участка кровью). Она длится 2 - 5 минут и заканчивается образованием большого количества тканевого и сывороточного тромбопластина.

фаза длится 12 - 13 мин и характеризуется переходом проотромбина под действием веществ первой фазы и ионов кальция в тромбин.

фаза - длится две минуты и характеризуется образованием фибрина-полимера.

III фаза - 30 - 120 мин характеризуется ретракцией фибринового сгустка и принятие им формы соответствующей дефекту или просвету сосуда.

Витамин К участвует в синтезе клетками печени ряда факторов свертывания крови (II, VII, IX, X).

Процесс свертывания крови идет постоянно. Однако кровь в сосудах не свертывается при нормальных условиях. Это обеспечивается существованием противосвертывающей системы. Последняя состоит из антитромбинов и фибрино-лизинов.

В системе антитромбинов выделяют несколько факторов. Наиболее описаны три антитромбина, обозначающиеся латинскими цифрами (I, II, III). Их действие связано с блокированием первой фазы свертывания крови (переход проот-ромбина в тромбин, и лизис тромбина). Антитромбин II - это гепарин. Он представляет собой кислый мукополисахарид, молекулярной массой 15000 - 20000. Гепарин предупреждает свертывание, как в организме, так и в пробирке. При внутривенном его введении противосвертывающее действие отмечается сразу. Гепарин оказывает действие и на фибрин, растворяя его. Поэтому при передозироваках гепарина, вследствие растворения фибриновой пленки сосудов увеличивается проницаемость сосудистой стенки. Устранить действие гепарина можно при применении его антогонистов - мети-леновой сини, протамина сульфата.

Система фибринолизинов состоит из ферементов и проферментов с активаторами, которые растворяют фибрин. Свежие тромбы (до 5 дней) могут рассасываться под действием этой системы.

Антисвертывающая и свертывающая системы находятся в постоянном равновесии. Свертывание крови идет постоянно. Постоянно образуется фибрин, который оседает на стенках сосудов, образуя пленку, снижающую проницаемость сосудов. Пленка эта за счет антикоагуляционной системы никогда не образуется в избыточных количествах и постоянно заменяется.

6.2 Коагуляционной способности крови

Нарушения свертывающей способности крови наблюдают при многих патологических состояниях. Снижение свертывающей способности клинически проявляется длительными кровотечениями и геморрагическими диатезами.

Выделяют:

первичные (наследственные нарушения) - гемофилия;

вторичные

при воспалительных, аллергических и аутоимунных нарушениях зачастую имеются местные нарушения гемокоа-гуляции, обусловленные воздействием медиаторов воспаления, к которым в некоторой степени относится и гепарин;

при инфекционных (бактериальных и вирусных инфекциях), особенно септического характера, за счет действия токсинов-блокаторов коагуляционной системы, гемолитические яды;

при отравлениях веществами, блокирующими свертывание (натрия фторид, гепарин и др.);

при минерально-витаминной не достаточности и особенно в отношении кальция и витамина К;

при заболеваниях печени со снижением синтетической функции);

при заболеваниях костного мозга, заключающихся в понижении образования тромбоцитов.

Повышение свертывающей способности характеризуется самопроизвольным образованием в сосуде тромба, приводящего к прекращению тока крови в этом участке и атрофией, некрозами региональных тканей. Выделяют:

первичные (наследственные нарушения), заключающиеся в основном в недостатке фибринолитической системы;

вторичные - при обширных травмах и ожогах, за счет избытка образования тканевого тромбопластина, внутри-сосудистых изменениях (нарушении гладкости эндотелия - рожа, артериосклероз, а так же нарушении трофики сосудов

- при сахарном диабете - гликолизирование эндотелия), при завышении доз солей кальция, магния.

Методы исследования системы гемостаза, которые наиболее доступны для ветеринарной медицины, можно разделить на биохимические и приборные. Кратко рассмотрим некоторые из них:

Время свертывания венозной крови по Ли-Уайту. Метод основан на определении времени образования сгустка в 1,0 мл нативной венозной крови больного, взятой в стеклянную пробирку. Норма 5 -- 8 мин. Метод относится к ориентировочным и является общекоагуляционным, т.е. характеризует состояние системы свертывания крови в целом (при участии в процессе свертывания всех систем и факторов).

Время рекальцификации плазмы (BP). Метод также относится к общекоагуляционным ориентировочным и характеризует время свертывания плазмы больного (полученной из крови, стабилизированной раствором цитрата натрия) при добавлении к ней раствора хлористого кальция. Норма 120-150 с.

Определение содержания фибриногена по Рутбергу. Метод основан на рекальцификации 1,0 мл цитратной плазмы и взвешивании образовавшегося сгустка фибрина (после отжатая из него жидкой фазы). Вес такого сгустка в норме 9 -- 18 мг, что соответствует концентрации фибриногена 2 -- 4 г/л.

4. Протромбиновое время -- это время свертывания цитратной плазмы после внесения в нее стандартного раствора тканевого тромбопластина и хлористого кальция. В наиболее распространенной трактовке характеризует активность факторов протромбинового комплекса. Поэтому тест наиболее часто применяется для контроля терапии непрямыми антикоагулянтами (антивитамины К).

При применении высокоактивного стандартного тромбопластина результат выражают в секундах (норма 12 -- 15 с). В связи с несоответствием этому стандарту большинство отечественных тромбопластинов результат выражают относительно (в процентах или единицах) протромбинового времени плазмы донора. Норма 80 -- 100% или 0,8 -- 1,0.

Определение содержания тромбоцитов в крови. Применяется подсчет тромбоцитов в камере или мазке.

Толерантность плазмы к гепарину. Тест показывает время свертывания цитратной плазмы при внесении в нее небольших количеств гепарина и последующей рекальцификации. Значения теста в норме 5 -- 7 мин. Он считается общекоагуляционным, но более чувствительно отражает наклонность крови к тромбообразованию (значение теста менее 5 мин), что, видимо, косвенно связано с содержанием в исследуемой плазме AT-III, при снижении которого и развивается тромбоопасность.

Приборные тесты. В лабораториях можно использовать приборы, дающие графическую запись процесса свертывания крови, ретракции и лизиса кровяного сгустка. Расшифровка графиков по специальным формулам позволяет получить целый ряд параметров, характеризующих состояние различных звеньев гемостаза.

Определение ретракции кровяного сгустка. Регистрируется как часть (%) жидкости, отжатой сгустком при сокращении, от количества плазмы. Норма 70 -- 85%. Тест «груб», малоинформативен, зависит от множества физико-химических параметров (качество стекла, применение якорьков, проволочек для фиксации сгустка и т.д.) и биохимических показателей крови.

Клинические пробы - жгута, баночная проба Нестерова. Показывают состояние проницаемости сосудистой стенки под влиянием относительно дозированного воздействия (наложение жгута на плечо, присасывающее действие «банки» при разряжении воздуха под ней). Дает грубую, но часто важную информацию о состоянии сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Результат оценивается по количеству петехий, появляющихся на исследуемом участке кожи после механического воздействия.

Лабораторная оценка иммунного статуса организма и диагностика иммунопатологии

План:

Понятие о иммунном статусе.

Молекулярные механизмы и химия иммунных реакций.

Лабораторная оценка иммунного статуса и диагностика основных иммунопатологических состояний.

1. Понятие о иммунном статусе Молекулярные механизмы и химия иммунных реакций

Иммунный статус организма - это количественная и качественная (функциональная) характеристики отдельных звеньев иммунитета на определенном этапе развития организма или на определенной стадии развития заболевания. Работа отдельных звеньев иммунитета строго согласована. Дефект одной из части иммунной системы первичного (врожденного) или вторичного (приобретенного) характера чаще компенсируется другими компонентами иммунитета. Так, у новорожденных недостаток гуморального звена иммунитета компенсируется за счет клеточного (врожденный нейтрофиллез и лейкоцитоз). Поэтому недостаток одного из звеньев - это не заболевание, а лишь фактор риска. Для суждения о иммунном заболевании необходимо наряду с этим и клиническое проявление.

Иммунный статус в зависимости от функционирования отдельных звеньев иммунитета подразделяется на виды (таблица).

Типы иммунного статуса	Т-звено	В-звено
Нормальный	N	N
Равномерно активированный	*	*
Равномерно супрессированный	Ф	Ф
Активированный по гуморальному звену	N	*
Активированный по гуморальному звену и супрессированный по клеточному	Ф	*
Супрессированный по гуморальному звену	N	Ф
Супрессированный по клеточному звену	Ф	N

С точки зрения молекулярной биохимии иммунная реакция в любом случае является строго специфической. Под иммунной реакцией понимается специфическое взаимодействие крупных молекул посредством рецепторного механизма. Продут реакции выключается из циркуляции из организма и подвергается превращениях доступными методами. В иммунную реакцию могут вовлекаться и клетки, в том случае если они несут на своей поверхности определенный рецептор (аг или ат). Иммунная реакция основной механизм слежения за генетической информацией в организме.

В организме определено на настоящее время значительное число иммунокомпетентных (участвующих в иммунитете) молекул (табл.). Т.к. называемый клеточный иммунитет, осуществляемый фагоцитами, так же зависим от некоторых иммунологических молекул и ими направляемый. Например химотаксис нейтро-филов направляется рецепртором С4

2. Лабораторная оценка иммунного статуса и диагностика основных иммунопатологических состояний

Оценка иммунного статуса проводится поэтапно. Прежде всего, чем приступить к лабораторному анализу, необходимо собрать иммунологический анамнез и выявить специфическую клиническую картину.

Лабораторные исследования подразделяют на тесты нескольких уровней. В ветеринарной практике используются в основном общий иммунологический анализ, позволяющий оценить иммунный статус и определить тип его функционированния.

Общий иммунологический анализ включает в себя:

Оценка клеточного звена иммунитета

подсчет общего числа лейкоцитов; выведение лейкограммы и расчет абсолютного количества лимфоцитов; определение относительного и абсолютного количества Т- В-лимфоцитов; определение фагоцитарной активности нейтрофилов

Оценка клеточного звена иммунитета

определение концентрации в сыворотке крови суммарного количества иммуноглобулинов и их основных классов

Оценка естественной резистентности

определение бактерицидной, лизоцимной активности крови; определение концентрации лизоцима, пропердина, интеферрона, комплемента и др неспецифическиз факторов иммунологической защиты

Подсчет количества лейкоцитов и выведение лейкограммы, проводится по общепринятой методике. Почти все заболевания иммунной системы протекают с изменением количества лейкоцитов и их отдельных видов, зачастую меняется и их морфология.

Определение относительного и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов крови. Определение соотношения между Т- и В-лимфоцитами позволяет выявить направленность иммунологической реакции в какой-то мосент. Например, резкое увеличение числа В-лимфоцитов указывает на протекание фазы иммунного ответа, характеризующейся продукцией антител. Т-лимфоциты обеспечивают клеточные реакции иммунитета, в частности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и реакции трансплантационного иммунитета.

Т- и В-популяции лимфоцитов мало различимы при световой микроскопии. Вместе с тем эти клетки имеют отчетливые антигенные и функциональные различия.

Одним из методов определения числа Т- и В-лимфоцитов в крови является реакция розеткообразования. Суть ее состоит в том, что при контакте Т-лимфоцитов с эритроцитами барана клетки формируют образования, напоминающие тутовую ягоду, которые принято называть розетками. В-лимфоциты также могут формировать розетки, но для этого нужны более сложные условия: эритроциты нагружаются комплексом аниген-антитело-комплемент.

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов (фагоцитарное число, фагоцитарный индекс).

Фагоцитарная активность лейкоцитов максимально выражена у нейтрофилов и, в меньшей мере, у моноцитов и эо-зинофилов. Фагоцитарная активность лейкоцитов зависит не только от функциональной активности клеточных элементов, но и от состояния внутренней среды организма. Интенсивность же фагоцитоза в значительной степени обусловлена активностью самих клеточных элементов.

Наибольшее распространение получила методика определения фагоцитарной активности клеток крови по Кост и Стенко. Принцип методики основан на том, что при контакте с чужеродными частицами гранулоциты и моноциты поглощают (фагоцитируют) и разрушают их внутриклеточными ферментами. Для повышения диагностической значимости данного теста необходима стандартизация чужеродного вещества и преимущество необходимо отдавать латексу. Микробные культуры могут значительно влиять на ход реакции.

Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови.

В ветеринарной лабораторной практике существует несколько методов определения иммуноглобулинов.

Количественное определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии в геле, содержащем моноспецифичную иммунную сыворотку (по Манчини). Суть методики: на стекляные пластины разливают раствор агара, содержащий моноспецифичную сыворотку, после застывания, в агаре делают лунки, в которые вносят исследуемую сыворотку крови животных. Затем пластины помещают во влажную камеру при 37оС и инкубируют в течение определенного времени. Далее замеряют диаметр образовавшихся колец преципитатов. В качестве стандарта используется сыворотка с известным количеством определенного иммуноглобулина.

Определение иммуноглобулинов методом дифференциального электрофореза в полиакриламидномгеле (в модификации В.М.Холода, 1983). Принцип метода: разделяют белки в зависимости от заряда белковой мицеллы и размера молекулы.

Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови путем осаждения цинком сульфатом или натрия сульфитом. Принцип метода основан на том, что при добавлении цинка сульфата или натрия сульфита происходит осаждение из сыворотки иммуноглобулинов. Образующееся при этом помутнение, интенсивность которого зависит от концентрации иммуноглобулинов, можно оценить с помощью колориметра или нефелометра. Методы эти простые, но недостаточно специфичные.

Иммуноглобулины основные участники гуморального иммунитета. При многих иммунопатологических состояниях наблюдаются значительные отклонения уровней иммуноглобулинов в крови.

Ig G - самый легкий из иммуноглобулинов. Молекулярный вес его 150 000, подразделяется на 4 класса. Его количество составляет 70 - 80 % от всех иммуноглобулинов. Ig G - составляет основную массу противобактериальных, противовирусных и др. антител, антитоксинов. Период полураспада составляет 12 - 14 дней. Активный синтез иммуноглобулинов G наступает на 3 - 7 дни после антигенного раздражения. Его количество возрастает во время инфекционных заболеваний (особенно п/острых и хронических), при некоторых болезнях печени и аутоиммунных растройствах, после вакцинаций. Уровень этих иммуноглобулинов снижается при иммунодефицитах, задержке развития и некоторых опухолях лимфоидной системы.

Ig M - самый большой из иммуноглобулинов, молекулярная масса 900 000 - 950 000. Его количество составляет 10 - 15 % отвсех иммуногобулинов. Несет на себе 5 - 10 активных, связывающих центров. Он в иммунном ответе появляется сразу. Способен связывать клеточные структуры и комплемент, антитоксической активностью практически не обладает. Период полураспада 3,5 сут. Концентрация Ig M повышается при острых инфекционных заболеваниях, поражающих систему крови, при острых гепатитах и первичном билиарном циррозе. Снижается - иммунодефицитах, некоторых опухолях лимфоидной системы.

Ig A - в организме существует в двух формах: сывороточной и секреторной (на слизистых). Связывается с клетками эпителия слизистых дисульфидными связями. Секретируется в молоко, слюну и секреты ЖКТ. Ig A связывает антиген, но не активизирует комплемент. Он играет решающую роль в местном иммунитете слизистых. Период полураспада составляет 3 - 6 суток. Количество от всех иммуноглобулинов 10 - 20 %. Уровень сывороточного Ig A возрастает при заболеваниях дыхательных путей и кишечного тракта, при перитониальных инфекциях. Снижается - при гипо- и агам-маглобулинемиях, некоторых опухолях лимфоидной системы.

Ig Е - содержаться в сыворотке крови лишь в следовых количествах. В его состав входят реагины, подготавливающие базофилы и тучные клетки для участвия в аллергических реакциях. Молекулярная масса 190 000. Количество возрастает при аллергических и инвазионных заболеваниях.

Ig D - также находится в крови в следовых количествах. Биологическая роль не установлена. Но считают, что он играет роль в развитии иммунологической толерантности и является как бы фактором предохраняющим иммунную систему от перенагрузки и истощения.

Кроме общего иммунологического анализа крови (тесты первого уровня) существуют тесты второго и третьего уровня, которые более специфичны и позволяют установить и дифференцировать конкретную патологию иммунной системы. К ним можно отнести разделение лимфоцитов на субпопуляции, выявление специфического аг или ат в иммунологической реакции и др.

Показательны при иммунологических реакциях и традиционные биохимические тесты (определение общего белка в сыворотке крови, концентрации гистамина, серотонина и др.).

Что касается нозологии, семиотики, классификации и номенклатуры болезней иммунной системы у животных, то этот вопрос в ветеринарной медицине более-менее оформлен. Примечательно, что родоначальниками этого выступали и выступают сотрудники ВГАВМ (Жаков, Прудников - иммуноморфология, Карпуть - иммунопатология и иммунитет при внутренних болезнях, Ятусевич - иммунитет при инвазионных болезнях, Конопелько, Могиленко, Абрамов, Севрюк, -иммунитет при незаразных болезнях, Веремей - при хирургической патологии, Кузьмич - при акушерско-гинекологической патологии и целый ряд др. сотрудников).

Поскольку иммунная система животных является наиболее динамичной, то она, естественно, постоянно меняются с возрастом, подвержена сезонным колебаниям, резко изменяется под влиянием различных факторов окружающей среды. В ветеринарной медицине выделяют следующие патологические состояния иммунной системы, или их можно объединить подтермином "иммунопатология":

Иммунные дефициты (иммунодефициты).

Аутоиммунные болезни.

Аллергическиезаболевания.

Болезни иммунных комплексов.

Лимфопролиферативные заболевания.

2. Лабораторная диагностика основных иммунопатологических состояний 2.1. Диагностика иммунных дефицитов. Иммунный дефицит состояние, характеризующееся недостаточностью в целом или одного из звеньев иммунитета. О иммунном дефиците говорят тогда, когда имеется определенная клиническая картина на фоне недостаточности иммунитета по лабораторным показателям.

Лекция 7. Современные методы биохимического исследования в диагностической практике

7.1 Прогресс аналитических методов, используемых в диагностической практике

В данной лекции мы разберем прогресс клинико-биохимической диагностики за период ее развитие. А так же остановимся на некоторых диагностически важных и прогрессивных современных методах биохимического исследования, применяемых в ветеринарной практике. Я думаю, что данная лекция будет полезна, т.к. некоторые из вас уже в недалеком будущем будут работать в ветеринарных лабораториях. А те, кто будет работать в хозяйствах, столкнутся с вопросом о том, куда отправить материал, в какую лабораторию, исходя из методов ими используемых. В настоящее время в нашей Республике и в ближнем зарубежье (прежде всего России) уже существует некоторое разнообразие, кроме районных ветеринарных лабораторий имеются другие лаборатории, проводящие широкий спектр биохимических исследований. Данные лаборатории по разному оснащены и используют различные методы.

7.2 Прогресс аналитических методов, используемых в диагностической практике

Лабораторная диагностика болезней, и в частности клиническая биохимическая диагностика относительно молодой раздел общей диагностики болезней животных. Наиболее интенсивно он развивался в конце прошлого века и в настоящее время продолжается его интенсивное развитие. Накопленные результаты экспериментальных и практических исследований по биохимических изменениях в организме при патологии составили основу теоритической дисциплины клиническая биохимия. Она в настоящее время введена в большинстве медицинских и ветеринарных ВУЗАХ.

На первой лекции уже отмечалось, что данные биохимического исследования биологического материала позволяют получить ценную информацию о сущности и развитии патологического процесса, служат дополнительными диагностически важными симптомами проявления болезни и значительно дополняют клиническую картину заболевания, облегчая диагностику. Во многих случаях данные биохимических исследований являются патогномичными симптомами, позволяя ставить диагноз.

Ценность этих результатов напрямую зависит от применяемых методов исследования, от их специфичности, воспроизводимости, правильности и чувствительности.

На заре развития лабораторной диагностики (начало XX века) Рис. 1. основными методами исследования служили: гравиметрические (весовые), основанные на выделении вещества из биологического объекта и последующего взвешивания, титрометрические и колориметрические, и те и другие были основаны на изменении цвета раствора. Чувствительность этих методов измерялась концентрациями г/л, мг/л или моль/л, ммоль/л. Воспроизводимость этих методов была низкой, ошибка определения составляла от 15 до 50, а то и более процентов. Доля ручного труда была чрезвычайно высока и результаты исследований в большей степени зависили от квалификации лаборанта.

Развитие техники позволило заменить колориметрию, с визуальным учетом результатов на фотометрию, с приборным у четом результатов, основанном на поглощении исследуемым веществом света определенной длины волны. Чувствительность метода при этом повысилась до мкмоль/л, а ошибка определения снизилась до 10 - 15 %. Чуть позже были разработаны разновидности фотометрии флюорометрия, атомно-абсорбционная фотометрия повысившие чувствительность до нмоль/л. Кроме того, эти методы стали обладать высокой специфичностью и воспроизводимостью.

С 50 годов прошлого века начали активно развиваться иммунологические методы (РИА, ИФА, ФИА). Данные методы обладают особенно высокой, почти абсолютной специфичностью, т.к. основаны на специфическом иммунологическом взаимодействии. Чувствительность этих методов подошло вплотную кпги пкмолям. С 90-х годов прошлого века появилась ПЦР с чувствительностью в пмоль/л и очень высокой специфичностью, основной в настоящее время метод изучения ДНК и РНК, т.е. генома.

Данный рисунок отражает и вторую сторону прогресса лабораторной диагностики. Обратите внимание, что площадь основания пирамиды значительной больше площади верхушки. Она пропорциональна числу анализов проводимых в единицу времени. Такое значительное ускорение процесса проведения исследований стало возможным за счет развития аналитической техники.

Отличительной чертой современных диагностических приборов является значительная степень автоматизации всех процессов проведения исследования, включая пробоподготовку. Автоматизация процессов исследования позволяет достигнуть нескольких целей:

прежде всего, это высокая производительность исследований (современные биохимические анализаторы способны проводить до 200 - 250 исследований в час по 10 - 15 показателям);

во вторых, автоматизация позволяет снизить погрешность исследований (полная беспристрастность машин и постоянная прогнозируемая ошибка);

в современных анализаторах зачастую блокируются методы биохимического исследования, что значительно повышает чувствительность и специфичность метода (например, автоматический хроматограф ВЭЖХ НР-1100, в котором сблокированы методы жидкостной хроматографии и УФ-детекции вещества);

современные аналитические приборы управляются с помощью ПЭВМ, которая проводит не только расчет результатов, но и оценивает правильность и случайность полученных результатов. Для некоторых приборов возможна оценка результатов через интернет специалистами, разработавшими и производящими прибор. Они проводят его диагностику.

7.3 Особенности современных аналитических приборов

Второй составляющей прогресса лабораторной диагностики явилось развитие аналитической техники. Основными чертами развития явилось:

автоматизация всех процессов проведения анализа, с одновременной унификацией и стандартизацией (Рис. 1. ), как результат число проводимых исследований в единицу времени резко увеличилось, кроме того все это позволяет;

блокирование методов исследования в одном комплексе, повышающее чувствительность метода (например хромотография и УФ детекция);

создание аналитических систем, управляемых ПВЭМ, с использованием средств интернета, с одновременной оценкой правильности исследований.

Автоматизация всех процессов позволяет унифицировать проведение исследований. Унификация - это приведение к единым стандартам проведения определенных исследований. В рамках этого ранжируются методы пробоподготовки и исследования по чувствительности, специфичности и точности. А так же вырабатывается единая система проверки качества лабораторных исследований.

Унификация исследований позволяет вырабатывать нормативные значения по большому числу анализов за счет совпадения результатов исследований во многих лабораториях. Вводить постоянную корректировку норм.

СРЕДСТВА ДОЗИРОВАНИЯ В процессе анализа наиболее частой манипуляцией является отмеривание определенного количества раствора. Особенно актуально это в настоящее время когда для постановки Ускорение этого процесса и стандартизация - очень важный момент во всем исследовании. В настоящее время для этих целей используются ряд автоматических и полуавтоматических дозирующих устройств.

группа устройств - это полуавтоматические дозаторы, пипетки и мокрошприцы (рис. 2).

Выделяют дозаторы фиксированного (рис. 3) - рассчитанные на один объем отмериваемой жидкости и переменного объема - на разный объем жидкости (рис 4). Кроме того, для работы в стандартных 96 луночных планшетах (рис. 5) используют многоканальные дозаторы (рис 6). Использование этих устройств чрезвычайно упростило постановку исследований. Расходные материалы (наконечники) (рис 7) являются стандартными и взаимозаменяемыми.

Дозаторы блокируются с резервуаром для реагентов (рис 8) и позволяют такие устройства отмеривать быстро и точно большое количество доз реактивов. Дозаторы диспензеры (рис 9) разновидность последних устройств, однако они более миниатюрны и фиксируются в руке.

Наличие этих устройств позволяет дозировать объемы от 0,2 мкл до 10 - 25 мл. группа устройств - это настольные автоматические дозирующие устройства, позволяющие отмеривать в пробирки нужное количество реагентов (рис. 10).

РОБОТИЗАЦИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Работу автоматической станции пробоотбора и постановки реакции можно посмотреть в следующем фильме (фильм ИФА).

АВТОМАТИЗАЦИЯ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В современных автоматических устройствах для гематологического анализа используются в основном два технологических принципа - кондуктометрический и оптический.

Основными параметрами, которые позволяют определять современные гематологические анализаторы, являются: количество лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, содержание гемоглобина, показатель гематокрита, объем форменных элементов, содержание гемоглобина в эритроците, лейкограмма.

Кондуктометрический принцип определения заключается в изменении сопротивления клетки в постоянном электрическом поле. Технология определения состоит в том, что фиксируется момент прохода через отверстие малого диаметра (апертуру) клеток крови. Для этого по обе стороны отверстия располагаются электроды с поданным на них напряжением. При протекании через отверстие чистого раствора электролита сопротивление в цепи мало, но в момент прохождения через апертуру клетки оно резко возрастает, что приводит к увеличению напряжения в цепи. Импульсы скачкообразного изменения напряжения фиксируются и подсчитываются специальным датчиком. Специальный прибор (дискриминатор) пропускает импульсы заранее заданной амплитуды, что позволяет регистрировать клетки в зависимости от их размера. О количестве однотипных частиц судят по числу импульсов, возникающих при прохождении клеток крови через апертуру строго определенного размера.

Оптический принцип определения в своей основе имеет измерение величины светопоглощение или свето-рассеивания (см. Оптические методы исследования). В анализаторах этого типа регистрируются электрооптические импульсы, возникающие при прохождении клеток крови в луче светового потока. Интенсивность импульса прямо пропорциональна размеру исследуемых частиц. Световой луч фокусируется на капилляр, через который проходят клетки, в результате чего происходит либо светопоглощение, либо светорассеяние светового потока. Величина светопоглощения или светорассеяния обусловлена размером, формой и структурой клеток крови.

В зависимости от типа анализаторов они делятся на полуавтоматические, где подготовка пробы к исследованию (ее разбавление соответствующими растворами) производится вручную и полностью автоматические, где все эта процедура проводятся в автоматическом режиме.

К приборам, работающим на принципе кондуктометрии, относятся такие гематологические автоанализаторы как Cobis Micros18, МД-11-18, System 9120 и др. Все они позволяют анализировать до 20 параметров крови.

К приборам, использующим оптический принцип детекции относятся гематологические анализаторы серии Techuicon (Н-1, Н-2, Н-3).

Характеристики и особенности некоторых современных методов исследования, используемых в биохимической практике.

В семидесятых годах (1966-1969 гг.) были опубликованы первые сообщения о возможности присоединения к белкам молекул фермантов.

В основе метода лежит взаимодействие между ат и аг, один из которых метится ферментной меткой. Одной из причин широко в настоящее время распространения данного метода, то что он наряду с точностью и специфичностью поддается автоматизации.

Широкое распространение метод ИФА получил при определении антител против бактериальных и вирусных антигенов. Метод ИФА можно широко использовать для обнаружения специфических антигенов возбудителей тех же заболеваний, а также самых различных химических соединений, которые могут выступать в качестве антигенов или гаптенов-антибиотиков, гормональных препаратов, микотоксинов, пестицидов и др.

Методы ИФА могут быть разделены на гетерогенные (твердофазные, ELISA) и гомогенные (EMJT ) отличающиеся по принципу проведения анализа. Гетерогенные методы ИФА основаны на использовании антигенов и антител, иммобилизованных на нерастворимых носителях (как правило пластик).

Гомогенные методы основаны на эффекте модуляции антителами активности фермента (или кофактора) используемого в качестве метки антигена.

В настоящее время разработано много вариантов ИФА-анализа. Среди этих методов можно выделить 2 типа: это методы последовательного (или неконкурентного) анализа и конкурентного анализа.

Метод неконкурентного анализа связан с осуществлением двухстадийного процесса. На первой стадии антитела адсорбированные на нерастворимом носителе взаимодействуют с антигеном. Не связавшиеся компоненты отмывают и затем добавляют раствор, содержащий антитела, конъюгированные с ферментом. Вторая стадия процесса также завершается отмывкой не связавшихся компонентов реакционной смеси после чего в систему вводят соответствующий субстрат для осуществления индикаторной ферментативной реакции.